CN102577978A

CN102577978A - 一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法

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Publication number: CN102577978A
Application number: CN201210070699XA
Authority: CN
Inventors: 罗俊杰; 刘新星; 陈玉梁; 曲延英; 陈子萱; 李忠旺
Original assignee: Biotechnology Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明公开了一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括有以下步骤：绿棉种子消毒后剥去种皮进行培养，得到无菌苗下胚轴；无菌苗下胚轴置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养；转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养；转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养得到胚性愈伤组织；再进行扩繁培养。本发明的有益效果为：本发明提供的绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，耗时短，诱导率高，拓展了可再生棉花的基因型，适应于彩棉的绿棉品种，对彩棉转基因育种的发展壮大具有积极作用。

Description

一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法

技术领域

本发明涉及一种植物领域组织培养的诱导和培养方法，具体涉及绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。

背景技术

棉花是世界性重要经济作物，彩色棉作为棉花品种的一类，是重要的纯天然、无污染绿色纺织产品的重要原料之一，随着人们生活水平的日益提高和纺织工业的飞速发展倍受青睐。彩色棉的纤维具有天然的棕、绿、黄、红等多种颜色，用它进行纺织可以不使用对环境有害的油剂、浆料、染料和其它后处理剂，避免了化工染料对人体的毒害作用和对棉纤维自身优良品质的破坏。但彩棉一直都受到产量低、纤维品质差、遗传不稳定等因素的限制，未能大面积示范推广。棉花转基因育种的突破极大地促进了世界棉花产业的发展，转基因育种作为传统育种的重要补充逐渐成为重要育种手段，拓展可再生彩棉品种基因型，尤其是具有重要推广价值的特色品种类型，胚性愈伤组织诱导是彩棉转基因研究的关键环节，也是彩棉转基因育种，进行彩棉品种改良和品质改善的重要途径和方法，具有重要的研究价值和发展前景。

在完成对棉花品质和抗性基因工程改造的同时，首先要建立一个高效的棉花再生体系。众所周知，棉花的再生工程受到基因型的限制很大，棉花的组织培养继代时间长，愈伤组织分化率低，重复性差。影响棉花体细胞再生的因素除外植体来源外，主要还有激素组合、培养基、氮源、碳源、无机盐、有机物等。目前仍旧没有任何一个体系可以完成对所有棉花品种的再生建立。目前所能做的就是扩展尽可能多得棉花品种来完成再生研究，在一定量的积累上实现质的突破。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，克服了绿棉体细胞胚胎发生及植株再生的困难，提供了一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括有以下步骤：

1)绿棉种子以硫酸脱绒后，再经过消毒洗涤，得到无菌绿棉种子，再将无菌绿棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS固体培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗下胚轴；

2)将步骤1)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8mm小段，并置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养绿棉愈伤组织；

3)将步骤2)得到的初级培养绿棉愈伤组织转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，得到增殖后绿棉愈伤组织；

4)将步骤3)得到的增殖后绿棉愈伤组织转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养2次，得到胚性愈伤组织；

5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织置于绿棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。

上述的诱导和培养方法，所述步骤1)中，

硫酸脱绒所用的为95％的浓硫酸；

消毒洗涤的过程为：绿棉种子先以70％乙醇涮洗30s，再用30％过氧化氢浸泡3h，无菌水冲洗5-8遍，最后用无菌水浸泡8-12h至种子露白；

无菌绿棉种子的培养周期为4-8天，光暗交替过称为黑暗3-5天，关照1-3天。

上述的诱导和培养方法，所述步骤2)中，绿棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了0.05-0.15mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.15mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.05-0.15mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。

上述的诱导和培养方法，所述步骤3)中，绿棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了0.025-0.075mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。

上述的诱导和培养方法，所述步骤4)中，绿棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃和1.8-2.5g/L凝固剂gelrite的MSB培养基。

上述的诱导和培养方法，所述步骤5)中，绿棉胚性愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃、1.8-2.0g/L凝固剂gelrite、0.1-0.5g/L天冬酰胺和0.1-0.5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH₄NO₃的加入量减半的MSB培养基。

本发明的有益效果为：

本发明提供的绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，从外植体的培养到愈伤组织诱导，愈伤组织增殖分化，调节和筛选愈伤组织质地疏松无硬化、颜色浅绿、灰绿到黄绿的愈伤组织，对其增殖及分化过程的培养条件进行优化，最终研究得到胚性愈伤组织诱导时间可缩短至4-6个月，愈伤组织诱导率高达100％，胚性愈伤组织分化率达10％-20％，继代15天后胚性愈伤组织的增殖倍数可达1.5倍，可有效节省人力、物力的损耗。外植体培养是再生的第一步，无菌苗的生长情况直接关系愈伤组织的诱导。由于采用了暗光交替的培养，为愈伤组织的诱导提供了分生能力最强时期的下胚轴。2，4-D在诱导愈伤组织中是必需的，它启动细胞分裂速度快，诱导产生愈伤组织频率高、质量好，在棉花组织培养和遗传转化中被广泛应用。但2，4-D浓度过高会导致愈伤组织稀松褐化，且长期使用不利于后期胚性愈伤组织的产生。因此，在愈伤组织诱导期加入了合适浓度的KT和2，4-D，而在后期愈伤组织增殖继代中采取去除2，4-D或对其进行减半的方法，以避免对后期工作的阻碍。愈伤组织分化过程中则采用无激素的培养基更加有利于其分化。此时，因前期外源激素的累积，后期若再加入激素，可能会造成外源激素与愈伤组织体内激素的冲突，不利于后期培养。关于胚性愈伤组织的增殖，研究发现氮源减弱有利于胚性愈伤组织增殖，完全去除和使用全量的氮源都会影响其增殖。该方法耗时短，诱导率高，拓展了可再生棉花的基因型。适应于彩棉的绿棉品种，对彩棉转基因育种的发展壮大具有积极作用。

