RU2128428C1 - Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток (варианты) - Google Patents

Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток (варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2128428C1
RU2128428C1 SU4614680A SU4614680A RU2128428C1 RU 2128428 C1 RU2128428 C1 RU 2128428C1 SU 4614680 A SU4614680 A SU 4614680A SU 4614680 A SU4614680 A SU 4614680A RU 2128428 C1 RU2128428 C1 RU 2128428C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
callus
medium
embryogenic
nutrient medium
explant
Prior art date
Application number
SU4614680A
Other languages
English (en)
Inventor
Сриниваса Ранган Тирумале
Морис Андерсон Дэвид
Раджасекаран Канниах
Вилльям Грула Джон
Лорн Хадспет Ричард
Ли Иенофски Ричард
Original Assignee
Майкоуджен Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Майкоуджен Корпорейшн filed Critical Майкоуджен Корпорейшн
Application granted granted Critical
Publication of RU2128428C1 publication Critical patent/RU2128428C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/002—Culture media for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в сельском хозяйстве для регенерации хлопчатника из соматических культур. Эксплант хлопчатника выделяют из пророщенных семян, культивируют его на твердой питательной среде, содержащей глюкозу для каллусообразования. При появлении первичного каллуса его переносят в твердую питательную среду, содержащую сахарозу. Культивируют на ней до развития вторичного каллуса. Варианты способа в средах используют сахарозу в качестве источника углерода в момент, когда фенольные секреции подходят к концу. В качестве экспланта используют эксплант, выделенный из гипокотиля и/или семядоли, происходящих от проростков и незрелых эмбрионов хлопчатника. Предлагаемые способы позволяют получить жизнеспособные растения хлопчатника примерно от 35% эксплантов за период от 6 до 8 мес. 3 с. и 21 з.п. ф-лы, 7 ил.

