CN102283131B - 一种剑麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种剑麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法，包括以下步骤：（1）无菌苗培养：茎尖作为外植体，消毒后纵切，接种在培养基中；（2）愈伤组织诱导：用无菌苗茎尖在诱导培养基中先进行暗培养，然后进行愈伤诱导培养；（3）愈伤组织继代培养：取诱导的淡黄绿色球状或块状愈伤组织进行继代培养；（4）分化培养及植株再生：将继代培养获得的块状或球状的浅黄绿色愈伤组织进行不定芽诱导；（5）生根培养：待分化出再生植株后转入生根培养基进行生根培养；（6）再生植株移栽；本方法通过对SH培养基进行改良，建立了剑麻愈伤诱导及再生体系，方法简单，外植体容易获得，生产快速、高效，为剑麻诱变和基因工程育种打下了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种剑麻植株再生体系建立的方法，特别涉及一种H.11648麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法，属于组织培养育苗技术领域。
背景技术
剑麻为重要的热带纤维作物，主要分布在南北回归线之间的部分热带、亚热带地区，种植区域十分有限，资源总量稀缺；剑麻纤维是航运、渔船、钻探所用绳缆、绳网，电梯、吊车的钢索绳心等不可替代的原料，目前剑麻制品已广泛用于金属抛光、特种纸浆、金属制品、运输、矿山、家庭装饰、地毯、工艺、医药和汽车工业中。
剑麻是我国热带地区的特色作物，自1963-1964年从国外引进剑麻高产品种H.11648以来，剑麻产量成倍增加，单产跃居世界前列，成为可出口创汇的优势产业。目前H.11648麻仍然是我国剑麻生产唯一的当家品种，由于单一品种的长期使用，早花早衰现象突出，病虫害不断滋生，剑麻产业健康发展已面临严重威胁，生产上对培育抗病高产剑麻新品种十分迫切。剑麻生命周期长，一生仅开一次花，其基因的分配与重组的机会有限，而且杂交育种受到数量性状遗传的制约，从一次杂交获得理想F1代的机率极少，必须经选择后再回交或杂交，使变异朝一定的方向积累才能育成有生产价值的新品种，因有性杂交育种时间长、效率低，因此利用基因工程对剑麻进行遗传改良是缓解剑麻种植品种长期缺乏的有效途径。
国内外对剑麻的组织培养和植株再生做了一定的探索。在国外利用种子、珠芽、走茎以及茎段等为外植体通过直接或间接的器官发生方式已成功的建立了亚洲马盖麻（A. cantala Robx）、灰叶剑麻（A. fourcroydes Lem）、普通剑麻（A. sisalana Perrine）、蓝剑麻（A. tequilana Weber cultivar azul）、A. parrasana Berger、 A. tequilana、A. crassispina、 A. duranguensisA. vera-cruz Mill.、 A. atrovirens和A. arizonica等体外再生体系并获得了完整的再生植株；在国内广东省农垦科技中心以剑麻钻心芽茎尖作为外植体通过快繁的方式获得大量丛生芽。广东湛江农垦科研所2005年初利用H.11648 高产植株的珠芽做外植体通过以快繁的方式成功培育了2 万多株小苗，但均存在玻璃化和繁殖系数偏低现象；中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所和海南大学分别利用剑麻嫩芽和无菌苗叶片为外植体通过愈伤诱导获得完整再生植株，但愈伤组织增殖缓慢，易褐化死亡，分化系数也较低；而且重复性也较差；中国热带农业科学院南亚热带作物研究所吕玲玲以H.11648麻茎尖为外植体通过快繁的方式获得了一定数量的H.11648植株，但繁殖系数低，玻璃化严重，且重复性差。因此，开展剑麻H.11648高效再生体系研究具有十分重要的理论和现实意义。不仅可以在短期内提供大量再生植株，为优良种质快速繁殖提供有效途径，同时为剑麻诱变育种、单倍体育种以及基因工程育种打下良好的基础，为剑麻遗传改良提供有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种增殖快，分化系数高，可在短期内获得大量再生植株的剑麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法，为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种剑麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法，包括如下步骤:
