KR100303729B1 - 면화의형질전환방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면화의 식물 재생 및 형질 전환 방법, 특히 고시퓸 히르스텀 엘. (Gossypium hirsutum L.)종의 면화의 재생 및 형질 전환 방법에 관한 것이다.
Description
[발명의 명칭]
면화의 형질 전환 방법
[도면의 간단한 설명]
제1도는 형질 전환의 확립 영역을 나타내는 조직 배양 기술에 의해 종자로부터 면화 작물을 발육시키는 바람직한 방법을 도식적으로 제시하고 있다.
제2도는 잎(14)과 뿌리(16)를 포함하여 여러 발육 단계에서 체세포 배(12)를 가진 면화의 배형성 가피(10)를 나타내는 사진이다.
제3도는 제2도에 도시된 배형성 가피 배양체를 형성하도록 분리된 후기 구형단계의 체세포 면화 배를 나타내는 사진이다.
제4도는 제2도와 관련하여, 배 발아 배지상에서 발육하고 있는 배 및 어린 묘목(18)을 나타내는 사진이다.
제5도는 면화의 현탁 배양체로부터의 배형성 세포의 작은 클럼프를 나타내는 사진이다.
제6도는 현탁 배양체로부터의 구형 단계의 배를 나타내는 사진이다.
제7도는 잎(14)과 뿌리(16)가 출현하는 것을 나타내는 현탁 배양체로부터 얻어진 발아하는 배를 나타내는 사진이다.
제8도는 배 발아 배지상에서 자라고 있는 면화 묘목의 발육을 나타내는 사진이다.
제9도 내지 제15도는 면화의 유전적 형질전환을 도시한 것으로,
제9도는 카나마이신 내성에 대한 유전자를 포함하는 형질전환된 면화 세포로부터의 세포 콜로니(20)의 발육을 나타낸다.
제10도는 항생제-보충 배지상에서 제9도의 선별된 항생제 내성 세포로부터 자라고 있는 체세포 배를 나타낸다.
제11도는 제초제 글리포세이트에 대해 내성을 부여하는 유전자를 포함한 형질전환된 체세포 배의 발아를 나타낸다.
제12도는 제11도의 배로부터 발육된 면화의 묘목을 나타낸다.
제13도는 잎(14)과 뿌리(16)가 발육되는, 인시류 곤충에 대한 내성이 부여되도록 형질전환된 체세포 배의 발아를 나타낸다.
제14도는 제13도의 배로부터 발육된 묘목을 나타낸다.
제15도는 카나마이신에 대한 내성을 나타내는 형질전환된 배에서 발육된 시오크라(Siokra)종의 묘목을 나타낸다.
제16도는 Bt 프로톡신 유전자의 5′ 말단을 포함하는 플라스미드, mp 19/bt의 구성을 나타낸다.
제17도는 Bt 프로톡신 암호 서열의 5′ 말단에 융합된 CaMV 유전자 VI 프로모터를 포함하는 플라스미드, mp 19/bt ca/del의 구성을 나타낸다.
제18도는 CaMV 전사 말단 시그널에 융합된 프로톡신의 3′ 암호 부위를 갖는 플라스미드 p702/bt의 구성을 나타낸다.
제19도는 CaMV 프로모터와 말단 서열에 인접한 완전한 프로톡신 암호 서열을 포함하는 pBR322/bt 14의 구성을 나타낸다.
제20도는 pRK252/Tn903/BglII의 구성을 나타낸다.
제21도는 pCIB 5의 구성을 나타낸다.
제22도 및 제23도는 pCIB 4의 구성을 나타낸다.
제24도는 pCIB 2의 구성을 나타낸다.
제25도는 T-DNA 경계와 식물 선별 유전자를 포함하는 넓은 숙주 범위의 플라스미드, pCIB10의 구성을 나타낸다.
제26도는 pCIB10/19Sbt의 구성을 나타낸다.
제27도는 pCIB 710의 구성을 나타낸다.
제28도는 pCIB10/710의 구성을 나타낸다.
제29도는 pCIB10/35Sbt의 구성을 나타낸다.
제30도는 pCIB10/35Sbt(KpnI)의 구성을 나타낸다.
제31도는 pCIB10/35Sbt(Bc1I)의 구성을 나타낸다.
제32도는 pCIB10/35Sbt(607)의 구성을 나타낸다.
제33도는 벡터 DEI PEP10의 구성을 나타낸다.
제34도는 버티시륨(Verticillium) 침습 농지에서 자라는 면화 재생체로 조성된 시험 농지의 사진이다.
제35도는 제33도에 나타낸 시험 농지내 재생된 SJ4 식물의 후대를 나타내는 사진이다. 버티시륨 진균에 대한 내성이 개선된 소마클로날 변이체는 화살표로 표시하고 있다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 목적]
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
본 발명은 면화의 식물 재생 및 형질 전환 방법, 특히 고시퓸 히르스텀 엘.(Gossypium hirsutum L.)종의 면화의 재생 및 형질 전환 방법에 관한 것이다.
최근 여러가지 분류군에 속하는 식물로부터의 다양한 기원의 많은 조직들이 시험관내 조직 배양으로 확립되었다. 그 배양체들의 생장과 분화를 조절하는 몇가지 인자가 또한 결정되어 있다. 직접, 간접으로, 단독 또는 상승 작용 조합으로 작용하는 여러가지 그룹의 식물 호르몬과 식물 생장 조절제간의 미묘한 상호 작용의 확립으로 세포, 조직 및 기관중에 존재할 수 있는 특정 상호 관계를 어느 정도 간파하게 되었다. 그러나 그 정보는 결코 완벽하지 않다.
얼마 동안은, 식물 세포 배양체는 비분화 증식 상태에서 무한히 유지될 수 있다는 것으로 알려져 있다. 그러나, 최근, 조직, 기관 또는 전체 식물 유기체의 재분화가 실험적으로 유도될 수 있다는 것이 밝혀졌다. Skoog의 “Chemical regulation of growth and organ formation in plant t issues cultured in vitro”, Symp. Soc. Exp. Biol. 11:18-130, 1958(본 명세서에 참고로 인용됨)에 의하면 옥신(auxin)에 대한 시토키닌(cytokinin)의 상대적 비율이 담배 심부 조직내 기관 형성의 특성을 결정함이 입증되었다. 가피(假皮, Callus) 배양체로부터의 재조직화 또는 재생은 원시세포 또는 배의 형성을 포함하는데, 양자는 궁극적으로 시험관내에서 묘목 발육을 유도한다.
배형성에 대한 조직 형성의 경향은 관련된 종 및 화학적 및/또는 물리적인 특정 유발 인자의 존재에 달려있다.
1902 년에 Haberlandt 는 “Kulturversuche mit isolierten pflanzenzellen”, Mat. KI. Kais, Akad, Wiss, Wien 111:62(본 명세서에 참고로 인용됨)에서는 식물 세포가 완전한 식물을 생성할 수 있는 능력을 가지는 것으로 가정하고 이것이 언젠가는 세포 배양체에서 입증될 것이라고 예측하였다. 1965 년, Reinert의 “Untersuchungen uber die morphogenese an Gewebekulturen”, Ber. dt. Bot. Ges. 71:15와 Steward 등의 “Growth and organized development of cultured cells/II. Organization in cultures grown from freely suspended cells” Am. J. Bot. 45:705-708은 별도 작업 결과, 시험관내에서 체세포 배형성의 발생을 확인하였다. 상기 두문헌은 본 명세서에 참고로 인용되어 있다. 체세포 배형성을 실험적으로 조작하는데 있어 배양 배지의 두 성분, 옥신과 질소원은 결정적인 역할을 하는 것으로 사료된다.
체세포 배형성의 과정은 두 단계로 일어나는 것으로 발혀졌다 : 먼저, 고 농도의 옥신 존재하에 배발생능을 가진 세포를 유도하고; 다음, 저 농도의 옥신의 존재 또는 부재하에서 배세포를 배로 발육시킨다.
기관형성 또는 배형성의 유발은 가피내 뚜렷한 구조적 패턴을 유도한다. 몇가지 식물종에 대한 상세한 연구에 의하여 특정한 재생화로부터 발아, 싹 또는 배의 발육을 유도하는 발육 경로를 만들어 낼 수 있게 되었다.
기관형성 또는 배형성을 통해 식물의 재생화에 조직 배양 기법을 적용시키는 것은 상업적인 면에서 형태발생학의 기초 연구에 가장 중요한 기여를 하고 있는 것으로 보인다.
Beasley는 1971 년에 “In Vitro culture of fertilized cotton ovules,” Bioscience 21:906:907, 1971(본 명세서에 참고로 인용됨)에서 면화의 배주 배양체에서의 가피 형성을 보고하였다. 그 후에, Hsu 등의 “Callus induction by (2-Chlorethyl) phosphonic(CPA) acid in cultured cotton ovules,” Physiol. Plant 36:150-153, 1976(본 명세서에 참고로 인용됨)은 그 배지에 CAP와 기베렐산을 첨가함으로써 배주로부터 얻은 가피의 생장 촉진을 관찰하였다.
(a) 잎(Davis 등., “In Vitro culture of callus tissues and cell suspensions from okra(Hibiscus esculentus) and cotton (Gossypium hirsufum)”, In Vitro 9:395-398, 1974)(본 명세서에 참고로 인용됨);
(b) 배축(Schenk 등. “Medium and technique for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cerll culture,” Can. J. Bot. 50:199-204, 1972(본 명세서에 참고로 인용됨)); 및
(c) 떡잎(Rani 등. “Establishment of Tissue Cultures of cotton,” Plant sci. Lett. Y:163-169, 1976(본 명세서에 참고로 인용됨))과 같은 다른 체외 이식조직으로부터의 가피 배양체가 고시퓸 히르수텀과 고시퓸 아르보럼(G. arboreum)에 있어서 확립되었다.
Katterman 등의 “The influence of a strong reducing agent upon initiation of callus from the germinating seedlings of Gossypium barbadens e,” Physiol. Plant 40:98-101, 1977(본 명세서에 참고로 인용됨)은 고시퓸 바르바덴세(G. Barbadense)의 떡잎으로부터의 밀집된 가피가 뿌리를 형성하며, 일례로는, 완전한 식물의 재생이 또한 이루어졌음을 보고하고 있다. Smith 등의 “Defined conditions for the initiation and growth of cotton callus in vitro, Gossypium arboreum,” In vitro 13:329-334, 1977(본 명세서에 참고로 인용됨)은 고시퓸 아르보럼의 배축-유래된 가피의 발단 및 아배양의 조건을 결정하였다. 연이어서, Price 등의 “Callus cultures of six species of cotton(Gossypium L) on defined media,” P1 Sci. Lett. 8:115-119, 1977, 및 “Tissue culture of Gossypium species and its potential in cotton genetits and crop improvement,” Beltwide Cotton Production Research Conference Proc. pp.51-55, 1977, of the National Cotton Council, Memphis(본 명세서에 참고로 인용됨)은 고시퓸의 5개 종으로부터의 가피의 발단 및 아배양의 조건을 규정하였다.
많은 식물종의 배양을 확립함에 있어서의 공통적인 문제점중 하나는 배양 배지중에서 체외이식조직(explant)의 “갈변화(browning)”이다. 면화에서, 이러한 폴리페놀의 침출(leaching)은 슈크로즈를 글루코즈로 대체하고, 그 배양체를 10 일마다 새로운 배지로 옮겨줌으로써 극복되었다. 글루코즈 보충 배지상에서 3 또는 4 대 계대후, 그 갈변화는 완전히 사라지고 그 배양체는 다시 슈크로즈 보충 배지로 옮겨 놓을 수 있었다. 특정 고시퓸종에 있어서 아배양중에 가피의 유발, 갈변화, 유지와 관련한 어려움이 극복되기는 하였지만 가피 배양체로부터 식물을 재생하기 위한 모든 시도는 실패로 끝났거나 몇가지의 시간 소요의 단계가 관련되어 있다. Davidonis와 Hamilton “Plant L. Plant Sci. Lett. 32:89-93, 1983(본 명세서에 참고로 인용됨)는 배양개시 2 년후, 배의 형성을 보고하였다.
천연 식물 호르몬 및 합성 생장 조절 화합물과 같은 많은 생장 물질들이 시험관내에서 식물 재생을 일으키도록 조직 배양체 배지중에서 사용되어 왔다고는 하지만, 식물 재생에 대한 여러 물질의 효과의 보편화가 이루어지지는 않았다. 실제로, 동일한 물질이 여러 다른 식물종에 적용될 때 생장을 억제, 생장을 향상시키거나 또는 아무런 효과를 나타내지 않을 수도 있다. 그러므로, 어떤 표준 방법과는 별도로, 어떤 새로운 종에 있어 식물 재생에 대한 작업 조서를 만드는 것과, 식물형질 전환을 위한 더욱 난이한 과제들이 계속 남아있다.
본 발명은 묘목으로부터 절단한 분체로부터 면화 작물을 급속히 재생시키는방법을 제공한다. 서술된 방법은 높은 재현도와 신빙도를 제공하며 면화 작물의 유전적 형질전환을 가능케한다.