Description

Изобретение относится к регенерации и трансформации хлопчатника, в частности хлопчатника вида Gossypium hirsutum Z. /Хлопчатник обыкновенный/.
В последнее время было получено много культур тканей in vitro, происходящих от различных растений, принадлежащих различным таксономическим группам. Для некоторых культур были также определены факторы, регулирующие рост и дифференциацию. Установление скрытых взаимодействий между различными группами растительных гормонов и регуляторов роста растений, действующих непосредственно или косвенным образом, отдельно или в синергичных комбинациях, продвинуло до некоторой степени понимание определенных взаимосвязей, существующих между клетками, тканями и органами. Однако имеющаяся в настоящее время информация относительно таких взаимосвязей далеко не полная.
Уже продолжительное количество времени был известен тот факт, что культуры клеток растений могут поддерживаться в недифференцирующем пролиферативном состоянии неопределенно длительное время. Однако только недавно было обнаружено, что можно экспериментально индуцировать повторную дифференциацию тканей, органов или целых растительных организмов. В работе Skoog et al "Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro" Symp. Soc. Exp. Biol, 11: 18 - 130, 1958 /эта работа вводится в настоящее описание в виде ссылки/ было показано, что соответствующее отношение цитокинина к ауксину определяет природу органогенеза в ткани табачной сердцевины. Реорганизация или регенерация из каллюсных культур заключает в себе образование примордия побега или эмбрионов, которые приводят в результате к развитию ростков растений in vitro.
Преимущественная тенденция к органогенезу по сравнению с эмбриогенезом зависит от участвующих видов и от наличия определенных запускающих факторов, которые по своему характеру являются химическими и/или физическими.
В 1902 г., Haberlandt в своей работе "Kulturversuche mit isolierten planzenzellen", Mat. KI. Kais. Akad.; Wiss. 111:62 /вводимой в качестве ссылки/ предположил, что клетки растений обладают способностью продуцировать растение целиком и предсказал возможность получения такой регенерации опытным путем. В 1965 г. Reinert "Untersuchungen ubermorphogenese an Gewebekulturen", Ber. dt. Bot. Ces. 71:15, и St. eward et al, "Growth and organized development of cultured cells/11. Organiztion in cultures grown from freely suspended Cells, Am. J. Bot. 45: 705 - 708, независимо друг от друга подтвердили возможность соматического эмбриогенеза in vitro. Обе работы вводятся в настоящую заявку в виде ссылки. В экспериментальном проведении соматического эмбриогенеза стало очевидно, что решающую роль в этом процессе играют два компонента культуральной среды, ауксин и источник азота.
Было также показано, что процесс соматического эмибриогенеза протекает в две стадии: первая - индукция клеток с эмбриогенной компетенцией при высокой концентрации ауксина; вторая - развитие эмбрионной клеточной массы в эмбрионы при отсутствии или при низкой концентрации ауксина.
Индукция органогенеза или эмбриогенеза приводит к образованию в каллюсах различных структур. Тщательное изучение различных видов растений дает возможность сделать некоторые обобщения по поводу эволюционного пути развития, приводящего к образованию побегов, почек или эмбрионов.
Применение тканевой культуры для регенерации растений посредством органогенеза или эмбриогенеза является наиболее значительным вкладом в изучение морфогенеза в целях его дальнейшего практического применения.
В 1971 г. в своей работе "In vitro culture of fertilized cotton ovules", Bioseience 21: 906 - 907, 1971, вводимой в настоящее описание в виде ссылки, Beasley сообщил о получении каллюса в культуре семяпочки хлопчатника. Позже, Hsu et al в работе "Callus induction by (2-chlorethyl) phosphonic (CPA) acidmcultured cotton ovules", Physiol. Plant 36: 150 - 153, вводимой в настоящее описание в виде ссылки, наблюдал стимуляцию роста каллюсов, полученных из семяпочек, вызванную добавлением в среду CPA и гибберелловой кислоты. Кроме того, для Gossypium nirsutum и G. arboreum были получены каллюсные культуры посредством других эксплантатов, таких как (a) лист, Davis et al., "In vitro culture of callus tissues and cell suspensions from okra (Hibiscus esculentus) and cotton (Gossypium nirsutum)", In vitro 9: 395 - 398, 1974 (обе работы вводятся в настоящее описание в виде ссылки; (b) гипокотиль, Schenk et al. "Medium and techinque for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures", Can. J. Bot. 50: 199 - 204, 1972 (вводится в настоящее описание в виде ссылки); и (c) семядоля, Rani et al. "Establishment of tissue Cultures of Cotton", Plant Sci. Lett. 7: 163 - 169, 1976 (вводится в настоящее описание в виде ссылки).
Katterman et al. "The influence of a stron g reducing agent upon initiation of callus from the germinating seedling of Gossypium barbadense" Physiol. Plant 40: 98 - 101, 1977 (вводится в настоящее описание в виде ссылки) удалось получить плотный каллюс из семядолей G. Barbadense, а в одном случае, помимо этого, также растение целиком. Smith et al. "Defined condition the initiation and growth of Cotton callus in vitro, Gossypium arboreum", In vitro 13: 329 - 334, 1977 (вводится в настоящее описание в виде ссылки) определили условия для инициации и получения субкультуры каллюса, происходящего от гипокотиля G. arboreum. Вслед за этим Price et al. "Callus cultures of sixspecies of Cotton Gossypium L. on defined media", PI. Sci. Lett. 8: 115 - 119, 1977, и "Tissue culture of Gossypium Species and its potential in cotton genetics and crop inprovement", Beltwide Cotton production Research Conference Proc. pp. 51 - 55, 1977, of the National Cotton Council, Memphis, /вводятся в настоящее описание в виде ссылки/ определили условия для инициации и получения субкультуры каллюса от пяти видов Gossypium. Одной из основных проблем в получении культур многих видов растений является "потемнение" экспланта в культурной среде. Для хлопчатника такое высолаживание полифенолов можно избежать путем замен сахарозы глюкозой и путем переноса культуры в свежую среду каждые 10 дней. После 3 или 4 переносов на дополнительную глюкозную среду потемнение полностью прекращается и культуры могут быть перенесены обратно на дополнительную сахарозную среду. И хотя трудности, возникающие в связи с индукцией, потемнением и поддержания каллюсов в течение процесса субкультивирования были преодолены использованием определенных видов Gossypium, все же попытки регенерировать растения из каллюсных культур были либо безуспешными, либо слишком трудоемкими, т.е. содержали несколько стадий. В своей работе "Plant Regeneration from Callus Tissue of Gossypium hirsutum", L. Plant Sci. tett. 32: 89 - 93, 1983, вводимой в настоящее описание в виде ссылки, Davidonis и Hamilton сообщали о получении, в конечном счете, эмбрионов лишь через два года после начала культивирования. И хотя в целях осуществления регенерации растения in vitro было использовано большое количество различных субстанций роста, таких, как естественные фитогормоны и синтетические регуляторы роста, никаких выводов относительно специфичности и влияния различных факторов на регенерацию растений сделано не было. В самом деле, те же самые вещества, применяемые для различных видов растений, обладали способностью либо ингибировать рост растений, либо стимулировать его, либо вообще не оказывать никакого влияния на последний. Следовательно, за исключением некоторых стандартных процедур, остается проблема получения рабочего протокола для регенерации растений любого нового вида, а также остается нерешенной более трудная задача осуществления трансформации растений.