(1)外植体表面消毒及无菌苗培养
以剑麻H.11648 10-15cm珠芽苗或10-20cm吸芽苗的茎尖为材料，先将外层老叶剥离，流水冲洗，用0.3%高锰酸钾溶液处理30min，接着在超净工作台上用75%酒精处理1min，再用0.1%氯化汞溶液处理15-30 min，最后用无菌水冲洗3-5次，晾干后纵切，接种于改良SH培养基SH1上，培养基SH1添加6-苄氨基腺嘌呤6-BA浓度为1.0-5.0mg/L，培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时，光照强度2000lux，培养温度为28±2℃，培养2-3个月成苗；
(2) 愈伤组织的诱导
取步骤（1）培养的生长健壮的无菌苗茎尖纵切后置于愈伤诱导培养基中暗培养10天，剥离外层叶片后转入半光条件下培养，愈伤组织诱导基本培养基为MS，培养基添加外源激素为萘乙酸NAA和6-苄氨基腺嘌呤6-BA；萘乙酸NAA的浓度为0.1-1.0mg/L，6-苄氨基腺嘌呤6-BA的浓度为1.0-3.5mg/L；培养基的pH为5.8-6.0；诱导条件为：光照12-14h， 黑暗10-12h， 光照强度2000lux，温度28±2℃；
(3)愈伤组织继代培养
将步骤（2）诱导的淡黄绿色球状或块状愈伤组织接种在继代培养基中进行继代培养，继代培养基为改良的SH培养基SH2，培养基添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6-BA的浓度为1.5-4.0mg/L; NAA的浓度为0.05-0.5mg/L，IBA的浓度为0.05-0.5mg/L；培养基的pH为5.8-6.0；继代培养条件为：光照12-14h，黑暗10-12h，光照强度2000lux，温度28±2℃；
(4)不定芽诱导
将经过继代培养之后得到的块状或球状的浅黄绿色愈伤组织转到分化培养基中进行不定芽诱导，分化基本培养基为改良SH培养基SH1，培养基添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6-BA的浓度为1.0-5.0mg/L; NAA的浓度为0-1.5mg/L，IBA的浓度为0-1.5mg/L，培养基的pH为5.8-6.0；光照12-14h，黑暗10-12h，光照为2000Lx，温度28±2℃；
（5）生根培养
将经过不定芽诱导得到的再生植株长到5-8cm左右时转入生根培养基进行生根培养，生根基本培养基为改良SH培养基SH1，培养基添加外源激素IBA浓度为0.5-3.0 mg/L，培养基的 pH为5.8-6.0;光照12-14h， 黑暗10-12h，温度28±2℃；
(6) 再生植株移栽
待经过生根培养的再生植株生根2-3周，长出4-5条壮根时，将其置于自然条件下炼苗1周，然后将其移出，洗净基部残留的培养基，用3%高锰酸钾浸泡1-3min后移植到基质为椰糠和河沙（椰糠:河沙=1:1）的塑料遮光大棚中，大棚遮光度75%，白天最高温度不超过32℃，夜晚最低温度不低于20℃，每天早晚各浇透水1次，再生植株的成活率在90%以上， 幼苗长出新叶后开始追施2%复合肥水肥，施肥后用清水喷淋一次，待幼苗长出新叶3片、苗高10cm左右即可移栽到自然环境下继续培育。
上述的改良的SH1培养基大量修改的成分为硝酸钾1500-2500 mg/l，磷酸二氢钾150-500 mg/l，硝酸氨100-500mg/l，SH铁盐中的FeSO4·7H2O为15-27.8mg/l，Na2-EDTA为15-37.3mg/l，SH微量的ZnSO4·7H2O为5-15mg/l，原来SH培养基的有机成分改为MS培养基的有机成分。
上述的改良SH2培养基大量修改的成分为硝酸钾0-2000mg/l，硝酸氨300-1100 mg/l，磷酸二氢钾150-500 mg/l，SH铁盐中的FeSO4.7H2O为15-27.8mg/l，Na2-EDTA为15-37.3mg/l，SH微量的ZnSO4.7H2O为5-15mg/l，原来SH培养基的有机成分改为MS培养基的有机成分。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
本发明对剑麻H.11648茎尖组织进行愈伤诱导及植株再生，愈伤诱导率和分化率均在90%以上，愈伤组织颜色鲜艳，增殖快，分化系数高，不仅可在短期内获得大量再生植株，同时为H.11648麻遗传转化和体外诱变研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础。该方法实施步骤简单易行、快速、高效、实施条件宽松效果非常显著。
