CN102405835A - 一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基 - Google Patents
一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102405835A CN102405835A CN2011102432044A CN201110243204A CN102405835A CN 102405835 A CN102405835 A CN 102405835A CN 2011102432044 A CN2011102432044 A CN 2011102432044A CN 201110243204 A CN201110243204 A CN 201110243204A CN 102405835 A CN102405835 A CN 102405835A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium
- culture medium
- culture
- cotton
- parts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基。本发明的培养基为用于棉花体细胞再生植株的成套培养基，由培养基A、培养基B和培养基C组成，所述培养基A由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和凝固剂组成；所述培养基B由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和氨基酸添加物组成；所述培养基C由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖、氨基酸添加物和凝固剂组成；本发明的方法是使用所述成套培养基，将棉花愈伤组织培养成再生植株的方法。本发明不受棉花基因型的限制，且培养周期短、重复性高，使棉花具高效获得大量体细胞胚胎与植株再生的能力，从而为棉花的细胞工程、基因工程以及棉花遗传改良等相关研究提供重要平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基。
背景技术
棉花是重要的经济作物，其细胞和组织培养研究已取得了很大的进展，并初步建立和完善了棉花组织培养的技术体系。棉花组织培养、离体再生作为棉花细胞工程和基因工程的基础技术，在棉花遗传改良中有着极为重要的作用。然而，棉花是较难通过体细胞胚胎发生途径获得再生植株的作物，表现为在组织培养中基因型依赖性强且周期长，重复性差。另外，在棉花体细胞胚胎发生过程中，体胚发生效率低且畸形胚胎频率高。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基。
本发明所提供的培养基为用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，分为只由活性成分组成的便于存放的贮存型培养基和由所述贮存型培养基和水配成的即用型培养基。
所述用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，其中的贮存型培养基，由独立包装的培养基A、培养基B和培养基C组成；
所述培养基A为由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和凝固剂组成的培养基；
所述培养基B为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和氨基酸添加物组成的培养基；
所述培养基C为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖、氨基酸添加物和凝固剂组成的培养基；
所述改良MS基本培养基由下述质量份的营养成分组成：
NH4NO3 825份、KNO3 3800份、KH2PO4 170份、CaCl2·2H2O 440份和MgSO4·7H2O370份；KI 0.83份、Na2MoO4·2H2O 0.25份、H3BO3 6.2份、CuSO4·5H2O 0.025份、MnSO4·4H2O 22.3份、CoCl2·6H2O 0.025份和ZnSO4·4H2O 8.6份；Na2EDTA 37.3份和FeSO4·7H2O 27.8份；烟酸0.5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆素0.5份和甘氨酸2.0份；
所述激素为吲哚丁酸和激动素，所述吲哚丁酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0.3份-1.0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3，具体可为0.3份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3或0.6份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3或1.0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3；所述激动素和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0.05份-0.3份所述激动素/825份NH4NO3，具体可为0.05份所述激动素/825份NH4NO3或0.15份所述激动素/825份NH4NO3或0.3份所述激动素/825份NH4NO3；所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基A、培养基B和培养基C中的质量份之比均为(7.00-3.00)∶1，具体可为6∶1或4∶1或3.33∶1；
所述葡萄糖和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足25000份-35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3，具体可为25000份所述葡萄糖/825份NH4NO3或30000份所述葡萄糖/825份NH4NO3或35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3；
所述氨基酸添加物为谷氨酰胺和天冬氨酸，所述谷氨酰胺和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3，具体可为300份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3或500份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3或700份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3；所述天冬氨酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述天冬氨酸/825份NH4NO3，具体可为300份所述天冬氨酸/825份NH4NO3或500份所述天冬氨酸/825份NH4NO3或700份所述天冬氨酸/825份NH4NO3；
所述凝固剂具体可为植物凝胶或琼脂。
所述用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，其中的即用型培养基，由独立包装的培养基A1、培养基B1和培养基C1组成；所述培养基A1为向液体培养基D中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基D由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L-1.0mg/L或0.3mg/L或0.6mg/L或1.0mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L；
