JPH084434B2 - 綿の再生及び形質転換 - Google Patents

綿の再生及び形質転換

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JPH084434B2
JPH084434B2 JP5214729A JP21472993A JPH084434B2 JP H084434 B2 JPH084434 B2 JP H084434B2 JP 5214729 A JP5214729 A JP 5214729A JP 21472993 A JP21472993 A JP 21472993A JP H084434 B2 JPH084434 B2 JP H084434B2
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は綿特にゴシピウム・ヒルスツムＬ．（Ｇｏｓｓ
ｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）種の綿の植物再
生及び形質転換に向けられたものである。近年、異った
分類学的群に属する植物からの各種起源の多くの組織が
ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織培養において確立されている。そ
のような培養の生育及び分化を調節する幾つかの因子も
又決定されている。異った植物ホルモン群及び直接的或
いは間接的に作用する植物成長制御体の間の微妙な相互
作用の確立は単独或いは相乗的組合せである程度細胞、
組織及び器官の間に存在するある種の相関関係への洞察
を与えてきた。しかしながら、この情報は決して完全で
はない。
【０００２】しばらくの間、植物細胞培養液は非分化増
殖状態に無限に維持されうることが知られていた。しか
しながら、最近になって組織、器官或いは全植物生物体
の再分化が実験的に誘発されうることが見出された。ス
クーグ（Ｓｋｏｏｇ）等による“Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄｏｒ
ｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉ
ｓｓｕｅｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，”
Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：１８−１
３０，１９５８，（ここにおいて準用する）により、サ
イトキニン対オーキシンの相対比がタバコ髄組織におけ
る器官発生の性質を決定することが示されている。カル
ス培養液からの再組織或いは再生は、共に究極的にはｉ
ｎ ｖｉｔｒｏの再発達に導く苗発生原基或いは胚の形
成を含むものである。器官発生対胚発生についての傾向
は、尚関連する種及び化学的及び／又は物理的性質のあ
る種の引金因子に応じて異る。
【０００３】１９０２年に、ハーバーラント（Ｈａｂｅ
ｒｌａｎｄｔ）、“Ｋｕｌｔｕｒｖｅｒｓｕｃｈｅ ｍ
ｉｔ ｉｓｏｌｉｅｒｔｅｎ ｐｆｌａｎｚｅｎｚｅｌ
ｌｅｎ，”Ｍａｔ．ＫＩ．Ｋａｉｓ．Ａｋａｄ．Ｗｉｓ
ｓ．Ｗｉｅｎ １１１：６２（ここにおいて準用する）
は、植物細胞は全植物を産出する能力を有すると仮定
し、これが何時の日か細胞培養において示されるであろ
うことを予言した。１９６５年に、ライナート（Ｒｅｉ
ｎｅｒｔ）“Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｕｂｅｒ
ｄｉｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｅ ａｎ Ｇｅｗｅ
ｂｅｋｕｌｔｕｒｅｎ，”Ｂｅｒ．ｄｔ．Ｂｏｔ．Ｇｅ
ｓ．７１：１５、及びスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｄ）
等“Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌ
ｌｓ／ＩＩ、Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌ
ｔｕｒｅｓ ｇｒｏｗｎ ｆｒｏｍ ｆｒｅｅｌｙ ｓ
ｕｓｐｅｎｄｅｄ ｃｅｌｌｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．
４５：７０５−７０８、は独立に研究しながらｉｎ ｖ
ｉｔｒｏの体細胞胚発生を確認した。これらの両文献は
ここに引用する。実験的に体細胞胚発生を操作するに際
し、細胞培地の二成分、オーキシン及び窒素源が決定的
役割を果たすものと思われる。又、体細胞胚発生の過程
は、二つの段階、先ず高濃度のオーキシンの存在下にお
ける胚発生能力を有する細胞の誘発及び第二にオーキシ
ンの不存在下或いは低濃度における胚細胞集団の胚への
発達として起こることが示された。器官発生或いは胚発
生の誘発はカルスにおける区別された構造パターンに導
く。幾つかの植物種の詳細な研究は、苗木、芽或いは胚
の発達に導く発達経路についてある種の一般化を行うこ
とを可能にした。組織培養技術の器官発生或いは胚発生
を介しての植物の再生への適用は、おそらく工業的応用
への継代発生における基本的研究の中で最も重要な寄与
を残すものと思われる。
【０００４】ビーズレー（Ｂｅａｓｌｅｙ）は１９７１
年に綿の胚珠の培養液におけるカルスの形成を報告して
いる［“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｆ
ｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｃｏｔｔｏｎ ｏｖｕｌｅ
ｓ，”Ｂｉｏｓ ｃｉｅｎｃｅ２１：９０６：９０７、
１９７１、ここにおいて準用する］。後にスー（Ｈｓ
ｕ）等 ［“Ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
（２−ｃｈｌｏｒｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ
（ＣＰＡ）ａｃｉｄ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｏｔ
ｔｏｎ ｏｖｕｌｅｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ
３６：１５０−１５３、１９７６、ここにおいて準用す
る］は、培地へのＣＰＡ及びジベレリン酸の添加による
胚珠から得られたカルスの生育の刺激を観察している。
その他の外植片例えば（ａ）葉［デビス（Ｄｅｖｉｓ）
等、“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃａ
ｌｌｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓ
ｐｅｎｓｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｏｋｒａ（Ｈｉｂｉｓｃ
ｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）ａｎｄ ｃｏｔｔｏｎ
（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ），”Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ９：３９５−３９８、１９７４（ここにお
いて準用する）］；（ｂ）胚軸［シェンク（Ｓｃｈｅｎ
ｋ）等、“Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ａｎｄ
ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ｐｌａｎｔｃｅｌｌ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ，”Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ． ５０：１
９９−２０４、１９７２（ここにおいて準用する）］；
及び（ｃ）子葉［ラニ（Ｒａｎｉ）等、“Ｅｓｔａｂｌ
ｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ，”Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．Ｌｅ
ｔｔ． ７：１６３−１６９、１９７６、（ここにおい
て準用する）］からのカルス培養液がゴシピウム・ヒル
スツム及びＧ．アルボレウム（Ｇ．ａｒｂｏｒｅｕｍ）
に対して確立されている。
【０００５】カッターマン（Ｋａｔｔｅｒｍａｎ）等
［Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆａ ｓｔｒｏｎｇ
ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｕｐｏｎ ｉｎｉｔ
ｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ，”Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ ４０：９８−１０１、１９７７
（ここにおいて準用する）］は、Ｇ．バーバデンス
（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）の子葉からのコンパクト
なカルスが根を形成し、一つの場合において完全な植物
の再生も又得られたことを観察した。スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）等［“Ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏ
ｗｔｈ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ，Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ，”
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ １３：３２９−３３４、１９７７
（ここにおいて準用する）］は、Ｇ．アルボレウムの胚
軸−由来の開始及び二次培養の条件を決定した。引続き
プライス（Ｐｒｉｃｅ）等［“Ｃａｌｌｕｓ ｃｕｌｔ
ｕｒｅｓ ｏｆ ｓｉｘ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｃｏ
ｔｔｏｎ（Ｇｏｓｓｙｐｕｉｍ Ｌ．）ｏｎ ｄｅｆｉ
ｎｅｄ ｍｅｄｉａ，”Ｐｌ．Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．
８：１１５−１１９、１９７７及び“Ｔｉｓｓｕｅ ｃ
ｕｌｔｕｒｅ ｏｆＧｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅ
ｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎ ｃｏｔ
ｔｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｒｏｐ ｉｍｐ
ｒｏｖｅｍｅｎｔ，”Ｂｅｌｔｗｉｄｅ Ｃｏｔｔｏｎ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｃｏｎ
ｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｃ．ｐｐ．５１−５５、１９７
７、ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｔｔｏｎ
Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｍｅｍｐｈｉｓ（各々ここに準用す
る）］は５種のゴシピウムからのカルスの開始及び二次
培養の条件を規定した。
【０００６】多くの植物種の培養液を確立する際の共通
の問題の一つは、培養培地中の外植片の「褐色片」であ
る。綿においては、このポリフェノール類の浸出はスク
ロースをグルコースで置換し、及び培養液を１０日毎に
新鮮な培地に移すことにより克服された。グルコース補
給培地上での３〜４回の継代後、褐色は完全に消滅し、
培養液をスクロース補給培地に戻すことができた。誘発
に伴う困難があったものの、二次培養時のカルスの褐色
及び維持はある種のゴシピウム種については克服され、
カルス培養液から植物を再生する全ての試みは不首尾で
あるか幾つかの時間のかかる工程を含むものであった。
タビドニス及びハミルトン（Ｄａｖｉｄｏｎｉｓ ａｎ
ｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ）［“Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅ
ｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｃａｌｌｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ
ｏｆ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ，”
Ｌ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３２：８９−９
３、１９８３、（ここに準用する）］は培養の開始後２
年後に終に胚の形成されたことを報告している。多くの
生育物質例えば植物ホルモン及び合成成長制御化合物が
植物再生をｉｎｖｉｔｒｏでもたらすために細胞培養培
地中に利用されてきたが、異った物質の植物再生に及ぼ
す効果の一般化は到達されておらず、特定化は更に少な