Настоящее изобретение относится к способу быстрой регенерации растений хлопчатника из сегментов, взятых от саженцев. Предложенный способ обеспечивает высокую степень повторяемости и надежности, а также дает возможность осуществлять генетическую трансформацию растений хлопчатника.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам регенерации необязательно с трансформацией хлопчатника из соматических клеток.
Зерно стерилизуют и выращивают в темноте до прорастания. Проросток является одним из источников экспланта, обычно, гипокотиля и семядоли. Другим источником экспланта является незрелый зиготический эмбрион развивающегося плода. Эксплант разделяют и культивируют в среде роста для образования первичного каллюса /содержащей глюкозу/ в течение периода времени, необходимого для развития каллюса на культуральной среде, которая препятствует выделению фенола и стимулирует клетки экспланта к делению и пролиферации. Затем каллюс, прошедший стадию фенольной секреции, переносят на севжую среду роста /содержащую сахарозу/, которая способствует развитию каллюса до эмбриогенного каллюса. Полученный эмбрион может быть затем подвергнут субкультивации для получения далее эмбриогенного каллюса, либо перенесен на другую среду роста /среду для прорастания растения/, где его культивируют в течение периода времени, необходимого для образования всходов, которые после определенного периода роста переносят в теплицу, а затем на поле, где они растут до стадии зрелого растения, от которого можно собирать урожай семян.
Эмбрионы можно также культивировать в суспензии. В этом случае после периода роста эмбрион, содержащий эмбриогенные агрегаты размером более 600 микрон, а предпочтительно, более 800 микрон, изолируют и используют для продуцирования растения. Каллюсы меньшего размера помещают в среду роста для повторного цикла в целях культивирования образующего растение каллюса или сохранения его в качестве эмбрионного источника.
Трансформация может происходить в стадии экспланта, каллюса или суспензии. Трансформация заключается в воздействии на эксплант, каллюс и/или эмбриогенный каллюс вектором Агробактерии, содержащим чужеродную к хлопчатнику последовательность экспрессируемого гена, в течение периода времени, достаточном для перехода этого гена в клетки. Остаток Агробактерии уничтожается токсичным к ней антибиотиком. После чего трансформированные клетки и/или эмбриогенный каллюс выделяют для формирования из них трансформированных проростков. В случае суспензионной культуры трансформацию и/или селекцию можно проводить до или после отделения эмбриогенного каллюса от клеток и каллюса, который является слишком незрелым для того, чтобы быть эмбриогенным.
Описанная выше процедура дает возможность получить растения с уникальными фенотипическими признаками и новые растения хлопчатника, которые обладают устойчивостью к антибиотикам, обычно ингибирующим рост клеток растений, повышенной устойчивостью и толерантностью к гербицидам и грибковым патогенам, а также растения хлопчатника, которые дают более высокие урожаи и улучшенное качество волокна.
Краткое описание фигур.
Фиг. 1 представляет собой фотографию, иллюстрирующую эмбриогенный каллюс /10/ хлопчатника с соматическим эмбрионом /11/ в различных стадиях развития, включая лист /14/ и корень /16/.
Фиг. 2 представляет собой фотографию соматического эмбриона хлопчатника на поздней глобулярной стадии, выделенной для образования культуры эмбриогенного каллюса, как показано на фиг. 1.
Фиг. 3, как и в случае фиг. 1, представляет собой фотографию, иллюстрирующую эмбрион и молодой проросток /18/ хлопчатника, культивируемого на среде для прорастания эмбриона.
Фиг. 4 представляет собой фотографию небольшой колонии эмбриогенных клеток из суспензионной культуры хлопчатника.
Фиг. 5 представляет собой фотографию глобулярной стадии эмбриона из суспензионной культуры.
Фиг. 6 иллюстрирует проросшие эмбрионы, полученные из суспензионных культур, и показывает появление листьев /14/ и корней /16/.
Фиг. 7 иллюстрирует развитие проростков хлопчатника, выращиваемого на среде прорастания эмбриона.
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к регенерации посредством культуры ткани растений хлопчатника, в частности растений вида Gossypium hirsutum из соматических клеток в целях разделения их на полях. Клетки необязательно могут быть трансформированы в целях сообщения им чужеродной генетической информации.
В соответствии с настоящим изобретением, используются среды роста, приведенные в табл. 1 - 3.
С использованием любого из приведенных выше растворов приготавливают 1 литр среды способом, описанным ниже. За основу берут 200 мл деионизированной воды и затем добавляют туда различные маточные растворы в количествах, установленных для 1 литра конечной среды. Например, если необходимо 10 мл маточного раствора в конечной среде, то к 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл маточного раствора. Для обеспечения гарантии того, что если останутся в растворе, обычно маточный раствор добавляют в том порядке, как это указано в приведенных выше композициях. После тщательного перемешивания в смесь добавляют дополнительное количество деионизированной воды с тем, чтобы довести раствор до требуемого объема 500 мл, и регулируют значение pH смеси в пределах от 5,8 до 6,0. Конечный объем доводят до 1000 мл, куда затем добавляют агар с культурой ткани, или ее эквивалента в количестве 0,8% масс. Затем смесь обрабатывают в автоклаве в течение 15 - 21 мин под давлением 15 - 21 фунт/дюйм2 (1,05 - 1,47 кг/см2) в целях устранения возможной инфекции, соответствующим образом помечают и оставляют на хранение в качестве стерильной среды.
Короче говоря, семена хлопчатника стерилизуются и высеваются на соответствующую среду для прорастания семян, такую как основная агаровая среда, помещенную в темное место на период времени, достаточный для прорастания семян. Нормальный период роста составляет около 4 недель, обычно от 7 до 14 дней.
Сегменты экспланта вырезаются от проростков. Предпочтительно, чтобы эксплант происходил от гипокотиля или семядоли. По желанию в качестве эксплантов можно также использовать незрелые эмбрионы от плодов, выращивающихся в теплицах, или растений хлопчатника, растущего на полях. Сегменты экспланта культивируются на среде роста для первичного каллюса, предпочтительно, полной питательной среде Мурагиге и Скуга /MS/, содержащей глюкозу. Культивирование происходит при температуре 25 - 35oC с циклом свет/темнота с периодом времени около 16 часов на свету и 8 часов в темноте. При культивировании в систему периодически подается свежая питательная среда в течение приблизительно около 3 - 4 недель до тех пор, пока не образуется недифференцированный каллюс. Затем это каллюс переносят в среду роста для вторичного каллюса, предпочтительно, в MS-среду, дополненную нафталинуксусной кислотой /NAA/ и сахарозой, в качестве углеродного источника, и культивируют в течение трех или четырех месяцев для получения эмбрионов.
Эмбрионы могут быть затем оставлены в среде роста для вторичного каллюса поддержания стадии эмбриона либо перенесены на среду для прорастания растений, такую как среда Бизли и Тинга, содержащую, предпочтительно, гидролизат казеина и источник аммония, после чего эти эмбрионы культивируют в течение 2 - 3 недель до получения проростков.
Эти проростки затем переносят в почву при условиях повышенной влажности, потом пересаживают в большие горшки, помещенные в теплице, и, наконец, высаживают на поля, где они выращиваются до полной зрелости.
Описанные выше способы были успешно использованы для образования соматических эмбрионов у хлопчатника вида Gossypium hirsutum при помощи культуры ткани и суспензионной культуры, чтобы в конечном счете получить зрелые растения из каллюсных культур, полученных от гипокотиля и семядоли для Acala-сортов Gossypium hirsutum, включая SJ2, SJ4, SJ5, B1644, B1810, B2724, CC510 и C1 и включая Acala "пиккер" Sioka и "стриппер" сорт FC 2017. Культуры могут быть трансформированы в нормальные растения с новыми признаками и свойствами.
