CN115380828A - 抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法。通过特定的消毒灭菌方法以及抑制茎尖玻璃化培养极大地提高了草果茎尖的存活率，通过特定的诱导培养基高效获得了胚性愈伤组织，为建立更高效的草果种苗离体再生体系和遗传转化体系奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法。
背景技术
草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)为姜科豆蔻属多年生常绿丛生草本经济植物，又称草豆蔻、草果子、草果仁，适宜生长在海拔1200～2000米、年平均温度17～19℃、年平均降雨量1000～1600毫米、相对湿度80％～85％的阔叶林中，果实成熟呈红褐色。草果种植3～4年后即可开花结果，可连续结果20年以上，是传统的中药材和调味品，具有巨大的经济价值。
草果是怒江州重要的特色经济作物，全州草果种植面积和产量均占全省总量的一半以上，从海拔1500～3500米均有种植，种植面积达111万亩，主要分布在泸水县、福贡县及贡山县等地区，已成为“三区三州”山区民众的重要经济收入之一。2019年怒江州种植草果的产值达12.15亿元。
草果种苗繁育主要采用播种繁育与分株繁育2种方式，分株繁育是挑选长势优良健康母株的分生茎繁育种苗，用此法繁育的种苗遗传背景单一，能保持母株优良性状，且耗时短，但这种繁育方法经常会受到环境气候与母株状态的影响，无法大规模高通量繁育种苗。另外，草果母株由于种植年限长，存在种苗病毒积累现象，容易造成种苗产量下降，影响经济效益。而采用播种繁育方法，能够获得无病毒的脱毒种苗，但由于杂交使得性状分离，无法保留母株的优良性状。采取组织培养技术，能够保持母株的优良性状，并且避免遭受环境因素的干扰，短时间内能够获得大量优良种苗。此外，通过丛生芽诱导进行植株再生，能够摆脱对母株材料的限制，极大地提高草果种苗的繁育效率，达到高通量繁育种苗的目的，提高草果种苗产量与经济效益。因此组织培养技术对于草果种苗高通量繁育具有重要的实用价值。
目前已有相关研究开展了草果组培育苗，管朝旭等人通过诱导草果产生丛生芽建立了草果的快速繁殖体系，但未探究抑制草果茎尖玻璃化的方案。萧洪东等人利用草果茎尖进行组织培养快速繁育种苗研究，成功获得不定芽且移栽成活率高，但仍存在玻璃化和褐化等问题，导致茎尖的存活率和愈伤组织诱导率并不高。因此愈伤组织产生玻璃化现象是目前影响草果组织培养效果的主要问题，亟需解决。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法，本发明提供了草果幼嫩茎尖消毒灭菌方法、抑制草果茎尖玻璃化的培养基以及愈伤组织诱导的培养基和方法。
本发明提供了草果组织培养的培养基，包括抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基；
本发明中，所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03～0.06mg/L TDZ、0.05～0.1mg/L NAA、0.1～0.5mg/L抗坏血酸、0.2～0.6mg/L PVP和2.5～3.5g/L活性炭的MS培养基；一些实施例中，所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03mg/L TDZ、0.05mg/L NAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭的MS培养基。
所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5～2.5mg/L 6-BA和0.1～0.5mg/L NAA的MS培养基；一些实施例中，所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS培养基。
所述胚性增殖培养基为含有0.5～1.0mg/L 6-BA和0.1～0.5mg/L 2,4-D的MS培养基；一些实施例中，所述胚性增殖培养基为含有1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D的MS培养基。