所述培养基B1为液体培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L-1.0mg/L或0.3mg/L或0.6mg/L或1.0mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L、谷氨酰胺0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L和天冬氨酸0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L；
所述培养基C1为向液体培养基E中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基E由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L-1.0mg/L或0.3mg/L或0.6mg/L或1.0mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L、谷氨酰胺0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L和天冬氨酸0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L；
所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基D、所述培养基B1、所述培养基E、所述培养基A1和所述培养基C1中的质量比为(7.00-3.00)∶1，具体可为6∶1或4∶1或3.33∶1。
所述培养基D、所述培养基B1、所述培养基E、所述培养基A1和所述培养基C1的pH值均为5.6-6.2或5.6或5.8或6.2；
所述凝固剂为植物凝胶，所述植物凝胶在所述培养基A1和所述培养基C1中的浓度均为2.4g/L-3.0g/L或2.4g/L或2.6g/L或3.0g/L。
利用所述的成套培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株：
1)将棉花愈伤组织在所述培养基A1中培养，获得胚性愈伤组织；
2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基B1中，获得原胚；
3)将所述步骤2)中获得的所述原胚在所述培养基C1中培养，获得棉花再生植株。
所述步骤2)包括如下步骤：将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织在所述培养基B1中进行第一次悬浮培养，使所述胚性愈伤组织增殖，再转接入所述培养基B1中进行第二次悬浮培养，得到所述原胚。
所述步骤2)中，所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的温度、振荡频率和培养时间如下：23-30℃、70-130转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养10-14天，具体可为10天或12天或14天。
所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的光照条件为每天24小时中光照14-18小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
所述转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于50目，如60目或70目的愈伤组织接入所述培养基B1。
所述步骤1)的培养在如下条件进行：23-30℃、光照条件为每天24小时中光照14-18小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗；
所述步骤3)的培养在如下条件进行：23-30℃、光照条件为每天24小时中光照14-18小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
所述棉花愈伤组织是通过如下诱导培养基培养棉花子叶苗的下胚轴得到的：向液体培养基F中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基F由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.9g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-D 0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、吲哚乙酸0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L；
所述诱导培养基中的所述2，4-D、所述吲哚乙酸和所述激动素的质量之比为1∶1∶1；
所述诱导培养基的pH值为5.6-6.2或5.6或5.8或6.2。
本发明所提供的方法及其培养基尤其适用于陆地棉品种。
本发明所提供的棉花体细胞再生方法及其培养基不受棉花基因型的限制；培养周期短，70天即可获得再生棉花苗；胚性愈伤诱导率高，可达72.14％；体细胞胚胎发生率高，可达47.71％；成苗率高，可达18.29％；本发明所提供的棉花体细胞再生方法及其培养基使棉花具高效获得大量体细胞胚胎与植株再生的能力，从而为棉花的细胞工程、基因工程以及棉花遗传改良等相关研究提供重要平台。
附图说明
图1为珂字棉201固-液交替培养诱导体胚发生与植株再生过程。其中，A为愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；B为胚性愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；C为胚性愈伤组织悬浮细胞系预增殖的愈伤形态；D为胚性愈伤组织悬浮细胞增殖和体细胞胚胎发生阶段愈伤及体胚形态，其中，a为增殖中胚性愈伤组织悬浮细胞形态，b为体胚发生过程中原胚的形态；E为体细胞胚胎发育阶段体胚形态；F为从体细胞胚胎中获得的再生植株。
图2为冀无2031固-液交替培养诱导体胚发生与植株再生过程。其中，A为愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；B为胚性愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；C为胚性愈伤组织悬浮细胞系预增殖的愈伤形态；D为胚性愈伤组织悬浮细胞增殖和体细胞胚胎发生阶段愈伤及体胚形态，其中，a为增殖中胚性愈伤组织悬浮细胞形态，b为体胚发生过程中原胚的形态；E为体细胞胚胎发育阶段形态；F为从体细胞胚胎中获得的再生植株。
图3为农大58固-液交替培养诱导体胚发生与植株再生过程。其中，A为愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；B为胚性愈伤诱导和增殖阶段愈伤状态；C为胚性愈伤组织悬浮细胞系预增殖的愈伤形态；D为胚性愈伤组织悬浮细胞增殖和体细胞胚胎发生阶段愈伤及体胚形态，其中，a为增殖中胚性愈伤组织悬浮细胞形态，b为体胚发生过程中原胚的形态；E为体细胞胚胎发育阶段形态；F为从体细胞胚胎中获得的再生植株。
具体实施方式
下面以三个基因型的棉花品种为例，阐明本发明的技术方案。
