SU1752284A1

SU1752284A1 - Способ клонального микроразмножени гибридов карельской березы

Info

Publication number: SU1752284A1
Application number: SU904834032A
Authority: SU
Inventors: Римма Кашаповна Байбурина; Наталья Владимировна Старова; Владимир Иванович Ермаков
Original assignee: Ботанический Сад Института Биологии Башкирского Научного Центра Уральского Отделения Ан Ссср
Priority date: 1990-04-02
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 1992-08-07

Abstract

Использование: сельское и лесное хоз йство , дл получени посадочного материала ценных видов березы. Провод т клональное микроразмножение гибридов карельской березы путем посева верхушечных и пазушных почек на агаризованную питательную среду Мурасигэ-Скуча, содержащую , мг/л: лизин 80-120; кинетин 0,05- 0,15; 6-бензиламинопурин 0,6-1.0 и НУК 0,05-0,08, после этого провод т субкультивирование и удлинение полученных побегов на питательной среде при концентрации 6- бензиламинопурина 0,3-0,5 мг/л индолил- масл ной кислоты 0,3-0,5 мг/л, а укоренение осуществл ют на жидкой питательной среде Мурасига-Скуча, содержащей дополнительно 0,4-0,6 мг/л индолилмасл ной и 0,1-0,3 мг/л нафтилук- сусной кислоты, 11 табл. СО с До разработки технологии клонального микроразмножени , Позвол ющей получать растени генетически идентичные исходному , ценные гибриды и клоны карельской березы не могли быть использованы дл создани .промышленных плантаций на древесное сырье высокого декоративного качества . Известны способы клонального микроразмножени некоторых видов березы, в частности понской белой березы, березы бородавчатой, бурой свилеватой карельской березы. Апробаци данных способов на уникальных гибридах карельской березы ел ю ю 00

Description

селекции В.И. Ермакоеа не дала положительных результатов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности вл етс способ клепального микроразмно- жени взрослых растений свилеватой карельской березы, Способ включает четыре этапа: введение в культуру верхушечных и пазушных почек и инициаци роста каллуса на среде Мурасиге и Скуга (MS-1A) с 1 мг/л БАП в течение двух недель; индукци почкообразовани на среде с 10 мг/л БАП, 0,2 мг/л НУК в течение 2-3 недель; удлинение побегов на среде MS с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей, 0,5 мг/л БАП, 0,5 мг/л ИУК в течение четырех недель; укоренение на среде MS с половинным содержанием макросолей и сахарозы, без гормонов в течение четырех недель.

Недостатками данного способа вл ют- с многоступенчатость технологии (4 этапа), что св зано с дополнительными экономическими и временными затратами (12-13 недель ), относительно низкий процент укорен емости и приживаемости растений при высадке в открытый грунт, высокий процент инфицировани и гибели регенерантов на этапах культивировани . Кроме того, повышенное использование БАП на втором этапе (10 мг/л) может вызвать нежелатель- ные изменени в генотипе, а длительность укоренени без гормонов (до четырех недель ) нежелательна дл развити побегов,

Целью изобретени вл етс увеличение выхода растений - регенерантов гибри- дов карельской березы и сокращение сроков выращивани .

Цель достигаетс тем, что согласно способу клонального микроразмножени гибридов карельской березы в качестве ис- ходных эксплантов используют верхушечные и пазушные почки гибридов карельской березы, рост каллуса и формирование конгломерата микропобегов провод т на основной агаризованной питательной среде по Мурасиге и Скугу с добавками 80-120 мг/л лизина, 0,05-0,15 мг/л кинетина, 0,6- 1,0 мг/л БАП (бензиламинопурина), 0,05- 0,08 мг/л НУК (нафтилуксусна кислота) (среда 1), с последующим субкультивирова- нием и удлинением побегов на основной агаризованной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и сахарозы и с дополнением 0,4-0,6 мг/л БАП, 0,3-0,5 мг/л ИУК (среда 2), укоренение растений-регене- рантов провод т на основной жидкой питательной среде с дополнением 0,4-0,6 мг/л ИМК (индолил-3-масл на кислота), НУК 0,1-0,3 мг/л (среда 3). Культуры выращивают при освещении люминесцентными лампами (10000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25 С и относительной влажности воздуха 70%. Укорененные растени -регене- ранты высаживают в почву в теплицу с последующей высадкой в открытый грунт.