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
체세포로부터 면화 작물을 임의적으로 형질전환시키는 것과 함께 재생시키는 방법이 제공되어 있다.
종자를 멸균시켜 어두운 곳에서 묘목으로 성장시킨다. 그 묘목은 체외이식조직, 대개는 배축과 떡잎의 공급원이 된다. 기타 공급원으로는 발육중인 과실의 미숙한 접합자 배가 있다. 체외이식조직을 세분하여, 페놀이 분비되며, 분열하여 증식하도록 체외이식조직의 세포를 자극하는 배양 배지상에서 체외이식조직으로부터 가피가 발생할 동안 일차 가피 생장 배지(글루코즈 함유)에서 배양시킨다. 그 가피는 페놀 분비 단계를 거친후, 새로운 가피 생장 배지(슈크로즈 함유)로 전이되어 배형성 가피로 발육된다. 그후, 배는 더욱 많은 배형성 가피를 만들어 내도록 아배양되거나 또는 다른 생장 배지(식물 발아 배지)로 옮겨져서 묘목이 될 충분한 기간동안 배양되어 이후, 생장 기간을 거친 후 온실 및 그후 밭으로 옮겨져서 종자가 수확될 수 있는 성숙 식물로 성장시킬 수 있다.
그 배는 또한 현탁액중에서 배양될 수도 있다. 이 과정에서, 생장 기간후, 크기가 약 600 마이크론 이상, 바람직하게는 약 800 마이크론 이상의, 배함유 배형성 클럼프(clump)는 분리되어 식물 생성에 사용된다. 보다 작은 가피는 식물 형성가피로 배양시키기 위해 가피 생장 배지로 회송되거나 또는 배공급원으로 유지된다.
형질전환은 체외이식조직, 가피 또는 현탁액 발육 단계에서 일어날 수 있다. 형질전환 과정은 체외이식조직, 가피 및/또는 배형성 가피를 그 세포로 유전자가 전이되기에 충분한 시간 동안 면화에 대해 외인성의 형질발현 가능한 유전자 서열이 함유된 아그로박테리움(Agrobacterium) 벡터의 영향하에 노출시키는 것을 포함한다. 그 후, 잔류 아그로박테리움은 그것에 독성인 항생제로 사멸시킨다. 그 다음에는 형질전환된 묘목으로 발육시키기 위한 형질전환된 세포 및/또는 배형성 가피를 선별한다. 현탁 배양체에서, 형질전환 및/또는 선별은 그 세포 및 배형성이 되기에는 지나치게 미숙한 가피로부터 배형성 가피를 분리하기 이전 또는 이후에 수행할 수 있다.
독특한 표현형 특성의 식물이 수득될 수 있으며 일반적으로 식물 세포 생장을 억제하는 항생제에 대해 내성을 갖는 신규 면화 작물, 제초제, 진균 병원체에 대한 내성 또는 용인성이 증대된 면화 작물 및 수확율이 높고 파이버 품질이 개선된 면화 작물이 제공된다.
[발명의 구성 및 작용]
본 발명은 농지에서 번식시키기 위해 체세포로부터 면화 작물, 특히 고시퓸 히르수텀종 식물을 조직 배양에 의해 재생시키는 방법에 관한 것이다. 임의로, 그 세포는 외래 유전 정보를 포함하도록 형질전환될 수 있다.
본 발명에 유용한 여러 생장 배지는 다음과 같다 :
[종자 발아 생장 배지]
변형 화이트 스톡 용액(White′s stock solution)의 조성
(Phytomorphology 11 : 109-127, 1961 참조)
[가피 생장/보존 배지]
MURASHIGE & SKOOG(MS) 스톡 용액의 조성
(Physiol. Plant 15:473-497, 1962 참조)
[식물 발아 배지]
BEASLEY와 TING′S 스톡 용액의 조성
(Am. J. Bot. 60 : 130-139, 1973 참조)
상기 용액에 관해서는, 하기 과정을 이용하며 1l의 배지를 제조한다. 베이스로서 200ml의 탈이온수가 제공되며 여러 가지 스톡 용액을 1l에 대하여 언급된 양으로 첨가한다. 예컨대, 최종 배지에 10ml의 스톡을 사용하여야 할 때, 10ml의 스톡을 200ml의 탈이온수에 가한다. 용액중에서 그 염이 유지되도록 하기 위해서는, 스톡 용액을 보통 상기 식에서 제시된 순서로 가한다. 철저히 혼합한 후, 부가적 탈이온수를 그 혼합물에 첨가하여 이것이 500ml가 되게하고 pH는 약 5.8 내지 6.0이 되도록 조절한다. 최종 부피는 1,000ml가 되며 보통 조직 배양 아가 또는 그것의 등가물을 약 0.8 중량%로 가한다. 이것은 용액의 유동성을 감소시키는 약간의 고형성을 용액에 부여하기 위한 것이다. 그 혼합물을 15-21 lbs/in2의 압력에서 약 5 내지 20분간 오토클래이브하여 오염 유기체를 사멸시킨 후, 적절히 라벨하여 멸균 배지로서 보관한다.
간단히, 면화 종자를 멸균시켜 묘목이 생성되기에 충분한 기간 동안 어두운 곳에서 기본 아가 배지와 같은 적합한 종자 발아 배지상에서 발아시킨다. 정상적인 생장 기간은 약 4주 이하이며 통상 7 내지 14일이다.
체외이식조직의 분체를 묘목에서 절단해낸다. 그 체외이식 조직은 배축이나 떡잎으로부터 유래되는 것이 바람직하다. 대안 방법으로는 체외이식조직으로서 온실의 자라고 있는 과실 또는 농지의 면화 작물로부터 얻어진 미성숙 배를 마찬가지로 사용할 수 있다. 체외이식조직 분체를 적합한 일차 가피 생장 배지, 바람직하게는 글루코즈 함유의 Murashige and Skoog(MS) 영양 배지 일부 또는 전체에서 배양한다. 약 25 내지 약 35℃ 온도에서 약 16 시간의 광과 약 8 시간의 단광의 광/단광의 사이클로 생장시킨다. 영양원이 소모되는 주기대로 배지를 교체해주고 약 3 내지 약 4 주, 또는 미분화된 가피가 형성될 때까지 계속 배양시킨다. 그 가피를 이차 가피 생장 배지, 바람직하게는 탄소원으로써 나프탈렌아세트산(NAA)과 슈크로즈가 보충된 MS 배지로 옮겨서 3 내지 4 개월간 배가 형성되도록 배양시킨다.
그 배는 이차 가피 생장 배지에 유지시켜 배 공급을 계속하거나 또는 바람직하게는 카제인 가수분해물과 암모늄원을 포함하는 Beasley and Ting 배지와 같은 식물 발아 배지로 옮겨서 묘목이 되도록 2 내지 3 주간 배양할 수 있다.
그 묘목을 고습도의 조건하에 토양으로 옮긴 후, 온실에서 큰 화분에 이식하고 최종적으로는 성숙하도록 농지로 옮겨준다.
조직 및 현탁액 배양에 의해 고시퓸 히르수텀종의 면화에서 체세포 배형성을 유도하여, 궁극적으로는 SJ2, SJ4, SJ5, B1644, B1810, B2724, GC510과 C1을 비롯한 고시퓸 히르수텀의 아카라(Acala) 변종과 비아카라 “피커(picker)” Siokra와 “스트립퍼(stripper)” 변종 FC2017의 배축과 떡잎 유래의 가피 배양체로부터 성숙 식물을 얻기 위하여 본 명세서에서 간단하게 기술되는 방법이 성공적으로 사용되어 왔다.
배양체는 새로운 특징이나 특성을 갖는 정상 식물로 형질 전환되었다.
더욱 특히, 그 과정은 먼저 면화 종자의 멸균을 포함한다. 적합한 멸균은 2 내지 3 분간 95% 에탄올에 그 종자를 담그고 1 회 이상 멸균수로 헹군 후 15 내지 20 분간 15% 소듐 히포크로라이트 용액으로 그 종자를 적신 후 여러번 멸균수로 헹구는 것으로 이루어질 수 있다.
멸균 종자를 종자 발아 배지로 불리는 일차 배지로 옮긴다. 종자 발아 배지는 일반적인 염 함유물중의 하나이다. 적합한 발아 배지는 기본 아가 배지로, 화이트 배지 또는 반 강도(1/2 성분 강도)의 MS 배지가 이에 포함된다. 발아는 일반적으로 약 12 내지 약 14 일간 어두운 곳에서 일어난다.
배축 및/또는 떡잎을 바람직하게는 발아된 종자에서 절단하며 세분하거나 분체로 분할하여 생장 성분이 보충된 MS 배지와 같은 일차 가피 생장 배지상에서 배양한다. 현재 바람직한 배지는 약 0.4 mg/l의 티아민 히드로클로라이드, 약 30g/1의 글루코즈, 약 2 mg/l의 나프탈렌아세트산, 약 1 mg/l의 키네틴, 통상의 생장 조절제 및 약 100 mg/l의 이노시톨과 아가가 보충된 MS 배지이다. 티아민 히드로클로라이드는 일반적으로 0.1 내지 약 0.5 mg/l의 농도 범위이며, 글루코즈는 약 20 내지 약 30 g/l 이며, 약 1 내지 약 10 mg/l의 나프탈렌 아세트산, 약 1 내지 약 2 mg/l의 키네틴과 약 50 내지 약 100 mg/l의 이노시톨이 포함된다.
그 배양체를 약 25 내지 약 35℃의 온도, 바람직하게는 약 30℃에서 약 16시간의 광 및 약 8 시간의 단광의 광/단광 사이클로 유지시킨다. 약 2000 내지 4000 룩스의 광도가 바람직하고 더욱 바람직하게는 약 3000 내지 4000 룩스가 사용된다.
형성된 가피는 3 내지 4주 간격으로 주기적으로 아배양되고 새로운 일차 가피 생장 배지로 옮겨진다. 체외이식조직을 배양함에 있어서, 체외이식조직으로부터의 페놀성 화합물의 분비가 일어날 수 있는데, 이는 배양 배지의 암화(darkening)에 의해 입증된다. 이 경우, 배지를 더욱 정규적으로 교체해준다. 암화는 그 배양 배지를 10 일 마다 교체해줌으로써 극복되었다. 일반적으로 3 내지 5 회의 배지 교체후, 페놀성 분비가 사라진다. 이것이 일어날 때, 일차 가피 생장 배지는 탄소원으로 슈크로즈가 포함되거나 보충된 새로운 가피 생장 배지로 교체될 수 있다.
3 내지 4 주 배양후, 활성 가피가 체외이식조직의 절단면에서 발육된다. 그 후 그 가피를 약 1 내지 10 mg/l, 바람직하게는 약 1 내지 약 5 mg/l의 NAA가 배합된 MS 배지와 같은 새로운 이차 가피 생장 배지로 옮긴다. 시토키닌이 0 내지 약 1 g/l의 농도로 사용된다. 가피 생장 배지는 종자 발아 배지보다 염을 10 배 이상 더 포함하는 높은 염 함량의 배지인 것이 그 특징이다. 일차 및 이차 가피 생장 배지 사이의 주요한 차이는 탄소원이다. 글루코즈는 페놀 분비 기간중에 사용되고 슈크로즈는 그 분비가 멈출 때 사용된다. 가피 생장 배지의 기타 성분들은 똑같이 유지되거나 또는 변화될 수 있다.
그 가피는 규칙적인 주기로 새로운 가피 생장 배지로 옮기며, 일반적으로 약 5 내지 7 회 교체후 또는 안토시아닌 색소가 그 가피의 일부분에 나타난 후, 황백색 배형성 가피의 발육이 나타난다.
그후, 배형성 가피를 선별하여 아배양시키며 규칙적인 아배양으로 유지시킨다. 배형성 가피는 여러 발육단계에서 체세포 배를 포함한다. 일부는 작은 묘목으로 생장할 수 있는 발육점에 도달할 수 있다. 그러나 대부분은 더욱 발육되어야 할 필요가 있는 것들이다. 일부는 발아로 진행될 수도 있다. 다른 것들은 앞으로의 사용을 위해 배의 공급원으로 보존될 수 있다.
제2도는 여러 상이한 크기의 체세포 배(12)가 있는 아카라 면화(10)의 가피를 나타내는 발육 단계를 도시한 것으로 그 일부는 잎(14)과 뿌리(16)가 출현하고 있는 것이 보인다. 제3도는 후기의 구형 단계에서 분리된 체세포 배를 나타낸다.
제4도에 관련하여, 일반적으로 암모니아 또는 그 등가물 형태로 질소가 풍부한 배 발아 배지로 불리는 삼차 생장 배지로 옮겨줌으로써 더욱 발육이 이루어질 수 있다. 그 배지의 적합한 배지는 Beasley and Ting 배지, 바람직하게는 약 500 mg/l의 카제인 가수분해물이 보충된 배지이다.
발아는 체세포 배로부터 발생하며, 2 내지 3 주내에, 6 개 이하의 잎과 좋은 뿌리 시스템이 달린 잘 발육된 묘목(18)이 형성된다.