い。事実、同一物質が異った植物種に適用された場合に
は成長を制御、向上させるか或いは全く効果がないかの
いずれかである。従って、ある種の標準的操作とは別
に、任意の新しい種に対する植物再生のための作業処方
に到達する困難な課題が必然的に残り、又多くの大きさ
の順序により植物形質転換を達成するより困難な課題が
残る。本発明は実生から切出されたセグメントからの綿
植物の迅速な再生方法を提供する。説明される方法は高
度の繰返し可能性及び信頼性を与え、又それは綿植物の
遺伝子形質転換を可能にする。
【０００７】発明の概要 綿植物の体細胞からの任意の形質転換を伴った再生方法
が提供される。種子が殺菌され、暗所で生育されて実生
にされる。実生は外植片の一源であり、通常胚軸及び子
葉である。もう一つの源は発達する果実の未熟接合子胚
である。外植片を細分し、第一のカルス生育培地（グル
コースを含有）中でカルスが外植片からフェノール分泌
と対抗し、外植片の細胞を刺激して分割及び増殖するよ
うにさせる培養培地上で発達させる時間培養する。カル
スはフェノール分泌段階を通過後、カルスを胚発生カル
スに発達させる新鮮なカルス生育培地（スクロースを含
有）に移される。胚を次いで二次培養により多い胚発生
カルスを産出するか或いはもう一つの生育培養（植物発
芽培地）に移し、苗を発達させるのに十分な期間培養
し、それをもう一つの生育期間後に温室に移し、次いで
畑に移し、それから種子を栽培することのできる成熟植
物に成長させる。胚は又浮遊液中で培養することもでき
る。この操作においては生育期間後に約６００ミクロン
より大きいより好ましくは約８００ミクロンより大きい
胚発生塊を含有する胚を単離し、植物産生に利用する。
より小さいカルスは植物形成カルスに成長するようにカ
ルス生育培地に再循環されるか或いは胚源として維持さ
れる。
【０００８】形質転換は外植片、カルス或いは浮遊液発
達の段階で生ずる。形質転換は外植片、カルス及び／又
は胚発生カルスを綿に外来性の発現性遺伝子配列を含有
するアグロバクテリウムベクターの作用に遺伝子が細胞
内に転移するのに十分な時間曝すことを含む。残存アグ
ロバクテリウムを次いでアグロバクテリウムに対して毒
性の抗生物質を用いて死滅させる。この後形質転換され
た苗に発達するための形質転換細胞及び／又は胚発生カ
ルスの選択を行った。浮遊培養においては、形質転換及
び／又は選択は細胞及び胚発生には余りにも未熟なカル
スからの胚発生カルスの分離前或いは後に行われうる。
独特の表現型形質の植物を得ることができ、通常植物細
胞成長に抑制的な抗生物質に対して耐性を有する新規綿
植物、殺草剤、真菌病原体に対して増大した耐性を有す
る綿植物及びより良好な収率及び改良された繊維品質を
示す綿植物が提供される。
【０００９】具体的説明 本発明は綿植物特にゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓ
ｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）属の植物の畑における
伝播のための体細胞からの組織培養による再生に向けら
れたものである。任意にこれらの細胞は外来遺伝子情報
を含むように形質転換されてよい。
【００１０】本発明に従って有用な各種生育培地は下記
の通りである。
【００１１】
【００１２】
【００１３】上記の溶液の任意のものを用い、下記操作
を用いて１リットル培地を調整する。ベースとして２０
０ｍｌのイオン交換水を提供し、各種原液を１リットル
について述べられた量で添加する。例えば、最終培地に
おいて１０ｍｌの原液が用いられるべき場合には、１０
ｍｌの原液が２００ｍｌの蒸留水に添加される。塩類の
溶液中の存在を確保するために原液は通常上記配合に示
される順序に従って添加される。十分に混合後、追加の
イオン交換水を混合物に添加し、それを必要な５００ｍ
ｌにし、混合物のｐＨを約５．８〜６．０に調整する。
最終容量を１０００ｍｌにし、通常組織培養寒天或いは
その等価物を約０．８重量％の濃度まで添加する。これ
は流動性を減少するために溶液に何等かの固体性を与え
るためのものである。混合物を次いで１５〜２１ポンド
／平方インチにおいて約５〜２０分間消毒して汚染生物
を殺し、適当にラベルして無菌培地として貯蔵する。簡
単に述べると、綿の種子を殺菌し、基礎寒天培地などの
適当な種子発芽培地上において暗所で実生を産生するの
に十分な時間発芽させる。通常の生育期間は約４週間ま
で、典型的には７〜１４日間である。外植片のセグメン
トを実生から切出す。外植片は胚軸成いは子葉から得ら
れるものが好ましい。或いは又、温室或いは畑に生育し
た綿植物の発達する果実から得られる未熟胚を外植片と
して同様に用いることができる。試験セグメントは適当
な第一のカルス生育培地、好ましくはグルコースを含む
完全ムラシゲ及びスクーグ（ＭＳ）栄養培地上で培養さ
れる。生育は約２５〜約３５℃の温度において約１６時
間の光及び約８時間の闇の光／闇サイクルにおいて培養
することにより行われる。培養は、培地が栄養成分が消
費されるに従って定期的間隔で交換され、約３〜約４時
間未分化カルスが形成されるまで継続される操作であ
る。カルスを第二カルス生育培地、好ましくは炭素源と
してナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及びスクロースを補給さ
れたＭＳ培地に移し、３〜４カ月間培養されて胚を産出
する。
【００１４】胚は次いで第二カルス生育培地中に維持さ
れ、胚供給を維持するか或いは好ましくはカゼイン加水
分解物及びアンモニウム源を含有するビーズレー及びテ
インの培地などの植物発芽培地に移され、２〜３週間培
養されて苗を産出する。苗は高湿度条件下に土壌に移さ
れ、次いで温室内のより大きいポットに移植され、最終
的に成熟まで成長するために畑に移される。ここに簡単
に説明した方法を用いて首尾良く組織及び浮遊培養によ
りゴシピウム・ヒルスツム種の綿における体細胞胚形成
を誘発し、最終的にＳＪ２、ＳＪ４、ＳＪ５、Ｂ１６４
４、Ｂ１８１０、Ｂ２７２４、ＧＣ５１０及びＣ１を含
むゴシピウム・ヒルスツムのアカラ品種及び非アカラ
（Ａｃａｌａ）「ピッカー」シオクラ（Ｓｉｏｋｒａ）
及び「ストリッパー」種ＦＣ２０１７のカルス培養物か
ら得られる胚軸及び子葉から成熟植物を得た。培養物
は、新規形質或いは性質を有する正営な植物に形質転換
された。より詳細には、この操作は先ず綿種子の殺菌を
含む。適当な殺菌は種子を９５％エタノールに２〜３分
間浸漬し、無菌水中で１回以上濯ぎ、次いで種子を次亜
塩素酸ナトリウムの１５％溶液中に１５〜２０分間浸漬
し、及び無菌水で数回濯ぐことにより達成される。
【００１５】殺菌種子を次いで種子発芽培地と称される
第一の培地に移す。種子発芽培地は通常の塩含量の一つ
である。適当な発芽培地はホワイトの培地或いは半強度
ＭＳ培地（半分の成分強度）を含む基礎寒天培地であ
る。発芽は通常暗所内で約１２〜約１４日間に亘って起
こる。胚軸及び／又は子葉が発芽した種子から好ましく
切出され、セグメントに細分或いは切断され、生育物質
を補給されたＭＳ培地などの第一のカルス生育培地上で
培養される。現在好ましい培地は、約０．４ｍｇ／ｌの
チアミン塩酸塩、約３０ｇ／ｌのグルコース、約２ｍｇ
／ｌのナフタレン酢酸、約１ｍｇ／ｌのキネチン、普通
の生育制御剤及び約１００ｍｇ／ｌのイノシトール及び
寒天を補給されたＭＳ培地である。チアミン塩酸塩は通
常０．１〜約０．５ｍｇ／ｌの濃度範囲であり得、グル
コースは約２０〜約３０ｇ／ｌ、ナフタレン酢酸は約１
〜１０ｍｇ／ｌ、キネチンは約１〜約２ｍｇ／ｌ、及び
イノシトールは約５０〜約１００ｍｇ／ｌの範囲であり
うる。培養液は約２５〜約３５℃、好ましくは約３０℃
の温度において約１６時間の光及び約８時間の闇の光／
闇サイクルで維持される。約２０００〜４０００ルク
ス、より好ましくは約３０００〜４０００ルクスの光強
度を有するのが好ましい。
【００１６】形成されたカルスは３〜４週間間隔で定期
的に二次培養され、新鮮な第一のカルス生育培地に移さ
れる。外植片の培養においては、培養培地の黒色化によ
り証明されるように、外植片からのフェノール化合物の
分泌が生じうる。この場合には、培地はより規則的に交
換される。黒色化は培養培地を１０日間毎に交換するこ
とにより避けられた。通常３回〜５回の培地交換後にフ
ェノール分泌が消滅する。これが生ずる場合には、第一
のカルス生育培地をスクロースを含有する或いは炭素源
としてスクロースを補給された新鮮なカルス生育培地で
置換することができる。３〜４週間の培養後、活発なカ
ルスが外植片の切断表面上に発達する。これらのカルス
を次いで好ましくは、約１〜約１０ｍｇ／ｌ、好ましく
は約１〜約５ｍｇ／ｌのＮＡＡと組合わされたＭＳ培地
である新鮮な第二のカルス生育維持培地に移す。サイト
キニンは０〜約１ｇ／ｌの濃度で用いられる。カルス生
育培地は種子発芽培地よりも１０倍より多い塩を含有す
る高塩含量培地として特徴付けられる。第一及び第二の
カルス生育培地の本質的相違は炭素源である。フェノー
ル分泌の間にはグルコースが用いられる。分泌が停止し
た時点ではスクロースが用いられる。カルス生育培地の
残りは同一のままであるか又は変化させることができ
る。これらのカルスを通常約５〜７継代後或いはカルス
の一部にアントシアニン色素形成が明らかとなるまで新
鮮なカルス生育培地に定期的間隔で移し、その後黄白色
胚発生カルスが発達する。
【００１７】胚発生カルスを次いで選択的に二次培養
し、規則的二次培養により維持する。胚発生カルスは各
種発達段階の体細胞胚を含有する。あるものは小苗への
生育を可能にする発達点に到達している。しかしなが
ら、殆んどは更に発達を必要とする。あるものは発芽ま
で進行しており、その他のものは将来の使用のための胚
源として維持される。第２図を参照すると、異った大き
さの体細胞胚１２を有し、あるものが発生する葉１４及
び根１６を有するアカラ綿１０のカルスを示すこの段階
の発達が図示されている。第３図は、後期球状段階で単
離された体細胞胚を図示する。第４図を参照すると、体
細胞胚をここで胚発芽培地と称される通常アンモニア或
いはその等価物の形態での窒素に富んだ培地である第三
の生育培地に移すことにより更に発達が達成される。適
当な培地としては、好ましくは約５００ｍｇ／ｌまでの
カゼイン加水分解物を補給されたビーズレー及びテイン
の培地が挙げられる。発芽は体細胞胚から起こり、２〜
３週間以内に６枚までの葉及び良好な根系統のよく発達
した苗１８が通常形成される。
【００１８】この段階において、苗を小さな塊で土壌に
移し、高湿度条件下に標準的インキュベーター内で生育
される。温度は通常約２５〜３０℃に維持される（第７
図参照）。ある生育期間後、小植物を温室内のより大き
いポットに移植し、その後畑に移植して成熟まで生育す
る。生育植物の全ては好ましくは温室内で生育させなが
ら或いは畑条件内で自己受粉するのが好ましく、種子を
採集する。種子を次いで発芽させ、４〜５週令の実生を
後代列試験その他の標準的植物育成操作のために畑に移
す。上記操作を実施することにより約６〜約８カ月の期
間中に約３５％の外植片から生育可能な綿植物が産出さ
れる。
【００１９】胚発生綿細胞の浮遊培養液中における増殖 生育胚発生カルスを植物に発達させる代りに、カルスを
より小さい細片に切断し、更に浮遊培養技術を用いて発
達させてもよい。この操作においては、浮遊濃度は通常
第二カルス生育培地（ＮＡＡを補給されたＭＳ培地）な
どの８ｍｌのカルス生育培地に対して約７５０〜１００
０ｍｇのカルス部数であり、浮遊状態で生育される。好
ましい実施態様において、カルスの浮遊液はＴ管内に挿
入され、約１６時間の光及び約８時間の闇の光方式下に
約１．５ｒｐｍで回転するローラードラム上に置かれ
る。生育は約３〜４週間である。約３〜４週間毎に、浮
遊液を濾過して第５図の群に図示されるような胚発生カ
ルスの大きい細胞塊を除去し、第６図に示されるように
後期球状段階において単離される。濾液は３〜４週間の
生育期間栄養培地に戻される。この操作を３〜４週間の
間隔で大きい塊の栽培と共に何回も繰返し、その時点で
培地を全部或いは部分的に新鮮なカルス生育培地で補給
する。好ましくは、４容以上の新鮮な培地を約１容の残
存浮遊液に対して添加する。現在用いられるフィルター
は、約６００ミクロンより大きい、好ましくは８００ミ
クロンより大きいメッシュ径を有するのが好ましく、６
００ミクロン未満の粒径を有する細胞集団は植物に発達
しないのに対し、６００ミクロンより大きい、好ましく
は８００ミクロンより大きい細胞集団は胚発生となり生
育可能な植物に発達することのできる十分な分化を行っ
たことが観察された。
【００２０】浮遊培養は又胚発生カルスを液体胚生育培
地を約２０ｍｌのＭＳ及び２．０ｍｇ／ｌ濃度のＮＡＡ
の量で含有するＤｅｌｏｎｇ或いは三角フラスコなどの
フラスコに移すことによって開始することもできる。フ
ラスコをジャイロ式シェーカー上に置き、毎分約１００
〜１１０ストロークで振盪する。３〜４週間後に、浮遊
液は上記のような濾過に適したものになり、大細胞塊を
植物発達のために取出す。より典型的には、第３回或い
は第４回二次培養後に、Ｔ管或いはＤｅｌｏｎｇ或いは
三角フラスコからの細胞浮遊液をＮＡＡ（２．０ｍｇ／
ｌ）を含有する寒天−固化ＭＳ培地或いはカゼイン加水
分解物（５００ｍｇ／ｌ）及び窒素源を含有するビーズ
レー及びテインの培地上にプレート培養する。３〜４週
間以内に発達する胚を有する胚発生カルスが目に見える
ようになる。同様に、より大きい塊を上記培地上にプレ
ート培養した場合には、発達する胚を有する胚発生塊を
生ずる。両浮遊成長方法において、ＭＳ培地を用いて胚
の促進及び／又は保持を行うのに対し、迅速植物発達の
ためには発芽培地が用いられる。
【００２１】実生外植片は必要に応じて形質転換するこ