对于植物组织培养，培养基是其生长状况的关键因素之一，本发明提供的草果组织培养的三种培养基，通过对组分及配比进行筛选，最终获得配比合适的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基和胚性增值培养基。以所述抑制茎尖玻璃化培养基对草果脱毒茎尖进行培养，能够有效避免玻璃化的产生，抑制率可达100％，以所述初级愈伤诱导培养基和胚性增值培养基对草果健康茎尖进行愈伤组织的诱导，能够提高草果愈伤组织的诱导率。而采用其他植物激素或其他配比或浓度的组分，则无法获得类似的效果。
本发明提供的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基和胚性增殖培养基在草果组织培养中的应用。
本发明还提供了草果组织培养的方法，其包括：
将草果幼嫩茎尖作为外植体，消毒灭菌后依次用所述的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基进行培养，获得胚性愈伤组织。
在本发明中，所述草果组织培养的方法具体包括：
1：选取草果幼嫩茎尖作为外植体，去除多余叶鞘，消毒灭菌后获得脱毒的草果外植体；
2：将消毒后的茎尖接种到所述抑制茎尖玻璃化培养基中培养，获得无毒无玻璃化的健康茎尖；
3：将所述健康茎尖接种到所述初级愈伤诱导培养基中培养，获得愈伤组织；
4：将所述愈伤组织接种到所述胚性增殖培养基中培养，获得胚性愈伤组织。
步骤2中所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养30d～60d；
优选地，茎尖抑制玻璃化培养60d；
步骤3中所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养35d～45d；
优选地，愈伤组织诱导培养45d；
步骤4中所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养20d～35d；
优选地，胚性愈伤组织诱导培养35d。
采用本发明提供的所述培养基，抑制了草果茎尖玻璃化的发生，提高了茎尖存活率，诱导草果愈伤组织的成功率显著提高。
本发明中，所述消毒方法包括：
a：用百菌清溶液浸泡后，用流水洗净表面污垢；
b：用维生素C溶液浸泡后，用滤纸吸干水分；
c：转入超净工作台中，用75％酒精消毒后，无菌水冲洗1次；
d：用二氧化氯溶液浸泡后，无菌水冲洗3次；
e：用升汞灭菌后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
在一些实施例中，所述百菌清溶液的浓度为0.1wt％～0.2wt％，所述维生素C溶液的为5～8mg/L，所述二氧化氯溶液的浓度为100～150mg/L，所述升汞的浓度为0.05wt％～0.1wt％。
优选地，所述百菌清溶液的浓度为0.1wt％，所述维生素C溶液的浓度为5mg/L，所述二氧化氯溶液的浓度为150mg/L，所述升汞的浓度为0.1wt％。
本发明中的对比试验表明，只有以0.1wt％百菌清、5mg/L维生素C、75％酒精、150mg/L的二氧化氯溶、0.1wt％升汞组合为抑制茎尖玻璃化的消毒灭菌方法，才能得到脱毒茎尖，最终获得胚性愈伤组织。本发明的草果茎尖脱毒方法显著优于各对照方法，能减少茎尖玻璃化发生。
在一些实施例中，所述百菌清溶液的浸泡时间为10min，所述维生素C溶液的浸泡时间为30min，所述75％酒精的浸泡时间为30s，所述二氧化氯溶液的浸泡时间为15min，所述升汞的浸泡时间为8min。
利用本发明中0.1％百菌清、5mg/L维生素C、75％酒精、150mg/L二氧化氯溶、0.1wt％升汞组合为抑制茎尖玻璃化的消毒灭菌方法，能得到脱毒茎尖，并且在抑制茎尖玻璃化培养基中培养之后，提高了草果茎尖的存活率，存活率达到100±1％。
利用本发明中的抑制茎尖玻璃化培养基配方：MS基础培养基添加噻苯隆(TDZ)、萘乙酸(NAA)、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭；初级愈伤组织诱导培养基配方：MS基础培养基添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)；胚性增殖培养基配方：MS基础培养基添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，实现了高效诱导草果愈伤组织，初级愈伤组织诱导率可达到70±2％，胚性愈伤组织诱导率可达到58±4％。
附图说明
图1示本发明抑制草果茎尖玻璃化及愈伤组织诱导的图片。
具体实施方式
本发明提供了抑制草果茎尖玻璃化的培养基及诱导愈伤组织的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1草果愈伤组织诱导
1、草果外植体消毒灭菌
选取草果母株的茎基部生出的幼嫩茎尖，剥去多余的叶鞘：