Способ осуществл ют следующим образом .

Молодые неодревесневшие побеги текущего года длиной 3-5 см обмывают в слабом мыльном растворе, а затем промывают водопроводной водой. Растительный материал сначала стерилизуют в лэминаре в течение 1 мин в 70% этаноле, а затем - 3 мин в диациде. По окончании стерилизации промывают трехкратно автоклавированной дистиллированной водой.

В стерильных услови х вычлен ют пазушные почки и помещают в питательную среду в пробирки Среда 1 дл культивировани почек с последующим образованием и ростом каллуса содержит, кроме основной среды по Мурасмге и Скуг/ (Murashige, Skoog, 1962), 80-120 мг/л лизина, 0,05- 0.15 мг/л кинетина, 0,6-1,0 мг/л БАП, 0,05- 0,08 мг/л НУК, сахарозу 20 г/л, агар 0,4%. На этой среде через три недели образуетс плотный каллус желтовато-бурого цвета. Через две недели он увеличиваетс в мзссе и наблюдаетс многочисленное образование почек зеленого цвета с последующим по влением укороченных побегов с молодыми листь ми Затем этот каллус с образовавшимс конгломератом /аленьких побегов перенос т на среду 2Ч на которой происходит удлинение побегов в течение 3-4 недель. Среда 2 с уменьшенной адвое концентрацией макросолей содержит 0,4- 0,6 мг/л БАП и 0,3-0,5 мг/л ИУК, 10 г/л сахарозы и 0,4%-ный агар. На среде 2 провод т мультипликацию побегов, т. е., помеща выросшие побеги, подрезав с основани и удалив верхушку, на свежую среду, можно, повтор этот процесс многократно , добитьс выхода максимального числа побегов из одного экспланта.

Выросшие до 2,0-3,0 см растени пересаживают на жидкую питательную среду 3 дл корнеобразовани . Эта среда состоит из минеральных солей по Мурусиге и Скугу с добавками лизина 80-120 мг/л, ИМК 0,4- 0,6 мг/л, НУК 0,1-0,3 мг/л, сахарозы 20 г/л. На этой среде побеги формируют корни в течение 10-15 дней. По достижении корн ми 3-5 см в длину растени пересаживают в почвенную смесь с торфом. Горшки с растени ми став т в теплицу дл доращивани ,

Способ апробирован в лабораторно- производственных услови х.

П р и м е р 1, Материалом дл размно- жени служат гибриды карельской березы,

полученные под руководством В.И. Ермакова и произрастающие на агробиостанции. Пазушные почки вз ты со взрослых деревьев , возраст которых 18-23 года.

Молодые неодревесневшие побеги дли- ной 3-5 см отрезают, поверхностно стерилизуют в растворе детергента, а затем промывают в проточной воде. В стерильных услови х (в ламинаре) кусочки побегов сначала стерилизуют в течение 1 мин в 70%- ном этаноле, а затем в диациде 3 мин. По окончании стерилизации промывают трехкратно автоклавированной дистилиро- ванной водой. После этого в стерильных услови х (шкаф с ламинарным течением воздуха) отдел ют почки от побегов, удал ют у них покровные чешуи. Пробирки со средой 1 (табл. 1) с добавками лизин 100 мг/л, кинетин 0,1 мг/л, БАП 0,85 мг/л НУК 0,065 мг/л (оптимальные концентрации) эвтоклавировали при 1 атм в течение 30 мин, воду - при 1,5 атм в течение 1 ч. Экспланты помещают на питательную среду 1 в биологические пробирки (21 х 200 мл), которые закрывают стерильными марлевыми пробками. Пробирки помещают на светоплощадку при освещении люминесцентными лампами (10000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25°С и 70% относительной влажности воздуха . Через три недели на нижней части почки образуетс каллус желто-бурого цвета, который , спуст 2 недели,увеличиваетс в массе, наблюдаетс массовое образование почек зеленого цвета. Этот каллус далее субкультивируют на среде дл элонгации побегов.