とができる。この操作においては、殺菌種子の子葉及び
／又は胚軸セグメントを用いることができる。セグメン
トを抗生物質、例えばカナマイシンに対する耐性などの
コード（遺伝マーカー）を含有するアグロバクテリウム
ベクターを含む培地内にベクターが遺伝子を外植片の細
胞に転移するのに十分な時間置く。通常１分乃至２４時
間の範囲の接触時間が用いられ、間欠的或いは静かな撹
拌が伴なわれる。外植片を次いで取出し、ＮＡＡ（２ｍ
ｇ／ｌ）を補給したＭＳ培地などの寒天−固化カルス生
育培地上に置き、２５〜３５℃、好ましくは３０℃で１
６：８時間の光：闇の方式で１５〜２００時間インキュ
ベートする。
【００２２】インキュベーション後、外植片を好ましく
は２００ｍｇ／ｌの抗生物質セフォタキシムを補給した
同一培地に移す。セフォタキシムは、残存するアグロバ
クテリウムの増殖及び植物組織の過剰成長を防止するた
めに含ませられる。或いは又は外植片をＮＡＡ（２ｍｇ
／ｌ）を補給したＭＳ培地で濯ぎ、更に濯ぐ前に４〜２
８時間インキュベートし、次いでセフォタキシムを含有
する同一培地をインキュベートすることができる。新鮮
な培地上での４〜５週間の培養の終りに、発達カルス即
ち主たるカルスを主たる外植片組織の残部から分離し、
ＮＡＡ（２ｍｇ／ｌ）、セフォタキシム（２００ｍｇ／
ｌ）及び硫酸カナマイシンなどの抗生物質（５０ｍｇ／
ｌ）を含有するＭＳ培地に移される。抗生物質（カナマ
イシン）の存在下において成長するその能力により同定
される形質転換された主たるカルスを選択し、胚を発達
させ、発芽させ、及び植物を上記操作に従って得る。細
胞浮遊液の形質転換を達成することも実施可能である。
７〜１４日間、通常７〜１０日間の通常の二次培養生育
細胞に引続いて、細胞を沈澱させて上澄液を除去する。
残存濃縮浮遊細胞を４０００×ｇで５分間遠心分離さ
せ、過剰の培地を廃棄する。濃縮浮遊培養液をアグロバ
クテリウムを含有する８ｍｌの同一培地に再浮遊させ
る。浮遊液を「Ｔ」管に移し、適当に撹拌してインキュ
ベーションを行う。
【００２３】細菌付着及びＤＮＡ転移を行わせるための
約２〜２４時間、好ましくは３〜５時間のインキュベー
ション後、浮遊液を取出し沈澱させる。細菌を含む上澄
液を廃棄し、細胞を新鮮な培地で洗浄する。浮遊液は必
要に応じて約５分間遠心分離し、上澄液を除去してよ
い。いずれの場合にも、細胞を同一培地に再浮遊させ、
「Ｔ」管或いはフラスコに移して浮遊二次培養を再開す
る。この目的は細胞培養液内に残される未付着アグロバ
クテリウムベクターの量を最少にすることである。
【００２４】約１５〜約２００時間、典型的には１５〜
約７２時間、好ましくは１８〜２０時間後に、浮遊液を
濾過して大きい塊を除去し、新鮮な液体培地で洗浄して
沈殿させる。浮遊液をセフォタキシム（２００ｍｇ／
ｌ）を含有する新鮮な液体培地に再浮遊させ、ペトリ皿
内の固化培地上でプレート培養する。或いは又、浮遊液
をセフォタキシムを含有する新鮮な培地に再浮遊させ、
更に４〜２８日間生育させてからペトリ皿内の固化培地
上でプレート培養してもよい。細胞濃度は１容の浮遊細
胞プラス３容のセフォタキシムを有する培地である。１
０〜３００ｍｇ／ｌ好ましくは約２０〜２００ｍｇ／ｌ
より好ましくは約４０〜８０ｍｇ／ｌのカナマイシンが
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝
子を発現する形質転換細胞の選択のために培地内に含ま
せられる。選択濃度のカナマイシン中で増殖する細胞及
び胚を更に上記の如くここに説明する操作に従って全植
物に発芽及び再生することのできる成熟体細胞胚に生育
させる。
【００２５】上記操作を用い、第９図を参照して形質転
換の結果である各種細胞コロニーが示される。抗生物質
カナマイシンに対して耐性を示す綿細胞２０が存在す
る。第１０図を参照すると、抗生物質ＭＳ培地上の体細
胞胚に発達する形質転換カルスが示されている。第１１
図はカナマイシン耐性を有するように確立され殺草剤グ
リホセードに耐性を有するように形質転換された形質転
換体細胞胚を示す。第１２図は第１１図の胚からの植物
を示す。第１３図はＭＳ培地上に生育する鱗翅目昆虫に
耐性を有するように形質転換された細胞を示し、第１４
図においてはビーズレー及びテインの培地に移されたも
のを示し、第１５図は第１４図の苗のより成熟した苗へ
の更なる発達を示す。
【００２６】綿再生 実施例１ 子葉外植片から出発する植物の再生 ゴッシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉ
ｒｓｕｔｕｍ）のアカラ（Ａｃａｌａ）綿品種ＳＪ２の
種子を、９５％アルコールと３分間接触させて殺菌し、
次いで無菌水で２回濯ぎ、次亜塩素酸ナトリウムの１５
％溶液に１５分間浸漬し、次いで無菌水で濯いだ。殺菌
種子を暗所中で基礎寒天培地上で約１４日間発芽させて
実生を産出した。この実生の子葉を２〜４ｍｍ２のセグ
メントに切断し、それを無菌的に０．４ｍｇ／ｌのチア
ミン−ＨＣｌ、３０ｇ／ｌのグルコース、２．０ｍｇ／
ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、１ｍｇ／ｌのキネチ
ン、１００ｍｇ／ｌのｍ−イノシトール、及び寒天
（０．８％）を補給されたムラシゲ及びスクーグ（Ｍ
Ｓ）主及び従塩類よりなるカルス誘発培地に移した。培
養物を約２０００〜４０００ルクスの光強度を与える蛍
光光線（冷昼光）を有するパーシブルインキュベーター
内で１６時間の光及び８時間の闇の条件下で約３０℃に
おいてインキュベートした。
【００２７】カルスは培養組織セグメント上に３〜４週
間以内に形成され、白色乃至灰−緑色であった。形成さ
れたカルスを１００ｍｇ／ｌのｍ−イノシトール、２０
ｇ／ｌのグルコース、２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸（Ｎ
ＡＡ）及び寒天よりなるカルス生育培地上に３週間乃至
４週間毎に二次培養した。組織外植片をカルス誘発培地
上に最初に置いた後４〜６カ月後に体細胞胚が形成され
た。カルス及び胚は３週間乃至４週間毎に新鮮なカルス
生育培地上に二次培養することによりカルス生育培地上
に維持した。組織片上に形成された体細胞胚は新鮮なカ
ルス生育培地或いはビーズレー及びテイン（Ｂｅａｓｌ
ｅｙ ＆ Ｔｉｎｇ）の培地（胚発芽培地）のいずれか
に外植した。体細胞胚から形成された体苗を１２００ｍ
ｇ／ｌの硝酸アンモニウム及び有機窒素源として５００
ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物を含有するビーズレー及
びテインの培地上に移した。培地を凝固剤（Ｇｅｌｒｉ
ｔｅ）により固化し、苗をマゼンタボックス内に入れ
た。体細胞胚は約３カ月以内に苗に発達した。これらの
苗は６枚乃至８枚の葉を根に付け、約３〜８インチの長
さであり、土壌に移し、高湿度下にインキュベーター中
で３乃至４週間、次いで温室に移した。硬化後、植物は
又開放耕地にも移された。
【００２８】実施例２ 培地として、全培地成分が半分の濃度に減少された半強
度ＭＳ培地を用いた他は実施例１の操作を繰返した。本
質的に同一の結果が得られた。
【００２９】実施例３ 外植片が胚軸ゼクメントとされた他は実施例１及び２の
操作を繰返した。本質的に同一の結果が得られた。
【００３０】実施例４ 外植片が未熟接合子胚とされた他は実施例１及び２の操
作を繰返した。本質的に同一の結果が得られた。
【００３１】実施例５ アカラ綿品種ＳＪ４、ＳＪ５、ＳＪ２Ｃ−１、ＧＣ５１
０、Ｂ１６４４、Ｂ２７２４、Ｂ１８１０、ピッカー品
種Ｓｉｏｋｒａ及びストリッパー品種ＦＣ２０１７を用
いて実施例１及び２の操作を繰返した。全て首尾よく再
生された。
【００３２】実施例６ 体細胞胚を形成することのできるカルスを得る程度まで
実施例１の操作を繰返した。約７５０〜１０００ｍｇの
活発に生育する胚発生カルス片をＴ管内の０．４ｍｇ／
ｌチアミンＨＣｌ、２０ｇ／ｌグルコース、１００ｍｇ
／ｌのイノシトール及びナフタレン酢酸（２ｍｇ／ｌ）
を補給したＭＳ主及び従塩類よりなる液体浮遊培養培地
８ｍｌ単位中に浮遊させ、１６：８光対闇方式下におい
て１．５ｒｐｍで回転するローラードラム上に置いた。
ここでも又約２０００〜４５００ルクスの光強度が蛍光
光線（冷昼光）により与えられた。
【００３３】４週間後に、浮遊液を８４０ミクロン径の
ナイロンメッシュを通して濾過して、より大きい細胞塊
を除去した。８４０ミクロンより小さい画分を沈澱さ
せ、約２０〜２５ｍｌの新鮮な浮遊培養培地で１回洗浄
した。この浮遊液をＴ−管（管当り２ｍｌ）に移し、各
管を６ｍｌの新鮮な浮遊培養培地で希釈した。これらの
培養液を上記操作を１０〜１２日間隔で繰返すことによ
り維持した。即ち浮遊液を濾過し、８４０ミクロンより
小さい細胞凝集物を含有する画分のみを新鮮な浮遊培養
培地に移した。全ての場合において、８４０ミクロンよ
り大きい細胞塊を含有する塊はカルス生育培地上に置か
れて成熟体胚を得た。カルス生育培地上に形成された体
細胞胚を取出し、胚発芽培地に移し、実施例１の方法を
用いて発芽させ、苗及び次いで畑生育植物に発達させ
た。
【００３４】実施例７ 浮遊培養液を７５０〜１０００ｍｇの胚発生カルスを２
ｍｇ／ｌ ＮＡＡを含有する１５〜２０ｍｌのＭＳ液体
培地を含むＤｅｌｏｎｇフラスコに移すことにより形成
した以外は、実施例６の操作を繰返した。この培養液含
有フラスコをジャイロ式シェーカーに置き、１００〜１
１０ストローク／分で振盪した。３週間後に浮遊液を８
４０ミクロンナイロンメッシュを通して濾過し、実施例
４と同様にして植物生育用の大細胞塊を除去した。８４
０ミクロン未満の浮遊物を沈澱させ、ＭＳ液体培地中で
一度洗浄し、２〜５ｍｌのＭＳ液体培地に再浮遊させ
た。浮遊液を１〜２ｍｌの浮遊液及び１５ｍｌの新鮮な
ＭＳ液体培地を含有するＤｅｌｏｎｇフラスコ内の新鮮
な培地に移すことにより二次培養した。培養液をこの操
作を７〜１０日間間隔で繰返すことにより維持した。各
二次培養においては、８４０ミクロン未満の浮遊物のみ
を二次培養し、大きい塊（８４０ミクロン以上）を植物
生育のために用いた。
【００３５】実施例８ 実施例６及び７の浮遊生育操作を用いる３回或いは４回
の二次培養後、１．５〜２．０ｍｌのＴ管及びＤｅｌｏ
ｎｇフラスコからの細胞浮遊液を各場合において２ｍｇ
／ｌ ＮＡＡを含有する寒天−凝固ＭＳ培地及び５００
ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物を含有するビーズレー及
びテイン培地上にプレート培養した。３〜４週間以内に
発達する胚を有する胚発生カルスが目に見えるようにな
った。再び、８４０ミクロン以上の細胞塊をカルス生育
培地上でプレート培養し、発達する胚を有する胚発生塊
を生じ、それは究極的に植物に成長した。
【００３６】綿形質転換 実施例９ アグロバクテリアＬＢＡ４４３４による腫瘍状−表現型
を形成する形質転換 アカラ綿浮遊培養液をＴ管内で培地（２ｍｇ／ｌ ＮＡ
Ａを含有するＭＳ培地）を７日乃至１０日毎に取変えな
がら３〜４ケ月間二次培養した。その後、いずれの培地
交換後においても細胞を沈澱させ、形質転換のために栽
培することができる。上澄液をピペッティングにより除
去し、細胞をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）菌株ＬＢＡ４４３４で形質転換した。アグロ
バクテリウム菌株ＬＢＡ４４３４は［Ｈｏｅｋｅｍａ，
Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９〜１８
０、１９８３、ここにおいて準用する］に説明されてお
り、Ｔｉプラスミド−由来二元植物形質転換系を含む。
そのような二元系においては、一つのプラスミドはＴｉ
−プラスミドのＴ−ＤＮＡを含有し、第二のプラスミド
はＴｉ−プラスミドのｖｉｒ−領域を含む。これらの二
つのプラスミドが共働して植物形質転換を行う。菌株Ｌ
ＢＡ４４３４においては、Ｔ−ＤＮＡプラスミドｐＡＬ
１０５０はｐＴｉＡｃｈ５のＴＬ、オクトピンＴｉ−プ
ラスミドを含み、菌株ＬＢＡ４４３４中のｖｉｒ−プラ
スミドｐＡＬ４４０４はｐＴｉＡｃｈ５の完全な毒性領
域を含む［Ｏｏｍｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉ
ｄ７：１５〜２９、１９８２、ここにおいて準用す
る］。菌株ＬＢＡ４４３４はオランダ、ライデン大学生
化学部のＲｏｂｅｒｔ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ博士
から利用可能である。形質転換アグロバクテリウム菌株
をグリセロール原液から取り、少量の一昼夜培養液に接
種し、それから次の日５０ｍｌ培養液を接種した。アグ
ロバクテリアをＮａＯＨでｐＨ７．２に調整した水中リ
ットル当り５ｇの牛肉エキス、１ｇの酵素エキス、５ｇ
のペプトン、５ｇのスクロースを含有するＹＥＢ培地上
で生育させた。消毒後、１ｍｌの２Ｎ ＭｇＣｌ２を添
加し、その後その他の菌株を殺すために必要な抗生物質
を添加した。５０ｍｌの一晩培養液の６００ｎｍにおけ
る吸光度を読取り、培養液を遠心分離し、形成されたペ
レットを植物細胞生育培地（ＭＳ培地プラス２ｍｇ／ｌ
のＮＡＡ）に０．５の６００ｎｍにおける最終吸光度ま
で再浮遊させた。
【００３７】８ｍｌのこのアグロバクテリウムＬＢＡ４
４３４の細菌浮遊液を上澄液の除去後浮遊植物細胞を含
有する各Ｔ−管に添加した。植物及び細菌細胞を含むＴ
−管を撹拌して細胞を再浮遊させ、ローラードラムに３
時間戻してアグロバクテリアを植物細胞に付着させた。
これらの細胞を次いで沈澱させ、残存上澄液を除去し
た。新鮮な生育培地のアリコートをＴ管に添加し、浮遊
液を残存する任意のアグロバクテリアの存在下において