(1)用0.1％百菌清浸泡10min后，用流水洗净表面污垢；
(2)用5mg/L的维生素C浸泡30min后，用滤纸吸干水分；
(3)转入超净工作台中，用75％酒精消毒30S后，无菌水冲洗1次；
(4)用100～150mg/L的二氧化氯溶液浸泡15min后，无菌水冲洗3次；
(5)用0.1％升汞灭菌8min后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
2、草果外植体抑制茎尖玻璃化培养
(1)抑制茎尖玻璃化培养基组分包括：MS基础培养基、0.03mg/L TDZ、0.05mg/LNAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭；
(2)将消毒后的茎尖接种到抑制茎尖玻璃化培养基培养60d，得到无毒无玻璃化的茎尖。
3、草果初级愈伤组织培养
(1)初级愈伤诱导培养基组分包括：MS基础培养基、1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；
(2)将健康茎尖转接到初级愈伤诱导培养基培养45d，获得初级愈伤组织。
4、草果胚性愈伤组织培养
(1)胚性增殖培养基组分包括：MS基础培养基、1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D；
(2)将初级愈伤组织转接到胚性增殖培养基培养35d，获得胚性愈伤组织。
本实施例组织培养技术中各个时期的培养效果见图1。
对比例1以上述实施例1，但不加维生素C的灭菌脱毒方法，采用实施例1中培养方法，具体如下：
1、草果外植体消毒灭菌
选取草果母株的茎基部生出的幼嫩茎尖，剥去多余的叶鞘：
(1)用0.1％百菌清浸泡10min后，用流水洗净表面污垢；
(2)转入超净工作台中，用75％酒精消毒30S后，无菌水冲洗1次；
(3)用100～150mg/L的二氧化氯溶液浸泡15min后，无菌水冲洗3次；
(4)用0.1％升汞灭菌8min后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
2、草果外植体抑制茎尖玻璃化培养
(1)抑制茎尖玻璃化培养基组分包括：MS基础培养基、0.03mg/L TDZ、0.05mg/LNAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭；
(2)将消毒后的茎尖接种到抑制茎尖玻璃化培养基培养60d，得到无毒无玻璃化的茎尖。
3、草果初级愈伤组织培养
(1)初级愈伤诱导培养基组分包括：MS基础培养基、1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；
(2)将健康茎尖转接到初级愈伤诱导培养基培养45d，获得初级愈伤组织。
4、草果胚性愈伤组织培养
(1)胚性增殖培养基组分包括：MS基础培养基、1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D；
(2)将初级愈伤组织转接到胚性增殖培养基培养35d，获得胚性愈伤组织。
对比例2以上述实施例1，但不使用二氧化氯溶液的灭菌脱毒方法，采用实施例1中培养方法，具体如下：
1、草果外植体消毒灭菌
选取草果母株的茎基部生出的幼嫩茎尖，剥去多余的叶鞘：
(1)用0.1％百菌清浸泡10min后，用流水洗净表面污垢；
(2)用5mg/L的维生素C浸泡30min后，用滤纸吸干水分；
(3)转入超净工作台中，用75％酒精消毒30S后，无菌水冲洗1次；
(4)用0.1％升汞灭菌8min后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
2、草果外植体抑制茎尖玻璃化培养
(1)抑制茎尖玻璃化培养基组分包括：MS基础培养基、0.03mg/L TDZ、0.05mg/LNAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭；
(2)将消毒后的茎尖接种到抑制茎尖玻璃化培养基培养60d，得到无毒无玻璃化的茎尖。
3、草果初级愈伤组织培养
(1)初级愈伤诱导培养基组分包括：MS基础培养基、1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；
(2)将健康茎尖转接到初级愈伤诱导培养基培养45d，获得初级愈伤组织。
4、草果胚性愈伤组织培养
(1)胚性增殖培养基组分包括：MS基础培养基、1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D；