В частности, данный способ включает стерилизацию семян хлопчатника. Соответствующая стерилизация может быть проведена сначала погружением семян в 95% этанол на 2 - 3 минуты, промываем их в стерильной воде один или несколько раз, потом пропитыванием эти семена 15% раствором гидрохлорита натрия в течение 15 - 20 минут, и, наконец, неоднократным промыванием в стерильной воде.
Стерилизованные семена затем переносятся в первую среду, называемую средой для прорастания семян. Указанная среда для прорастания является средой с нормальным содержанием соли. Подходящей средой для прорастания является среда Уайта или полуконцентрированная MS-среда (концентрация ингредиентов = 1/2). Прорастание происходит в темноте обычно в течение 12 - 14 дней.
Из проросшего семени вырезается, предпочтительно, гипокотиль и/или семядоли, которые разделяются или разрезаются на сегменты и культивируются на среде роста для первичного каллюса, такой как MS-среда, пополненная субстанциями, стимулирующими рост. Предпочтительной для этих целей средой является MS-среда, пополненная около 0,4 мл/л тиаминогидрохлорида, около 30 г/л глюкозы, около 2 мл/л нафталинуксусной кислоты, около 1 мг/л кинетина, регулятором роста и около 100 мг/л инозитола и агара. Тиамингидрохлорид может быть взят в концентрации от 0,1 до 0,5 мг/л, глюкоза - в концентрации от 20 до 30 г/л, нафталинуксусная кислота - от 1 до 10 мг/л, кинетин - около 1 - 2 мг/л и инозитол - около 50 - 100 мг/л.
Эти культуры поддерживаются при температуре около 25 - 35oC, предпочтительно при 30oC с циклом свет/темнота: около 16 ч на свету и около 8 ч - в темноте. Предпочтительно, чтобы интенсивность света составляла около 2000 - 4000 люкс, а более предпочтительно около 3000 - 4000 люкс.
Полученные каллюсы периодически подвергаются субкультивированию с интервалами в 3 - 4 недели, а затем переносятся в свежую среду роста для первичного каллюса. При культивировании эксплантов может иметь место выделение фенольных соединений из эксплантов, что выражается потемнением культуральной среды. В этом случае среду меняют более регулярно. Потемнения можно избежать путем замены культуральной среды через каждые 10 дней. Обычно, после трех- или пятиразовой замены среды фенольные выделения прекращаются. Если это все же происходит, то среду роста для первичного каллюса можно свежей средой роста каллюса, содержащей сахарозу или дополненной сахарозой в качестве источника углеродного питания.
После 3 - 4 недель культивирования на поверхностях вырезанных эксплантов активно развиваются каллюсы. Затем эти каллюсы переносят на свежую поддерживающую питательную среду для вторичного каллюса, которая, предпочтительно, является MS-средой, комбинированной с около 1 - 10 мг/л, а предпочтительно, около 1 - 5 мг/л среды NAA. Цитокинин используется в концентрации от 0 до 1 г/л. Среда для выращивания каллюса является средой с высоким содержанием соли, примерно в 10 раз превышающим содержание соли в среде для прорастания семян. Основное отличие питательных сред для первичного и вторичного каллюсов заключается в источнике углеродного питания. Глюкоза используется для стимуляции фенольной секреции. Тогда как сахароза используется для прекращения этой секреции. Равновесие питательной каллюсной среды может поддерживаться постоянным или меняться.
Полученные каллюсы переносятся с регулярными интервалами времени в свежую среду для выращивания каллюса, и обычно, после 5 - 7 переносов или до тех пор, пока на части каллюсов не будет видна антоцианиновая пигментация, начинает развиваться желтовато-белый эмбриогенный каллюс.
Затем эмбриогенный каллюс выборочно субкультивируют и поддерживают при помощи регулярного субкультивирования. Эмбриогенный каллюс содержит соматические эмбрионы в различных стадиях развития. Некоторые из них могут достигать той стадии развития, при которой они способны вырасти в небольшие проростки. Однако по большей части необходимо дальнейшее выращивание. Некоторые из этих эмбрионов можно продвинуть до стадии прорастания. Другие можно поддерживать в качестве источника эмбрионов для использования их в будущем.
На фиг. 2 показана эта стадия развития каллюсов хлопчатника Acala 10 с соматическими эмбрионами различных размеров 12, некоторые из которых имеют уже появившиеся листья 14 и корни 16. На фиг. 3 изображен соматический эмбрион в более поздней глобулярной стадии.
В соответствии с фиг. 4, дальнейшее развитие может быть достигнуто путем переноса соматических эмбрионов в третью питательную среду, определяемую в настоящем описании как среда для прорастания эмбрионов, среду, богатую азотом, обычно, в виде аммиака или его эквивалента. Подходящей для этих целей средой является среда Бизли и Тинга, предпочтительно, дополненная около 500 мг/л гидролизата казеина.
При прорастании соматических эмбрионов за 2 - 3 недели обычно образуются хорошо развитые проростки /18/ с 6 листьями и хорошо выраженной корневой системой.
На этой стадии развития проростки пересаживают в почву небольшими группами и выращивают в стандартном инкубаторе в условиях повышенной влажности. При этом поддерживается температура порядка 25 - 30oC /см. фиг. 7/.
После некоторого периода роста небольшие растения переносятся в более просторные горшки, помещенные в теплице, а после этого их пересаживают на поле, где выращивают до полной зрелости. Предпочтительно, чтобы все регенерированные растения были самоопыляемыми как во время роста в теплице, так и в полевых условиях, полученные при этом семена собираются. Затем семена проращиваются, и на поле в целях испытания потомственной линии высаживаются 4 - 5-недельные проростки и другие стандартные растения, полученные способом обычного разведения. Описанный выше способ позволяет получить жизнеспособные растения хлопчатника примерно от 35% эксплантов за период от 6 до 8 месяцев.
Пролиферация эмбриогенных клеток хлопчатника в суспензионных культурах
По желанию каллюс может быть разрезан на мелкие кусочки и затем выращиваться в суспензионной культуре.
В этой процедуре нормальная концентрация суспензии составляет около 750 - 1000 мг частей каллюса к 8 мл каллюсной среды роста, например, среды роста для вторичного каллюса (MS-среда, дополненная средой NAA). В предпочтительном осуществлении этого способа суспензия каллюса вводится в Т-пробирки, которые помещаются на барабаны роллера, вращающегося со скоростью 1,5 об/мин при световом режиме 16 часов на свету и 8 часов в темноте. Период роста составляет около 3 - 4 недель.
Через каждые 3 - 4 недели суспензию фильтруют для удаления крупных кусков ткани эмбриогенного каллюса, изображенного на фиг. 5, и для выделения каллюса в поздней глобулярной стадии, изображенного на фиг. 6. Полученный фильтрат снова возвращают в питательную среду для роста на 3 - 4 недели. Эта процедура неоднократно повторяется, в результате чего в период времени 3 - 4 недели собирают крупные агрегаты каллюса, а питательная среда для выращивания каллюса полностью или частично обновляется. Предпочтительно, чтобы на один объем оставшейся суспензии приходилось около или более 4 объемов добавленной свежей среды. Предпочтительно также, чтобы используемый фильтр имел сито с размером отверстия более 600 микрон, а более предпочтительно, более 800 микрон, так как из наблюдений было замечено, что клеточные массы с размерами частиц менее 600 микрон не развиваются в зрелые растения, тогда как клеточные массы с частицами более 600 мк, а предпочтительно, более 800 мк подвергаются достаточной дифференциации для того, чтобы стать эмбриогенным и развиваться в жизнеспособное растение.