ローラードラム上で１８〜２０時間インキュベートさせ
た。この時間後、細胞を再び沈澱させ、上澄液を除去
し、細胞をセフォタキシム（２００μｇ／ｍｌ）を含有
する生育培地溶液で２回洗浄した。洗浄後各Ｔ管からの
細胞をセフォタキシム（全ての場合において２００μｇ
／ｍｌ）含有する１０ｍｌの生育培地に再浮遊させ、浮
遊液の１ｍｌのアリコートをペトリ皿上でプレート培養
させた。感染細胞は植物ホルモンを添加されなかった生
育培地上で成長し、組織がＴ−ＤＮＡにおける野生種の
植物ホルモン遺伝子を受取ったことを確立した。これら
の細胞は腫瘍を発達させ、更に培養物の形質転換を示し
た。
【００３８】実施例１０ カナマイシン耐性非−腫瘍状表現型を形成する綿の形質
転換 実施例９で得られた浮遊培養液をＴ−ＤＮＡ含有二元ベ
クターｐＣＩＢ１０［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｊ．ｅ
ｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５３：１５３−１６１、１９８
７、ここにおいて準用する］並びにｐＡＬ４４０４ｖｉ
ｒ−プラスミドを含有するアグロバクテリアを用いて形
質転換した。ｐＣＩＢ１０のＴ−ＤＮＡは酵素ネオマイ
シンホスホトランスフェラーゼをコード化するＴｎ５か
らのコード化領域であるノパリンシンターゼからのプロ
モーター及びノパリンシンターゼからのターミネーター
より構成されるキメラ遺伝子を含有する。ｐＣＩＢ１０
を含有するアグロバクテリアはカナマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）を含有するＹＥＢ培地上で生育させた。形質転
換は細胞及びアグロバクテリアを生ずる１ｍｌのアリコ
ートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）或いはＧ４１８
（２５μｇ／ｍｌ）のいずれかを含有する選択培地上に
直ちにプレート培養した以外は、実施例１０と同様にし
て達成された。形質転換植物組織におけるｎｏｓ／ｎｅ
ｏ／ｎｏｓキメラ遺伝子の発現はこの組織の両抗生物質
の存在下における選択を可能にする。２〜４週間以内に
形質転換組織の存在が選択プレート上で明らかとなっ
た。未感染組織並びに追加されたコントロール組織は生
育の徴候を示さず、褐色に変って死滅した。形質転換組
織はカナマイシン及びＧ４１８の両者の存在下において
極めて良好に成長した。
【００３９】この時点で、良好に生育していた組織片を
新鮮な選択培地に二次培養した。これらの組織片上に形
成された体細胞胚を新鮮な非選択性生育培地に外植し
た。胚が分化及び発芽を開始した時点において、即ちそ
れらが根の形成を開始し２或いは３枚の葉を有した時点
において、それらを実施例１で説明した生育培地を含有
するマゼンタボックスに移した。苗が６〜８枚の葉を有
するまで生育させ、その時点でそれを寒天培地から取出
した。苗を今度ポット内の土壌に入れ、湿度を維持する
ためにビーカーで覆い、パーシバルインキュベーターに
４〜８週間入れた。この時点で植物をビーカーから取出
し、温室に移した。植物は温室で成長し開花し、結実し
た。
【００４０】実施例１１ 用いられた形質転換アグロバクテリアがＴ−ＤＮＡベク
ターＤＥＩ ＰＥＰ１０並びにｐＡＬ４４０４ｖｉｒプ
ラスミドを含有した以外は、実施例１０の操作に従っ
た。第３３図に示されるＤＥＩ ＰＥＰ１０は更に植物
ゲノム内で一体化するためにＢａｍＨＩで分割された
Ａ．ツメファンエンス（Ａ．Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
（菌株Ｃ−５８）からの二つのＴ−ＤＮＡ Ｐｓｔ Ｉ
切断右境界配列、パッセンジャーメイズホスホエノール
ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ペプカーゼ遺伝
子）、及び植物内で発現可能で抗生物質カナマイシン及
びＧ４１８に耐性を与えるキメラ遺伝子（ＮＯＳ／ＮＰ
Ｔ／ＴＫ）を利用するものである。このキメラ遺伝子は
Ｔｎ５からのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ
Ｉコード化領域であるノパリンシンセターゼプロモータ
ー、及び単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子
からのターミネーターを利用する。形質転換後、胚発生
カルス及び胚をカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）上の選択
により得た。この濃度（５０ｍｇ／ｌ）におけるカナマ
イシン上でプレート培養された対照（非−形質転換カル
ス）からは耐性カルスは得られなかった。
【００４１】実施例１２ 綿浮遊培養液細胞のグリフォゼート耐性表現型への形質
転換 用いられた形質転換アグロバクテリアがＴ−ＤＮＡベク
ターｐＰＭＧ８５／５８７［Ｆｉｌｌａｔｔｉ，Ｊ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：１
９２−１９９、１９８７、ここにおいて準用する］並び
にｐＡＬ４４０４ｖｉｒプラスミドを含有した以外は実
施例１０の操作に従った。このプラスミドｐＰＭＧ８５
／５８７は植物内で発現が可能な３個のキメラ遺伝子を
保有する。二つの遺伝子は抗生物質カナマイシン及びＧ
４１８に耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ（ＮＰＴ）をコード化する。（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）の変異体ａｒｏＡ遺伝子からのコード化配
列を含有する第３番目のキメラ遺伝子は殺草剤グリホゼ
ート［Ｃｏｍａｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２
１：３７０−３７１、１９８３、ここにおいて準用す
る］に耐性を与える。ｐＰＭＧ８５／５８７を含有する
アグロバクテリアはカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）
を含有する培地上で生育した。形質転換は浮遊液を２８
日間生育させ、その時点で１ｍｌのアリコートを選択抗
生物質を含有する培地上でプレート培養した以外は、実
施例１０と同様にして達成した。形質転換植物組織内の
ＮＰＴキメラ遺伝子の発現がこの組織の両抗生物質上で
の選択を可能にした。この場合に、選択抗生物質はカナ
マイシンであった（５０μｇ／ｍｌ）。２〜４週間以内
に形質転換組織が選択プレート上に明らかになった。植
物組織、個々の胚及びカルスを次いで殺草剤グリホゼー
ト１ｍＭを含有する生育培地上に置いたところ、形質転
換組織は良好な成長を続けた。カルス及び胚の両者のタ
ンパク質の抽出及び分析はグリホゼート耐性遺伝子の産
成物の存在を確認した。
【００４２】実施例１３ 綿浮遊培養細胞のハイグロマイシン耐性非−腫瘍状表現
型への形質転換 形質転換アグロバクテリアとしてＴ−ＤＮＡ二元ベクタ
ーｐＣＩＢ７１５［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５３：１５３−１６１、１９８
７］並びにｖｉｒプラスミドを含有するものを用いた以
外は、実施例１０の形質転換に従った。ｐＣＩＢ７１５
のＴ−ＤＮＡはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）３５Ｓ転写体［０ｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１３：８１０−８１２、１９８５、ここにお
いて準用する］からのプロモーター及びターミネーター
及びハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ［Ｇ
ｒｉｔｚ，Ｌ．及びＪ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｇｅｎｅ２５：
１７９−１８８、ここにおいて準用する］のコード化領
域より構成されるキメラ遺伝子を含有する。ｐＣＩＢ７
１５を含有するアグロバクテリアを、カナマイシン（５
０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＥＢ上で生育させた。形質
転換は１ｍｌのアリコートを選択抗生物質として５０μ
ｇ／ｍｌハイグロハイシンを含有する培地上で直ちにプ
レート培養した以外は再び実施例１０と同様にして達成
した。形質転換植物組織におけるキメラハイグロマイシ
ン遺伝子の発現はハイグロマイシンを含有する培地上で
のこの組織の選択を可能にする。形質転換組織は選択生
育培地上で実施例８と同様にして生育され、形質転換が
起ったことを確立した。
【００４３】実施例１４ 鱗翅目の昆虫に対する耐性を付与する綿浮遊培養細胞の
形質転換 以下に示す変更をした以外は実施例１０の操作に従っ
た。異った形質転換アグロバクテリアを用いた。又、植
物組織を形質転換物質の選択のために抗生物質上で選択
した後にそれを更にここに規定するＢＴ遺伝子の発現の
ために選択した。用いられたアグロバクテリアはその中
に次のキメラバチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）内毒素遺伝子
（“ＢＴ遺伝子”）を挿入したＴ−ＤＮＡベクターｐＣ
ＩＢ１０［Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ
ｅ ５３：１５３−１６１（１９８）、ここにおいて準
用する］を含有した。
【００４４】このアグロバクテリウムベクターを調製す
るために、ＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーター及びプロト
キシンコード化配列を融合した。ファージベクターｍｐ
１９［Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１
９８５］の誘導体を先ず造築した。工程を第１６図及び
第１７図に示す。先ず、１５５個のヌクレオチド５’乃
至プロトキシンコード化領域及び隣接の１３４６個のコ
ード化配列のヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片をｍｐ
１９に挿入する。ファージｍｐ１９ｄｓ ｒｆ（二本鎖
複製形態）ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ及
びＳｍａＩで消化し、約７．２−ｋｂｐベクター断片を
低ゲル化温度アガロースによる電気泳動後に標準的操作
により精製した。プロトキシン遺伝子を含む約１０ｋｂ
ｐ（キロベース対）のバチルス・ツリンギエンシスＤＮ
Ａを含有するプラスミドｐＫＵ２５／４を、スイス国、
バーゼル、ＣＩＢＡ−Ｇｅｉｇｙ社のＪ．Ｎｕｅｅｓｃ
ｈ博士から得た。プラスミドｐＫＵ２５／４に存在する
プロトキシン遺伝子のヌクレオチド配列を下記式１に示
す。プラスミドｐＫＵ２５／４ＤＮＡをエンドヌクレア
ーゼＨｐａＩ及びＳａｃＩで消化し、一般式１のヌクレ
オチド２〜１５０５を含有する１５０３ｂｐ断片を精製
した。この断片は約１５５ｂｐのバクテリアプロモータ
ー配列及び１３４６ｂｐのプロトキシンコード化配列の
出発部分を含有する。各断片の約１００ｎｇを次いで混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１５℃で一晩イン
キュベートした。得られた混合物をＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ）菌株ＨＢ１０１中に形質転換し、指示体細菌Ｅ．
コリＪＭ１０１と混合し、プレート培養した。１個のフ
ァージ（ｍｐ１９／ｂｔ）を更に下記造築のために用い
た。
【００４５】次いで、ＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーター
を含有するＤＮＡの断片乃び遺伝子ＶＩのためのコード
化配列のいくつかをｍｐ１９／ｂｔ中に挿入した。ファ
ージｍｐ１９／ｂｔ ｄｓ ｒｆ ＤＮＡをＢａｍＨＩ
で消化し、ＤＮＡポリメラーゼの大断片で処理し、プラ
ント末端を創出し、エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで再切
断した。より大きいベクター断片を上記の如く電気泳動
により精製した。プラスミドｐＡＢＤ１は［Ｐａｓｚｋ
ｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３、２７１
７−２７２２（１９８４）、ここにおいて準用する］に
説明されている。プラスミドｐＡＢＤ１ＤＮＡをＰｓｔ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣａＭＶ遺伝子ＶＩ
プロモーター及び約７５ｂｐの遺伝子ＶＩコード化配列
を含有する約４６５ｂｐ長の断片を精製した。これらの
二つの断片を連結し、上記の如くプレート培養した。得
られた組換えファージの一つｍｐ１９／ｂｔｃａは遺伝
子ＶＩコード化配列の一部であるＣａＭＶ遺伝子ＶＩプ
ロモーター配列、プロトキシンコード化配列の上流の約
１５５ｂｐのバチルス・ツリンギエンシスＤＮＡ及び約
１３４６ｂｐのプロトキシンコード化領域を含有した。
これらのＣａＭＶプロモーター配列を正確にプロトキシ
ンコード化配列に融合するために、介在ＤＮＡをｍｐ１
９／ｂｔｃａＤＮＡのオリゴヌクレオチド−指示突然変
異誘発を用いて削除した。配列（５’）ＴＴＣＧＧＡＴ
ＴＧＴＴＡ ＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡ
（３）を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡシンセサイザーを
用いて通常の操作により合成した。このオリゴヌクレオ
チドはＣａＭＡプロモーター［（Ｈｏｈｎ、ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９６、１９３−２３５（１
９８２）、ここにおいて準用する）中のヌクレオチド５
７６２〜５７７８］の３’末端におけるファージｍｐ１
９／ｂｔｃａＤＮＡ及びプロトキシンコード化配列の開
始部（上記一般式Ｉのヌクレオチド１５６〜１７２）に
おける配列と相補的である。突然変異誘発の一般的操作
は［Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍ．，１００、４６８−５００（１９８３）、こ
こにおいて準用する］に記載されているものである。約
５μｇの一本鎖ファージｍｐ１９／ｂｔｃａ ＤＮＡを
４０μｌの容量で０．３ｍｇのホスホリル化オリゴヌク
レオチドと混合した。混合物を６５℃に５分間加熱し、
５０℃に冷却し、ゆっくり４℃まで冷却した。次いで緩
衝液ヌクレオチドトリホスフェート、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの大断片を添加し、
１５℃において［Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１００、４６８−５００（１９８
３）、ここにおいて準用する］に説明されるように一晩
インキュベートした。アガロースゲル電気泳動後、円形
二本鎖ＤＮＡを精製し、Ｅ．コリ菌株ＪＭ１０１中にト
ランスフェクションした。得られたプラークを３２Ｐ−
標識化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列に
ついてスクリーニングし、ファージをＤＮＡ制限エンド
ヌクレアーゼ分折により分析した。得られたファージク
ローンの中にはＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターとプロ
トキシンコード化配列間の不所望の配列を正確に欠失し
たものがあった。このファージをｍｐ１９／ｂｔｃａ／
ｄｅｌと称する（第１７図参照）。
【００４６】次に、プロトキシン遺伝子の３’コード化
領域がＣａＭＶ転写停止シグナルに融合したプラスミド
を造築した。工程を第１８図に示す。先ず、プラスミド
ｐＡＢＤＩ ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及
びＢａ１ＩＩで消化し、ＣａＭＶ転写ターミネーター配
列を含有する０．５ｋｂｐ断片を単離した。次にプラス
ミドｐＵＣ１９［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ３３、１０３−１１９（１９８
５）、ここにおいて準用する］をＢａｍＨＩで消化し、
０．５ｋｂｐ断片を混合しＴ４ＤＮＡリガーゼとインキ
ュベートした。このＤＮＡのＥ．コリ菌株ＨＢ１０１中
への形質転換後、プラスミドｐ７０２と称される生じた
クローンの一つが得られ、それは第１８図に示される構
造を有する。次にプラスミドｐ７０２ＤＮＡをエンドヌ
クレアーゼＳａｃＩ及びＳｍａＩで切断し、より大きい
約３．２ｋｂｐ断片をゲル電気泳動により単離した。プ
ラスミドｐＫＵ２５／４ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＡ
ｈａＩＩＩ及びＳａｃＩで消化し、プロトキシンコード
化配列（ｎｔ １５０４〜３７７３）を含有する２，３
−ｋｂｐ断片（一般式１のヌクレオチド１５０２〜３７
７３）をゲル電気泳動後に単離した。これらの二つのＤ
ＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベー
トし、Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０１中に形質転換した。得ら
れたプラスミドはｐ７０２／ｂｔであった（第１８
図）。
【００４７】最後に、ファージｍｐ１９／ｂｔｃａ／ｄ
ｅｌ ｄｓ ｒｆ ＤＮＡ及びプラスミドｐ７０２／ｂ
ｔの部分を連結してＣａＭＶプロモーター及びターミネ
ーター配列の隣接した完全プロトキシンコード化配列を
含有するプラスミドを創出した（第１８図参照）。ファ
ージｍｐ１９／ｂｔｃａ／ｄｅｌ ＤＮＡをエンドヌク
レアーゼＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化し、約１．７５ｋ
ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動に従って精製し
た。同様に、プラスミドｐ７０２／ｂｔ ＤＮＡをエン
ドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化し、約２．
５ｋｂｐの断片を単離した。最後に、プラスミドｐＢＲ
３２２ＤＮＡ［Ｂｏｌｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ
ｅ，２、９５−１１３（１９７７）、ここにおいて準用
する］をＳａｌＩ及びＳｐｈＩで消化し、より大きい
４．２ｋｂｐ断片を単離した。全ての三つのＤＮＡ断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、
Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０１中に形質転換した。得られたプ
ラスミドＰＢＲ３２２／ｂｔ１４はバチルス・ツリンギ
エンシス結晶タンパク質コード化配列に融合したＣａＭ
Ｖ遺伝子ＶＩプロモーター及び翻訳開始シグナル及びそ
れに続いてＣａＭＶ転写停止シグナルを含有するＰＢＲ
３２２の誘導体である（第１９図に示される）。
【００４８】ベクターｐＣＩＢ１０は、このキメラ遺伝
子のアグロバクテリウムツメファシエンスを介する植物
へのトランスファーに有用なＴｉ−プラスミド−由来ベ
クターである。このベクターはミズリー州、セントルイ
ス、ワシントン大学のＷ．Ｂａｒｎｅｓ博士から得られ
る広宿主範囲プラスミドｐＲＫ２５２から得られる。こ
のベクターは又Ｔｎ９０３からのアグロバクテリウムに
おけるカナマイシン耐性に対する遺伝子及びＴｉプラス
ミドｐＴｉＴ３７からの左及び右Ｔ−ＤＮＡ境界配列も
含有する。境界配列の間には、プラスミドｐＵＣ１８か
らのポリリンカー領域及び植物内のカナマイシン耐性を
付与するキメラ遺伝子がある。先ず、プラスミドｐＲＫ
２５２を修飾してテトラサイクリン耐性を付与する遺伝
子をトランスポソンＴｎ９０３からカナマイシンに対す
る耐性を付与するものと置換し［Ｏｋａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７、２１７−２２
６（１９８１）、ここにおいて準用する］、又ｐＲＫ２
５２における独特なＥｃｏＲＩ部位をＢａｌＩＩ部位で
置換することにより修飾した（これらの修飾の概要につ
いて第２０図参照）。プラスミドｐＲＫ２５２を先ずエ
ンドヌクレアーゼＳａｌＩ及びＳｍａＩで消化し、次い
でＤＮＡポリメラーゼＩの大断片で処理してブラント末
端を創出し、大ベクター断片をアガロースゲル電気泳動
で精製した。次に、プラスミドｐ３６８をエンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼの大断
片で処理し、約１０５０−ｂｔ断片をアガロースゲル電
気泳動後に単離した。この断片は抗生物質カナマイシン
に耐性を付与するトランスポソンＴｎ９０３からの遺伝
子を含有する［Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１４７、２１７−２２６（１９８１）、ここ
において準用する］、両断片を次いでＤＮＡポリメラー
ゼの大断片で処理してブラント末端を創出した。両断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１５℃で一晩インキュ
ベートした。Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０１中への形質転換及
びカナマイシン耐性コロニーの選択後、プラスミドｐＲ
Ｋ２５２／Ｔｎ９０３を得た（第１９図参照）。
【００４９】プラスミドｐＲＫ２５２／Ｔｎ９０３をそ
のＥｃｏＲＩ部位で消化後、Ｅ．コリＤＮＡポリメラー
ゼの大断片で処理してブラント末端を創出した。この断
片を合成ＢａｌＩＩ制限部位リンカーに添加し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼと一晩インキュベートした。得られたＤＮ
Ａを過剰のＢａｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化
し、より大きいベクター断片をアガロースゲル電気泳動
により精製した。得られた断片を再びＴ４ＤＮＡリガー
ゼとインキュベートしてその新たに添加されたＢａｌＩ
Ｉ付着端を介して再円形化した。Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０
１中に形質転換後プラスミドｐＲＫ２５２／Ｔｎ９０３
／ＢａｌＩＩが得られた（第２０図参照）。
【００５０】ＴｉプラスミドＴ−ＤＮＡ境界、プラスミ
ドｐＵＣ１９のポリリンカー領域及び植物におけるカナ
マイシン耐性の選択遺伝子を含有するプラスミドｐＢＲ
３２２の誘導体を造築した（第２１図参照）。プラスミ
ドｐＢＲ３２５／Ｅｃｏ２９はノパリンＴｉプラスミド
ｐＴｉＴ３７からの１．５−ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ断片を
含有する。この断片はＴ−ＤＮＡ左境界配列を含有する
［Ｙａｄａｖ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６３２２−６３２６（１
９８２）、ここにおいて準用する］。この断片のＥｃｏ
ＲＩ末端をＨｉｎｄＩＩＩ末端で置換するためにプラス
ミドｐＢＲ３２５／Ｅｃｏ２９ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消
化し、次いでヌクレアーゼＳ１でインキュベートし、次
いでＤＮＡポリメラーゼの大断片とインキュベーション
を行い、ブラント末端を創出し、次いで合成ＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカーと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュ
ベートした。得られたＤＮＡをエンドヌクレアーゼＣｌ
ａＩ及び過剰のＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたＴ−
ＤＮＡ左境界を含有する１，１−ｋｂｐ断片をゲル電気
泳動により精製した。次いで、プラスミドｐＵＣ１９の
ポリリンカー領域をプラスミドＤＮＡのエンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる消化により単
離し、より小さい断片（約５３ｂｐ）をアガロースゲル
電気泳動により単離した。次に、プラスミドｐＢＲ３２
２をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化
し、その他の二つの単離断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼとインキュベートし、Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０１中に
形質転換した。得られたプラスミドｐＣＩＢ５はプラス
ミドｐＢＲ３２２の誘導体中にポリリンカー及びＴ−Ｄ
ＮＡ左境界を含有する（第２１図参照） 。
【００５１】植物中でのカナマイシン耐性の発現のため
の遺伝子を含有するプラスミドを造築した（第２２図及
び第２３図参照）。プラスミドＢｉｎ６は英国、ケンブ
リッジ、Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅのＭ．Ｂｅｖａｎ博士から得られた。このプラス
ミドはＢｅｖａｎによる［Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．，１２、８７１１−８７２１（１９８４）、ここに
おいて準用する］の文献に説明されている。プラスミド
Ｂｉｎ６ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、キメラネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎ
ＰＴ）遺伝子を含有する約１．５ｋｂｐの大きさの断片
を単離し、アガロースゲル電気泳動により精製した。こ
の断片を次いでエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断されたプラスミドｐＵＣ１８ＤＮＡと
混合した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼとのインキュベーション
後、得られたＤＮＡをＥ．コリ菌株ＨＢ１０１中に形質
転換した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８／ｎｅｏと
称する。このプラスミドＤＮＡはネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子とノパリンシンダーゼのターミ
ネーター配列との間に不所望のＢａｍＨＩ認識配列を含
有する［Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．，１２、８７１１−８７２１（１９８４）（ここに