이 단계에서, 그 묘목을 작은 클럼프중의 흙으로 옮기고서 고습도 조건하에 표준 인큐베이터에서 생장시킨다. 온도는 대개 약 25 내지 약 30℃로 유지된다(제7도 참조).
생장 기간후, 작은 식물을 온실의 큰 화분으로 옮긴 후 밭으로 다시 옮겨서 성숙할 때까지 생장시킨다. 모든 재생 식물은 바람직하게는 온실에서 또는 밭 조건하에서 생장시 자가 수분 작용을 한다. 종자를 수거한 후, 발아시켜 4 내지 5 주생 묘목을 자손 시험 및 다른 표준 식물 육종을 위해 밭으로 옮긴다. 상기 과정을 실시하여 약 6 내지 약 8 개월의 기간 동안 약 35%의 체외이식조직으로부터 생육성 면화 작물을 얻는다.
[현탁 배양체에서의 배형성 면화 세포의 증식]
배형성 가피를 식물로 발육시키기 위한 다른 대안으로, 그 가피를 작은 조각으로 절단하고 현탁 배양법을 이용하여 더욱 발육시킬 수도 있다. 이 과정에서, 현탁 농도는 이차 가피 생장 배지(NAA가 보충된 MS 배지)와 같은 8 ml의 가피 생장 배지에 대하여 약 750 내지 1000 mg의 가피로 하고 현탁액중에서 배양시킨다. 바람직한 실례에서 가피의 현탁액을 T-튜브에 넣고 약 16 시간의 광 및 약 8 시간의 단광의 광 영역하에서 약 1.5 rpm으로 회전하는 로울러 드럼상에 놓는다. 약 3 내지 4 주간 성장시킨다.
약 3 내지 4 주후, 현탁액을 여과하여 제5도에서 군으로 도시되고 제6도에서 후기 구형 단계에서 분리된 배형성 가피의 큰 세포 클럼프를 제거한다. 그 여액을 영양 배지로 옮겨 3 내지 4 주간 생장시킨다. 이 과정을 약 3 내지 4 주 간격으로 큰 클럼프를 수확할 동안 반복하며 이 때 배지는 새로운 가피 생장 배지로 전체 또는 일부 교체한다. 약 4 용적 이상의 새로운 배지를 약 1 용적의 잔류 현탁액에 가하는 것이 바람직하다. 사용된 필터는 약 600 마이크론 이상, 바람직하게는 800 마이크론 이상의 메쉬 크기를 가지는 것이 현재 바람직한데, 600 마이크론 이하의 입자 크기의 세포는 식물로 발육되지 않지만, 600 마이크론 이상의 세포, 바람직하게는 800 마이크론 이상의 세포는 배형성이 되어 생육성 작물로 발육되기에 충분한 분화를 거친다는 것이 관찰되었기 때문이다.
배형성 가피를, 2.0 mg/l 농도의 NAA 및 MS 약 20 ml의 양으로 액체 배배양 배지를 포함하는 DeLong 또는 Erlenmeyer 플라스크와 같은 플라스크에 옮겨줌으로써 현탁 배양을 개시할 수 있다. 그 플라스크를 자이로토리 진탕기상에 놓고 약 100-110 스토로크/분으로 진탕한다. 3 내지 4 주후, 현탁액을 전술한 바와 같이 적합하게 여과시켜 식물 발육을 위해 큰 세포 클럼프를 분리시킨다.
더욱 전형적으로는, 삼차 또는 사차 아배양후, “T” 튜브 또는 드롱 또는 엘레마이어 플라스크로부터의 세포 현탁액을 NAA(2.0 mg/l)가 함유된 아가-고화된 MS 배지 또는 카제인 가수분해물(500 mg/l) 및 질소원이 함유된 비슬리 앤드 팅 배지상에 도말한다. 3 내지 4 주내에 발육되고 있는 배를 지닌 배형성 가피가 가시화된다. 마찬가지로, 상기 배지상에 도말할 때 큰 세포 클럼프는 발육되고 있는 배를 지닌 배형성 클럼프가 된다.
양자 현탁 배양 방법 양자에서, 배를 자극시키고/시키거나 지속시키기 위해서는 MS 배지를 사용하는 반면 급속한 식물 발육을 위해서는 발아 배지를 사용한다.
필요에 따라서는, 묘목 체외이식조직을 형질전환시킬 수 있다. 이 과정에서, 멸균 종자의 배축 및/또는 떡잎 분체가 사용될 수 있다. 떡잎이 바람직하다.
분체를 예컨대 카나마이신과 같은 항생제 내성등의 암호(유전 마커)가 함유된 아그로 박테리움 벡터를 포함하는 배지상에 벡터가 유전자를 체외이식조직의 세포로 전이시키기에 충분한 시간 동안 위치시킨다. 일반적으로, 접촉 시간은 1 분 내지 24 시간 범위일 수 있으며, 이 때 간헐적으로 또는 조심스럽게 진탕을 수행할 수도 있다. 체외이식조직을 제거한후, NAA(2 mg/l)가 보충된 MS 배지등의 아가-고화된 가피 생장 배지상에 위치시키고 25 내지 35℃, 바람직하게는 30℃ 에서 16:8시간의 광:단광 사이클하에 약 15 내지 200 시간 동안 항온보존시킨다.
항온보존후, 체외이식 조직을 항생제 세포탁심(cefotaxime)이, 바람직하게는 200 mg/l의 농도로 보충된 동일한 배지로 옮긴다.
세포탁심은 남아 있는 아그로박테리움이 그 식물 조직을 증식 및 과대 생장시키지 않도록 하기 위하여 포함된다. 대안 방법으로, 그 체외이식조직을 NAA(2 mg/l)가 보충된 MS 배지로 헹구어질 수 있는데, 헹구기 4 내지 28 일전에 항온보존시키며, 그후 세포탁심이 함유된 동일한 배지를 항온보존시킬 수 있다. 새로운 배지상에서 4-5 주 배양 말기에, 발육 가피 즉, 일차 가피를 일차 체외이식조직의 나머지로부터 분리해내어 NAA(2 mg/l), 세포탁심(200 mg/l) 및 카나마이신 설페이트(50 mg/l)와 같은 항생제가 함유된 MS 배지로 옮긴다. 항생제(카나마이신)의 존재하에서의 생장능으로 보아 확인된 형질전환된 일차 가피를 선택하고, 배를 발육, 발아시켜, 전술한 방법으로 식물을 얻는다.
세포 현탁액을 형질전환시키는 것도 또한 실현 가능하다. 7 내지 14 일, 일반적으로는 7 내지 10 일의 정상적 아배양 생장 사이클후, 세포를 정치시켜 상청액이 생기도록 하여 그것을 제거한다. 남아 있는 농축 현탁 세포를 5 분간 4000 xg에서 원심분리시켜 과량의 배지를 버린다. 농축된 현탁 배양체를 아그로박테리움이 함유된 동일 배지 8 ml에 재현탁시킨다. 그 현탁액을 “T” 튜브에 옮기고 항온보존을 위해 적절히 교반시킨다.
박테리아 부착 및 DNA 전이가 이루어지도록 약 2 내지 24 시간, 바람직하게는 3 내지 5 시간의 항온보존후, 그 현탁액을 제거하고 정치시킨다. 박테리아가 포함된 상청액을 버리고 그 세포를 새로운 배지로 세척한다. 필요에 따라, 그 현탁액을 약 5 분간 원심 분리시키고 그 상청액을 제거한다. 어떤 경우에든, 그 세포를 동일 배지에 재현탁시키고 “T” 튜브 또는 플라스크에 옮겨 현탁액 아배양을 다시 시작한다. 그 목적은 세포 현탁액에 남아 있는 미부착된 아그로박테리움 벡터의 양을 최소화시키기 위한 것이다.
약 15 내지 약 200 시간후, 전형적으로는 15 내지 약 72 시간후, 바람직하게는 18 내지 20 시간후, 현탁액을 여과시켜 대형 클럼프를 제거하고 새로운 액체 배지로 세척후 정치시킨다. 그 현탁액을 페트리 디쉬중의 고화 배지상에 도말된 세포탁심(200 mg/l)가 포함된 새로운 액체 배지중에 재현탁시킨다.
대안 방법으로는, 현탁액을 세포 탁심이 함유된 새로운 배지에 재현탁시켜 이후, 페트리 디쉬중의 고화 배지상에 도말하기 4 내지 28 일전에 생장시킬 수도 있다. 세포 농도는 1 용적의 현탁 세포와 세포 탁심이 포함된 3 용적의 배지이다. 네오마이신 포스포트란스퍼라제(NPT) 유전자를 형질발현하는 형질전환 세포의 선별을 위해 그 배지중에 10 내지 300 mg/l, 바람직하게는 약 20 내지 200 mg/l, 더욱 바람직하게는 약 40 내지 80 mg/l의 카나마이신이 포함된다. 카나마이신의 선정농도에서 증식한 세포와 배를 전술한 바와같이, 본 발명의 방법에 따라 완전한 식물로 발아되어 재생할 수 있는 성숙된 체세포 배로 더욱 생장시킨다.
상기 과정 및 제9도를 참조하면, 형질전환의 결과로 여러가지 세포 콜로너가 나타난다. 카나마이신 항생제에 대한 내성을 나타내는 면화 세포(20)가 존재한다. 제10도에 따르면, 형질전환된 가피가 항생제 MS 배지상에서 체세포 배로 발육되는 것이 제시되어 있다. 제11도는 카나마이신 내성을 가지는 것으로 확립되며, 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 갖도록 형질전환된 체세포 배를 나타낸다. 제12도는 제11도의 배로부터의 식물을 제시하고 있다. 제13도는 MS 배지상에서 자라고 있는 인시류 곤충에 대한 내성을 가지도록 형질전환된 세포를 나타내고, 제14도는 비스리 앤드 팅 배지로 옮겨진 것을 나타내며, 제15도는 제14도의 묘목이 더욱 성숙한 묘목으로 발육된 것을 보이고 있다.
[면화 재생]
[실시예 1]
[떡잎 체외이식조직으로부터 출발하는 식물의 재생]
고시퓸 히르수텀의 아카라 면화 변종 SJ2의 종자를 3 분간 95% 알콜과 접촉시켜 멸균 시킨후, 멸균수로 2 회 헹구고 15 분간 15% 소듐 히포클로라이트 용액으로 침지시킨후, 멸균수로 헹구었다. 멸균 종자를 약 14 일간 어두운 곳에서 기본아가 배지상에서 발아시켜 묘목을 얻었다. 그 묘목의 떡잎을 2-4 mm2의 분체로 절단해내고 0.4 mg/l의 티아민-HCl, 30 g/l의 글루코즈, 2.0 mg/l의 나프탈렌아세트산(NAA), 1 mg/l의 키네틴, 100 mg/l의 m-이노시톨 및 아가(0.8%)가 보충된 미량의 염과 무라쉬지 앤드 스코그(MS)로 이루어진 가피 유도 배지에 무균적으로 옮겼다. 그 배양체를 약 2000-4000 룩스의 조도를 제공하는 형광 빛(냉 일광)의 퍼시발(Percival) 인큐베이터에서 16 시간의 광 및 8 시간의 단광의 조건으로, 약 30℃하에 항온보존시켰다.
3 내지 4 주내에 배양된 조직 분체상에서 가피가 형성되었으며, 그 색상은 회녹색을 띠었다. 형성된 가피를 3 내지 4 주 마다, 100 mg/l의 m-이노시톨, 20 g/l의 슈크로즈, 2 mg/l의 나프탈렌 아세트산(NAA) 및 아가를 포함하는 MS 배지가 함유된 가피 생장 배지상으로 아배양시켰다. 체세포 배가 가피 유도 배지상에 체외이식조직을 일차 도말시킨 후, 4 내지 6 개월만에 형성되었다. 그 가피와 배를 3 내지 4 주마다 새로운 가피 생장 배지상에 아배양시킴으로써 가피 생장 배지상에서 유지시켰다.
조직 단편상에 형성된 체세포 배를 새로운 가피 생장 배지 또는 비슬리 앤드 팅 배지(배 발아 배지)로 이식했다.
체세포 배로부터 형성된 체세포 묘목을 1200 mg/l의 암모늄 니트레이트와 500 mg/l의 카제인 가수분해물을 유기 질소원으로 포함하는 비슬리와 팅의 배지로 옮겼다. 그 배지를 고화제(겔라이트)에 의해 고화시키고 묘목을 마겐타(Magenta) 상자에 넣었다.
체세포 배는 약 3 개월내에 묘목으로 발육되었다. 그 묘목은 6 개 내지 8개 잎과 약 3 내지 4 인치의 키를 보이면서 뿌리를 내리고, 토양으로 옮겨져서 3 내지 4 주간 고습도하에 인큐베이터에서 유지시킨 후, 온실로 옮겼다. 그 식물은 넓은 경작지로 옮겨주었다.
[실시예 2]
실시예 1의 과정을 모든 배지 성분들이 규정된 농도의 1/2로 감소된 반-강도의 MS 배지를 사용하여 반복했다. 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
[실시예 3]
체외이식조직이 배축 분체인 것을 제외하고는 실시예 1과 2의 과정을 반복 실시하였다. 동일한 결과가 얻어졌다.