Для инициации суспензионной культуры эмбриогенную каллюсную ткань помещают в колбу, такую как колба Дэлонга или колба Эрленмейера, содержащую жидкую питательную среду MS в количестве около 20 мл и NAA в концентрации 2,0 мг/л. Эту колбу помещают на круговую качалку и ее содержимое перемешивают со скоростью 100 - 110 об/мин. Через 3 - 4 недели суспензию фильтруют так, как это было описано выше для выделения крупных агрегатов для дальнейшего выращивания растения.
Обычно после третьей или четвертой субкультивации клеточную суспензию из "Т"-пробирки или колбы Дэлонга или Эрленмейера помещают в агаризованную MS-среду, содержащую NAA (2,0 мг/л) или среду Бизли и Тинга, содержащую гидролизат казеина (500 мг/л) и источник азота. За период 3 - 4 недели эмбриогенные каллюсы развиваются в видимые эмбрионы. Затем более крупные агрегаты помещают в вышеуказанную среду для получения эмбриогенных колоний с последующим развитием эмбрионов.
В обеих способах выращивания суспензионной культуры MS-среда используется для поддержания и/или стимулирования эмбрионов, в то время как среда для прорастания используется для ускоренного развития растения.
Регенерация хлопчатника
Пример 1
Регенерация растений из эксплантов, происходящих от семядоли
Семена хлопчатника Acala вида Gossypium hirsutum /сорт SJ2/ стерилизовали в 95% спирте в течение 3 минут, после чего дважды промывали стерильной водой, погружали на 15 минут в 15% раствор гипохлорита натрия, а затем снова промывали в стерильной воде. Стерилизованные семена проращивали в течение 14 дней на базальной агаровой среде, содержащейся в темноте, для получения проростков. Семядоли этих проростков разрезали на сегменты, размером 2 - 4 мм, которые затем в стерильных условиях переносили на каллюс-продуцирующую среду, содержащую среду Мурасиге и Скуга /MS/ с добавленными в нее основными и второстепенными солями. 0,4 мг/л тиамин-HCl, 30 г/л глюкозы, 2,0 мг/л нафталинуксусной кислоты /NAA/, 1 мг/л кинетина, 100 мг/л m-инозитола и агар /0,8%/. Эти культуры инкубировали при 30oC в инкубаторе Персиваля с флуоресцентным источником света /холодный дневной свет/ с интенсивностью 2000 - 4000 люкс в режиме: 16 часов на свету и 8 часов в темноте.
Через 3 - 4 недели на культивируемых сегментах ткани образуются каллюсы от белого до серо-зеленого цвета. Эти каллюсы субкультивировали каждые три-четыре недели на среде для выращивания каллюсов, содержащей MS-среду, в которую входят 100 мг/л m-инозитола, 20 г/л сахарозы, 2 мг/л нафталинуксусной кислоты /NAA/ и агар. Через 4 - 6 месяцев после первоначального помещения тканевых эксплантов на каллюс-продуцирующую среду образуются соматические эмбрионы. Каллюс и эмбрионы поддерживались на среде для выращивания каллюса путем субкультивирования в свежей среде для выращивания каллюса, которая заменялась каждые 3 - 4 недели.
Соматические эмбрионы, образованные на кусочках ткани, эксплантировали либо на свежую среду для выращивания каллюса, либо на среду Бизли и Тинга /среду для проращивания эмбрионов/.
Образованные от соматических эмбрионов соматические проростки затем переносили в среду Бизли и Тинга, содержащую 1200 мг/л нитрата и 500 мг/л гидролизата казеина в качестве органического источника азота. Среду сгущали при помощи загущающего агента /Гельтрита/ и проростки помещали в камеру Магента.
Соматические эмбрионы развиваются в проростки в течение около трех месяцев. Образовавшиеся проростки примерно 3 - 4 дюймов /около 7,5 - 10,2 см/ высотой, имеющие корни и 6 - 8 листьев, были пересажены в почву и поддерживались в инкубаторе в условиях повышенной влажности в течение трех-четырех недель, а затем перенесены в теплицу. После закаливания растения высаживают в открытый вспаханный грунт.
Пример 2
Процедура, описанная в примере 1, повторялась, но с использованием полуконцентрированной среды MS, в которой концентрация всех компонентов, входящих в эту среду, была снижена наполовину. Полученные результаты были в основном аналогичны предыдущим.
Пример 3
Повторялась процедура, описанная в примерах 1 и 2, за исключением того, что эксплантом были сегменты гипокотиля. Полученные результаты были в основном аналогичны предыдущим.
Пример 4
Повторялась процедура, описанная в примерах 1 и 2, за исключением того, что эксплантом были незрелые зиготические эмбрионы. Полученные результаты были в основном аналогичны предыдущим.
Пример 5
Процедуру, описанную в примерах 1 и 2, повторяли в сортами хлопчатника Acala SJ4, AJ5, AJ2C-1, GC510, B1644, B2724, B1810, пиккер-сорт Siokra и стриппер-сорт FC2017. Все эти растения были успешно регенерированы.
Пример 6
Процедуру, описанную в примере 1, повторяли до получения каллюса, способного образовывать соматические эмбрионы. Затем кусочки весом около 750 - 1000 мг активно развивающегося эмбриогенного каллюса суспендировали в 8 мл жидкой суспензионной среды, содержащей основные и второстепенные соли среды MS, дополненной 0,4 мг/л тиамина-HCl, 20 г/л сахарозы, 100 мг/л инозитола и нафталинуксусной кислоты 2 мг/л в Т-пробирках и помещали на вращающийся со скоростью 1,5 об/мин барабан роллера при режиме свет : темнота = 16 : 8. Источником света служила флуоресцентная лампа /холодный дневной свет/ с интенсивностью света около 2000 - 4500 люкс.
Через 4 недели в целях выделения крупных клеточных агрегатов суспензию фильтровали при помощи нейлонового сита с величиной отверстия 840 микрон. Фракцию менее 840 мкм осаждали и один раз промывали свежей суспензионной культуральной средой. Затем эту суспензию переносили в Т-пробирки /2 мл на пробирку/ и каждую пробирку разбавляли 6 мл свежей суспензионной культуральной средой. Эти культуры поддерживали путем повторения описанной выше процедуры с интервалом 10 - 12 дней. А именно суспензию фильтровали и только фракцию, содержащую клеточные агрегаты менее 840 микрон переносили на свежую суспензионную культуральную среду. Во всех случаях фракции, содержащие клеточные агрегаты, превышающие 840 микрон, помещали на среду для выращивания каллюса для получения зрелых соматических эмбрионов.
Соматические эмбрионы, образовавшиеся на среде для роста каллюса, выделяли и переносили в среду для проращивания эмбрионов, где они прорастали, развивались в проростки и выращивались на поле до зрелых растений по методу, описанному в примере 1.
Пример 7
Процедуру, описанную примере 6, повторяли за исключением того, что суспензионные культуры выращивали путем переноса 750 - 1000 мг эмбриогенных каллюсов в колбу Дэлонга, содержащую 15 - 20 мл жидкой MS-среды, дополненной 2 мг/л NAA. Колбу, содержащую культуру, помещали на круговую качалку, имеющую скорость перемешивания 100 - 110 об/мин. Через три недели суспензию фильтровали при помощи сита с размером отверстий 840 мкм в целях выделения крупных клеточных агрегатов для культивирования растений, как описано в примере 4. Суспензию с частичками меньше 840 микрон осаждали, промывали один раз в жидкой MS-среде и ресуспендировали в 2 - 5 мл жидкой MS-среде. Культуры поддерживали путем повторения этой процедуры с интервалом 7 - 10 дней. При каждом субкультивировании повторному культивированию подвергались только суспензии менее 840 мкм, а крупные агрегаты /840 микрон или более/ использовались для выращивания растений.
Пример 8
После трех или четырех культивирований в соответствии с описанной в примерах 6 и 7 процедурой 1,5 - 2,0 мл клеточной суспензии из Т-пробирок и колбы Дэлонга в каждом случае помещали в агаризованную MS-среду, содержащую 2 мл/л NAA и среду Бизли и Тинга, содержащую 500 мг/л гидролизата казеина. За три-четыре недели эмбриогенные каллюсы с развивающимися эмбрионами становятся видимым. И снова клеточные агрегаты размером 840 мкм и более платировали на среду для выращивания каллюса с целью получения эмбриогенных колоний с развивающимися эмбриогенами, которые в конечном счете образуют растения.