おいて準用する）参照］。この認識配列を除去するため
にプラスミドｐＵＣ１８／ｎｅｏをエンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩで消化後、ＤＮＡポリメラーゼの大断片で処
理してブラント末端を創出した。断片を次いでＴ４ＤＮ
Ａリガーゼとインキュベートして断片を再円形化し、
Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０１中に形質転換した。得られたプ
ラスミドｐＵＣ１８／ｎｅｏ（Ｂａｍ）はＢａｍＨＩ認
識部位を失っていた。
【００５２】Ｔ−ＤＮＡ右境界配列を次いでキメラＮＰ
Ｔ遺伝子の次に添加した（第２４図参照）。プラスミド
ｐＢＲ３２５／Ｈｉｎｄ２３はプラスミドｐＴｉＴ３７
の３，４−ｋｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有する。こ
の断片は右Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含有する［Ｂｅｖａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
１、３６９〜３８５、ここにおいて準用する］。プラス
ミドｐＢＲ３２５／Ｈｉｎｄ２３ＤＮＡをエンドヌクレ
アーゼＳａｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、右境界
を含有する１．０ｋｂｐ断片を単離し、アガロースゲル
電気泳動に従って精製した。プラスミドｐＵＣ１８／ｎ
ｅｏ（Ｂａｍ）ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃＩＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、４．０ｋｂｐベクター断
片をアガロースゲル電気泳動により単離した。これらの
二つの断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベ
ートし、Ｅ．コリ菌株ＨＢ１０１中に形質転換した。得
られたプラスミドｐＣＩＢ４（第２３図に示す）は、プ
ラスミドｐＵＣ１８の誘導体中にＴ−ＤＮＡ右境界及び
カナマイシン耐性のための植物−選択性マーカーを含有
する。
【００５３】次に、Ｔ−ＤＮＡ左及び右境界の両者を植
物選択性カナマイシン耐性遺伝子及び境界間のｐＵＣ１
８のポリリンカーと共に含有するプラスミドを造築した
（第２８図参照）。プラスミドｐＣＩＢ４ＤＮＡをエン
ドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡポリメ
ラーゼの大断片で処理してブラント末端を創出した後、
エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化した。キメラカナ
マイシン耐性遺伝子及びＴ−ＤＮＡの右境界を含有する
２．６−ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動により単
離した。プラスミドｐＣＩＢ５ＤＮＡをエンドヌクレア
ーゼＡａｔＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処
理してブラント末端を創出し、次いでエンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲＩで切断した。より大きいベクター断片をア
ガロースゲル電気泳動により精製し、ｐＣＩＢ４断片と
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ．
コリ菌株ＨＢ１０１中にインキュベートした。得られた
プラスミドｐＣＩＢ２（第２４図に示す）は二つのＴ−
ＤＮＡ境界間に目的配列を含有するプラスミドｐＢＲ３
２２の誘導体である。
【００５４】以下の工程はベクターｐＣＩＢ１０の造築
を完結し、第２５図に示される。プラスミドｐＣＩＢ２
ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶで消化し、Ｂａ
ｌＩＩ認識部位を含有する合成リンカーを上記の如く添
加する。過剰のＢａｌＩＩエンドヌクレアーゼで消化
後、約２．６−ｋｂｐ断片をアガロースゲル電気泳動に
従って単離した。上記プラスミドｐＲＫ２５２／Ｔｎ９
０３／ＢａｌＩＩ（第２０図参照）をエンドヌクレアー
ゼＢａｌＩＩで消化し、次いでホスファターゼで消化し
て再円形化を防止した。これらの二つのＤＮＡ断片を混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとインキュベートし、Ｅ．コ
リ菌株ＨＢ１０１中に形質転換した。得られたプラスミ
ドが完成ベクターｐＣＩＢ１０である。キメラプロトキ
シン遺伝子のベクターｐＣＩＢ１０中への挿入は、第２
６図に示される工程によって行われる。プラスミドｐＢ
Ｒ３２２／ｂｔ１７ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＰｖｕ
Ｉ及びＳａｌＩで消化し、次いで部分的にエンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩで消化した。キメラ遺伝子を含有する
約４．２−ｋｂｐの大きさのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片
をアガロースゲル電気泳動に従って単離し、エンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化されたプラスミ
ドｐＣＩＢ１０ＤＮＡと混合した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
とのインキュベーション及びＥ．コリ菌株ＨＢ１０１中
の形質転換後第２６図に示されたプラスミドはプラスミ
ドベクターｐＣＩＢ１０中にキメラプロトキシン遺伝子
を含有した。
【００５５】プラスミドｐＣＩＢ／１９ＳｂｔをＥ．コ
リＨＢ１０１からアグロバクテリウムに転移するため
に、中間体Ｅ．コリ宿主菌株Ｓ１７−１を用いた。こ
の、コロラド州ボールダーのＡｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．から得られる菌株はプ
ラスミドｐＣＩＢ１０を接合を介してアグロバクテリウ
ムに直接転移して裸プラスミドＤＮＡの直接アグロバク
テリウム中への形質転換させる必要性を回避する可動化
機能を含有する［菌株Ｓ１７−１に対する文献は、Ｓｉ
ｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ ｏｆｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎ
ｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ”、Ａ．Ｐｕｈｌｅｒ編、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ベルリン、９８〜１
０６頁、１９８３、（ここにおいて準用する）であ
る］。先ず、プラスミドｐＣＩＢ１０／１９ＳｂｔＤＮ
Ａを塩化カルシウム処理Ｓ １７−１細胞中に導入す
る。次いで形質転換Ｓ１７−１細胞の培養液及びアグロ
バクテリウムツメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０４［Ｏ
ｏｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１４ ３３−５０
（１９８１）、ここにおいて準用する）］を混合し、Ｎ
寒天（Ｄｉｆｃｏ）プレート上で室温において一晩交配
した。得られた細菌の１白銀耳をＡＢ最小培地上にスト
リークし［Ｃｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、７３４７
−７３５１（１９７４）、ここにおいて準用する］、５
０μｇ／ｍｌのカナマイシンと共にプレート培養し、２
８℃でインキュベートした。コロニーを同一培地上に再
ストリークし、次いでＮＢ寒天プレート上に再ストリー
クした。遅い成長コロニーをつつき出し、ＡＢ最小培地
上にカナマイシンと共にストリークし、単一コロニーを
単離した。この操作はｐＣＩＢ１０／１９Ｓｂｔプラス
ミドを含有するアグロバクテリアを選択するものであ
る。
【００５６】バチルス・ツリンギエンシスプロトキシン
キメラ遺伝子のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによる造築
は、第２７図に示されたように造築されたＣａＭＶ３５
ＳプロモーターカセットプラスミドｐＣＩＢ７１０の造
築により達成された。このプラスミドはＣａＭＶプロモ
ーター及び３５ＳＲＮＡ転写体に対する転写停止配列を
含有した［Ｃｏｖｅｙ，Ｓ．Ｎ．，Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏ
ｆｆ，Ｇ．Ｐ．，及びＨｕｌｌ，Ｒ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．９、６７３
５−６７４７（１９８１）、ここにおいて準用する］。
ＣａＭＶ ＤＮＡの１１４９−ｂｐ ＢａｌＩＩ制限断
片［Ｈｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９６、１９４−２２０、及びＡｐ
ｐｅｎｄｉｃｅｓ Ａ ｔｏ Ｇ（１９８２）、ここに
おいて準用する］をプラスミドｐＬＶ１１１（サンディ
エゴのカルフォルニア大学のＳ．Ｈｏｗｅｌｌ博士から
得られたもの；或いはこの断片は直接ＣａＭＶ ＤＮＡ
から単離することができる）から前記の如く調製アガロ
ースゲル電気泳動により単離し、ＢａｍＨＩ−切断プラ
スミドｐＵＣ１９ＤＮＡと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で処理し、Ｅ．コリ中に形質転換した。得られたプラス
ミド中のＢａｍＨＩ制限部位はＢｇｌＩＩ付着端のＢａ
ｍＨＩ付着端への連結により破壊された。ｐＵＣ１９／
３５Ｓと称される得られたプラスミドを次いでオリゴヌ
クレオチド−指示ｉｎ−ｖｉｔｒｏ突然変異誘発におい
て用いてＨｏｈｎ文献におけるＣａＭＶヌクレオチド７
４８３の直後にＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを挿入
した。得られたプラスミドｐＣＩＢ７１０はＢａｍＨＩ
制限部位により分離されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター
領域及び転写停止領域を含有する。このＢａｍＨＩ部位
に挿入されたＤＮＡ配列はＣａＭＶ転写制御配列により
植物内で発現される。ｐＣＩＢ７１０は転写の開始点及
びＢａｍＨＩ部位の間に如何なるＡＴＧ翻訳開始コドン
も含有しない。
【００５７】ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／ターミネー
ターカセットのｐＣＩＢ１０中への挿入は第２８図に概
略図示される工程により行われた。プラスミドｐＣＩＢ
１０及びｐＣＩＢ７１０ ＤＮＡｓをＥｃｏＲＩ及びＳ
ａｌＩで消化し、混合し、連結した。得られたｐＣＩＢ
１０／７１０は植物形質転換ベクターｐＣＩＢ１０に挿
入されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／ターミネーター
カセットを有する。ＣａＭＶ３５Ｓ配列は、ｐＣＩＢ１
０のＴ−ＤＮＡ境界の間にあり、従って植物形質転換に
おける植物ゲノム中に挿入される。バチルス・ツリンギ
エンシスプロトキシン遺伝子のｐＣＩＢ１０／７１０中
への挿入は第２９図に概略図示される工程により行われ
た。プロトキシン遺伝子源としては、プラスミドｐＣＩ
Ｂ１０／１９ＳｂｔをＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで消化
し、プロトキシン遺伝子を含有する３，６−ｋｂ断片を
調製ゲル電気泳動により単離した。この断片を次いで配
列５’−ＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣ−３’を有
する合成ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩアダプターと混合し、次
いでＢａｍＨＩで消化した。この工程はプロトキシン断
片の両末端にＢａｍＨＩ付着端を創出す。この断片を次
いでＢａｍＨＩ−切断ｐＣＩＢ１０／７１０中に挿入し
た。第２９図に示される得られたプラスミドｐＣＩＢ１
０／３５ＳｂｔはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと転写停
止配列の間にプロトキシン遺伝子を含有する。
【００５８】プラスミドｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔのア
グロバクテリウムツメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０４
中への転移は前記の通りであった。約７２５個のアミノ
酸を含有する欠失バチルスツリンギエンシスプロトキシ
ンの造築及びこの欠失遺伝子をＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターと共に含有するキメラ遺伝子の造築は、一般式１に
示された配列における位置２３２５においてＫｐｎＩ制
限エンドヌクレアーゼにおいて切断することによって、
遺伝子のＣＯＯＨ−末端部分を除去して行われた。プラ
スミドｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔ（第２９図）をＢａｍ
ＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、欠失プロトキシン遺伝子を
含有する約２．２−ｋｂｐのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片
を調製アガロースゲル電気泳動により単離した。３’末
端におけるＫｐｎＩ部位をＢａｍＨＩ部位に転換するた
めに、断片をＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩアダプターオリゴヌ
クレオチドと混合し、連結した。この断片を次いでＢａ
ｍＨＩ−切断ｐＣＩＢ１０／７１０と混合した（第２８
図）。
【００５９】約６４５個のアミノ酸を含有する欠失プロ
トキシン遺伝子を一般式１に示された配列における２０
９０位におけるＢｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に
おいて切断して遺伝子のＣＯＯＨ−末端部分を除去する
ことにより作成した。プラスミドｐＣＩＢ１０／３５Ｓ
ｂｔ（第２９図）をＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩで消化し、欠
失プロトキシン遺伝子を含有する約１．９−ｋｂｐのＢ
ａｍＨＩ／ＢＣＩＩ断片を調製アガロースゲル電気泳動
により単離した。ＢｃｌＩはＢａｍＨＩと適合性の付着
端を創出するので、この断片をＢａｍＨＩ−切断ｐＣＩ
Ｂ１０／７１０（第２８図）に連結する前に更に操作が
必要とされない。第３１図に示された構造ｐＣＩＢ１０
／３５Ｓｂｔ（ＢｃｌＩ）を有する得られたプラスミド
はカナマイシン上で選択された。ｐＣＩＢ１０／３５Ｓ
ｂｔ（ＫｐｎＩ）と命名され、第３０図に示される得ら
れた形質転換体は約７２５のアミノ酸の欠失プロトキシ
ン遺伝子を含有する。これらの形質転換体はカナマイシ
ン上で選択される。
【００６０】欠失プロトキシン遺伝子はＢａｍＨＩ切断
部位（ＧＧＡＴＣＣ）を導入することにより作られた。
これはｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔからのプロトキシン配
列を含有するＢａｍＨＩ断片をｍｐ１８中にクローニン
グし、及び上記標準オリゴヌクレオチド突然変異誘発を
用いることによりなされる。突然変異誘発後、二本鎖複
製形態ＤＮＡをＭ１３クローンから調製し、それを次い
でＢａｍＨＩで消化する。欠失プロトキシン遺伝子を含
有する約１．９−ｋｂｐ断片をＢａｍＨＩ−切断ｐＣＩ
Ｂ１０／７１０中に挿入する。第３２図に示される構造
ｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔ（６０７）を有する得られた
プラスミドをカナマイシン上で選択する。ｐＣＩＢ１０
／Ｓｂｔ（６０７）が用いられた。形質転換は選択性抗
生物質を含有する培地上で１ｍｌのアリコートを直ちに
プレート培養した以外は、実施例７と同様にして達成さ
れた。この選択培地はカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）
或いはＧ４１８（２５μｇ／ｍｌ）を含有した。両形質
転換植物組織中におけるＮＲＴキメラ遺伝子の発現がい
ずれの抗生物質上でのこの組織の選択を可能にする。
【００６１】２〜４週間以内に形質転換組織が選択プレ
ート上に明らかとなった。植物物質はカナマイシン或い
はＧ４１８上で選択した。植物組織（個々の胚或いはカ
ルス）を次いで緩衝液で抽出し、ＢＴ遺伝子生成物の発
現についてＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。抽出の
条件は次の通りである：１００ｍｇの組織当り、５０ｍ
Ｍ ＮａＣＯ３（ｐＨ９．５）、０．０５％Ｔｒｉｔｏ
ｎ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、１００ｎＭ ＮａＣｌ、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭロイペプチン、及び１ｍＭ
ＰＭＳＦを含有する０．１ｍｌの抽出緩衝液中でホモジ
ナイズする。ロイペプチン及びＰＭＳＦは使用直前に１
００×原液から添加する。組織をモーター駆動乳棒で磨
砕した。抽出後、２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７を添加してｐ
Ｈを８．０〜８．５に調整し、次いでベックマンマイク
ロヒュージ１２中で１２０００ｒｐｍで遠心分離し（４
℃で１０分間）、上澄液を酵素結合免疫吸着剤アッセイ
（「ＥＬＩＳＡ」）のために保存した。
【００６２】ＥＬＩＳＡ技術は一般的道具として［Ｍ．
Ｆ．ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１８：７４２−７６６（１９
８６）、ここにおいて準用する］により説明されてい
る。Ｂｔ毒素用のＥＬＩＳＡは標準操作を用いて開発さ
れ、トランスジェニック植物物質をＢｔ配列の発現につ
いて分析するために用いられた。この操作のために、Ｅ
ＬＩＳＡプレートをエタノールで予備処理し、及びアフ
ィニティ精製ウサギ抗−Ｂｔ抗血清（５０μｌ）をホウ
酸−緩衝化塩水（下記参照）中の３μｇ／ｍｌの濃度で
プレートに添加する。これを４℃で一晩インキュベート
させた。抗血清が勾配精製Ｂｔ結晶によるウサギの免疫
化に応答して産生され［Ａｎｇ，Ｂ．Ｊ．＆ Ｎｉｃｋ
ｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｗ．；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：６２５−６２６（１９７
８）、ここにおいて準用する］、ドデシル硫酸ナトリウ
ムで可溶化し、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（下記参照）で洗
浄した。それを次いで室温で１時間ブロッキング緩衝液
（下記参照）で処理し、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄し
た。植物抽出液を５０μｇのタンパク質を与える量で添
加した（これは典型的には約５μｌの抽出液である）。
タンパク質としての葉抽出緩衝液は、カリフォルニア
州、リッチモンド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社から得られる市販
のキットを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により求める［Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７
２：２４８（１９７６）、ここにおいて準用する］。葉
抽出液の稀釈が必要な場合には、ＥＬＩＳＡ稀釈液（下
記参照）を用いる。これを４℃で一晩インキュベートさ
せる。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄後、５０μｌアフィ
ニティ精製ヤギ抗−Ｂｔ抗血清をＥＬＩＳＡ稀釈液中の
３μｇ／ｍｌタンパク質の濃度で添加する。これを３７
℃で１時間インキュベートさせ、次いでＥＬＩＳＡ洗浄
緩衝液で洗浄する。アルカリホスファターゼに結合した
５０μｌのウサギ抗−ヤギ抗体［ミズリー州、セントル
イス、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から市販のも
の］を、ＥＬＩＳＡ稀釈液中に１：５００に稀釈し、３
７℃で１時間インキュベートさせ、次いでＥＬＩＳＡ洗
浄緩衝液で洗浄する。５０μｌの基質［ＥＬＩＳＡ基質
緩衝液（下記参照）中０．６ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート］を添加し、室温で３０分間インキ
ュベートする。反応は５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨを添加
することにより停止する。修正ＥＬＩＳＡ読取機［カリ
フォルニア州、スタンフォード、Ｈｅｗｌｅｔ Ｐａｃ
ｋａｒｄ社］における４０５ｎｍでの吸光度を読取る。
【００６３】ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢｔ（ＢｃｌＩ）で
形質転換した植物組織は、このＥＬＩＳＡ操作を用いて
分析した際に陽性反応を示し、Ｂｔ遺伝子の発現を示し
た。ＥＰＢＳ（ＥＬＩＳＡリン酸緩衝塩水） １０ｍＭ Ｎａホスフェート：Ｎａ２ＨＰＯ４
４．６８ｇ／４リットル ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ０．９７６ｇ／４リットル １４０ｍＭ ＮａＣｌ ＮａＣｌ ３
２．７ｇ／４リットル ｐＨは約７．４であるべきである。ホウ酸緩衝塩水 １００ｍＭホウ酸 ２５ｍＭ Ｎａボレート ７５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨを必要に応じてＨＣｌ或いはＮａＯＨで８．４〜
８．５に調整する。
【００６４】ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液 ＥＰＢＳ中 １％ ＢＳＡ ０．０２％ ＮａアジドＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．０２％ Ｎａアジド２．５Ｍ ＴＲＩＳ ＥＬＩＳＡ稀釈液 ＥＰＢＳ中 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ １％ ＢＳＡ ０．０２％ ＮａアジドＥＬＩＳＡ基質緩衝液 ５００ｍｌ中 ４８ｍｌジエタノールアミン ２４．５ｍｇ ＭｇＣｌ２ ＨＣｌでｐＨ９．８に調整。
【００６５】ＥＬＩＳＡ基質 ２５ｍｌ基質緩衝液中１５ｍｇのｐ−ニトロフェニルホ
スフェート。バイオアッセイに対しては、これらのアグ
ロバクテリアによる形質転換から得られた抗生物質耐性
細胞培養液からの細胞浮遊液を開始した。浮遊液をＧ４
１８（２５ｍｇ／ｌ）で補給した培地中で生育させ、７
〜１０日間間隔で新鮮な抗生物質含有培地中に二次培養
した。次いでこれらの培養液の試料を培養アッセイに用
いて鱗翅目昆虫に対する毒性を試験した。２０ｍｌのこ
れらの培養液のアリコートを沈澱させ（細胞容積＝３〜
４ｍｌ）、抗生物質に欠ける培地中に再浮遊させた。浮
遊液を次いでこの培地中において追加の２日間生育させ
て細胞から残存抗生物質を欠乏させた。３／４オンス部
分のカップの底に湿潤Ｗｈａｔｍａｎ２．３ｃｍ濾紙の
２枚の円盤を置いた。０．２ｃｍ深さの形質転換浮遊培
養細胞の層を濾紙円盤上に置いた。新たに孵化したマン
デュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）或い
はヘリオティス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖ
ｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫を各部分のカップ中に入れた。
対照例は非形質転換浮遊培養細胞で、飼育した幼虫によ
り構成された。円盤は必要に応じて２日間間隔で更新さ
れた。マンデュカ幼虫は通常より多くの植物物質を必要
とする。形質転換細胞で飼育された幼虫の成長速度及び
死亡率を、未形質転換細胞で飼育された幼虫の成長速度
と対比して５日後に評点したところ、形質転換綿細胞に
おけるＢｔ遺伝子産生物の毒性が明らかに認められた。
【００６６】実施例１５ チーズクロスのシート上に置かれたヘリオティス・ビレ
センスの卵は、ノースカロライナ州レイリーのノースカ
ロライナ州立大学のＴａｂａｃｃｏ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られた。チ
ーズクロスシートをカバーされた大ガラスビーカーに移
し、湿潤紙タオルで湿度を維持して２９℃でインキュベ
ートした。卵は３日以内に孵化した。孵化後なるべく早
く、幼虫（カップ当り１匹の幼虫）をカバーされた３／
４オンスのプラスチックカップに移した。各カップは綿
の葉の円盤を含有する。幼虫は細い荒毛塗料ブラシを用
いて移した。１ｃｍ直径の葉の円盤は綿植物の葉から切
抜きカップ内の円形湿潤濾紙上に幼虫と共に置いた。各
植物について若い及び古い両方の葉である少なくとも６
〜１０枚の葉の円盤について試験した。葉の円盤は２日
間間隔或いは必要に応じて取り変えて幼虫を飼育した。
形質転換された植物の葉上で飼育される幼虫の成長速度
［全レプリカ昆虫の大きさ或いは合一重量］及び死亡率
を未形質転換綿の葉で飼育される幼虫のそれらと比較し
た。ｐＣＩＢ１０／３５ＳＢ５（ＢｃｌＩ）で形質転換
された綿の円盤で飼育される幼虫は、対照例と比較して
成長速度の減少及び死亡率の増大を示す。ある数の我々
の再生植物（５〜１０％）は、再生過程の結果として遺
伝的に継承可能な表現型変化を獲得したように見えるこ
とが観察された。この変化はソマクローナル変化として
知られている。以下の実施例は我々の再生操作の結果と
してのソマクローナル変化が如何にして用いられて商業
的に有用な新しい形質を綿の品種中に導入したかを例示
するものである。
【００６７】実施例１６ 真菌病源体に耐性の綿再生体 実施例１の操作に従い、品種ＳＪ５及びＳＪ４の得られ
た再生綿植物を硬化し、土壌中に入れた。これらの植物
は自己受粉させ、Ｆ１世代を表わす種子を集めた。バー
ティシリウム（Ｖｕｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）に対して耐