在本发明的第一个实施例中，棉花珂字棉201使用的成套培养基为：培养基A1、培养基B1和培养基C1。其中，培养基A1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L、激动素0.05mg/L、葡萄糖25g/L，植物凝胶2.4g/L和水，pH5.6；
培养基B1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L、激动素0.05mg/L、葡萄糖25g/L、谷氨酰胺0.3g/L、天冬氨酸0.3g/L和水，pH5.6；
培养基C1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L、激动素0.05mg/L、葡萄糖25g/L、谷氨酰胺0.3g/L、天冬氨酸0.3g/L、植物凝胶2.4g/L和水，pH5.6；
诱导培养基：NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.9g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-D0.05mg/L、吲哚乙酸0.05mg/L、激动素0.05mg/L、葡萄糖为25g/L、植物凝胶2.4g/L和水，pH值为5.6。
利用上述成套培养基和诱导培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株：
1)将在诱导培养基中形成的棉花愈伤组织在所述培养基A1中培养，获得胚性愈伤组织；
2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基B1中，获得原胚；
3)将所述步骤2)中获得的所述原胚在所述培养基C1中培养，获得棉花再生植株。
其中，在第一次悬浮培养和第二次悬浮培养的温度、振荡频率、培养时间、光照条件如下：23℃、70转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养10天、每天24小时中光照14小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于60目的愈伤组织接入所述培养基B1。
所述步骤1)和所述步骤3)的培养在如下条件进行：23℃、每天24小时中光照14小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
在本发明的第二个实施例中，棉花品种是冀无2031使用的成套培养基为：培养基A1、培养基B1和培养基C1。其中，培养基A1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO40.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、H3BO 36.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.6mg/L、激动素0.15mg/L、葡萄糖30g/L，植物凝胶2.6g/L和水，pH5.8；
培养基B1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.6mg/L、激动素0.15mg/L、葡萄糖30g/L、谷氨酰胺0.5g/L、天冬氨酸0.5g/L和水，pH5.8；
培养基C1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.6mg/L、激动素0.15mg/L、葡萄糖30g/L、谷氨酰胺0.5g/L、天冬氨酸0.5g/L、植物凝胶2.6g/L和水，pH5.8；
诱导培养基：NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.9g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-D0.15mg/L、吲哚乙酸0.15mg/L、激动素0.15mg/L、葡萄糖为30g/L、植物凝胶2.6g/L和水，pH值为5.8。
利用上述成套培养基和诱导培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株：
1)将在诱导培养基中形成的棉花愈伤组织在所述培养基A1中培养，获得胚性愈伤组织；
2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基B1中，获得原胚；
3)将所述步骤2)中获得的所述原胚在所述培养基C1中培养，获得棉花再生植株。
其中，第一次悬浮培养和第二次悬浮培养的温度、振荡频率、培养时间、光照条件如下：26℃、100转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养12天、每天24小时中光照16小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于60目的愈伤组织接入所述培养基B1。
所述步骤1)和所述步骤3)的培养在如下条件进行：26℃、光照条件为每天24小时中光照16小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
在本发明的第三个实施例中，棉花农大58使用的培养基为：培养基A1、培养基B1和培养基C1。其中，培养基A1：NH4NO30.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸1.0mg/L、激动素0.3mg/L、葡萄糖35g/L，植物凝胶3.0g/L和水，pH6.2；
培养基B1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸1.0mg/L、激动素0.3mg/L、葡萄糖35g/L、谷氨酰胺0.7g/L、天冬氨酸0.7g/L和水，pH6.2；
培养基C1：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸1.0mg/L、激动素0.3mg/L、葡萄糖35g/L、谷氨酰胺0.7g/L、天冬氨酸0.7g/L、植物凝胶3.0g/L和水，pH6.2；
诱导培养基：NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.9g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-D0.3mg/L、吲哚乙酸0.3mg/L、激动素0.3mg/L、葡萄糖为35g/L、植物凝胶3.0g/L和水，pH值为6.2。
利用上述成套培养基和诱导培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株：
1)将在诱导培养基中形成的棉花愈伤组织在所述培养基A1中培养，获得胚性愈伤组织；
2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基B1中，获得原胚；
3)将所述步骤2)中获得的所述原胚在所述培养基C1中培养，获得棉花再生植株。
其中，第一次悬浮培养和第二次悬浮培养的温度、振荡频率、培养时间、光照条件如下：30℃、130转/分钟振荡(旋转半径为12mm)培养14天、每天24小时中光照18小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于60目的愈伤组织接入所述培养基B1。
所述步骤1)和所述步骤3)的培养在如下条件进行：30℃、光照条件为每天24小时中光照18小时，光照强度为1600lux，其余时间黑暗。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、高效获得体细胞胚胎与再生植株
(一)无菌子叶苗的获得
1、棉花种子的脱绒
取50g棉花品种珂字棉201种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。