Claims (24)

1. Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток, включающий культивирование экспланта хлопчатника на твердой питательной среде для каллусообразования, содержащей источник углерода, в течение времени, достаточного для развития эмбриогенного каллуса и появления по крайней мере одного эмбриона, перенос эмбриона в среду для регенерации и культивирование на ней до развития ростка, отличающийся тем, что эксплант выделяют из пророщенных семян хлопчатника, твердая питательная среда для каллусообразования в качестве источника углерода содержит глюкозу, культивирование осуществляют до получения первичного каллуса, после чего его переносят на твердую питательную среду, содержащую в качестве источника углерода сахарозу, и культивируют до получения вторичного каллуса.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что семена перед проращиванием стерилизуют вначале в 95%-ном водном растворе этанола, промывают водой и повторно стерилизуют в 15%-ном водном растворе гидрохлорита натрия с последующей промывкой в стерильной воде, после чего осуществляют проращивание на питательной среде до получения всходов в темном помещении.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что проращивание семян осуществляют на базальной агаровой среде не менее 4 недель.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что эксплант выбирают из группы, содержащей гипокотиль, семядолю, их смесь, незрелые зиготные эмбрионы.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что эксплант культивируют до образования эмбриогенного каллуса при 16-часовом световом периоде и 8-часовом темноты при 25 - 30oС.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что культивирование экспланта до образования эмбриогенного каллуса осуществляют при освещенности в световой период 2000 - 4000 лк, предпочтительно 3000 - 4000 лк.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что эксплант культивируют в среде, содержащей глюкозу, в течение времени фенольной секреции с последующей заменой среды, содержащей сахарозу в качестве источника углерода, через 3 - 4 недели, предпочтительно каждые 10 дней.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды для получения первичного каллуса используют среду Мурасиге и Скуга.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вторичный каллус получают на среде Мурасиге и Скуга, содержащей 1 - 5 мг/л НУК.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве питательной среды для регенерации и развития ростка используют среду Бизли и Тинга, обогащенную источником азота.
11. Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток, включающий культивирование экспланта в присутствии питательной среды для каллусообразования до развития эмбриогенного каллуса и последующее культивирование его до регенерации и развития ростка, отличающийся тем, что эксплант выделяют из пророщенных семян хлопчатника, после развития эмбриогенного каллуса его подразделяют и суспендируют на питательной среде и культивируют до образования эмбриогенных агрегатов размером по меньшей мере 600 мкм, выделяют путем фильтрации агрегаты более 600 мкм и культивируют их до образования ростков, при этом агрегаты размером менее 600 мкм ресуспендируют в свежей питательной среде и повторно культивируют в ней до получения эмбриогенных агрегатов нужного размера.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что семена перед проращиванием стерилизуют, промывают в стерильной воде и подвергают повторной стерилизации и промывке.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что семена проращивают на базальной агаризованной питательной среде не менее 14 дней.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что эмбриогенные агрегаты размером более 800 мкм используют для регенерации ростков.
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что суспензионная каллусная культура содержит в начале культивирования 750 - 1000 мг каллусных частей на 8 мл питательной среды.
16. Способ по п.11, отличающийся тем, что эмбриогенный каллус выращивают в суспензии при 16-часовом световом и 8-часовом темновом периоде при 25 - 35oС.
17. Способ по п.11, отличающийся тем, что эмбриогенный каллус выращивают при освещенности в течение светового дня 2000 - 4000 лк, предпочтительно 3000 - 4000 лк.
18. Способ по п.11, отличающийся тем, что эмбриогенный каллус культивируют в питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей нафтилуксусную кислоту.
19. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве питательной среды для регенерации эмбриогенного каллуса и получения ростков используют питательную среду Бизли и Тинга, содержащую гидролизат казеина и источник аммония.
20. Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток, включающий культивирование экспланта хлопчатника в присутствии питательной среды, содержащей источник углевода, до каллусообразования и развития эмбриогенного каллуса, перенос на питательную среду для регенерации и культивирования на ней до получения ростка, отличающийся тем, что в качестве экспланта используют эксплант, выделенный из гипокотиля и/или семядоли, происходящих от проростков и незрелых эмбрионов хлопчатника, при этом осуществляют культивирование экспланта до получения первичного каллуса на питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей в качестве источника углерода глюкозу и дополнительно тиамингидрохлорид, нафтилуксусную кислоту, кинетин и инозитол, при 25 - 35oС, 16-часовом световом периоде с интенсивностью освещения 2000 - 4000 лк и 8-часовом темновом периоде, переносят первичный каллус на среду Мурасиге и Скуга, содержащую в качестве источника углевода сахарозу и дополнительно 1 - 10 мг/л нафтилуксусной кислоты, культивируют при 25 - 35oС, 16-часовом световом периоде при интенсивности света 2000 - 4000 лк до образования эмбриогенного каллуса, после чего осуществляют суспендирование частей эмбриогенного каллуса в свежей питательной среде того же состава до концентрации 750 - 1000 мкм частей каллуса на 8 мл среды и культивируют на этой среде в течение периода времени, достаточного для образования эмбриогенных агрегатов, размером более 800 мкм, которые переносят на среду для регенерации и получения ростков.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что эмбриогенные агрегаты размером менее 800 мкм ресуспендируют в питательной среде с повторным культивированием до получения эмбриогенных агрегатов более 800 мкм.
22. Способ по п.20, отличающийся тем, что питательная среда Мурасиге и Скуга, используемая для получения первичного каллуса, содержит 30 г/л глюкозы, 0,4 мг/л тиамингидрохлорида, 2 мг/л нафтилуксусной кислоты, 1 мг/л кинетина и до 100 мг/л инозитола.
23. Способ по п.20, отличающийся тем, что среда Мурасиге и Скуга, используемая для получения эмбриогенного каллуса, содержит 1 - 5 мг/л нафтилуксусной кислоты и до 1 мг/л цитокинина.
24. Способ по п.20, отличающийся тем, что в качестве питательной среды для регенерации эмбриогенного каллуса и образования ростков используют питательную среду Бизли и Тинга, содержащую до 500 мг/л гидролизата казеина.
SU4614680A 1987-11-18 1988-11-16 Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток (варианты) RU2128428C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12220087A 1987-11-18 1987-11-18
US122200 1987-11-18
PCT/US1988/004116 WO1989005344A1 (en) 1987-11-18 1988-11-16 Regeneration and transformation of cotton