Дл элонгации побегов используют среду 2 (табл. 1), котора представл ет собой основную среду с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и с дополнением 0,5 мг/л БАП и 0,4 мг/л ИУК (оптимальные концентрации), сахарозой 10 г/л и агаром 0,4%. На этой среде провод т мультипликацию побегов. Побеги гибридов, достигшие 2,0-3,0 см, в течение трех недель пересажи- вают на жидкую питательную среду 3 дл корнеобразовани (табл. 1), состо щую из минеральных солей по Мурасиге и Скугу с дополнением ИМК 0,5 мг/л, НУК 0,2 мг/л (оптимальные концентрации), сахарозы 20 г/л. По достижении корн ми 3-5 см в длину растени пересаживают в почвенную смесь с торфом. Горшки с растени ми став т в теплицу дл доращивани . Полив обильный, Приживаемость растений со- ставл ет 76%. Наблюдени показывают нормальный рост и развитие растений.

Сравнение результатов каллусообразо- вани показывает, что процент каллусооб- разовани у предложенного способа

(83,6%) выше, чем даже на лучшей из сред дл инициации каллуса (MS-1 А) у известного (82,7%).

На этапах культивировани (этапе 1 - 4) у известного способа случаи бактериального инфицировани и гибели составл ют 40-101%. В предложенном способе инфицировани и гибель эксплантов наблюдаетс только на этапе 1 (табл. 2), что составл ет в среднем 16,4%, на этапах органогенеза (этапы 2-3) инфицировани и гибели регене- рантов не на блюд а ют (табл. 3).

Сравнение результатов укоренени in vitro показывает, что предложенный способ позвол ет достигнуть укоренени in vitro у деревьев всех испытанных гибридов (например , у гибрида 32 из 32 побегов 22 укорен ютс сразу на среде 3, а 10 инертных побегов после повторного помещени на среды 2,3 тоже дают корни), в тоже врем у известного способа укоренение in vitro достигнуто не у всех деревьев и процент укоренени низок из-за инфицировани и гибели регенерантов на этапах 2-4 (40- 101%).

В предложенном способе приживаемость растений, высаженных в грунт, составл ет в среднем 76%, в известном способе данные по приживаемости не привод тс .

Предложенный способ позвол ет проводить культивирование взрослых деревьев карельской березы в укороченные сроки 10- 11 недель (известный способ 12-13 недель) за 3 этапа (табл. 4).

Пример 2. С молодых неодревесневших зеленых побегов отдел ют пазушные почки и культивируют их на питательной среде 1 с различными концентраци ми гормональных веществ. В процессе экспериментов вы влены предельные значени и оптимальные концентрации кинетина, БАП, ИУК, НУК, лизина соответственно. Результаты представлены в табл. 5-8.

П р и м е р 3. Растительный материал тот же, что и в примере 1 и 2. После культивировани на среде 1 полученные множественные микропобеги отдел ли и- субкультивировали индивидуально на среде 2 с различными концентраци ми БАП и ИУК, с целью удлинени . Экспериментально определ ют предельные и оптимальные концентрации БАП и ИУК соответственно. Результаты представлены в табл. 9 и 10.

П р и м е р 4. После культивирований на средах 1 и 2 выросшие микропобеги пересаживают на среду 3 дл стимулировани образовани корней с различными концентраци ми ИМК. Экспериментально определ ют предельные значени и оптимальные концентрации ИМК. Результаты приведены в табл. 11.