附图说明
图1为本发明例1的无菌苗茎尖暗培养10天的情形；
图2为本发明例1愈伤诱导1个月的情形；
图3为愈伤组织继代培养；
图4为愈伤组织分化不定芽；
图5为再生植株生根培养；
图6为再生植株移栽。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
取保存于本实验室生长健壮的无菌苗茎尖为外植体，纵切后接种于愈伤诱导培养基（MS﹢NAA 0.1-1.0mg/L﹢6-BA 1.5-3.5mg/L）中暗培养10天，剥离外层叶片后转入半光条件下培养，待愈伤组织诱导出来后，取淡黄绿色球状或块状愈伤组织接种在愈伤继代培养基（改良SH2+6-BA 1.5-4.0mg/L+NAA 0.05-0.5mg/L+IBA 0.05-0.5mg/L）中进行继代培养，待愈伤组织表面出现绿色芽点后将其转入分化培养基（改良SH1+6-BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0-1.5mg/L+IBA 0-1.5mg/L）中诱导植株再生。培养条件为：pH5.8-6.0，卡那胶6.8-8.0 g/l，蔗糖30g/l，光照12-14h，黑暗10-12h，温度28±2℃；本次接种58个外植体共获得1021株再生植株，愈伤诱导率为93.6%，分化率为92.9%。
实施例2
以H.11648麻吸芽苗茎尖为材料进行消毒，先去除根和部分老叶，在流水冲洗下用手术刀片将其剩余叶片剥离，用0.3%高锰酸钾溶液处理30min，接着在超净工作台上用75%酒精浸泡1min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最后用无菌水冲洗3-5次。晾干并切除部分外植体，纵切后接种于改良SH1+6-BA1.0-5.0mg/L培养基上，培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时，光照强度2000lux，培养温度为28±2℃。待丛芽长出后， 以生长健壮的丛生芽茎尖为外植体，纵切并接种于愈伤诱导培养基MS﹢6-BA 1.5-3.5mg/L ﹢NAA 0.1-1.0mg/L中暗培养10天，剥离外层叶片后转入半光条件下培养，每30天继代1次，待愈伤诱导出来后，取淡黄绿色球状或块状愈伤组织接种在继代培养基（改良SH2﹢6-BA 1.5-4.0mg/L mg/L﹢NAA 0.05-0.5mg/L﹢IBA 0.05-0.5mg/L ）中进行继代培养，待愈伤组织表面出现绿色芽点后将其转入分化培养基（改良SH1+6-BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0-1.5mg/L+IBA 0-1.5mg/L）中诱导再生植株。培养条件为：pH5.8-6.0，卡那胶6.8-8.0 g/l，蔗糖30g/l， 光照12-14h， 黑暗10-12h，光照为2000Lx，温度28±2℃，湿度相对60%；本次接种24个外植体共获得 256株再生植株，愈伤诱导率为90.9%，分化率为91.6%。
实施例3
以剑麻H.11648 10-15cm珠芽苗茎尖为材料进行消毒，流水冲洗下用手术刀片将叶片剥离，用0.3%高锰酸钾溶液处理30min，接着在超净工作台上用75%酒精浸泡1min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡15-30 min，最后用无菌水冲洗3-5次。晾干并切除部分外植体，纵切后接种于改良SH1+6-BA1.0-5.0mg/L培养基上，培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时，光照强度2000lux，培养温度为28±2℃。待丛生芽诱导出来后，取生长健壮的无菌苗茎尖，纵切后接种于愈伤诱导培养基中暗培养10天，剥离外层叶片后转入半光条件下培养，取淡黄绿色球状或块状愈伤组织接种在继代培养基（改良SH2﹢6-BA 1.5-4.0mg/L mg/L﹢NAA 0.05-0.5mg/L﹢IBA 0.05-0.5mg/L ）中进行继代培养，待愈伤组织表面出现绿色芽点后将其转入分化培养基（改良SH1+6-BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0-1.5mg/L+IBA 0-1.5mg/L）中诱导再生植株。培养条件为：pH5.8-6.0，卡那胶6.8-8.0 g/l，蔗糖30g/l， 光照12-14h，光照为2000Lx，温度28±2℃，湿度相对60%。本次接种30个外植体共获得325株再生植株，愈伤诱导率为93.3%，分化率为90.4%。