[실시예 4]
체외이식조직이 미숙한 접합자 배인 것을 제외하고는 실시예 1 과 2의 과정을 반복 실시하였다. 동일한 결과가 얻어졌다.
[실시예 5]
아카라 면화 변종 SJ4, SJ5, SJ2C-1, GC510, B1644, B2724, B1810 및 피커(picker) 변종 시오크라(Siokra)와 스트리퍼 변종 FC2017을 사용하여 실시예 1과 2의 과정을 반복 실시하였다. 모두 성공적으로 재생되었다.
[실시예 6]
체세포 배를 형성할 수 있는 가피를 얻을 수 있도록 실시예 1의 과정을 반복 실시하였다. 활성적으로 자라고 있는 배형성 가피 약 750-1000 mg의 조각을 T-튜브에서 MS 주성분과 소량의 염으로 이루어지며, 0.4 mg/l 티아민 HCl, 20 g/l의 슈크로즈, 100 mg/l의 이노시톨과 나프탈렌아세트산(2 mg/l)이 보충된 액체 현탁 배양 배지 8 ml 단위중에 현탁시키고 16:8의 광:단광 사이클하에 1.5 rpm으로 회전하는 로울러 드럼상에 놓았다 약 2000-4500 룩스의 조도가 형광 빛(냉 일광)에 의해 다시 제공되었다.
4 주후, 현탁액을 840 마이크론 크기의 나일론 메쉬로 여과시켜 큰 세포 클럼프를 제거했다. 840 마이크론 이하의 분획을 정치시켜 약 20-25 ml의 새로운 현탁 배양 배지로 1 회 세척했다. 이 현탁액을 T-튜브(2 ml/튜브)로 옮기고 각 튜브를 6 ml의 새로운 현탁 배양 배지로 희석시켰다. 그 배양체를 10-12 일 간격으로 상기 과정을 반복 실시하여 유지시켰다. 즉, 그 현탁액을 여과하여 840 마이크론 이하의 세포 응집체를 포함하는 분획만을 새로운 현탁 배양 배지로 옮겼다. 모든 경우에, 840 마이크론 이상의 세포 클럼프 함유의 분획을 가피 생장 배지상에 유지시켜 성숙한 체세포 배를 얻었다. 가피 생장 배지위에 형성된 체세포 배를 제거하여 배 발아 배지로 옮기고 실시예 1의 과정을 사용하여 발아시키며 묘목 및 농지에서 생장된 식물로 발육시켰다.
[실시예 7]
2 mg/l의 NAA가 함유된 MS 액체 배지 15-20 ml를 포함하는 드롱 플라스크에 배형성 가피 750-1000 mg을 옮김으로써 현탁 배양체를 형성시킨다는 것을 제외하고는 실시예 6의 과정을 반복 실시했다. 배양체 함유 플라스크를 자이로토리 진탕기상에 놓고 100-110 스트록크/분으로 진탕시켰다. 3 주후 실시예 4 에서와 같이 그 현탁액을 840 마이크론 나일론 메쉬로 여과시켜 식물 생장을 위해 큰 세포 클럼프를 제거하였다. 840 마이크론 이하에서 현탁액을 정치시키고 MS 액체 배지 중에서 1 회 세척하여 2 내지 5 ml의 MS 액체 배지중에 재현탁시켰다. 현탁액을 1-2 ml의 현탁액과 15 ml의 새로운 MS 액체 배치가 함유된 드롱 플라스크내에 새로운 배지로 전이시켜 아배양시켰다. 그 배양체를 7 내지 10 일 간격으로 이 과정을 반복하여 유지시켰다. 각 아배양에서 840 마이크론 이하의 현탁액만을 아배양시키고 큰 클럼프(840 마이크론 이상)는 식물 생장에 사용하였다.
[실시예 8]
실시예 6 과 7의 현탁 배양 과정을 이용하여 3 내지 4 차 아배양후, T 튜브와 드롱 플라스크로부터의 1.5 내지 2.0 ml의 세포 현탁액을 각각 2 mg/l의 NAA가 함유된 아가-고화된 MS 배지와 500 mg/l의 카제인 가수분해물이 함유된 비슬리 앤드 팅 배지상에 도말하였다. 3 내지 4 주내에, 발육하고 있는 배를 가지는 배형성 가피가 육안으로 관찰되었다. 다시 840 마이크론 이상의 세포 클럼프는 가피 생장 배지상에 도말하여 발육배가 있는 배형성 클럼프를 생성시키며 최종적으로는 묘목으로 생장되었다.
[면화 형질전환]
[실시예 9]
[아그로박테리아 LBA 4434를 사용하여 종양-표현형을 형성하기 위한 형질전환]
T-튜브에서 3 내지 4 개월간 아카라 면화 현탁 배양체를 아배양시키는데, 그 배지(2 mg/l NAA를 포함하는 MS 배지)를 7 내지 10 일 마다 교체해준다. 배지 교체후, 그 세포를 정치시켜 형질전환을 위해 수확할 수 있다. 피펫팅으로 상청액을 제거하고 세포를 아그로박테리움 균주 LBA 4434 로 형질전환시켰다. 아그로박테리움 균주 LBA 4434(Hoekema, A. 등, Nature 303:179-180,1983, 본 명세서에 참고로 인용됨)는 Ti 플라스미드-유래된 이원의 식물 형질전환 시스템을 함유한다. 그 이원 시스템에 있어, 하나의 플라스미드는 Ti-플라스미드의 T-DNA를 함유하며, 두번째 플라스미드는 Ti-플라스미드의 vir-부위를 포함한다. 두개의 플라스미드는 공동 작용하여 식물 형질전환을 일으킨다. 균주 LBA 4434 에서 T-DNA 플라스미드, pAL 1050은 pTiAch5, 옥토핀 Ti-플라스미드의 TL을 함유하며, 균주 LBA 4434, pAL 4404에서 vir-플라스미드는 pTiAch5의 본래의 유독성 부위를 포함한다(Ooms, G. 등, Pllasmid 7:15-29, 1982, 본 명세서에 참고로 인용됨). 균주 LBA 4434 는 네덜란드의 라이덴 대학의 생화학부 소속의 로버트 쉘페로트 박사(Dr. Robert Schilperoort of the Department of Biochemistry, University of Leiden)로부터 입수할 수 있다.
형질전환용 아그로박테리움 균주를 글리세롤 스록으로부터 취하여 밤새 배양한 소량의 배양체중에 접종시키고 이중 50-ml 배양체를 그 다음날 접종했다. 아그로박테리아를 NaOH 를 사용하여 pH 7.2로 조절한 물중에 1 리터당 5 g의 추출물, 1g의 효모 추출물, 5g의 펩톤 및 5g의 슈크로즈가 포함된 YEB 배지상에 생장시켰다. 오토클레이브 후, 1ml의 2M MgCl2를 가한후, 필요하다면 다른 균주를 사멸시키기 위한 목적으로 항생제를 가했다. 50ml의 밤새 배양한 배양체의 600nm에서의 흡광도를 판독하고, 그 배양체를 원심분리하며 형성된 펠릿을 식물 세포 생장 배지(MS 배지 + NAA, 2 mg/l)에 재현탁시켜 600 nm에서 최종 흡광도가 0.5가 되도록 하였다.
아그로박테리움 LBA 4434의 박테리아 현탁액 8 ml를 상청액 제거후 현탁 식물 세포가 포함된 가 T-튜브에 가했다. 식물과 박테리아 세포가 함유된 T-튜브를 교반하여 그 세포를 재현탁시키고 3시간 동안 로울러 드럼으로 보내어 아그로 박테리아가 식물 세포에 부착되도록 하였다. 그 세포를 정치시켜 잔류 상청액을 제거했다. 새로운 생장 배지 분취량을 T-튜브에 가하고 그 현탁액을 18 내지 20 시간 동안, 남아 있는 잔류 아그로박테리아의 존재하에 로울러 드럼상에서 항온보존시켰다. 이후, 세포를 다시 정치시켜 상청액을 제거하고 그 세포를 세포탁심(200㎍/ml) 함유의 생장 배지의 용액으로 2 회 세척했다. 세척후, 각 T-튜브로 부터의 세포를 세포탁심(모든 경우에 200㎍/m1) 함유의 10 ml 생장 배지에 재현탁시키고 그 현탁액의 1 ml 분취액을 페트리 디쉬상에 도말하였다.
감염 세포를 식물호르몬이 부가되지 않은 생장 배지상에서 생장시켜 그 조직이 와일드형의 식물호르몬 유전자를 T-DNA 중에 수용하고 있음이 입증되었다. 그 세포는 종양을 발생시키며 그 배양체의 형질전환을 나타낸다.
[실시예 10]
[카나마이신-내성의 비-종양성 표현형을 형성하기 위한 면화의 형질 전환]
실시예 9 에서 얻어진 현탁 배양체를 T-DNA 함유의 이원 벡터 pCIB10(Rothstein, S.J. 등, Gene 53:153-161, 1987, 본 명세서에 참고로 인용됨)와 pAL 4404 vir-플라스미드가 포함된 아그로박테리아를 사용하여 형질전환시켰다. pCIB 10의 T-DNA는 노팔린 합성효소로부터의 프로모터, 효소 네오마이신 포스포트란스퍼라제를 암호하는 Tn5로부터의 암호 부분 및 노팔린 합성 효소로부터의 터미네이터로 구성된 키메라 유전자를 포함한다. pCIB 10이 함유된 아그로박테리아를 카나마이신(50㎍/ml)이 함유된 YEB 배지상에서 생장시켰다. 세포 및 아그로박테리아에서 1 ml의 분취액을 카나마이신(50㎍/m1) 또는 G418(25㎍/ml)가 함유된 선별 배지상에 즉시 도말하는 것을 제외하고는 실시예 10과 같은 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환시킨 식물 조직에서 노스/네오/노스 키메라 유전자의 형질발현에 의해 두 항생제의 존재하에서 이 조직을 선별하는 것이 가능하게 되었다. 2 내지 4 주내에 형질전환된 조직이 선별 플레이트상에 나타난다. 미감염된 조직과, 부가된 대조 조직은 생장의 징후를 보이지 않으며 갈변되어 고사했다. 형질전환된 조직은 카나마이신과 G418의 존재하에 매우 잘 생장하였다.
이때, 잘 자라고 있는 조직 단편을 새로운 선별 배지로 아배양시켰다. 이 조직 단편상에 형성된 체세포 배를 새로운 비-선별 배지로 이식시켰다. 그 배가 분화 및 발아를 시작할 때, 즉, 뿌리를 형성하여 2 또는 3 개의 잎을 가지기 시작할 때 이들을 실시예 1에서 설명된 생장 배지가 포함된 마겐타(Magenta) 상자로 옮겼다. 묘목이 6 내지 8 개 잎을 가질 때까지 계속 생장시키며 이 때 아가 배지로부터 분리시켰다.
그 묘목을 화분 토양에 위치시킨후 비이커로 덮어 습도를 유지시키고 4 내지 8 주간 퍼시발 인큐베이터내에 위치시켰다. 이 후 그 식물을 비이커로부터 꺼내어 온실로 옮겼다. 식물은 온실에서 생장하여 개화되며 씨를 갖게 되었다.
[실시예 11]
사용된 형질전환용 아그로박테리아가 T-DNA 벡터 DEI PEP10과 PAL 4404 vir 플라스미드를 포함하는 것을 제외하고는 실시예 10의 방법을 실시하였다. 제33도에 나타낸 DEI PEP 10은 이후, 식물 게놈에서 통합을 위해 BamHI로 세분되는 에이. 투메파시엔스(A. Tumefaciens)(균주 C-58)로부터의 두개의 T-DNA PstI 절단된 오른쪽 경계 서열, 페신저 메이지(passenger maize) 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 유전자(Pepcase 유전자) 및 식물에서 형질발현될 수 있고 항생제 카나마이신과 G418에 대한 내성을 부여하는 키메라 유전자(NOS/NPT/TK)를 사용한다. 이 키메라 유전자는 노팔린 합성 효소 프로모터, Tn5 로부터의 네오마이신 포스포트란 스퍼라제 II 암호부, 혜르페스 심플렉스 비루스 티미딘 키나제 유전자로부터의 터미네이터를 사용한다. 형질전환후, 배형성 가피와 배를 카나마이신(50 mg/l)에 대해 선별하여 얻었다. 이 수준(50 mg/l)에서의 카나마이신상에 도말된 대조군(비-형질전환된 가피)으로부터는 내성 있는 가피가 전혀 얻어지지 않았다.