(2)将初级愈伤组织转接到胚性增殖培养基培养35d，获得胚性愈伤组织。
对比例3将实施例1中的抑制茎尖玻璃化培养基改为MS基础培养基、0.03mg/LTDZ、0.05mg/L NAA和2.5g/L活性炭。具体如下：
1、草果外植体消毒灭菌
选取草果母株的茎基部生出的幼嫩茎尖，剥去多余的叶鞘：
(1)用0.1％百菌清浸泡10min后，用流水洗净表面污垢；
(2)用5mg/L的维生素C浸泡30min后，用滤纸吸干水分；
(3)转入超净工作台中，用75％酒精消毒30S后，无菌水冲洗1次；
(4)用100～150mg/L的二氧化氯溶液浸泡15min后，无菌水冲洗3次；
(5)用0.1％升汞灭菌8min后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
2、草果外植体抑制茎尖玻璃化培养
(1)抑制茎尖玻璃化培养基组分包括：MS基础培养基、0.03mg/L TDZ、0.05mg/LNAA和2.5g/L活性炭；
(2)将消毒后的茎尖接种到抑制茎尖玻璃化培养基培养60d，得到无毒无玻璃化的茎尖。
3、草果初级愈伤组织培养
(1)初级愈伤诱导培养基组分包括：MS基础培养基、1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；
(2)将健康茎尖转接到初级愈伤诱导培养基培养45d，获得初级愈伤组织。
4、草果胚性愈伤组织培养
(1)胚性增殖培养基组分包括：MS基础培养基、1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D；
(2)将初级愈伤组织转接到胚性增殖培养基培养35d，获得胚性愈伤组织。
对比例4将实施例1中的抑制茎尖玻璃化培养基改为MS基础培养基、0.03mg/LTDZ、0.05mg/L NAA、0.4mg/L抗坏血酸和0.4mg/L PVP。具体如下：
1、草果外植体消毒灭菌
选取草果母株的茎基部生出的幼嫩茎尖，剥去多余的叶鞘：
(1)用0.1％百菌清浸泡10min后，用流水洗净表面污垢；
(2)用5mg/L的维生素C浸泡30min后，用滤纸吸干水分；
(3)转入超净工作台中，用75％酒精消毒30S后，无菌水冲洗1次；
(4)用100～150mg/L的二氧化氯溶液浸泡15min后，无菌水冲洗3次；
(5)用0.1％升汞灭菌8min后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
2、草果外植体抑制茎尖玻璃化培养
(1)抑制茎尖玻璃化培养基组分包括：MS基础培养基、0.03mg/L TDZ、0.05mg/LNAA、0.4mg/L抗坏血酸和0.4mg/L PVP；
(2)将消毒后的茎尖接种到抑制茎尖玻璃化培养基培养60d，得到无毒无玻璃化的茎尖。
3、草果初级愈伤组织培养
(1)初级愈伤诱导培养基组分包括：MS基础培养基、1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；
(2)将健康茎尖转接到初级愈伤诱导培养基培养45d，获得初级愈伤组织。
4、草果胚性愈伤组织培养
(1)胚性增殖培养基组分包括：MS基础培养基、1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D；
(2)将初级愈伤组织转接到胚性增殖培养基培养35d，获得胚性愈伤组织。
对比例5将实施例1中抑制茎尖玻璃化培养过程省略，消毒灭菌后直接使用初级愈伤组织诱导培养基，再到胚性增殖培养基。具体如下：
1、草果外植体消毒灭菌
选取草果母株的茎基部生出的幼嫩茎尖，剥去多余的叶鞘：
(1)用0.1％百菌清浸泡10min后，用流水洗净表面污垢；
(2)用5mg/L的维生素C浸泡30min后，用滤纸吸干水分；
(3)转入超净工作台中，用75％酒精消毒30S后，无菌水冲洗1次；
(4)用100～150mg/L的二氧化氯溶液浸泡15min后，无菌水冲洗3次；
(5)用0.1％升汞灭菌8min后，无菌水冲洗4-5次，沥干水分待用。
2、草果初级愈伤组织培养
(1)初级愈伤诱导培养基组分包括：MS基础培养基、1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA；
(2)将健康茎尖转接到初级愈伤诱导培养基培养45d，获得初级愈伤组织。
3、草果胚性愈伤组织培养
(1)胚性增殖培养基组分包括：MS基础培养基、1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D；
(2)将初级愈伤组织转接到胚性增殖培养基培养35d，获得胚性愈伤组织。