2、棉花种子的萌发
将脱绒种子经0.1％(w/v)HgCl2溶液消毒10分钟，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，28℃暗处萌发24小时，获得萌发种子。
3、棉花种子的发芽
将萌发种子在无菌环境下剥去种壳，并将去种壳的棉花种胚种植于发芽培养基上，28℃暗培养6天，获得无菌黄化子叶苗。
发芽培养基为：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、蔗糖20g/L，琼脂粉7.5g/L和水，pH5.8。
(二)愈伤组织的诱导和增殖
将珂字棉201无菌黄化子叶苗的下胚轴切成0.5cm长度，接种于诱导培养基(培养皿直径9cm，每皿含诱导培养基25ml，每皿接种8-10个下胚轴)23℃每天光照14小时，光照强度为1600Lux，培养30天(图1-A)。按每10皿为一个重复统计，每个重复接种的下胚轴数目记为A，共设重复3个。
诱导培养基的基础培养基是MS基本培养基(表1)。向MS基本培养基中添加2，4-D、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该诱导培养基。在该诱导培养基中，2，4-D、IAA和KT的浓度均为0.05mg/L，葡萄糖的浓度为25g/L，植物凝胶的浓度为2.4g/L。灭菌前调pH值为5.6，115℃高压灭菌20min。
表1.MS基本培养基
| 大量元素 | 培养基中浓度(g·L-1) |
| NH4NO3 | 1.65 |
| KNO3 | 1.9 |
| KH2PO4 | 0.17 |
| MgSO4·7H2O | 0.37 |
| CaCl2·2H2O | 0.44 |
| 微量元素 | 培养基中浓度(mg·L-1) |
| FeSO4·7H2O | 27.8 |
| Na2EDTA | 37.3 |
| MnSO4·4H2O | 22.3 |
| ZnSO4·4H2O | 8.6 |
| H3BO3 | 6.2 |
| KI | 0.83 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| 有机成分 | 培养基中浓度(mg·L-1) |
| 甘氨酸 | 2.0 |
| 盐酸硫胺素 | 0.1 |
| 盐酸吡哆素 | 0.5 |
| 烟酸VB5 | 0.5 |
| 肌醇 | 100 |
注：将上表中的NH4NO3减半为0.825g/L并将KNO3加倍至3.8g/L即为改良MS基本培养基。
(三)胚性愈伤组织的诱导和增殖
从实施例1(二)得到的愈伤组织中挑选颜色为灰白或淡黄色，质地松软，色泽鲜亮的愈伤继代至胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)上(培养皿直径9cm，每皿含胚性愈伤诱导培养基25ml，每皿接种16个-20个愈伤组织)，23℃每天光照14小时，光照强度为1600Lux，培养30天(图1-B)。
胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)。在该胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)中，IBA和KT的浓度分别为0.3mg/L和0.05mg/L，葡萄糖的浓度为25g/L，植物凝胶的浓度为2.4g/L。灭菌前调pH值为5.6，115℃高压灭菌20min。
(四)胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖
从实施例1(三)得到的愈伤组织中挑选颜色为灰白或淡黄色，质地紧凑，色泽鲜亮的愈伤放入装有50ml新鲜的胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)的100ml三角瓶中，每50ml约加入胚性愈伤组织8-10块，23℃下光周期为14小时光照(1600Lux)、10小时黑暗，旋转半径为12mm、70转/分钟振荡培养10天(图1-C)。统计每个重复的悬浮愈伤数目记为B。
胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖、谷氨酰胺和天冬酰胺得到的液体培养基即为该胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)。在该胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)中，IBA和KT的浓度分别为0.3mg/L和0.05mg/L，葡萄糖的浓度为25g/L，谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度均为0.3g/L。灭菌前调pH值为5.6，115℃高压灭菌20min。
(五)胚性愈伤组织悬浮细胞的增殖和原胚发生
将实施例1(四)中悬浮培养预增殖获得的悬浮细胞过60目筛，将过筛后下层的小颗粒悬浮细胞转入装有50ml新鲜的胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)(同实施例1(四))的100ml三角瓶中，23℃下光周期为14小时光照(1600Lux)、10小时黑暗，旋转半径为12mm、70转/分钟振荡培养10天(图1-D)，形成原胚。该原胚以沉淀的形式存在于三角瓶中。
(六)体细胞胚胎的发育
将实施例1(五)得到的原胚转入分化培养基(培养基C1)(100ml三角瓶含50ml分化培养基，每瓶接种10-15个原胚，光周期为14小时光照(1600Lux)、10小时黑暗，23℃条件下培养，经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚阶段，直至获得具备完整形态学芽与根的体细胞胚胎(图1-E)。统计每个重复接种的原胚数目记为C，统计每个重复分化的体细胞胚胎数记为D。
分化培养基(培养基C1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖、谷氨酰胺、天冬酰胺和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该分化培养基(培养基C1)。在该分化培养基(培养基C1)中，IBA和KT的浓度分别为0.3mg/L和0.05mg/L，葡萄糖的浓度为25g/L，谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度均为0.3g/L，植物凝胶的浓度为2.4g/L。灭菌前调pH值为5.6，115℃高压灭菌20min。
(七)体细胞胚胎经诱导获得再生植株阶段
将实施例1(六)获得的体细胞胚胎继代至分化培养基(培养基C1)(同步骤(六))，光周期为14小时光照(1600Lux)、10小时黑暗，23℃条件下培养，直到获得再生植株(图1-F)。统计每个重复的成苗数目记为E。
整个实验周期为70天-120天，实验结果见表2。
结果分析：实验结果经Excel2003统计函数进行分析，发现本发明所采用的棉花植株再生方法实验周期短，最短时间为70天即可再生，相比目前棉花体细胞培养与再生时间一般为3-4个月，很大程度上缩短了所需时间。与常规棉花组织培养方法相比，本发明所采用的培养基能有效提高胚性愈伤诱导率及体胚发生率，以珂字棉201为诱导材料，其胚性愈伤诱导率及体胚发生率分别达到72.14％与47.71％。同时，在该方法及其培养基条件下，棉花再生成苗率也高达17.53％，降低了棉花组织培养中出现的畸形苗率高的问题。
表2棉花体细胞植株再生实验结果(珂字棉201)
实施例2、高效获得体细胞胚胎与再生植株
(一)无菌子叶苗的获得
1、棉花种子的脱绒