[실시예 12]
[면화 현탁 배양체 세포의 글리포세이트-내성 표현형으로의 형질전환]
사용된 형질전환용 아그로박테리아가 T-DNA 벡터 pPMG 85/587(Fillatti, J. 등, Mol Gen. Genet. 206:192-199, 1989, 본 명세서에 참고로 인용됨)과 pAL4404 vir 플라스미드를 함유한다는 것을 제외하고는 실시예 10의 방법을 수행했다. 그 플라스미드 pPMG85/587은 식물에서 형질발현될 수 있는 세 개의 키메라 유전자를 가진다. 두 유전자는 항생제 카나마이신과 G418에 대한 내성을 갖게하는 네오마이신 포스포트란스퍼라제(NPT)를 암호한다. 에스. 티피뮤리윰(S. typhimurium)의 돌연변이 aroA 유전자로부터의 암호 서열이 포함된 세 번째 키메라 유전자는 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 갖게한다(Comai, 등, Science 221:370-371, 1983, 본 명세서에 참고로 인용) pPMG85/587이 함유된 아그로박테리아를 카나마이신(100 ㎍/ml)이 함유된 배지상에서 생장시켰다. 그 현탁액을 28일간 생장시켜 1ml의 분취액을 선별 항생제 함유의 배지상에 도말하는 것을 제외하고는 실시예 10의 형질전환을 수행했다. 형질전환된 식물 조직에서의 NPT 키메라 유전자의 형질발현에 의해 두 항생제상에서 이 조직을 선별하는 것이 가능하게 되었다. 이 경우 선별
항생제는 카나마이신(50㎍/ml )이었다.
2 내지 4 주내, 형질전환된 조직이 선별 플레이트상에 나타났다. 식물 조직, 각 배와 가피를 1 mM의 제초제 글리포세이트가 함유된 생장 배지상에 위치시킨 후 형질전환된 조직이 계속 잘 자라도록 하였다. 가피 및 배 양자의 단백질을 추출하여 분석함으로써 글리포세이트 내성 유전자 생성물의 존재가 확인되었다.
[실시예 13]
[면화 현탁 배양 세포의 히그로마이신 내성의 비-종양성 표현형으로의 형질전환]
T-DNA 이원 벡터 pCIB715(Rothstein, S. J. 등, Gene. 53:153-161, 1987) 및 vir 플라스미드가 포함된 형질전환용 아그로박테리아를 사용한다는 것을 제외하고는 실시예 10의 형질전환 과정을 실시했다. pCIB715의 T-DNA는 카울리플라우어 모자이크 비루스(CaMV) 35S 전사체(Odell 등, Nature 313:810-812, 1985, 본 명세서에 참고로 인용됨)로부터의 프로모터와 터미네이터 및 히그로마이신 B 포스포트란스퍼라제(Gritz, L. 및 J. Davies, Gene 25:179-188, 본 명세서에 참고로 인용됨)에 대한 암호 서열로 이루어진 키메라 유전자를 포함한다. pCIB715가 포함된 아그로박테리아를 카나마이신(50㎍/ml)이 함유된 YEB상에서 생장시켰다.
실시예 10에서 기술된 형질 전환을 실시하는데, 단, 1ml의 부분 표본을 선택성 항생제로서 50㎍/ml의 히그로마이신을 함유하고 있는 배지상에 즉시 평판화시킨다. 형질 전환된 식물 조직에서 키메릭 히그로마이신 유전자의 표현은 히그로마이신 함유의 배지상에서 이 조직을 선택하게 한다. 형질 전환 조직은 선택 배양배지상에서 실시예 8에서와 같은 방법으로 생장되어 형질 절환이 이루어졌음이 확증되었다.
[실시예 14]
[인시류곤충에 대한 저항을 부여하는 면화의 현탁 배양 세포의 형질 전환]
하기 기술되는 변화이외에는 실시예 10의 방법에 따른다. 여러 가지 형질전환 아그로박테리아를 사용한다. 또한, 형질 전환된 물질의 선택에 대하여 항생제상에서 식물 조직이 선택된 후, BT 유전자 표현을 위해 보다 더 선택된다. 사용된 아그로박테리아는 T-DNA 벡터 pCIB10을 포함한다(하기 키메릭 Bacillus thuringiensis 엔도톡신 유전자(“BT 유전자”)가 삽입된 것, Rothstein et al., gene 53 : 153-161(198)):
아그로박테리움 벡터를 제조하기 위하여, CaMV유전자 VI 프로모터와 프로톡신암호 서열이 융합된다. 파아지 벡터 mp19(Yanish-Penon 등, 1985)의 유도체를 먼저 조립한다. 그 단계를 제16도와 제17도에 나타내었다. 먼저, 프로톡신 암호 부분에 대한 약 155의 뉴클레오티드 5′와 암호 서열의 인접한 약 1346 뉴클레오티드가 포함된 DNA 분체를 mp19로 삽입시킨다. 파아지 mp19 ds rf(이중쇄 복사형태) DNA를 제한 엔도뉴클레아제 SacI와 SmaI로 분해하고 약 7.2-kbp 벡터 분체를 표준과정에 의해 저-겔링 온도 아가로즈를 통해 전기 영동후 정제한다. 프로톡신 유전자를 비롯한, 바실러스 투린기네시스 DNA의 약 10kbp을 포함한 플라스미드 pKU25/4는 스위스연방 바슬의 시바가이기사의 제이. 누에쉬 박사(Dr. J. Nueesch, CIBA-Geigy Ltd., Basle, Switzerland)로부터 제공되었다. 플라스미드 pKU25/4에 존재하는 프로톡신 유전자의 뉴클레오티드 서열은 하기 식(1)으로 표현된다. 플라스미드 pKU25/4 DNA를 엔도뉴클레아제 HpaI와 SacI로 분해하고 식(1)의 뉴클레오티드 2 내지 1505가 포함된 1503bp 분체를 정제한다. 이 분체는 약 155 염기쌍의 박테리아 프로모터 서열과 그 프로톡신 암호 서열 출발의 약 1346 염기쌍을 포함한다. 각 분체의 약 100ng를 혼합하고 T4 DNA 리가제를 가한후 15℃에서 하룻밤동안 항온 보존한다. 그 결과의 혼합물로 E. coli 균주 HB101을 형질전환시키며 인디케이터 박테리아 E. coli JM101과 혼합한 뒤 평판화시킨다. 하나의 파아지(mp19/bt)를 하기 조립을 위해 사용한다. 다음. CaMV 유전자 VI 프로모터와 유전자 VI의 암호 서열의 일부를 포함하는 DNA분체를 mp19/bt로 삽입시킨다. 파아지 mp19/bt ds rf DNA를 BamHI로 분해시키고 큰 분체의 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활 말단을 얻고 엔도뉴클레아제 PstI으로 재분해시킨다. 큰 벡터 분체를 상기와 같은 전기 영동으로 정제한다. 플라스미드 pABD1은 Paszkowski 등의 EMBO J. 3, 2717-2722(1984)에서 설명되었다. 플라스미드 pABD1 DNA를 PstI과 HindIII으로 분해시킨다. CaMV 유전자 VI 프로모터와 약 75 염기쌍의 유전자 VI암호 서열이 포함된 약 465염기쌍의 분체를 정제한다. 두 개 분체를 결찰시켜 상기와 같이 평판화시킨다. 그 결과의 하나의 재조합체 파아지, mp19/btca는 CaMV유전자 VI 프로모터서열, 유전자 VI 암호 서열의 일부분, 프로톡신 암호서열 상부의 약 155 염기쌍의 바실러스 투린기엔시스 DNA와 약 1346 염기쌍의 프로톡신 암호 서열을 포함한다. CaMV 프로모터 서열을 프로톡신 암호 서열에 정확하게 융합시키기 위해, mp19/btca DNA의 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이를 사용하여 간섭 DNA를 삭제한다. 서열 (5′)TTCGGATTGTTATCCATGGTTGGAGGTCTGA(3)의 DNA 올리고뉴클레오티드를 용융 바이오 시스템 DNA 합성자(Applied Biosystems DNA Synthesizer)를 사용하여 일반적인 과정에 의해 합성한다. 이 올리고뉴클레오티드 CaMV 프로모터의 3′말단에서 파아지 mp19/btca DNA에서의 서열(Hohn, Current Topics, in Microbiology and Immunology, 96, 193-235(1982)에서 뉴클레오티드 5762에서 5778)과 프로톡신 암호 서열의 개시부(상기식(I)에서 뉴클레오티드 156에서 172)에 상보적이다. 돌연변이화에 대한 일반적인 과정은 Zoller and Smith Meth, Enzym., 100 468-500(1983)에 설명되어 있다. 단일쇄 파아지 mp19/btca DNA의 약 5 미생물을 40㎕ 볼륨에서 포스포릴화 올리고뉴클레오티드 0.3mg과 혼합한다. 그 혼합물을 65℃에서 5분간 가열 50℃로 냉온후, 서서히 4℃로 냉온시킨다. 다음, 완충제, 뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP, T4 DNA 리가제와, DNA 폴리머라제의 큰 분체를 가하고 zoller and Smith Meth Enzym., 100, 468-500(1983)에서와 같이 15℃에서 하룻밤 항온 보존시킨다. 아가로즈 겔의 전기 영동후, 환상의 이중쇄 DNA를 정제하고 E. coli 균주 JM101로 트랜스펙숀시킨다. 그 결과의 플라크를 32p-라벨된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드될 수 있는 서열에 대하여 스크리닝하고 파아지를 DNA 억제 엔도뉴클레아제에 의해 분석한다. 그 파아지 클론들 중 CaMV 유전자 VI프로모터와 프로톡신 암호 서열사이의 비의도성 서열이 정확하게 삭제된 것이 있다. 이 파아지를 mp19/btca/del로 칭한다(제17도 참조).
다음에는, 프로톡신의 3′암호 부분이 CaMV 전사 말단 시그널이 융합된 플라스미드를 조립한다. 이 단계는 제18도에 나타내었다. 먼저, 플라스미드 pABDI DNA를 엔도뉴클레아제 BamHI와 HglII로 분해하고 CaMV 전사 터미네이터 서열이 포함된 0.5kbp 분체를 분리한다. 다음 플라스미드 pUC19, Yanisch-Perron 등의 gene, 33, 103-119(1985)를 BamHI로 분해하고 0.5kbp 분체와 혼합한 후 T4 DNA 리가제로 항온보존시킨다. E. coli 균주 HB101에 DNA를 형질전환시킨 후, 그 결과의 하나의 클론인 플라스미드 p702를 얻는다. 이것의 구조가 제18도에 도시되었다. 그 다음, 플라스미드 p702 DNA를 엔도뉴클레아제 SacI과 SmaI으로 분해하고 보다 큰 분체, 약 3.2kbp분체를 겔 전기 영동으로 분해한다. 플라스미드 pKU25/4 DNA를 엔도뉴클레아제 AhaIII과 SacI로 분해하고 프로톡신 암호 서열(nt 1504에서 3773)의 3′ 부분이 포함된 2.3-kbp 분체(식(1)의 뉴클레오티드 1502에서 3773)를 겔 전기 영동후 분리한다. 이 두 개의 DNA 분체를 혼합하고 T4 DNA 리가제와 항온 보존 후 E. coli 균주 HB101을 형질전환시킨다. 그 결과의 플라스미드는 p702/bt이다(제18도).
마지막으로, 파아지 mp19/btca/del ds rf DNA의 부분자 플라스미드 p702/bt를 결합하여 CaMV 프로모터와 터미네이터 서열이 인접한 완전한 프로톡신 암호 서열이 포함된 플라스미드를 만든다(제18도). 파아지 mp19/btca/del DNA를 엔도뉴클레아제 SacI과 SphI으로 분해시키고 약 1.75kbp의 분체를 아가로즈 겔 전기 영동후 정제한다. 유사하게, 플라스미드 p702/bt DNA를 엔도뉴클레아제 SacI과 SalI으로 분해하고 약 2.5kbp의 분체를 분리한다. 마지막으로, 플라스미드 pBR322 DNA(Boliver 등의 Gene, 2, 95-113(1977))를 SalI과 SphI으로 분해시키고 큰 4.2-kbp 분체를 분리한다. 세 개의 모든 DNA 분체를 혼합하고 T4 DNA 리가제와 항온 보존시켜 E. coli HB101을 형질 전환시킨다. 그 결과의 플라스미드, PBR322/bt 14는 CaMV 유전자 VI 프로모터와 바실러스 투린기엔시스 결정 단백질 암호 서열에 융합된 변역 시발 시그널과 CaMV 전사 말단 시그널이 포함된 PBR322의 유도체이다(제19도에 표시됨).
벡터 pCIB10은 아그로박테리움 투메파시엔스에 의해 키메릭 유전자를 식물로 전이시키기에 유용한 Ti-플라스미드-유래 벡터이다. 그 벡터는 넓은 숙주 범위의 플라스미드 pRK 252로부터 유래되는데, SalI으로 분해된 플라스미드 pCIB10 DNA와 혼합한다. T4 DNA 리가제로 항온처리 및 E. coli HB 101로 형질 전환시킨 후, 제26도에 나타낸 플라스미드는 그 플라스미드 벡터 pCIB 10에서 키메릭 프로톡신 유전자를 포함한다.