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2128428C1 true RU2128428C1 (ru) 1999-04-10

Family

ID=22401286

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU4614680A RU2128428C1 (ru) 1987-11-18 1988-11-16 Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток (варианты)
RU97121926/13A RU2225882C2 (ru) 1987-11-18 1997-12-30 Способ трансформации хлопчатника, способ получения эмбриогенного каллюса (варианты) и вектор

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU97121926/13A RU2225882C2 (ru) 1987-11-18 1997-12-30 Способ трансформации хлопчатника, способ получения эмбриогенного каллюса (варианты) и вектор

Country Status (16)

Country Link
EP (2) EP0344302B1 (ru)
JP (2) JPH0822196B2 (ru)
KR (3) KR970010757B1 (ru)
CN (3) CN1035799C (ru)
AT (1) ATE178353T1 (ru)
AU (2) AU632038B2 (ru)
BR (1) BR8806136A (ru)
CA (1) CA1337406C (ru)
DE (1) DE3856319T2 (ru)
ES (1) ES2016428A6 (ru)
GR (1) GR1002421B (ru)
IL (1) IL88266A (ru)
PT (1) PT89034B (ru)
RU (2) RU2128428C1 (ru)
WO (1) WO1989005344A1 (ru)
ZA (1) ZA888550B (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0317511A3 (de) * 1987-11-18 1991-10-16 Ciba-Geigy Ag Insektizide Baumwollpflanzenzellen
ES2040174B1 (es) * 1992-02-24 1994-05-01 Consejo Superior Investigacion Metodo para el enraizamiento de estaquillas semileñosas de chirimoyo (anona cherimola mill.) cv. fino de jete, micropropagadas por cultivo de tejidos in vitro.
AUPM379294A0 (en) * 1994-02-10 1994-03-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
CN1056409C (zh) * 1996-10-09 2000-09-13 中国石化扬子石油化工公司 蝴蝶兰组织培养方法
CN1056410C (zh) * 1996-10-09 2000-09-13 中国石化扬子石油化工公司 一种蝴蝶兰组织培养基组合物
DE69711925D1 (de) 1996-12-06 2002-05-16 Innovations L L C Outdoor Spinnerköder, draht und kabel vorfach zum angeln
JPH11311227A (ja) * 1998-02-25 1999-11-09 Wakai & Co Ltd ビス固定補助具
US6710228B1 (en) 1998-05-29 2004-03-23 Mycogen Corporation Cotton cells, plants, and seeds genetically engineered to express insecticidal and fungicidal chitin binding proteins (lectins)
WO1999061635A2 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Mycogen Corporation Cotton cells, plants, and seeds genetically engineered to express insecticidal and fungicidal chitin binding proteins (lectins)
ES2160019B1 (es) * 1998-09-11 2002-05-01 Consejo Superior Investigacion Procedimiento para la propagacion vegetativa y transformacion genetica de tomate, pimiento y otras dicotiledoneas, mediante agrobacterium tumefaciens.
AU777365B2 (en) * 1999-03-10 2004-10-14 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Agrobacterium-mediated transformation of cotton with novel explants
US6483013B1 (en) 1999-05-19 2002-11-19 Bayer Bioscience N.V. Method for agrobacterium mediated transformation of cotton
ATE365218T1 (de) * 1999-05-19 2007-07-15 Bayer Bioscience Nv Verbesserte methode zur agrobakterien- vermittelten transformation von baumwolle
ATE449854T1 (de) * 1999-06-11 2009-12-15 Temasek Life Sciences Lab Ltd Hocheffiziente, durch agrobakterium-vermittelte transformation von baumwoll-pflanzen unter verwendung von blattstielexplantaten
ES2382804T3 (es) 2003-02-12 2012-06-13 Monsanto Technology Llc Evento de algodón MON 88913 y composiciones y procedimientos para su detección
KR100715248B1 (ko) * 2005-10-28 2007-05-09 대한민국 아배양에 의한 개느삼 묘목의 생산방법
BR122017020958B1 (pt) * 2007-05-08 2022-05-10 Monsanto Technology Llc Métodos para melhorar a eficiência da regeneração de planta de algodão
US7858371B2 (en) * 2007-09-26 2010-12-28 Weyerhaeuser Nr Company Method of separating embryo suspension mass
CN102405835A (zh) * 2011-08-23 2012-04-11 中国农业大学 一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基
CN102577980A (zh) * 2012-03-16 2012-07-18 甘肃省农业科学院生物技术研究所 彩棉体细胞胚状体的萌发及成苗方法
AU2020277499A1 (en) * 2019-05-23 2021-12-23 Galy Co. Compositions and methods for plant cell culture
CN115380721A (zh) * 2022-10-09 2022-11-25 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种高效的棉花转基因植株嫁接技术