取50g棉花品种冀无2031(购自河北冀丰种业有限公司，为河北省农作物品种审定委员会审定品种)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。
2、棉花种子的萌发
将脱绒种子经0.1％(w/v)HgCl2溶液消毒10分钟，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，28℃暗处萌发24小时，获得萌发种子。
3、棉花种子的发芽
将萌发种子在无菌环境下剥去种壳，并将去种壳的棉花种胚种植于发芽培养基(同实施例1)上，28℃暗培养7天，获得无菌黄化子叶苗。
(二)愈伤组织的诱导和增殖
将冀无2031无菌黄化子叶苗的下胚轴切成0.6cm长度，接种于诱导培养基(培养皿直径9cm，每皿含诱导培养基25ml，每皿接种8-10个下胚轴)26℃每天光照16小时，光照强度为1600Lux，培养30天(图2-A)。按每5皿为一个重复统计每个重复接种的下胚轴数目记为A，共设重复3个。
诱导培养基的基础培养基是MS基本培养基(表1)。向MS基本培养基中添加2，4-D、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该诱导培养基。在该诱导培养基中，2，4-D、IAA和KT的浓度均为0.15mg/L，葡萄糖的浓度为30g/L，植物凝胶的浓度为2.6g/L。灭菌前调pH值为5.8，115℃高压灭菌20min。
(三)胚性愈伤组织的诱导和增殖
从实施例2(二)得到的愈伤组织中挑选颜色为灰白或淡黄色，质地松软，色泽鲜亮的愈伤继代至胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)上(培养皿直径9cm，每皿含胚性愈伤诱导培养基25ml，每皿接种16-20个愈伤组织)，26℃每天光照16小时，光照强度为1600Lux，培养30天(图2-B)。
胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)。在该胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)中，IBA和KT的浓度分别为0.6mg/L和0.15mg/L，葡萄糖的浓度为30g/L，植物凝胶的浓度为2.6g/L。灭菌前调pH值为5.8，115℃高压灭菌20min。
(四)胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖
从实施例2中(三)得到的愈伤组织中挑选颜色为灰白或淡黄色，质地紧凑，色泽鲜亮的愈伤放入装有50ml新鲜的胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)的100ml三角瓶中，每50ml约加入胚性愈伤组织8-10块，26℃下光周期为16小时光照(1600Lux)、8小时黑暗，旋转半径为12mm、100转/分钟振荡培养12天(图2-C)。统计每个重复的悬浮愈伤数目记为B。
胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖、谷氨酰胺和天冬酰胺得到的液体培养基即为该胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)。在该胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)中，IBA和KT的浓度分别为0.6mg/L和0.15mg/L，葡萄糖的浓度为30g/L，谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度均为0.5g/L。灭菌前调pH值为5.8，115℃高压灭菌20min。
(五)胚性愈伤组织悬浮细胞的增殖和原胚发生
将实施例2(四)中悬浮培养预增殖获得的悬浮细胞过60目筛，将过筛后下层的小颗粒悬浮细胞转入装有50ml新鲜的胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)(同实施例2中(四))的100ml三角瓶中，26℃下光周期为16小时光照(1600Lux)、8小时黑暗，旋转半径为12mm、100转/分钟振荡培养12天(图2-D)，形成原胚。该原胚以沉淀的形式存在于三角瓶中。
(六)体细胞胚胎的发育
将实施例2(五)得到的原胚转入分化培养基(培养基C1)(100ml三角瓶含50ml分化培养基，每瓶接种10-15个原胚)，光周期为16小时光照(1600Lux)、8黑暗小时，26℃条件下培养，经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚阶段，直至获得具备完整形态学芽与根的体细胞胚胎(图2-E)。统计每个重复接种的原胚数目记为C，统计每个重复分化的体细胞胚胎数目记为D。
分化培养基(培养基C1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖、谷氨酰胺、天冬酰胺和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该分化培养基(培养基C1)。在该分化培养基(培养基C1)中，IBA和KT的浓度分别为0.6mg/L和0.15mg/L，葡萄糖的浓度为30g/L，谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度均为0.5g/L，植物凝胶的浓度为2.6g/L。灭菌前调pH值为5.8，115℃高压灭菌20min。
(七)体细胞胚胎经诱导获得再生植株阶段
将实施例2(六)获得的体细胞胚胎继代至分化培养基(同步骤(六))，光周期为16小时光照(1600Lux)，8小时暗培养，26℃条件下培养，直到获得再生植株(图2-F)。统计每个重复的成苗数目记为E。
整个实验周期为70天-120天，实验结果见表3。
结果分析：实验结果经Excel2003统计函数进行分析，发现本发明所采用的棉花植株再生方法实验周期短，最短时间为70天即可再生，相比目前棉花体细胞培养与再生时间一般为3-4个月，很大程度上缩短了所需时间。与常规棉花组织培养方法相比，本发明所采用的培养基能有效提高胚性愈伤诱导率及体胚发生率，以冀无2031为诱导材料，其胚性愈伤诱导率及体胚发生率分别达到52.86％与39.83％。同时，在该方法及其培养基条件下，棉花再生成苗率也高达18.04％，降低了棉花组织培养中出现的畸形苗率高的问颗。
表3棉花体细胞植株再生实验结果(冀无2031)
实施例3、高效获得体细胞胚胎与再生植株
(一)无菌子叶苗的获得
1、棉花种子的脱绒
取50g棉花品种农大58(购自河北冀丰种业有限公司，为河北省农作物品种审定委员会审定品种)种子加15ml左右浓硫酸，快速搅动2-3min，然后石灰水中和，不断搓洗，流水冲洗10-12min，获得干净的脱绒种子。
2、棉花种子的萌发
将脱绒种子经0.1％(w/v)HgCl2溶液消毒10分钟，然后用灭菌水清洗种子5-6遍，最后加入150ml灭菌水，28℃暗处萌发24小时，获得萌发种子。
3、棉花种子的发芽
将萌发种子在无菌环境下剥去种壳，并将去种壳的棉花种胚种植于发芽培养基(同实施例1)上，28℃暗培养8天，获得无菌黄化子叶苗。
(二)愈伤组织的诱导和增殖
将农大58无菌黄化子叶苗的下胚轴切成0.8cm长度，接种于诱导培养基(培养皿直径9cm，每皿含诱导培养基25ml，每皿接种8个-10个下胚轴)30℃每天光照18小时，光照强度为1600Lux，培养30天(图3-A)。按每10皿为一个重复统计每个重复接种的下胚轴数目记为A，共设重复3个。
诱导培养基的基础培养基是MS基本培养基(表1)。向MS基本培养基中添加2，4-D、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该诱导培养基。在该诱导培养基中，2，4-D、IAA和KT的浓度均为0.3mg/L，葡萄糖的浓度为35g/L，植物凝胶的浓度为3.0g/L。灭菌前调pH值为6.2，115℃高压灭菌20min。