아그로박테리움에 E. Coli HB101로부터의 플라스미드 pCIB 10/19 Sbt를 전이시키기 위하여, 중간체 E.coli 숙주 균주 S17-1을 사용한다. Agrigenetics Research Corp., Boulder, Co.로부터 입수될 수 있는 이 균주는 플라스미드 pCIB10을 접합에 의해 아그로 박테리움에 직접 전이시키는 이동 기능을 포함함으로, 아그로 박테리움에 넥크된 플라스미드 DNA를 형질 전환시킬 필요가 제거된다(균주 S 17-1의 참조 문헌 : Simon et al., “Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction”. A Puhler, ed. Springer Verlag, Berlin, Pages 98-106. 1983).
먼저, 플라스미드 pCIB10/19Sbt DNA를 칼슘 클로라이드-처리된 S17-1세포로 도입시킨다.
다음, 형질 전환된 S17-1 세포와 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404(Ooms et al., Gene. 14, 33-50(1981) 참조)의 그 플라스미드는 미조리주 세인트 루이스의 워싱톤 대학의 반스 박사(Dr. W. Barnes)로부터 제공될 수 있다. 그 벡터는 또한 아그로박테리움에서 카나마이신 내성 유전자(Tn 988으로부터)와 Ti 플라스미드 pTiT37로부터의 왼쪽 및 오른쪽 T-DNA 경계 서열을 포함한다. 경계 서열 사이에 플라스미드 pUC18로부터의 폴리링커 부분과 식물에 카나마이신 내성을 부여하는 키메릭 유전자가 존재한다.
먼저, 플라스미드 pRK252를 변형시키는데, 테트라시클린 내성 유전자를 트랜스포손 Tn 903으로부터의 카나마이신 내성 유전자로 바꾸고(Oka, et al., J. Mol. Biol., 147, 217-226(1981)) pRK252에서 유일한 EcoRI 부위를 BglII부위로 대치시켜 또한 변형시킨다(제20도 참조). 플라스미드 pRK252를 먼저 엔도뉴클레아제 SalI과 SmaI으로 분해한 후 DNA 폴리머라제 I의 큰 분체로 처리하여 평활 말단을 얻고 큰 벡터 분체는 아가로즈 겔 전기 영동으로 정제한다. 다음, 플라스미드 p368을 엔도뉴클레아제 BamHI로 분해하고 DNA 폴리머라제의 큰 분체로 처리후, 약 1050 염기쌍 분체를 아가로즈겔 전기 영동 후 분리한다; 이 분체는 항생제 카나마이신에 내성인 트랜스포손 Tn903으로부터의 유전자를 함유한다(Oka et al., J. Mol. Biol., 147, 217-226(1981)).
두 개 분체를 DNA 폴리머라제의 큰 분체로 처리하여 평활말단을 얻는다. 두 가지 분체를 혼합, 15℃에서 하룻밤동안 T4 DNA 리가제와 항온 보존시킨다. E. coli HB101을 형질 전환케한 후 카나마이신 내성 콜로리, 플라스미드 pRK252/Tn903을 선택하여 얻는다(제19도 참조).
플라스미드 pRK252/7n903을 이것의 EcoRI 부위에서 분해하고 E. coli DMA 폴리머라제로 처리하여 평활말단을 얻는다. 이 분체를 합성 BglII 억제 부위 링커에 가하고 T4 DNA 리가제와 함께 하룻밤 항온 보존한다. 그 결과의 DNA를 과량의 BglII 억제 엔도뉴클레아제로 분해하고 큰 벡터분체는 아가로즈겔 전기영동으로 정제한다. 그 결과의 분체를 다시 T4 DNA 리가제와 항온 보호시켜 그 분체를 이것의 새로이 부가된 BglII 접착 말단을 재환상화시킨다. E. coli HB101을 형질전환시킨 후 플라스미드 pRK252/Tn903/BglII를 얻는다(제20도 참조).
Ti 플라스미드 T-DNA 경계, 플라스미드 pUC19의 폴리링커 부분, 카나마이신 내성 유전자가 포함된 플라스미드 pBR322의 유도체를 조립한다. 플라스미드 pBR325/Eco29는 노팔린 Ti 플라스미드 pTiT37로부터의 1.5-kbp EcoRI 분체를 포함한다. 그 분체는 T-DNA 왼쪽 경계 서열을 포함한다; Yadav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6322-6326(1982)이 분체의 EcoRI 말단을 HindIII 말단으로 대치하기 위해, 플리스미드 pBR325/Eco29 DNA를 EcoRI으로 분해한후 뉴클레아제 S1과 항온 보존 후 DNA 폴리머라제의 큰 분체와 항온 보존하여 평활 말단을 얻고 합성 HindIII 링커와 혼합하여 T4 DNA 리가제와 보존한다. 그 결과의 DNA를 엔도뉴클레아제 Cla I 과 과량의 HindIII으로 분해시키고 T-DNA 왼쪽 경계가 포함된 1.1-kbp 분체를 겔 전기 영동으로 정제한다. 다음, 플라스미드 pUC19의 폴리링커 부분은 그 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 EcoRI와 HindIII으로 분해하여 분리시키고 작은 분체(약 53 염기쌍)는 아가로즈겔 전기영동으로 분리시킨다. 다음, 플라스미드 pBR322를 엔도뉴클레아제 EcoRI과 ClaI으로 분해시켜 다른 두 개의 분리된 분체와 혼합시키며 T4 DNA 리가제와 항온 보존시켜, E. coli 균주 HB101를 형질전환시킨다. 그 결과의 플라스미드, pCIB5는 플라스미드 pBR322의 유도체에서 T-DNA 왼쪽 경계와 폴리링커를 함유한다(제21도 참조).
식물에서 카나마이신 내성을 표현하는 유전자가 함유된 플라스미드를 조립한다(제22도와 제23도 참조).
플라스미드 Bin6은 영국 캠브리지의 식물 육종 연구소(Plant Breeding Institute)의 엠 베반(Dr. M. Bevan)박사로부터 입수되었다. 이 플라스미드는 Bevan, Nucl, Acids Res., 12. 8711-8721(1984)에서 설명되었다. 플라스미드 Bin6 DNA를 EcoRI와 Hind III으로 분해시키고 키메릭 네오마이신 길스포트란스퍼라제(NPT) 유전자가 함유된 1.5kbp의 분체를 분리하고 아가로즈 겔 전기 영동으로 정제한다. 이 분체를 플라스미드 PUC 18 DNA와 혼합하는데 이것은 이미 엔도뉴를레아제 EcoRi와 Hind III으로 분해된 것이다. T4 DNA 리가제와 항온보존시킨 후 그 결과의 DNA를 E. coli HB 1010에서 형질전환케 한다. 그 결과의 플라스미드는 PUC 18/neo 이다.
이 플라스미드 DNA는 네오마이신 포스포트란스퍼라제 유전자와 노말린 합성효소에 대한 터미네이터 서열 사이의 늘 필요한 BamH I 인식 서열을 포함하고 있다 : Devan, Nucl, Acids Res., 12. 8711-8721 참조, 이 인식 서열을 제거하기 위해 플라스미드 PUC 18/neo를 엔도뉴클레아제 Bam HI로 분해하고 DNA 폴리머라제의 큰 분체로 처리하여 평활 말단을 만든다. 그 분체를 T4 DNA 리가제로 항온 처리하여 그 분체를 재환상화시키며 E. coli HB101을 형질 전환시킨다. 그 결과의 플라스미드, PUC 18/neo(Bam)은 Bam HI인식 서열을 유실하였다.
T-DNA 오른쪽 경계 서열을 키메릭 NPT 유전자에 부가시킨다(제24도 참조).
플라스미드 PBR325/Hind23은 플라스미드 P TiT 37의 3.4-kbp의 Hing III 분체를 포함한다.
이 분체는 오른쪽 T-DNA경계 서열을 포함한다; Bevan et al., Nucl, Acids Res., 11. 369-385. 플라스미드 pBR 325/Hind 23 DNA를 엔도뉴클레아제 Sac II와 Hind III으로 분해하고, 오른쪽 경계를 함유하는 1.0kbp의 분체를 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리 및 정제한다. 플라스미드 PUC 18/neo(Bam) DNA를 엔도뉴클레아제 Sac II와 Hind III으로 분해하고 4.0kbp의 벡터 분체를 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리한다.
두 분체를 혼합, T4 DNA 리가제 항온 처리하고 E. Coli HB 101 대로 형질전환시킨다. 그 결과의 플라스미드, PCIB 4(제23도 참조)는 플라스미드 PUC 18의 유도체내에서 T-DNA 오른쪽 경계와 카나마이신 내성에 대한 식물-선택성 마커를 함유한다.
다음에는 T-DNA 왼쪽 및 오른쪽 경계와 식물 선택성 카나마이신-내성 유전자와 그 경계들 사이의 PUC 18의 폴리링커를 함유하는 플라스미드를 조립한다(제28도 참조). 플라스미드 PCIB 4 DNA를 엔도뉴클레아제 Hind III으로 분해하고 DNA 폴리머라제의 큰 분체로 처리하여 평활 말단을 만들고 엔도뉴클레아제 EcoRI로 분해한다. 키메릭 카나마이신-내성 유전자와 T-DNA의 오른쪽 경계가 함유된 2.6-kbp 분체를 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리한다. 플라스미드 pCIB5 DNA를 엔도뉴클레아제 AatII으로 분해하고 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활 말단을 만든 후 엔도뉴클레아제 EcoRI로 분해한다. 큰 벡터 분체를 아가로즈 겔 전기 영동으로 정제하여 pCIB 4 분체와 혼합하여 T4 DNA 리가제로 항온처리하여 E. coli HB101 대로 형질전환시킨다. 그 결과의 플라스미드 pCIB(제24도에 나타냄)는 두 개의 T-DNA 경계 사이의 목적 서열을 함유하는 플라스미드 pBR 322의 유도체이다. 하기 단계로서 벡터 PCB10의 조립을 완결시키는 것이 제25도에 표시되어 있다.
플라스미드 pCIB 2 DNA를 엔도뉴클레아제 EcoRI로 분해시키고 BglII 인식 부위를 함유하는 합성 링커를 상기와 같이 부가한다.
과량의 BglII 엔도뉴클레아제로 분해시킨 후, 약 2.6-kbp의 분체를 아가로즈 겔 전기 영동 후 분리한다. 상기 플라스미드 pRK 252/Tn 903/BglII(제20도 참조)를 엔도뉴클레아제 BglII로 분해하고 포스페타제로 처리하여 재환상화시킨다.
이 두 개의 DNA 분체를 혼합하여 T4 DNA 리가제로 항온 처리하여 E. Coli HB101로 형질 전환시킨다. 그 결과의 플라스미드는 완전한 벡터 pCIB 10이다.
벡터 pCIB10으로 키메릭 프로톡신 유전자를 삽입하는 것은 제26도에 나타내는 단계에 의한다.
플라스미드 pBR322/bt14 DNA를 엔도뉴클레아제 PvuI과 SalI으로 분해하고, 부분적으로 엔도뉴클레아제 Bam HI로 분해한다. 키메릭 유전자를 함유하는 약 4.2kbp의 Bam HI-SalI 분체를 아가로즈 겔 전기 영동에 의해 분리하고 엔도뉴클레아제 Bam HI와 배향체를 혼합하고 실온에서 하룻밤동안 N아가(디프코) 플레이트상에 깐다.
그 결과의 박테리아 1 루프를 AB 최소 배지상에 도말시킨다; Chilton et at., Proc. Natl, Acad, Sa, USA, 77, 7347-7351(1974). 그것을 50ug/m1의 카나마이신과 함께 평판화시킨 후 28℃에서 항온처리한다.
콜로니를 똑같은 배지상에 재도말시킨 후 NB 아가플레이트에 재도말시킨다.
서서히 자라고 있는 콜로니를 집어내어 카나마이신과 함께 AB 최소 배지상에 도말하고 하나의 콜로니를 분리한다. 이 과정은 pCIB10/19SBt 플라스미드가 포함된 아그로 박테리아에 대한 것이다.
제27도에 나타낸 바와 같이,
CaMV 35S 프로모터 카세트 플라스미드 pCIB 710의 조립에 의해 바실러스 투린기엔시스 프로톡신 키메릭 유전자를 조립한다. 이 플라스미드는 CaMV 프로모터와 35S RNA 전사에 대한 전사 말단 서열을 포함한다.(Covey, S., N., Lomonossoff, G.P. and Hull, R., Nucleic Acids Research vol., 9, 6735-6747(1981) 참조).
CaMV DNA의 1149-bp BglII 제한 분체(Hohn et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 194-220 and Appendices A to G 91982) 참조)를 플라스미드 pLVIII(Dr. S. Howell, Univ. California-San Diego로부터 제공되거나 또는 그 분체는 직접 DaMV DNA로부터 분리될 수 있다)로부터 전술한 바와 같이 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여 Bam HI-분해된 플라스미드 pUC 19 DNA와 혼합하고 T4 DNA 리가제로 처리한 후 E, coli로 형질전환시킨다.
그 결과의 플라스미드에서 Bam HI 제한 부위는 BglII 접착 말단과 Bam HI 접착 말단의 결찰에 의해 파괴되었다.
그 결과의 플라스미드, pUC 19/35S는 올리고 뉴클레오티드-유도 시험관내 돌연변이에서 Hohn의 참고 서적의 CaMV 뉴클레오티드 7483를 따르는 Bam HI 인식 서열 GGATCC를 삽입시키기 위해 사용된다.