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4672035A (en) * 1984-03-16 1987-06-09 Research Corporation Controlled regeneration of cotton plants from tissue culture
EP0207965A4 (en) * 1984-12-13 1987-06-17 Bioteknika International VECTOR FOR PLANT TRANSFORMATION.
AU590597B2 (en) * 1985-08-07 1989-11-09 Monsanto Technology Llc Glyphosate-resistant plants
EP0243469A4 (en) * 1985-10-22 1988-02-16 Plant Genetics Inc IMPROVED SOMATIC ENBRYOGENESIS METHODS AND AGENTS.
US5004863B2 (en) * 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
TR27832A (tr) * 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
EP0317512B1 (de) * 1987-11-18 1992-08-05 Ciba-Geigy Ag Eine leistungsfähige Methode, Baumwolle aus kultivierten Zellen zu regenerieren
EP0317511A3 (de) * 1987-11-18 1991-10-16 Ciba-Geigy Ag Insektizide Baumwollpflanzenzellen

Also Published As

Publication number Publication date
CN1035799C (zh) 1997-09-10
CN1032111C (zh) 1996-06-26
DE3856319T2 (de) 1999-07-15
AU668915B2 (en) 1996-05-23
PT89034B (pt) 1994-08-31
AU632038B2 (en) 1992-12-17
BR8806136A (pt) 1989-08-15
AU3528493A (en) 1993-05-20
EP0344302A1 (en) 1989-12-06
GR1002421B (el) 1996-08-22
KR100303729B1 (ko) 2001-12-17
IL88266A (en) 1998-03-10
ZA888550B (en) 1989-08-30
KR100198008B1 (en) 1999-06-15
JPH02502253A (ja) 1990-07-26
KR970010757B1 (ko) 1997-06-30
AU2926689A (en) 1989-07-05
CA1337406C (en) 1995-10-24
IL88266A0 (en) 1989-06-30
EP0344302A4 (en) 1991-09-25
GR880100761A (el) 1994-03-31
CN1034298A (zh) 1989-08-02
ATE178353T1 (de) 1999-04-15
JPH0822196B2 (ja) 1996-03-06
CN1070310A (zh) 1993-03-31
EP0899341A3 (en) 1999-04-21
ES2016428A6 (es) 1990-11-01
JPH084434B2 (ja) 1996-01-24
EP0344302B1 (en) 1999-03-31
JPH0765A (ja) 1995-01-06
DE3856319D1 (de) 1999-05-06
CN1032401C (zh) 1996-07-31
KR890701729A (ko) 1989-12-21
WO1989005344A1 (en) 1989-06-15
CN1070309A (zh) 1993-03-31
PT89034A (pt) 1989-11-30
RU2225882C2 (ru) 2004-03-20
EP0899341A2 (en) 1999-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2128428C1 (ru) Способ регенерации хлопчатника из соматических клеток (варианты)
US4217730A (en) Embryogenesis of gymnosperm forest trees
US4665030A (en) Process for regenerating corn
Eccher et al. Comparison between 2iP and zeatin in the micropropagation of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum)
Mori et al. Callus formation and plant regeneration in various Lilium species and cultivars
Mikuła et al. Somatic embryogenesis of Gentiana genus I. The effect of the preculture treatment and primary explant origin on somatic embryogenesis of Gentiana cruciata (L.), G. pannonica (Scop.), and G. tibetica (King)
Qureshi et al. Adventitious shoot induction and somatic embryogenesis with intact seedlings of several hybrid seed geranium (Pelargonium x hortorum Bailey) varieties
Farzana et al. Somatic embryogenesis in papaya (Carica papaya L. cv. Rathna)
Georges et al. Plant regeneration from aged-callus of the woody ornamental species Lonicera japonica cv.“Hall's Prolific”
JP2007528197A (ja) 綿植物を生産するための組織培養法
RU2080780C1 (ru) Способ клонального микроразмножения растений
Mezghani et al. Morpho-histological study on shoot bud regeneration in cotyledon cultures of pepper (Capsicum annuum)
JP2001511652A (ja) サトウキビの生産
US6555375B1 (en) Methods for somatic embryo formation and plant regeneration of Beta vulgaris
CA2423393C (en) Methods for producing high yields of zygotic-like cotyledonary pine embryos utilizing media that include a disaccharide and glucose
Srivastava et al. Direct in Vitro Shoot Regeneration of Cicer Arietinum L. from Decapitated Embryo Axes Explants.
RU2152150C1 (ru) Способ получения оздоровленного in vitro посадочного материала gerbera jamesonii bolus
PAKYÜREK et al. A research on micropropagation of Pixy rootstock
WO2002001940A2 (en) A method of generating fertile plants from isolated microspores
James et al. Paeonia species (tree peonies)
Gawel et al. Somatic embryogenesis in cotton (Gossypium spp.)
AU2003203636B2 (en) Methods for producing cotyledonary pine embryos utilizing a gibberellin
RU2037289C1 (ru) Способ отбора трансформантов томата
Sedlak et al. Protocol for in vitro shoot multiplication of ancient pear cultivars and landraces
RU2333633C2 (ru) Способ получения высоких урожаев зиготоподобных семядольных зародышей сосны с использованием сред, содержащих дисахарид и глюкозу (варианты)