Claims (2)
1.一种剑麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法，其特征在于：包括如下步骤:
(1)外植体表面消毒及无菌苗培养
以剑麻H.11648 10-15cm珠芽苗或10-20cm吸芽苗的茎尖为材料，先将外层老叶剥离，流水冲洗，用0.3%高锰酸钾溶液处理30min，接着在超净工作台上用75%酒精处理1min，再用0.1%氯化汞溶液处理15-30 min，最后用无菌水冲洗3-5次，晾干后纵切，接种于改良SH培养基SH1上，培养基SH1添加6-苄氨基腺嘌呤6-BA浓度为1.0-5.0mg/L，培养条件为每天光照12-14小时，暗培养10-12小时，光照强度2000lux，培养温度为28±2℃，培养2-3个月成苗；
(2) 愈伤组织的诱导
取步骤（1）培养的生长健壮的无菌苗茎尖纵切后置于愈伤诱导培养基中暗培养10天，剥离外层叶片后转入半光条件下培养，愈伤组织诱导基本培养基为MS，培养基添加外源激素为萘乙酸NAA和6-苄氨基腺嘌呤6-BA；萘乙酸NAA的浓度为0.1-1.0mg/L，6-苄氨基腺嘌呤6-BA的浓度为1.0-3.5mg/L；培养基的pH为5.8-6.0；诱导条件为：光照12-14h， 黑暗10-12h，光照强度2000lux，温度28±2℃；
(3)愈伤组织继代培养
将步骤（2）诱导的淡黄绿色球状或块状愈伤组织接种在继代培养基中进行继代培养，继代培养基为改良的SH培养基SH2，培养基添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚-3-丁酸IBA；其中6-BA的浓度为1.5-4.0mg/L; NAA的浓度为0.05-0.5mg/L，IBA的浓度为0.05-0.5mg/L；培养基的pH为5.8-6.0；继代培养条件为：光照12-14h，黑暗10-12h，光照强度2000lux，温度28±2℃；
(4)不定芽诱导
将经过继代培养之后得到的块状或球状的浅黄绿色愈伤组织转到分化培养基中进行不定芽诱导，分化基本培养基为改良SH培养基SH1，培养基添加外源激素为6-苄氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚-3-丁酸IBA；其中6-BA的浓度为1.0-5.0mg/L; NAA的浓度为0-1.5mg/L，IBA的浓度为0-1.5mg/L，培养基的pH为5.8-6.0；光照12-14h，黑暗10-12h，光照为2000Lx，温度28±2℃；
（5）生根培养
将经过不定芽诱导得到的再生植株长到5-8cm时转入生根培养基进行生根培养，生根基本培养基为改良SH培养基SH1，培养基添加外源激素IBA浓度为0.5-3.0 mg/L，培养基的 pH为5.8-6.0；光照12-14h，黑暗10-12h，温度28±2℃；
(6) 再生植株移栽
待经过生根培养的再生植株生根2-3周，长出4-5条壮根时，将其置于自然条件下炼苗1周，然后将其移出，洗净基部残留的培养基，用3%高锰酸钾浸泡1-3min后移植到基质为椰糠和河沙的塑料遮光大棚中，大棚遮光度75%，白天最高温度不超过32℃，夜晚最低温度不低于20℃，每天早晚各浇透水1次，再生植株的成活率在90%以上， 幼苗长出新叶后开始追施2%复合肥水肥，施肥后用清水喷淋一次，待幼苗长出新叶3片、苗高10cm即移栽到自然环境下继续培育；
所述的SH1培养基大量修改的成分为硝酸钾1500-2500 mg/l，磷酸二氢钾150-500 mg/l，硝酸铵100-500mg/l，SH铁盐中的FeSO4·7H2O为15-27.8mg/l，Na2-EDTA为15-37.3mg/l，SH微量的ZnSO4·7H2O为5-15mg/l，原来SH培养基的有机成分改为MS培养基的有机成分；
所述的SH2培养基大量修改的成分为硝酸钾0-2000mg/l，硝酸铵300-1100 mg/l，磷酸二氢钾150-500 mg/l，SH铁盐中的FeSO4.7H2O为15-27.8mg/l，Na2-EDTA为15-37.3mg/l，SH微量的ZnSO4.7H2O为5-15mg/l，原来SH培养基的有机成分改为MS培养基的有机成分。
2.根据权利要求1所述的一种剑麻茎尖愈伤组织的诱导及再生体系建立的方法，其特征在于：步骤（6）所述的基质的重量比为：椰糠:河沙=1:1。
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