그 결과의 플라스미드 pCIB 710은 CaMV 35S 프로모터 부분과, Bam HI 제한부위에 의해 분리된 전사 말단 부분을 포함한다. 이 Bam HI 부위에 삽입된 DNA서열은 CaMV 전사 조절 서열에 의해 식물내에서 표현될 것이다. pCIB 710은 전사 시발부 및 Bam HI 부위 사이의 ATG 번역 개시 코돈의 어떤 것도 함유하지 않는다.
그 단계에 의해 일어나는 pCIB 10으로의 CaMv 35S 프로모터/터미네이터 카세트의 삽입은 제28도에 대략적으로 표시되어 있다. 플라스미드 pCIB 10과 pCIB 710 DNA를 EcoRI와 Sal I로 분해시켜, 혼합 및 결찰시킨다. 그 결과의 플라스미드, pCIB 10/710은 식물 형질 전환 벡터 pCIB 10으로 삽입된 CaMv35S 프로모터/터미네이터 카세트를 갖는다. CaMC 35S서열은 pCIB 10에서 T-DNA 경계들 사이에 존재하므로 식물 형질 전환에서 그 식물 게놈으로 삽입될 것이다.
그 단계에 의한 pCIB 10/710으로의 바실러스 트린기엔시스 프로톡신 유전자의 삽입은 제29도에 개요되어 있다. 프로톡신 유전자의 출처로서, 플라스미드 pCIB 10/19 Sbt를 Bam HI와 Nco I로 분해하고 프로톡신 유전자가 함유된 3.6-kb 분체를 겔 전기 영동에 의해 분리한다. 그 분체를 서열 5′-CATGGCCGGATTCCGGC - 3′의 합성 Nco I-Bam HI 아답터와 혼합시킨 후 Bam HI로 분해한다. 이 단계에 의해, 프로톡신 분체의 양쪽 말단에서 Bam HI 접착 말단이 만들어진다. 이 분체를 Bam HI- 분해된 pCIB 10/710으로 삽입시킨다. 그 결과의 플라스미드, pCIB 10/35Sbt(제29도)는 CaMV 35 S 프로모터와 전사 말단 서열 사이의 프로톡신 유전자를 포함한다.
아그로박테리움 투메파시엔스 LBA404 로의 플라스미드 pCIB 10/35Sbt의 전이는 상기한 바와 같다.
약 725 아미노산 함유의 삭제된 바실레스 투린기엔시스 프로톡신 유전자의 조립과 이 삭제된 유전자와 CaMV 35S 프로모터가 함유된 키메릭 유전자의 조립은 그 유전자의 COOH-말단 부분이 서열 1a 내지 서열 1d에 나타낸 서열의 2325 부위에서 KpnI 억제 엔도뉴클레아제 부위에서 분해 및 제거됨으로써 이루어진다. 플라스미드 pCIB 10/35Sbt(제29도)를 BamHI와 KpnI으로 분해하고 삭제된 프로톡신 유전자가 포함된 약 2.2-kbp BamHI/KpnI 분체를 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리한다.
BamHI 부위로 3′말단에서 KpnI 부위를 전환시키기 위하여 KpnI/BamHI 아답터 올리고뉴클레오티드와 혼합 및 결찰시킨다. 이 분체를 BamHI-분해된 pCIB10/710(제28도)와 혼합한다. 약 645 아미노산 함유의 삭제된 프로톡신 유전자는 서열 1a 내지 서열 1d에 나타낸 서열의 2090위치에서 Bc1I 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 분해시킴으로써 그 유전자의 COOH-말단 부분을 제거하여 만들어진다. 플라스미드 pCIB10/35Sbt(제29도)를 BamHI와 Bc1I으로 분해시켜 삭제된 프로톡신 유전자가 함유된 약 1.9-kbp의 BamHI/Bc1I 분체를 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리한다. Bc1I은 BamHI와 양립성인 접착말단을 만들기 때문에, BamHI - 분해된 pCIB10/710(제28도)으로 이 분체를 결찰시키기 전에 더 이상의 조작이 필요치 않다.
제31도에 나타낸 구조 pCIB 10/35Sbt(Bc1I)을 갖는 그 결과의 플라스미드가 카나마이신에 대하여 선택된다.
pCIB 10/35Sbt(KpnI)으로 지칭되며, 제30도에 표시된 그 결과의 형질전환체는 카나마이신에 대하여 선택한다. 삭제된 프로톡신 유전자는 BamHI분해 부위(GGATCC)를 도입시켜 제조한다. 이것은 pCIB 10/35Sbt로 부터의 프로톡신 서열이 포함된 BamHI 본체를 mp18로 클로닝시키며, 상술한 표준 올리고 뉴클레오티드 돌연변이 과정을 사용하여 달성된다. 돌연변이후, 이중쇄 복제 형태 DNA를 M13 클론으로 부터 제조하고 이것을 BamHI로 분해시킨다. 삭제된 프로톡신 유전자가 함유된 약 1.9-kbp 분체를 BamHI-분해된 pCIB 10/710으로 삽입시킨다. 제32도에 나타낸 구조 pCIB 10/35Sbt(607)를 가지는 그 결과의 플라스미드를 카나마이신에 대하여 선택한다. pCIB 10/Sbt 607을 사용한다.
선택성 항생제가 함유된 배지상에 1ml의 부분표본이 즉시 평판화되는 것을 제외하고는 실시예 7의 방법에 의해 형질 전환시킨다.
이 선택 배지는 카나마이신(50㎍/ml) 또는 G418(25㎍/ml)를 포함한다. 형질전환된 식물 조직에서 NPT 키메릭 유전자의·표현에 의해 두가지 항생제에 대한 이 조직의 선택이 가능하다. 2-4주내에, 형질 전환된 조직이 선택 플레이트상에 출현한다. 식물물질은 카나마이신 또는 G418에 대하여 선택된다. 식물 조직(각 배 또는 가피)을 완충액으로 추출하고 ELISA 분석에 의해 BT 유전자 생성물의 발현에 대하여 분석한다. 추출 조건은 다음과 같다: 100mg의 조직에 대하여 50mM의 NaCO3(pH 9.5), 0.05% 트리톤, 0.05% 트윈, 100nM NaCl, 10mM의 EDTA, 1mM의 로이펩틴과 1 mM의 PMSF가 함유된 추출 완충액 0.1 ml 중에 균질화시킨다. 로이펩틴과 PMSF는 100 × 스톡 용액으로 부터 사용하기 바로 전에 가한다.
그 조직을 모터 드라이브 막자로 분쇄한다. 추출후, 2M의 트리스 pH 7을 가하여 pH 를 8.0-8.5로 조절하고 베크만 마이크로퓨즈 12에서 12,000RPM 하에 원심 분리시킨다(4℃, 10분간). 그 상청액을 효소 결합된 면역형광 분석(“ELISA”)을 위해 비축시킨다.
일반적 수단으로서의 ELISA 방법은 Methods in Enzymology 118: 742-766(1986)에서 M.F. Clark등에 의해 설명되었다.
표준 방법을 사용하여 Bt 독소에 대한 ELISA를 전개하여 Bt 서열의 표현을 위한 트란스게닉 식물 물질을 분석한다. 이 과정에서, ELISA플레이트를 에탄올로 예비처리하고 보레이트-완충염수(하기 참조)중의 3㎍/ml의 농도에서 친화도 정제된 토끼항-Bt 항혈청(50㎕)를 그 플레이트에 가한다. 이것을 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다. 구배-정제된 Bt 결정으로 면역 토끼에 대한 반응에서 항혈청을 얻고[Ang, B.J. & Nickerson, K.W.; Appl. Environ. Microbiol. 36: 625-626(1978)]소듐 도데실 설페이트로 용액화하여 ELISA세척 완충제(하기 참조)로 세척한다. 1시간 동안 실온에서 차단 완충제(하기 참조)로 처리하고 ELISA세척 완충제로 세척한다. 식물 추출물을 50㎍의 단백질이 되게 가한다.(이것은 약 5 마이크로리터의 추출물이다) 단백질로서 추출 완충제를 Bio-Rad(Richmond, California)에서 상업 시판되는 키트를 사용하여 브래드포드 방법으로 측정한다.(Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248(1976)참조). 잎 추출물의 희석이 필요하다면, ELISA 회석제(하기 참조)를 사용한다. 이것을 4℃에서 하룻밤동안 항온처리한다. ELISA 세척 완충제로 세척한 후, 50㎕의 친화도-정제된 염소 항-Bt 항 혈청을 ELISA 희석제중의 3㎍/ml 단백질의 농도로 가한다. 1시간 동안 37℃에서 항온 보존시키고, ELISA 세척 완충제로 세척한다. 알칼리 포스페타제(Sigma Chemicalo, St. Louis Mo에서 시판)에 결합된 50㎕의 토끼 항-염소 항체를 ELISA 희석제중의 1:500으로 희석하고 1시간 동안 37℃에서 항온 처리하여 ELISA 세척 완충제로 세척한다. 50마이크로리터의 기질(ELISA 기질 완충제(하기 참조)중의 0.6mg/ml의 p-니트로페닐 포스페이트)을 가하고 30분간 실온에서 항온 처리한다. 3M의 NaOH 50마이크로리터를 가하여 반응을 종결시킨다. 변형된 ELISA 리더(Hewlett Pactard, Standford, Ca.)에서 405 nm의 흡광도를 읽는다. ELISA 과정을 사용하여 분석할 때 pCIB10/35Sbt(Bc1I)으로 형질 전환된 식물 조직은 양성 반응을 나타내는데, Bt 유전자의 표현을 암시하는 것이다.
[EPBS(ELISA 포스페이트 완충염수)]
pH는 약 7.4이어야 한다.
[보레이트 완충 염수]
100 mM 보린산
25 mM Na 보레이트
75 mM NaCl
HCl 또는 NaOH로 pH를 8.4-8.5로 조절
[ELISA 차단 완충제]
EPBS, 중
1% BSA
0.02% Na 아지드
[ELISA 세척 완충제]
10 mM 트리스-HCl pH 8.0
0.05% Tween 20
0.02% Na 아지드
[2.5M TRIS]
[ELISA 희석제]
EPBS 중:
0.05% Tween 20
1% BSA
0.02% Na 아지드
[ELISA 기질 완충제]
500㎖ 중에
43㎖ 디에탄올아민
24.5mg MgCl2;
HCl로 pH 9.8로 조절
[ELISA 기질]
[25㎖ 기질 완충제중의 15mg의 p-니트로페닐 포스페이트]
생분석을 위해, 이 아그로박테리아로 형질 전환된 것으로부터 얻어진 항생제 내성 세포 배양체로부터 세포 현탁을 개시한다. 현탁액을 G418(25mg/L)가 보충된 배지에서 배양하고 7-10일 간격으로 신선한 항생제 함유 배지에 아배양시킨다. 이 배양체의 샘플을 인시류 곤충에 대한 독성 시험을 위한 생 분석에서 사용한다. 이 배양체의 20㎖의 부분 파본을 정치시키고(세포 부피=3-4㎖), 항생제가 없는 배지에 재현탁시킨다. 현탁액을 이틀간, 잔류 항생제의 세포를 제거하기 위하여 이 배지중에서 배양시킨다. 젖은 와트만 2.3cm 여과지의 2개 써어클을
oz 부분 컵의 바닥에 놓는다. 0.2cm 깊이의 형질 전환 현탁 배양체 세포층을 여과지 디스크상에 놓는다. 세로 부화된 만두카 섹스타(Manduca sexta) 또는 헬리오리스 비레센스(Heliothis virescens) 유충을 각 부분 컵에 놓는다. 비-형질 전환된 현탁 배양 세포상에서 자란 유충으로 대조 그룹을 만든다. 디스크를 2일 간격으로 또는 필요한 대로 보충한다.
만두카 유충은 일반적으로 더욱 많은 식물 물질을 필요로 한다. 비형질 전환된 세포에서 자란 유충의 생장률과 비교하여, 형질 전환된 세포에서 자란 유충의 생장률과 사멸률을 5일후 측정하여, 형질 전환된 면화 세포에서 BT 유전자 생성물의 독성을 확인한다.
[실시예 15]
얇은 무명(치이즈클로스) 시이트위에 놓여진 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens) 알을 노오스 캘로라이나, 라레이(Raleigh)의 노오스 캘로라이나 주립 대학내 담배 곤충 조절 실험실(Tobacco Insect Control Laboratory)로부터 제공받는다. 얇은 무명 시이트를 덮개된 큰 유리 비어커에 옮겨 놓고 29℃에서, 습도를 유지하기 위해 젖은 종이 수건과 함께 항온 처리한다. 그 알은 3일내에 부화한다. 부화후 가능한 빨리, 그 유충(1컵당 1개 유충)을 덮개된
지름으로 잎 디스크를 만들고 그 유충과 함께 그 컵에서 젖은 여과지의 원에 놓는다. 어리거나 노화된 잎을 모두 보이는 적어도 6 내지 10개 잎의 원반이 각 식물에서 시험된다. 잎 디스크를 2일 간격으로 교환하거나 필요하다면 유충에 먹이를 준다. 형질전환된 식물 잎에서 자란 유충이 생장률(모든 복제 벌레의 크기와 결합된 중량)과 사멸률을 비형질 전환의 면화 잎에서 자란 유충의 그것과 비교하다. pCIB10/35SB5(Bc1I)으로 형질 전환된 면화의 디스크상에서 자란 유충은 대조군에 비하여 감소된 생장률과 증가된 사멸률을 보인다.