В культуру ввод т растени нескольких гибридных комбинаций. Преимуществами предлагаемого способа вл ютс : возможность промышленного использовани в лесном хоз йстве уникальных гибридов карельской березы с ценной древесиной, которые ранее не могли быть использованы в производстве вследствие трудности их размножени черенкованием; возможность размножени взрослых деревьев; возможность многократной мультипликации; сокращение сроков получени укорененных растений до 10-11 недель; подготовка укоренившихс растений в услови х теплицы к началу вегетации в открытом грунте; возможность выращивани посадочного материала независимо от времени года.

Среды, используемые дл клонального микроразмножени гибридов карельской березы, представлены в табл. 1.

Результаты каллусообразовани у предложенного и известного способов представлены в табл. 2.

Результаты размножени гибридов карельской березы (сент брь-окт брь 1988 г.) представлены в табл. 3.

Этапы культивировани и их длительность у предложенного и известного способов приведены в табл. 4.

Результаты роста каллуса и формировани конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации кинетика приведены в табл. 5.

Результаты роста каллуса и формировани конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации БАП представлены в табл. 6.

Результаты роста каллуса и формировани конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации НУК приведены в табл. 7.

Результаты роста каллуса и формировани конгломерата молодых побегов в зависимости от концентрации лизина приведены в табл. 8.

Результаты удлинени побегов в зависимости от концентрации БАП приведены в табл. 9.

Результаты удлинени побегов в зависимости от концентрации ИУК приведены в табл. 10.

Эффективность корнеобразованц в зависимости от концентрации ИМК приведена в табл. 11.

i

Claims

Формулаизобретени

Способ клонального микроразмножени гибридов карельской березы, включающий посев верхушечных и пазушных почек на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга , содержащую в своем составе фитогормоны, культивирование до получени побегов, их удлинение на питательной среде Мурасиге-Скуга с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и содержащей в

качестве фитогормонов 6-бензиламинопу- рин и индолилуксусную кислоту с последующим переносом на питательную среду дл укоренени , отличающийс тем, что, с целью увеличени выхода растений-регенерантов и сокращени сроков выращивани , посев верхушечных и пазушных почек провод т на питательную среду, содержащую в качестве фитогормонов 80-120 мг/л лизина, 0,05-0,15 мг/л кинетика, 0,61 .0 мг/л б-бензиламинопурина и 0,05- 0,08 мг/л НУК, субкультивирование побегов и их удлинение провод т на питательной среде при концентрации б-бензиламинопурина 0,3-0,5 мг/л и индолилмасл ной

кислоты ,5 мг/л, а укоренение осуществл ют на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга , содержащей дополнительно 0,4-0.6 мг/л индолилмасл ной и 0.1- 0,3 мг/л нафтилуксусной кислоты.

Примечание. В культуру вводились экспланты от 10-20 деревьев каждого гибрида. Здесь и в последующих таблицах даны данные по одному дереву от каждого гибрида, так как результаты по деревь м от одного гибрида не варьировали. 8 предложенном способе в культуру вводились экспланты от трех гибридных комбинаций (32, 368, 539), в известном - от п ти плюсовых деревьев (Е 8469, Е 83Э9, Е 9000, Е , Е 1092).

Таблица 3

Примечание. Данные привод тс без учета процессов субкультивировани каллуса и мультипликации побегов, которые позвол ют многократно увеличивать выход растений - регенерантов от одного экспланта. Не укоренившиес сразу побеги (32-22-10 у гибрида 32) не инфицируютс и не погибают, э повторно помещаютс на свежие среды 2 и 3, где позднее дают корни. Инфицировани и гибели регенерантов на этапах 2 и 3 не ваблюдалось.

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 7

Таблица 9

Таблица 10