(三)胚性愈伤组织的诱导和增殖
从实施例3中(二)得到的愈伤组织中挑选颜色为灰白或淡黄色，质地松软，色泽鲜亮的愈伤继代至胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)上(培养皿直径9cm，每皿含胚性愈伤诱导培养基25ml，每皿接种16个-20个愈伤组织)，30℃每天光照18小时，光照强度为1600Lux，培养30天(图3-B)。
胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)。在该胚性愈伤诱导培养基(培养基A1)中，IBA和KT的浓度分别为1.0mg/L和0.3mg/L，葡萄糖的浓度为35g/L，植物凝胶(phytagel)的浓度为3.0/L。灭菌前调pH值为6.2，115℃高压灭菌20min。
(四)胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖
从实施例3(三)得到的愈伤组织中挑选颜色为灰白或淡黄色，质地紧凑，色泽鲜亮的愈伤放入装有50ml新鲜的胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)的100ml三角瓶中，每50ml约加入胚性愈伤组织8-10块，30℃下光周期为18小时光照(1600Lux)、6小时黑暗，旋转半径为12mm、130转/分钟振荡培养14天(图3-C)。统计每个重复悬浮的胚性愈伤数目记为B。
胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖、谷氨酰胺和天冬酰胺得到的液体培养基即为该胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)。在该胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)中，IBA和KT的浓度分别为1.0mg/L和0.3mg/L，葡萄糖的浓度为35g/L，谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度均为0.7g/L。灭菌前调pH值为6.2，115℃高压灭菌20min。
(五)胚性愈伤组织悬浮细胞的增殖和原胚发生
将实施例3(四)中悬浮培养预增殖获得的悬浮细胞过60目筛，将过筛后下层的小颗粒悬浮细胞转入装有50ml新鲜的胚性愈伤悬浮培养基(培养基B1)(同实施例3中(四))的100ml三角瓶中，30℃下光周期为18小时光照(1600Lux)、6小时黑暗，旋转半径为12mm、130转/分钟振荡培养14天(图3-D)，形成原胚。该原胚以沉淀的形式存在于三角瓶中。
(六)体细胞胚胎的发育
将实施例3(五)得到的原胚转入分化培养基(培养基C1)(100ml三角瓶含50ml分化培养基，每瓶接种10-15个原胚)，光周期为18小时光照(1600Lux)，6小时黑暗，30℃条件下培养，经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚阶段，直至获得具备完整形态学芽与根的体细胞胚胎(图3-E)。统计每个重复接种的胚性愈伤数目记为C，统计每个重复分化的体细胞胚胎数目记为D。
分化培养基(培养基C1)的基础培养基是改良MS基本培养基(表1)。向改良MS基本培养基中添加吲哚丁酸(IBA)、激动素(KT)、葡萄糖、谷氨酰胺、天冬酰胺和植物凝胶(phytagel)得到的固体培养基即为该分化培养基(培养基C1)。在该分化培养基(培养基C1)中，IBA和KT的浓度分别为1.0mg/L和0.3mg/L，葡萄糖的浓度为35g/L，谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度均为0.7g/L，植物凝胶(phytagel)的浓度为3.0g/L。灭菌前调pH值为6.2，115℃高压灭菌20min。
(七)体细胞胚胎经诱导获得再生植株阶段
将实施例3(六)获得的体细胞胚胎继代至分化培养基(同实施例3(六))，光周期为18小时光照(1600Lux)、6小时黑暗，30℃条件下培养，直到获得再生植株(图3-F)。统计每个重复的成苗数目记为E。
整个实验周期为70天-120天，实验结果见表4。
结果分析：实验结果经Excel2003统计函数进行分析，发现本发明所采用的棉花植株再生方法实验周期短，最短时间为70天即可再生，相比目前棉花体细胞培养与再生时间一般为3-4个月，很大程度上缩短了所需时间。与常规棉花组织培养方法相比，本发明所采用的培养基能有效提高胚性愈伤诱导率及体胚发生率，以农大58为诱导材料，其胚性愈伤诱导率及体胚发生率分别达到61.62％与47.7％。同时，在该方法及其培养基条件下，棉花再生成苗率也高达18.29％，有效降低了棉花组织培养中出现的畸形苗率高的问题。
表4棉花体细胞植株再生实验结果(农大58)
Claims (10)
1.用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，由独立包装的培养基A、培养基B和培养基C组成；
所述培养基A为由改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和凝固剂组成的培养基；
所述培养基B为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖和氨基酸添加物组成的培养基；
所述培养基C为由所述改良MS基本培养基、激素、葡萄糖、氨基酸添加物和凝固剂组成的培养基；
所述改良MS基本培养基由下述质量份的营养成分组成：
NH4NO3 825份、KNO3 3800份、KH2PO4 170份、CaCl2·2H2O 440份和MgSO4·7H2O370份；KI 0.83份、Na2MoO4·2H2O 0.25份、H3BO3 6.2份、CuSO4·5H2O 0.025份、MnSO4·4H2O 22.3份、CoCl2·6H2O 0.025份和ZnSO4·4H2O 8.6份；Na2EDTA 37.3份和FeSO4·7H2O 27.8份；烟酸0.5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆素0.5份和甘氨酸2.0份；
所述激素为吲哚丁酸和激动素，所述吲哚丁酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0.3份-1.0份所述吲哚丁酸/825份NH4NO3；所述激动素和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足0.05份-0.3份所述激动素/825份NH4NO3；所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基A、培养基B和培养基C中的质量份之比均为(7.00-3.00)∶1；
所述葡萄糖和所述改良MS基本培养基在所述培养基A、培养基B和培养基C中的配比满足25000份-35000份所述葡萄糖/825份NH4NO3；
所述氨基酸添加物为谷氨酰胺和天冬氨酸，所述谷氨酰胺和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述谷氨酰胺/825份NH4NO3；所述天冬氨酸和所述改良MS基本培养基在所述培养基B和培养基C中的配比满足300份-700份所述天冬氨酸/825份NH4NO3。