具体实施方式

本发明技术方案材料中所提及的的MSB培养基，是一种常规培养基，其主要成分及用量如表1所示：

表1

其中，KT--N6-异戊烯腺嘌呤；2.4-D--二氯苯氧乙酸；IAA-吲哚乙酸，均为分析纯级试剂。Gelrite-植物凝胶，来源Sigma公司进口分装；天门冬酰胺和谷氨酰胺-氨基酸类，均为分析纯级试剂。

名词解释：继代培养是植物组织培养的专业术语，意思就是由于诱导培养基中的营养物质和水分的减少，培养物分泌产物积累，导致愈伤组织生长缓慢，影响愈伤组织其细胞分化很难保持一个旺盛分裂、均一的群体状态，需要在一定时间段把愈伤组织转接到新鲜的培养基上继续进行培养，其目的就是使培养的愈伤组织保持旺盛的生长状态。

实施例1：

(1)供试材料：陇绿棉3号、G3-1和G3-6。

(2)外植体培养：种子消毒后用无菌水浸泡过夜，待种子露白，于超净工作台中剥去种皮接种于1/2MS发芽培养基中培养。培养温度为28±1℃，光照强度2000Lx，以光照和黑暗培养时间交替周期为设计依据，分别设置暗2-5d/光1-3d的处理组。培养完毕后观察苗子色泽，高矮，粗壮度，之后切取下胚轴后全部转入添加KT和2，4-D的MSB培养基考察愈伤诱导情况。结果证明陇绿棉3号与G3-1的最佳培养时间为6天，暗4d/光2d，；G3-2则需7天培养，暗4d/光3d下生长最为良好。此时间内的无菌苗下胚轴材料幼嫩度适宜，愈伤诱导容易。

(3)将获得的三种材料的无菌苗下胚轴切成5-8mm小段，平放于附加0.01-0.1mg/L2，4-D+0.05-0.3mg/L KT或0.01-0.1mg/L 2，4-D+0.1-0.3mg/L KT+0.1-0.3mg/L IAA的MSB培养基。30天后，陇绿棉3号和G3-1在0.1mg/L2，4-D+0.05-0.3mg/L KT或0.1mg/L 2，4-D+0.1mg/LKT+0.1mg/L IAA的MSB培养基上，愈伤诱导率均达100％；而G3-2则在0.05mg/L2，4-D+0.1-0.3mg/L KT的MSB培养基上，获得100％的愈伤诱导率。且获得的愈伤颜色呈灰白色，状态疏松。

(4)将三种材料诱导出的愈伤组织分别转接至上述对应的培养基，2，4-D减半和去除的MSB培养基，25天继代一次。继代两次后，发现继续在原培养基上继代的三种材料均呈现愈伤稀松，发褐，逐渐死亡，而转接至2，4-D减半和去除的原培养基，则愈伤增殖快，状态疏松，颜色呈黄绿色。

(5)在上述培养基中继代两次后，挑选生长旺盛，状态疏松的愈伤组织转入去除外源激素，添加1.9g/L KNO₃并添加2.0g/L凝固剂gelrite的MSB培养基上，25-30天继代一次，继代两到三次后，三种材料均可在愈伤组织底部或侧边缘看到淡黄色或浅绿色松散颗粒状的胚性愈伤组织，陇绿棉3号、G3-1和G3-6的胚性愈伤诱导率分别为17％、20％和13％，且陇绿棉3号最先诱导出胚性愈伤。

(6)将挑选出的三种材料的胚性愈伤组织放置在MSB(NH₄NO₃减半)中添加1.9g/L KNO₃并添加1.8g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺的培养基上。15天继代一次，15天后测得三种材料的胚性愈伤组织增殖倍数均达1.5倍以上。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，包括有以下步骤：

1）绿棉种子以硫酸脱绒后，再经过消毒洗涤，得到无菌绿棉种子，再将无菌绿棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS固体培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗下胚轴；

2）将步骤1）得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8mm小段，并置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养绿棉愈伤组织；

3）将步骤2）得到的初级培养绿棉愈伤组织转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，得到增殖后绿棉愈伤组织；

4）将步骤3）得到的增殖后绿棉愈伤组织转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养2-3次后，得到胚性愈伤组织；

5）将步骤4）得到的胚性愈伤组织置于绿棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。

2.根据权利要求1所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤1）中，

硫酸脱绒所用的为95%的浓硫酸；

消毒洗涤的过程为：绿棉种子先以70%乙醇涮洗30s，再用30%过氧化氢浸泡3h，无菌水冲洗5-8遍，最后用无菌水浸泡8-12h至种子露白；

3.根据权利要求1或2所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤2）中，绿棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了0.05-0.15mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.15mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.05-0.15mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。

4.根据权利要求3所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤3）中，绿棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了0.025-0.075mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L 吲哚乙酸的MSB培养基。

5.根据权利要求4所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤4）中，绿棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃和1.8-2.5g/L 凝固剂gelrite的MSB培养基。

6.根据权利要求5所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤5）中，绿棉胚性愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃、1.8-2.0g/L 凝固剂gelrite、0.1-0.5g/L天冬酰胺和0.1-0.5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH₄NO₃的加入量减半的MSB培养基。