性の再生体（ソマクローナル変種）を得るためにＦ１世
代をバーティシリウム蔓延畑に植付けて、後代列分析を
行った。品種ＳＪ４及びＳＪ５の種子を畑に対照例とし
て植付けた。バーティシリウム真菌に対して親品種より
耐性のあるソマクローナル変種は総合的植物の活力、収
量及び病気に伴う葉の徴候の不存在を評価することによ
り僅かの後代列（５％）中に確認された。第３３図は、
バーティシリウム蔓延畑内に植付けられた再生体の後代
列を示す。第３４図は品種ＳＪ４のバーティシリウム耐
性ソマクローナル変種を示す。この真菌病源体に対する
耐性の改良は、遺伝的に安定であることが判明し、引続
く世代に継代された。
【００６８】実施例１７ 変更された成長性癖を有する綿再生体 病気蔓延土壌中に植付ける代りにＦ１世代を綿育成苗床
に植付けた以外は、実施例１３の操作に従った。Ｆ１再
生後代の総合的成長性癖を対照例品種のそれと対比し
た。成長性癖においてより均一であり、且つ親品種より
丈の短いソマクローナル変種が確認された。我々の試み
においてＰｈｙ６と同定された一つのＳＪ５再生体は親
品種より丈が２０％短かった。この種の成長性癖は狭い
列（３０インチ列間隔）の栽培条件下において生育され
る綿においては望ましいものである。これらの形質は遺
伝的に安定であり、引続く世代に継代された。
【００６９】実施例１８ 改良された繊維形質を有する綿再生体 Ｆ１後代の再生体を綿育成苗床内に植付け結実させた以
外は、実施例１３の操作に従った。ボールが成熟した時
点で、綿を収穫し、長さ、均一性、引張強度、弾性及び
ミクロネールを含む幾つかの繊維品質形質の分析に付し
た。これらの形質の１以上において親品種に対して有意
に改良されたソマクローナル変種が確認された。Ｆ２後
代（Ｆ１の細胞受粉）からの代表的データを下記表１に
含ませる。星印を付けた値は統計学的に有意であり、引
続く世代において真に生育することが判明したＳＪ５再
生体における改良を表わす。
【００７０】
【表１】
【００７１】実施例１９ 改良した収量を有する綿再生体 品種ＳＪ４のＦ１後代の再生体を非再生対照例と共に複
製収率試験において植付けた以外は、実施例１３の操作
に従った。より均一な成長性癖及びより活力のある成長
性癖を示した一つの変種は、同一試験における親品種よ
りも４％多い綿を生産した。データを下記表２に示す。
【００７２】
【表２】 収率の４％増大は、１００万エーカーを越す綿が毎年栽
培されているカリフォルニアにおいて平均的綿生産者に
対してエーカー当り殆んど２０ドルの収益を表わす。
【００７３】実施例２０ 殺草剤（カナマイシン）に耐性の綿再生体 綿品種Ｂ１６４４の浮遊培養液を実施例５の方法に従っ
て発達させた。浮遊培養液を、実施例６と同様である
が、しかし殺草剤（抗生物質）カナマイシン（２５ｍｇ
／ｌ）を補給した寒天培地上にプレート培養した。殆ん
どの細胞が死滅したが、僅か（１〜５％）は耐性であり
生残った。これらを選択的に増大濃度のカナマイシンに
より最終濃度が５０ｍｇ／ｌに到達するまで補給された
寒天−固化培地上で二次培養した。胚をこのカルスから
次いで発達させ耐性胚をカナマイシン耐性植物に発芽さ
せた。
【００７４】
【図面の簡単な説明】
【図１】形質転換の確立領域を示す組織培養技術による
種子からの綿植物の発達のための好ましい操作を図示す
る。
【図２】葉（１４）及び根（１６）を含む各種発達段階
における体細胞胚（１２）を有する綿の胚発生カルス
（１０）の写真図である。
【図３】図２に図示されるような胚発生カルス培養液を
形成するために単離された後期球状段階における体細胞
綿胚の写真図である。
【図４】図２と同様に胚発芽培地上に発達する綿の胚及
び若い苗（１８）の写真図である。
【図５】綿の浮遊培養液からの胚発生細胞の小塊の写真
図である。
【図６】浮遊培養液からの球状段階の胚の写真図であ
る。
【図７】発生する葉（１４）及び根（１６）を示す浮遊
培養液から得られる発芽胚を図示する。
【図８】胚発芽培地上に生育する綿の苗の発達を図示す
る。
【図９】カナマイシン耐性の遺伝子を含有する形質転換
綿細胞からの細胞コロニー（２０）の発達を示す。
【図１０】図９の選択された抗生物質耐性細胞から抗生
物質補給培地上に発達する体細胞胚を示す。
【図１１】殺草剤グリホセートに耐性を付与する遺伝子
を含有する形質転換された体細胞胚の発芽胚を示す。
【図１２】図１１の胚から発達した綿の苗を示す。
【図１３】葉１４及び根１６の発達を有する鱗翅目の昆
虫に耐性を付与するように形質転換された発芽体細胞胚
を示す。
【図１４】図１３の胚から発達された苗を示す。
【図１５】カナマイシンに対する耐性を示す形質転換さ
れた胚から発達された品種Ｓｉｏｋｒａの苗を示す。
【図１６】Ｂｔプロトキシン遺伝子の５’末端を含有す
るプラスミドｍｐ１９／ｂｔの造築を示す。
【図１７】Ｂｔプロトキシンコード化配列の５’末端に
融合されたＣａＭＶ遺伝子ＶＩプロモーターを含有する
プラスミドであるｍｐ１９／ｂｔ ｃａ／ｄｅｌの造築
を示す。
【図１８】ＣａＭＶ転写停止シグナルに融合されたプロ
トキシンの３’コード化領域を有するプラスミドである
ｐ７０２／ｂｔの造築を示す。
【図１９】ＣａＭＶプロモーター及びターミネーター配
列が隣接した完全なプロトキシンコード化配列を含有す
るｐＢＲ３２２／ｂｔ１４の造築を示す。
【図２０】ｐＲＫ２５２／Ｔｎ９０３／ＢｇｌＩＩの造
築を示す。
【図２１】ＰＣＩＢ５の造築を示す。
【図２２】ｐＣＩＢ４の造築を示す。
【図２３】ｐＣＩＢ４の造築を示す。
【図２４】ｐＣＩＢ２の造築を示す。
【図２５】Ｔ−ＤＮＡ境界及び植物選択の遺伝子を含有
する広宿主範囲のプラスミドであるｐＣＩＢ１０の造築
を示す。
【図２６】ｐＣＩＢ１０／１９Ｓｂｔの造築を示す。
【図２７】ｐＣＩＢ７１０の造築を示す。
【図２８】ｐＣＩＢ１０／７１０の造築を示す。
【図２９】ｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔの造築を示す。
【図３０】ｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔ（ＫｐｎＩ）の造
築を示す。
【図３１】ｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔ（ＢｃｌＩ）の造
築を示す。
【図３２】ｐＣＩＢ１０／３５Ｓｂｔ（６０７）の造築
を示す。
【図３３】ベクターＤＥＩ ＰＥＰ１０を図示する。
【図３４】バーティシリウム蔓延畑に植付けられた綿再
生体から構成される畑試験を示す。
【図３５】図３３に示された畑試験における再生ＳＪ４
植物の後代を示す。バーティシリウム真菌に対して改良
された耐性を有するソマクローナル変種は矢印で示され
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (72)発明者 ラジャセカラン，カンニアー アメリカ合衆国 91024 カリフォルニア, シエラ マドレ，エスペランザ アベニュ ー 116シー (72)発明者 グリュラ，ジョン ウィリアム アメリカ合衆国 91104 カリフォルニア, パサデナ，クウィーンズベリ ロード 2077 (72)発明者 ハドスペス，リチャード ローン アメリカ合衆国 91001 カリフォルニア, アルタデナ，ブレーバーン ロード 1512 (72)発明者 イエノフスキ，リチャード リー アメリカ合衆国 91006 カリフォルニア, アルカディア，ウェスト ノーマン アベ ニュー 628 (56)参考文献 １．Ｒ．Ｃ．ＳＨＯＥＭＡＫＥＲ Ｅ Ｔ．ＡＬ．，ＰＬＡＮＴ ＣＥＬＬ ＲＥ ＰＯＲＴＳ，５（３），（1986），Ｐ. 178−181（庁内整理番号３−１−１) 山田康之、岡田吉美編集「現代化学増刊 ５植物バイオテクノロジー」東京化学同 人、1986年４月25日発行、Ｐ．206−212、 特にＰ．209には、アグロバクテリウムを クラフォランで殺菌する旨が記載されてい る。また、カナマイシンによる選別につい ても記載されている。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記工程を含んでなることを特徴とする
    綿細胞の形質転換方法： ａ） 綿外植片を綿に外来性の発現性遺伝子暗号を含有
    するアグロバクテリウムベクターとその遺伝子を外植片
    に転移するのに十分な時間接触させる工程； ｂ） その外植片を炭素源としてグルコースを含む第一
    の固体カルス生育培地上で約２５乃至約３５℃の温度に
    おいて１６時間の光及び８時間の闇のサイクル下におい
    て約１５乃至約２００時間インキュベートする工程； ｃ） インキュベートされた外植片を、炭素源としてグ
    ルコースを含み且つアグロバクテリウムに毒性である抗
    生物質を含有する第一の固体カルス生育培地とアグロバ
    クテリウムを殺すのに十分な時間接触させる工程； ｄ） 更に、転移された遺伝子を含む外植片を、炭素源
    としてグルコースを含み且つアグロバクテリウムを含ま
    ない第一の固体カルス生育培地上で、カルスを形成する
    外植片からのフェノール類の分泌が終了し且つ未分化カ
    ルスが発達するのに十分な時間及び前記の未分化カルス
    の発達の間培養する工程； ｅ） 形質転換カルスを未形質転換カルスから選別する
    工程；及び ｆ） 選別した形質転換したカルスを、炭素源としてス
    クロースを含む第二の固体カルス生育培地に移す工程。
  2. 【請求項２】 下記工程を含んでなることを特徴とする
    綿の形質転換方法： ａ） 胚軸、子葉及びその混合物である綿外植片を第一
    の抗生物質に対する耐性を含む遺伝子暗号を含有するア
    グロバクテリウムベクターと約１分間乃至約２４時間接
    触させる工程； ｂ） この外植片を、炭素源としてグルコースを含み且
    つ約１０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸を補給されたムラシ
    ゲ及びスクーグ培地である固体カルス生育培地に移して
    約２５乃至３５℃の温度において約１６時間の光及び８
    時間の闇のサイクル下に約１５乃至約２００時間の間外
    植片からカルスを発達させる工程； ｃ） カルスを、第一の抗生物質をアグロバクテリウム
    を殺してしまうのに十分な濃度で含有する新鮮なカルス
    生育培地に移す工程； ｄ） カルスを新鮮な第一のカルス生育培地上で培養す
    る工程；及び ｅ） 残存アグロバクテリウムを殺してしまうかかる第
    一の抗生物質及びその後に形質転換カルスが非感受性で
    ある第二の抗生物質を含有する新鮮な固体カルス生育培
    地と接触させてその抗生物質に耐性のカルスを選択する
    工程。
  3. 【請求項３】 炭素源としてスクロースを含む液体カル
    ス生育培地中で浮遊培養を行なう形質転換胚発生綿細胞
    の製造方法であって、浮遊二次培養生育サイクル後に下
    記工程を含んでなることを特徴とする方法： ａ） 液体カルス生育培地から細胞及び形成された胚発
    生細胞塊を回収する工程； ｂ） 回収細胞及び胚発生細胞塊を綿に外来性の発現性
    遺伝子配列を含むアグロバクテリウムベクターを含有す
    る液体カルス生育培地中に綿細胞を、形質転換するのに
    十分な時間浮遊生育条件を維持しながら再浮遊させる工
    程； ｃ） 浮遊細胞及び胚発生細胞塊をアグロバクテリウム
    を含有する液体カルス生育培地から回収する工程； ｄ） 形質転換細胞及び胚発生細胞塊をアグロバクテリ
    ウムに毒性である第一の抗生物質で処理してアグロバク
    テリウムを殺してしまう工程； ｅ） 未形質転換細胞及び胚発生細胞塊から形質転換細
    胞及び胚発生細胞塊を、形質転換した細胞及び細胞塊が
    非感受性である第二の抗生物質と接触させることにより
    選別する工程；及び ｆ） 細胞の浮遊液を濾過して約６００ミクロンより大
    きい胚発生細胞塊を除去する工程。
  4. 【請求項４】 第一及び第二の固体カルス生育培地が約
    １乃至約１０ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸を補給したムラ
    シゲ及びスクーグ培地を含む前記の請求項の何れか１つ
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】 第一の抗生物質がセフォタキシムである
    前記の請求項の何れか１つに記載の方法。
  6. 【請求項６】 第二の抗生物質がカナマイシン又はＧ−
    ４１８である前記の請求項の何れか１つに記載の方法。
  7. 【請求項７】 通常綿植物細胞の生育を阻止する抗生物
    質に耐性を有するように請求項１〜６の何れかに記載の
    方法により形質転換した植物からの綿。
  8. 【請求項８】 請求項１〜６の何れかに記載の綿の形質
    転換における、綿に抗生物質耐性を与えるためのベクタ
    ーの利用（該ベクターは、綿中で発現出来て抗生物質カ
    ナマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え得るキメ
    ラ遺伝子に隣接して植物ゲノムにインテグレートし得る
    Ａ．ツメファシエンスからの２つのＴ−ＤＮＡ右境界配
    列を含む）。
  9. 【請求項９】 キメラ遺伝子が配列中にノパリンシンテ
    ターゼプロモーター、Ｔｎ５からのネオマイシンホスホ
    トランスフェラーゼＩＩコード領域及び単純ヘルペスウ
    イルスチミジンキナーゼ遺伝子からのターミネーターを
    含む請求項８に記載のベクター。
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