2.用于获得棉花体细胞再生植株的成套培养基，由独立包装的培养基A1、培养基B1和培养基C1组成；所述培养基A1为向液体培养基D中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基D由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L-1.0mg/L或0.3mg/L或0.6mg/L或1.0mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L；
所述培养基B1为液体培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L-1.0mg/L或0.3mg/L或0.6mg/L或1.0mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L、谷氨酰胺0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L和天冬氨酸0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L；
所述培养基C1为向液体培养基E中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基E由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 0.825g/L、KNO3 3.8g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L-1.0mg/L或0.3mg/L或0.6mg/L或1.0mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L、谷氨酰胺0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L和天冬氨酸0.3g/L-0.7g/L或0.3g/L或0.5g/L或0.7g/L；
所述吲哚丁酸与所述激动素在所述培养基D、所述培养基B1、所述培养基E、所述培养基A1和所述培养基C1中的质量比为(7.00-3.00)∶1。
3.根据权利要求2所述的成套培养基，其特征在于：所述培养基D、所述培养基B1、所述培养基E、所述培养基A1和所述培养基C1的pH值均为5.6-6.2或5.6或5.8或6.2；
所述凝固剂为植物凝胶，所述植物凝胶在所述培养基A1和所述培养基C1中的浓度均为2.4g/L-3.0g/L或2.4g/L或2.6g/L或3.0g/L。
4.利用权利要求2或3所述的成套培养基按照包括如下步骤的方法将棉花愈伤组织培养成再生植株：
1)将棉花愈伤组织在所述培养基A1中培养，获得胚性愈伤组织；
2)将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织培养于所述培养基B1中，获得原胚；
3)将所述步骤2)中获得的所述原胚在所述培养基C1中培养，获得棉花再生植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)包括如下步骤：将所述步骤1)中获得的所述胚性愈伤组织在所述培养基B1中进行第一次悬浮培养，使所述胚性愈伤组织增殖，再转接入所述培养基B1中进行第二次悬浮培养，得到所述原胚。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的温度、振荡频率和培养时间如下：23-30℃、70-130转/分钟、振荡培养10-14天。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述第一次悬浮培养和所述第二次悬浮培养的光照条件为每天24小时中光照14-18小时，其余时间黑暗。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述转接是将第一次悬浮培养得到的粒径小于50目的愈伤组织接入所述培养基B1。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤1)的培养在如下条件进行：23-30℃、光照条件为每天24小时中光照14-18小时，其余时间黑暗；
所述步骤3)的培养在如下条件进行：23-30℃、光照条件为每天24小时中光照14-18小时，其余时间黑暗。
10.根据权利要求4-9中任一所述方法，其特征在于：
所述棉花愈伤组织是通过如下诱导培养基培养棉花子叶苗的下胚轴得到的：向液体培养基F中加入凝固剂得到的固体培养基；所述液体培养基F由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质的浓度如下：NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.9g/L、KH2PO4 0.17g/L、CaCl2·2H2O 0.44g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、MnSO4·4H2O 22.3mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、ZnSO4·4H2O 8.6mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、2，4-D 0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、吲哚乙酸0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、激动素0.05mg/L-0.3mg/L或0.05mg/L或0.15mg/L或0.3mg/L、葡萄糖为25g/L-35g/L或25g/L或30g/L或35g/L；
所述诱导培养基中的所述2，4-D、所述吲哚乙酸和所述激动素的质量之比为1∶1∶1；
所述诱导培养基的pH值为5.6-6.2或5.6或5.8或6.2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102432044A CN102405835A (zh) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | 一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102432044A CN102405835A (zh) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | 一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102405835A true CN102405835A (zh) | 2012-04-11 |
Family
ID=45908404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102432044A Pending CN102405835A (zh) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | 一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102405835A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586756A (zh) * | 2017-10-23 | 2018-01-16 | 南京林业大学 | 一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基 |
| CN108271692A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-13 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法及培养基 |
