SU888861A1 - Способ регенерации растений клевера IN VIтRо - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к сельскому хоз йству и может быть использовано iB селекции и семеноводстве растений, в частности в селекции на клеточном уровне и дл  ускоренного размножени  и оздоровлени  селекционного материала , в исследовани х по фитопатологии , физиологии и генетике растени Известны способы регенерации растений из клеток суспензионных культур клевера белого (Trifoeium repens L.) и люцерны-(наиболее близкого к клеверу рода семейства бобовых). В соответствии с этими способами регенерацию растений осуществл ют посредством получени  каллусов из проростков клевера белого и листьев люцерны на агаризованных питательных средах с последующей дезинтеграцией каллусной ткани на клетки и клеточные агрегаты в жидких питательных средах размножени  образовавшихс  клеточных попул ций и формировани  дифференцированных структур (почки, эмбриоиды а затем растений-регенерантов 1 и . Однако эти способы оказались неприемлемыми дл  клевера лугового (trifptium pratense L- ), что св зано со специфическими требовани ми каждого вида растений к услови м, способствующим регенерации. Кроме того , получение каллусов из проростков приводит к потере исходных форм и затрудн ет оценку селекционного ма териала. Известен также способ регенерации растений клевера лугового из каллусной ткани, полученной из листовых эксплантатов, на агаризованных питательных средах 3. Однако этот способ неприменим дл  клеточной селекции и не позвол ет получать большое число регенерантов в расчете на 1 эксплантат (в среднем получают 25 растений). Целью изобретени   вл етс  увеличение выхода регенерантов. Поставленна  цель достигаетс  тем, что каллусы получают из листьев посредством культивировани  эксплантатов на модифицированной агаризованной среде в которую дополнительно ввод т итаконовую кислоту, каллусную .ткань помещают в жидкую среду Bg с кинетином и повышенной концентрацией тиамина - НСв, а образовавшиес  клеточные суспензии кульг

гивируют в жидкой среде В без гормонов , сформировавшиес  в cycneHStH проэмбриоиды культивируют на агаризованной среде Bg- без гормонов до .образовани  эмбриогеиной ткани, проростков и растений-регенерантов.

Причем итаконовую кислоту ввод ч в агаризованную модифицированную среду Гамборга Bg. в количестве 2--4 мг/л.

Содержание тиамина - НСв в жидкой среде Гамборга В. составл ет 2025 мг/л.

Количество кинетина в жидкой среде Гамборга В составл ет 0,20 ,8 мг/л.

Способ осуществл етс  следующим образом.

Семена культивируегвлх сортов и гибридов клевера лугового обрабаты- вают 30 мин в концентрированной серной кислоте (скарификаци  и стерилизаци ) , затем промывают стерильной дистиллированной водой до нейтральной реакции и выдерживают в течение ч в темноте при 22±1С. Наклюнувшиес  семена помещают на агаризованную среду Bj- с уменьшенной вдвое концентрацией всех вход щих в нее компонентов (1/2 Ъ) и инкубируют в закрытых прозрачных сосудах при

11юминесцентном освещении 8-10 тыс.лк и при фотопериоде 16 ч/сут, температуре 22il°C и относительной влажности воздуха 80+10% до образовани  растений с 6-7 листь ми. Часть тройg чатых листьев используют дл  получени  каллусов, а растени  с оставшимис  2-3 листь ми высаживают в почву . .

На листочках, предназначенных

o дл  получени  каллусов, делают р д надрезов вдоль жилок, помещают на питательную среду Вд-, в которую дополнительно ввод т 6000-8000 мг/л агар - агара или бактоагара, 200300 мг/л нитрата аммони  и 2-4 мг/л

s итаконовой кислоты, содержание сахарозы увеличивают до 25000 30000 мг/л, железа (ГГ) сернокислого (РеЗОд- ) до 70-100 мг/л, трилона Б (Ка2.ЭДТА) до 90-130 мг/л

0 и внос т следукедие фитЬгормоны; 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) 5-6 мг/л, кинетин 6-10 мг/  и ci-нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,1-0,5 мг/л, рН реды довод т до 5 .5,8-6,0.

Состав среды Eg- (Gamborg et аВ., 1968) при рН 5,5 представлен в табл. 1.

Таблица 1

Материал инкубируют 12-14 дней |при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 8,010 ,0 тыс. лк) г I температуре 22 + 1С и относительной влажности воздуха

95i5%.

В случае по влени  на листочках бактериальной или грибной инфекции их удал ют с частью прилегающей к ним Питательной среды.

Образовавшиес  каллусы использую Дл  получени  клеточных суспензий, помеща  их в жидкую питательную среду Рг с 0,2-0,8 мг/л кинетина и 20-25 мг/л тиамина - НСЕ, (на каждый мл среды внос т 15-25 мг каллусной ткани). Материал инкубируют на встр хивающих аппаратах с числом колебаний 100-125 мин при освещенности 3-4 тыс о лк и температуре 24+2°С. Через 8-10 суток суспензии субкультивируют путем добавлени  к 3-5 объемам свежей среды без гормонов 1-го объема суспензии. Через 2-3 недели в Суспензии образуютс  проэмбриоиды (незрелые соматические зародыши), которые пересаживают на агаризованную среду 1/2 В без гормонов . Через 8-10 суток из проэмбриидов образуетс  эмбриогенна  ткань, которую пассируют на свежую среду того же состава. После 12-14 дней культивировани  масса пересаженной

ткани увеличиваетс  в 14-16 раз, и в ней развиваютс  проростки, которые через 2-3 недели образуют растени регенеранты . Разросшуюс  эмбриогенную ткань субкультивируют с 10-12дневным интервалом с целью получени  новых проростков, в конце каждого цикла выращивани  образовавшиес  проростки перенос т на агаризованную среду 1/2 Вр без гормонов. Через 2-3 недели из проростков формируютс  растени -регенеранты с 4-5 листь ми и корн ми. Регенеранты пересаживают в почву и выращивают 14-16 дней под прозрачной синтетической пленкой (дл  предотвращени  десикации), а затем в обычных услови х.