效果例1实施例和对比例的结果见表1
表1
实施例1实现了抑制草果茎尖玻璃化及高效愈伤组织诱导，茎尖存活率达100％，初级愈伤诱导率达70％以上，胚性愈伤诱导率达58％以上。
对比例1抑制茎尖玻璃化效果不佳，茎尖玻璃化率在80％左右，茎尖存活率达20％左右，初级愈伤诱导率达70％以上，胚性愈伤诱导率达58％以上。
对比例2抑制茎尖玻璃化效果不佳，茎尖玻璃化率在50％左右，存活率45％左右，初级愈伤诱导率达70％以上，胚性愈伤诱导率达58％以上。
对比例3抑制茎尖玻璃化效果尚好，茎尖玻璃化率在30％左右，存活率65％左右，初级愈伤诱导率达70％以上，胚性愈伤诱导率达58％以上。
对比例4抑制茎尖玻璃化效果尚好，茎尖玻璃化率在18％左右，存活率达78％左右，初级愈伤诱导率达70％以上，胚性愈伤诱导率达58％以上。
对比例5无法实现抑制茎尖玻璃化，经培养多半开始褐化死亡，无法获得愈伤组织。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.草果组织培养的培养基，其特征在于，包括抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基；
所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03～0.06mg/L TDZ、0.05～0.1mg/L NAA、0.1～0.5mg/L抗坏血酸、0.2～0.6mg/L PVP和2.5～3.5g/L活性炭的MS培养基；
所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5～2.5mg/L 6-BA和0.1～0.5mg/L NAA的MS培养基；
所述胚性增殖培养基为含有0.5～1.0mg/L 6-BA和0.1～0.5mg/L 2,4-D的MS培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03mg/L TDZ、0.05mg/L NAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭的MS培养基；
所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS培养基；
所述胚性增殖培养基为含有1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2,4-D的MS培养基。
3.权利要求1或2所述的培养基在草果组织培养中的应用。
4.草果组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将草果幼嫩茎尖作为外植体，消毒灭菌后依次以权利要求1或2所述的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基进行培养，获得胚性愈伤组织。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养20d～60d。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述抑制茎尖玻璃化培养基培养60d，所述初级愈伤诱导培养基培养45d，所述胚性增殖培养基培养35d。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消毒灭菌的方法包括：依次用百菌清溶液、维生素C溶液、75％酒精水溶液、二氧化氯溶液以及升汞进行消毒灭菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述百菌清溶液的浓度为0.1wt％～0.2wt％，所述维生素C溶液的浓度为5～8mg/L，所述二氧化氯溶液的浓度为100～150mg/L，所述升汞的浓度为0.05wt％～0.1wt％。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述百菌清溶液的浓度为0.1wt％，所述维生素C溶液的浓度为5mg/L，所述二氧化氯溶液的浓度为150mg/L，所述升汞的浓度为0.1wt％。
10.根据权利要求7～9任一项所述的方法，其特征在于，所述百菌清溶液的消毒时间为10min，所述维生素C溶液的消毒时间为30min，所述75％酒精水溶液的消毒时间为30s，所述二氧化氯溶液的消毒时间为15min，所述升汞的消毒时间为8min。
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