| CN114503915A (zh) * | 2022-02-24 | 2022-05-17 | 新疆农业大学 | 一种陆地棉遗传转化体系的构建方法 |
| CN115777538A (zh) * | 2022-12-07 | 2023-03-14 | 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） | 一种棉花短周期培育方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1070309A (zh) * | 1987-11-18 | 1993-03-31 | 泛多金公司 | 棉花的再生和转化 |
| CN1886041A (zh) * | 2003-12-31 | 2006-12-27 | 科学与工业研究委员会 | 一种生产棉花植株的组织培养方法 |
| CN101679997A (zh) * | 2007-05-08 | 2010-03-24 | 孟山都技术公司 | 诱导棉花胚发生性愈伤组织的方法 |
-
2011
- 2011-08-23 CN CN2011102432044A patent/CN102405835A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1070309A (zh) * | 1987-11-18 | 1993-03-31 | 泛多金公司 | 棉花的再生和转化 |
| CN1886041A (zh) * | 2003-12-31 | 2006-12-27 | 科学与工业研究委员会 | 一种生产棉花植株的组织培养方法 |
| CN101679997A (zh) * | 2007-05-08 | 2010-03-24 | 孟山都技术公司 | 诱导棉花胚发生性愈伤组织的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 中国棉花学会: "中国棉花学会2011 年年会会议纪要", 《中国棉花》 * |
| 佘建明等: "陆地棉原生质体高频率分裂及植株再生", 《遗传学报》 * |
| 张园等: "固液交替培养高效诱导棉花胚性愈伤形成与体胚发生", 《中国棉花学会２０１１年年会论文汇编》 * |
| 王彦霞等: "影响棉花幼胚( 珠) 离体培养及植株建成的因素分析", 《华北农学报》 * |
| 韩改英等: "陆地棉抗病品种中521 植株再生的研究", 《棉花学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107586756A (zh) * | 2017-10-23 | 2018-01-16 | 南京林业大学 | 一种高效诱导抗松材线虫病黑松体胚发生的培养基 |
| CN108271692A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-07-13 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法及培养基 |
| CN108271692B (zh) * | 2018-02-11 | 2021-06-01 | 中国农业科学院棉花研究所 | 棉花外植体直接分化为胚性愈伤组织的方法及培养基 |
| CN114503915A (zh) * | 2022-02-24 | 2022-05-17 | 新疆农业大学 | 一种陆地棉遗传转化体系的构建方法 |
| CN115777538A (zh) * | 2022-12-07 | 2023-03-14 | 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） | 一种棉花短周期培育方法 |
| CN115777538B (zh) * | 2022-12-07 | 2023-08-29 | 河北省农林科学院棉花研究所（河北省农林科学院特种经济作物研究所） | 一种棉花短周期培育方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102124954B (zh) | 红叶石楠离体叶片诱导快繁培养基 | |
| CN102217548A (zh) | 龙脑樟树工厂化育苗方法 | |
| CN108243960B (zh) | 无种质基因型限制的高频体胚再生培养基及其应用 | |
| Ochatt et al. | The growth regulators used for bud regeneration and shoot rooting affect the competence for flowering and seed set in regenerated plants of protein peas | |
| CN104429952A (zh) | 一种培养结球甘蓝游离小孢子高效获得再生植株的方法 | |
| CN108575747B (zh) | 一种福建山樱花的不定芽再生方法 | |
| CN102405835A (zh) | 一种高效诱导棉花体胚发生与植株再生的方法及其培养基 | |
| CN101238793B (zh) | 南美水仙组织培养的一组培养基及其标准化快繁方法 | |
| CN101926285B (zh) | 克服苜蓿品种基因型限制高频体胚再生培养方法 | |
| CN106508673A (zh) | 一种茄子花药培养直接获得植株的方法和培养基 | |
| CN107372122B (zh) | 橡胶树胚性愈伤组织诱导培养基及橡胶树胚性愈伤组织快速增殖方法 | |
| CN105557522A (zh) | 一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法 | |
| CN101836589B (zh) | 一种南抗杨的快速繁殖方法 | |
| Cai et al. | Plant regeneration from cell suspension-derived protoplasts of Populus× beijingensis | |
| JPS6156022A (ja) | 植物組織培養による球根類の増殖法 | |
| CN108056023B (zh) | 无种质基因型限制高频体胚再生培养方法 | |
| CN105010123A (zh) | 通过离体挽救培养获得草莓远缘杂种的方法及培养基 | |
| CN104663445A (zh) | 一种高产脂湿地松的离体快繁技术 | |
| CN111165356B (zh) | 一种牡丹的组织培养繁殖方法 | |
| CN104719161B (zh) | 一种通过诱导体细胞胚获得非洲菊再生植株的方法 | |
| CN109105260B (zh) | 一种杂交兜兰无性克隆高效繁殖方法 | |
| CN109169285B (zh) | 一种辣椒未成熟种子培养和种苗快速扩繁的方法 | |
| CN102577978A (zh) | 一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法 | |
| Inoue | Improvement of the method for overcoming the hybrid lethality between Nicotiana suaveolens and N. tabacum by culture of F1 seeds in liquid media containing cytokinins | |
| CN100411508C (zh) | 一种高效诱导植物组织分化再生的培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120411 |