본 발명의 재생 식물중 일부(5-10%)는 재생 과정의 결과로서 획득된 유전적으로 유전될 수 있는 표현형 변화를 가지는 것으로 나타난다. 이 변화는 소마크로날 변화(Somaclonal variation)로 알려져 있다. 하기 실시예는 재생 과정의 결과로서 소마크로날 변화가 변이주에 새로운 유용한 특성을 도입시키기 위하여 어떻게 사용하는 가를 나타낸다.
[실시예 16]
[진균 병원체에 대한 내성의 면화 재생체]
실시예 1의 방법대로 행하여, 변종 SJ 5와 SJ 4에서 얻은 재생 면화 식물을 튼튼하게 만든후(Hardening 후) 토양에 유치시킨다. 이 식물은 자가-수분 작용을 하는데, F1 재생을 나타내는 종자를 수거한다.
버티실륨(Verticillium)에 더욱 내성인 재생체(소마크로날 변이체)를 얻기 위해, F1 재생체를 버티실륨으로 감염된 밭에 자손일(progeny row) 분석을 위해 심는다. 변이체 SJ4와 SJ5의 종자를 대조군으로서 밭에 심는다. 버티실륨 진균에 대한 모 변이체보다 더욱 내성인 소마크로날 변이체를 전반적인 식물 생장력, 수율과 질병에 관련된 엽상 증후의 부재를 측정함으로써 일부 자손에서 확인하였다(5%). 제33도는 버티실륨 감연된 밭에 심겨진 재생체의 자손의 열을 나타낸다. 제34도는 변종 SJ4의 버티실륨 내성 소마크로날 변종을 나타낸다. 진균 병원체에 대한 내성의 개선은 유전적으로 안정하며 후속 세대로 이어지는 것으로 나타났다.
[실시예 17]
[변화된 생장 체형(habit)의 면화 재생체]
질병 감염의 토양에 심지 않고 면화 육종 묘상에 심는 것을 제외하고는 실시예 13의 과정을 실시한다. F1 재생된 자손의 전체 생장 체형을 대조의 변이체와 비교한다. 모 변이체보다 균일한 생장 체형과 보다 짧은 체세를 갖는 소마크로날 변이체가 확인되었다. Phy6으로 본 발명자들의 시험에서 확인된 하나의 SJ5 재생체는 모 변이체보다 20%가 짧은 체세를 보인다. 이러한 생장 체세는 협소한 열(30″열 간격) 배양 조건하에서 자라는 면화에서는 바람직한 것이다. 이 특성은 유전적으로 안정하며 후세로까지 이어지는 것으로 확인되었다.
[실시예 18]
[개선된 파이버 특성을 갖는 면화 재생체]
재생체의 F1 자손을 면화 육종 묘상에 심고 실과되도록 하는 것을 제외하고는 실시예 13의 과정을 실시한다. 보올(boll)이 성숙해지면, 면화를 수확하여 길이, 균일성, 인장 강도, 탄성력, 마이크로나레(micronaire)를 비롯한 몇가지 파이버 품질 특성 분석을 실시한다. 모 변이체보다 하나 이상의 특성이 크게 개선된 소마크로날 변이체들이 확인되었다. F2 자손(F1의 세포 수분)으로부터의 대표적인 데이타가 하기 표 1에 수록되었다. 별표가 된 수치는 통계적으로 현저하며 후세까지 품종이 개선된 것으로 밝혀진 SJ5 재생체에서의 개선을 표시하고 있다.
[표 1]
[실시예 19]
[향상된 수율의 면화 재생체]
변종 SJ4의 재생체의 F1 자손을 비재생된 대조와 함께 복제된 수율 시험으로 심는 것을 제외하고는 실시예 13의 과정을 실시한다. 똑같은 시험에서 모 변이체보다 균일한 생장 체형과 더욱 활동적인 생장 체형을 나타내는 하나의 변이체는 4%가 많은 면화의 수율을 보였다. 데이터가 하기 표 2에 수록되어 있다.
[표 2]
수율에 있어서의 4% 증가는 1백만 아르의 면화가 재배되는 캘리포니아에서 평균 면화 재배자에게 1아르당 거의 20불의 이윤을 제공한다.
[실시예 20]
[제초제(카나마이신)에 대한 내성을 갖는 면화 재생체]
실시예 6에서 설명된 바의 아가 배지상에 현탁 배양체를 평판화시키는데, 그 배지는 제초제(항생제) 카나마이신(25mg/ℓ)로 보충된 것을 사용한다. 대부분의 세포는 죽지만 일부(1 내지 5%)가 내성이며 생존한다. 이것을 점증 농도의 카나마이신이 보충된 아가-고화된 배지상에서 최종 농도가 50mg/ℓ에 달할 때까지 선택적으로 아배양시킨다. 이 가피로부터 배를 발육시키고 이 내성 배를 카나마이신 내성 식물로 발아시킨다.
[서열 1a]
[서열 1b]
[서열 1c]
[서열 1d]
[발명의 효과]
상기의 설명으로부터 명백한 것처럼, 독특한 표현형 특성의 식물이 수득될 수 있으며 일반적으로 식물 세포 생장을 억제하는 항생제에 대해 내성을 갖는 신규 면화 작물, 제초제, 진균 병원체에 대한 내성 또는 용인성이 증대된 면화 작물 및 수확율이 높고 파이버 품질이 개선된 면화 작물이 제공된다.
Claims (19)
- a) 배축, 떡잎 및 그것의 혼합물에서 선택된 면화 묘목 체외이식조직의 단편을 약 1 분 내지 약 24 시간 동안 항생제에 대한 내성을 포함하는 유전자 암호가 함유된 아그로박테리움 벡터와 접촉시키는 단계; b) 약 16 시간의 광과 8 시간의 단광 사이클하에 약 25℃ 내지 약 35℃ 의 온도로 약 15 내지 약 200 시간 동안, 약 1 내지 약 10 mg/l의 나프탈렌아세트산이 보충된 무라쉬지 앤드 스쿡 배지인 가피 생장 배지로 상기 체외이식조직을 옮겨 체외이식조직으로부터 가피를 발육시키는 단계; c) 상기 아그로박테리움을 사멸시키기에 충분한 농도로 세포탁심이 함유된 신선한 가피 생장 배지로 상기 가피를 옮기는 단계; d) 신선한 일차 가피 생장 배지상에서 상기 가피를 배양하는 단계; e) 잔류 아그로박테리움을 사멸시키기 위해 세포탁심 및 형질전환된 가피가 비감수성을 나타내는 항생제가 부가적으로 항유된 신선한 가피 생장 배지와 상기 가피를 접촉시켜 항생제에 대해 내성이 있는 가피를 선별하는 단계를 포함하는 면화의 형질전찬 방법.
- 제1항에 있어서, 세포탁심이 함유된 가피 생장 배지와 접촉시키기 전에 형질전환된 가피를 세포탁심이 없는 가피 생장 배지에서 헹구는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항생제가 카나마이신인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 항생제가 카나마이신인 방법.
- 현탁액 아배양 성장 사이클 후에, a) 1-10mg/ℓ의 나프탈렌아세트산이 보충된 무라쉬지 앤드 스쿡 배지로부터 형성된 배형성성 가피와 세포를 회수하는 단계; b) 면화 세포를 1-24시간 동안 현탁액 생장 조건을 유지하면서 면화에 대해 이종인 형질발현가능한 유전자 서열이 함유된 아그로박테리움 벡터가 포함된 가피 생장 배지에서 상기에서 회수한 세포와 가피를 재현탁시키는 단계; c) 상기 아그로박테리움이 포함된 가피 생장 배지로부터 현탁된 세포와 가피를 회수하는 단계; d) 상기 아그로박테리움을 사멸시키기 위하여 아그로박테리움에 대해 독성이 있는 항생제로 상기 형질전환된 세포와 가피를 처리하는 단계; e) 형질전환되지 않은 면화 세포와 배형성성 가피 세포로부터 상기 형질전환된 면화 세포와 가피를 선별하는 단계; f) 세포 현탁액을 여과하여 약 600 마이크론 이상의 배형성성 가피를 제거하는 단계를 포함하여, 가피 생장 배지중에서 현탁액 배양되는 면화 세포로부터 형질전환된 배형성성 면화 가피를 생성하는 방법.
- 제5항에 있어서, 현탁액을 여과하기 전에 상기 형질전환된 세포와 가피를 항생제로 처리하는 방법.
- 제5항있어서, 현탁액을 여과하기 전에 상기 형질전환된 세포와 가피를 선별하는 방법.
- 제6항에 있어서, 현탁액을 여과하기 전에 상기 형질전환된 세포와 가피를 선별하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 형질전환된 세포와 배형성성 가피를 현탁액의 여과후 항생제로 별도 처리하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 형질전환된 세포와 배형성성 가피를 현탁액 여과후 선별하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 형질전환된 세포와 배형성성 가피를 현탁액 여과후 선별하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 아그로박테리움에 대해 독성이 있는 항생제가 세포탁심인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 아그로박테리움에 대해 독성이 있는 항생제가 세포탁심인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 아그로박테리움에 대해 독성이 있는 항생제가 세포탁심인 방법.
- 약 7 내지 약 14 일의 현탁액 아배양 생장 사이클 후에, a) 1-10mg/ℓ의 나프탈렌아세트산이 보충된 무라쉬지 앤드 스쿡 배지로부터 세포를 회수하는 단계; b) 현탁된 세포를 1-24시간 동안 현탁액 생장 조건을 유지하면서 면화에 대해 이종인 형질발현가능한 유전자 서열이 함유된 아그로박테리움 벡터가 포함된 가피 생장 배지에서 상기 세포를 재현탁시키는 단계; c) 상기 아그로박테리움이 포함된 가피 생장 배지로부터 상기 세포를 회수하는 단계; d) 아그로박테리움이 없는 신선한 가피 생장 배지중에서 상기 세포를 추가로 아배양하는 단계; e) 상기 현탁액을 여과하여 약 600 마이크론 이상의 배형성성 가피를 제거하는 단계; f) 아그로박테리움에 대해 독성이 있는 항생제를 함유하는 가피 생장 배지중에 잔류 세포를 재현탁시키는 단계; g) 상기 아그로박테리움에 대해 독성이 있는 항생제로 상기 배형성성 가피를 처리하는 단계; h) 형질전환되지 않은 세포와 배형성성 가피로부터 형질전환된 세포와 배형성성 가피를 선별하는 단계를 포함하여, 가피 생장 배지중에서 현탁액 배양되는 면화 세포로부터 배형성성 면화 가피를 생성하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 항생제가 카나마이신인 방법.
- 약 7 일 내지 약 14 일의 현탁액 아배양 생장 사이클 후에, a) 1-10mg/ℓ의 나프탈렌아세트산이 보충된 무라쉬지 앤드 스쿡 배지로부터 세포를 회수하는 단계; b) 현탁된 세포를 1-24시간 동안 현탁액 생장 조건을 유지하면서 항생제 내성 유전자 서열이 포함된 아그로박테리움 벡터가 함유된 가피 생장 배지중에 상기 세포를 재현탁시키는 단계; c) 상기 아그로박테리움이 함유된 가피 생장 배지로부터 상기 세포를 회수하는 단계; d) 아그로박테리움이 없는 신선한 가피 생장 배지중에서 상기 세포를 세척하는 단계; e) 아그로박테리움이 없는 신선한 가피 생장 배지중에서 상기 세포를 추가로 아배양시키는 단계; f) 상기 현탁액을 여과하여 약 600 마이크론 이상의 배형성성 가피를 제거하는 단계; g) 세포탁심이 함유된 가피 생장 배지중에 잔류 세포를 재현탁시키는 단계; h) 현탁된 잔류 세포와 제거된 배형성성 가피를 형질전환된 세포가 비감수성을 나타내는 항생제와 접촉시켜 형질전환된 세포를 선별하는 단계를 포함하여, 가피 생장 배지중에서 현탁액 배양되는 면화 세포로부터 형질전찬된 면화 가피를 생성하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 항생제가 카나마이신인 방법.
- 노팔린 합성효소 프로모터, Tn5 로부터의 네오마이신 포스포트란스퍼라제II 암호부 및 헤르페스 심플렉스 비루스 티미딘 키나제 유전자로부터의 터미네이터를 포함하는 면화에서 형질발현 가능한 키메릭 유전자에 인접한 식물 게놈과 통합될 수 있으며 항생제 카나마이신과 G418에 대한 내성을 부여할 수 있는 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)로부터의 두개의 T-DNA 우측 보더(border) 서열을 포함하는, 면화 작물에 대하여 항생제 내성을 부여하는 벡터.
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