П р и м е р. Проводили регенерацию растений иЗ клеток суспензион80

б,45±0,14 342±24,4 530+10,0

3,60+0,17 180+17,6 330+18,7 . 98

Разность между вариантами с итаконовой кислотой и контролем без итаконовой кислоты достоверна при Р 0,0.1.

Полученные каллусы помещают в жидкую питательную среду с 0,5 мг/л кинетина и 20 мг/л тиамина из расчета 20 мг ткани на 1 мл среды и инкубируют на аппарате АВУ-1 (аппарат универсальный дл  встр хивани  жидкости в колбах и пробирках) при 100-125 колебани х в минуту и амплитуде колебаний 20-30 мм. В течение 8-10 дней из каллусов образуютс  суспензии, содержащие в среднем 300 тыс. клеток/мл.

Дл  получени  проэмбриоидов из клеток суспензионных культур к 4 объемам свежей среды без гормонов добавл ли 1 объем суспензии. Через 2 недели в суспензии сформировались зеленые проэмбриоиды (10 штук в каждом мл среды), которые после пересаки на среду без гормонов образовали

ных культур клевера лугового сорта ВИК-7. При этом получены следующие результаты: 80% листовых эксплантатов на среде с трем  фитогормонами: 5 мг/л 2,4-Д 4- 8 мг/л кинетика J +0,5 мг/л НУК и итаконовой кислотой (3 мг/л) через 2 недели образуют каллусы со средней массой 530±10 мг. Итаконова  кислота (ненасыщенна  двухосновна  карбонова  кислота HOOC-CH,j-(J-COOH  вл етс  продуктом

снг

обмена веществ некоторых плесневых грибов, например AspergiCCuj itaconlcus , в культуре тканей используетс  впервые) стимулирует интенсивное

5 развитие каллусов у растений сорта ВИК-7 и у полученных из этого сорта регенерантов (табл. 2).

;Т а б л и ц а

82,2

53,0

50,0 91,7

эмбриогенную ткань. В этой ткани через 2 недели сформировались проростки , а затем растени -регенеранты . Разросшуюс  эмбриогенную ткань

5 пересаживают с 10 дневным интервалом на свежую среду 1/2 В5-. В конце кг1Ждого цикла выращивани  в ткани формируютс  новые проростки (по 150 шт на 500 мг пересаженной ткани), ко0 торые перенос т на среду того же состава. Через 2 недели проростки образуют растени -регенеранты с 4-5 листь ми и корн ми. Последние высаживают в почву и выращивают 2

5 недели под полиэтиленовой пленкой, а затем в обычных услови х. Полученные растени -регенеранты свободны от фитопатогенной инфекции, нормально ростут и развиваютс , цветут и зав зывают семена. Весь процесс

О регенерации от получени  каллусов до высадки растений-регенерантог в почву занимает в среднем три мес ца . Выход регенерантов в расчете на 1 эксплантат (листочек) составл ет: без субкультивировани  эмбриогенной ткани - 7 тыс. растений, а при 2-кратном субкультивировании 1 млн,

Использование изобретени  позвол ет быстро размножать и оздоравливать селекционный материал, обра- батывать мутагенами многочисленные клеточные попул ции и проводить эффективный отбор ценных генотипов методами клеточной селекции, получа  из отобранных форм растени -регенеранты .

Claims (4)

1. Способ регенерации растений клевера in vitro, включающий получение каллусов на агаризованной питательной среде с последующей пересадкой их в жидкую питательную среду дл  выращивани  клеточных суспен-зий с последующим получением из них дифференцированных структур и растеНИИ - регенерантов, о т л и ч а ющ и и с   тем, что, с целью увеличени  выхода регенерантов, в качесТ ве агаризованной питательной среды . используют модифицированную среду Гамборга В с итаконовой кислотой, образовавшиес  каллусы перенос т в жидкую среду Гамборга Bj с повышенной концентрацией тиамина - KGB , в которую в качестве фитогормона

ввод т кинетин, полученные клеточные суспензии пересаживают в жидкую среду Гамборга В5 без гормонов, а образовавшиес  из клеток проэмбриоиды выращивают на агаризованной среде , Гамборга Вр- без гормонов с регул рным субкультивированием образовавшейс  из них амбриогенной ткани и пересадкой сформировавшихс  в этой ткани проростков на среду Гамборга В, без гормонов.

0

2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что итаконовую кислоту ввод т в агаризованную модифицированную среду Гамборга BC в количестве 2-4 мг/л.

5

3.Способ по п. 1, отличающ и и с   тем, что содержание тиамина-НСб в жидкой среде Гамборга В.. составл ет 20-25 мг/л.

4.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что количество кине0 тина в жидкой среде Гамборга BS составл ет 0,2-0,8 мг/л.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1.Т.Н. Oswald et ag. СаССus and

5 pgantCet regeneration from cuCtures of &adino cCover and soybean .- PhysioC . PC ant, p. 39, 129134 , 1977.

2.Авторское свидетельство СССР

0 № 721036, кл. А 01 Н 3/00, 1978.

3.Авторское свидетельство СССР № 721035, кл. А 01 Н 3/00, 1978.