CN101238793B - 南美水仙组织培养的一组培养基及其标准化快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了南美水仙组织培养的一组培养基及其标准化快繁方法，属植物组织培养技术领域。本发明的南美水仙组织培养的一组培养基由诱导培养基、增殖培养基、继代增殖培养基、壮苗培养基、生根培养基组成。本发明公开的南美水仙组织培养的标准化快繁方法分七个步骤，构成南美水仙组织培养标准化体系。本发明完成了外植体的选取、诱导培养、增殖培养、壮苗、生根、移栽等关键技术的研究，重点通过“诱导”、“增殖”与“生根”三个关键环节的研究，使本发明优化的组织培养基及其标准化快繁方法针对性强，适用性好，操作简单易行，标准化程度高，使增殖率达4～5倍，生根率达90％以上，移栽成活率达95％以上。
Description
技术领域 本发明属植物组织培养技术领域，具体涉及南美水仙组织培养的一组培养基配方和标准化快繁方法。
背景技术 南美水仙(Eucharis grandiflora)别名大花油加律、亚马逊百合，属石蒜科油加律属多年生常绿鳞茎植物。其株型姿态优雅，其叶片基生宽大，宽椭圆形，花朵硕大，顶生伞形花序，着生5-7朵小花，洁白无瑕，清香四溢，且一年可多次开花，不开花时可作观叶盆栽，既可点缀庭院，又可盆载布置室内，同时也是鲜切花的好材料，产业化应用前景广阔，可作为新兴花卉产业化种类。
南美水仙常规采用分球或播种2种传统方法进行繁殖，繁育速度慢，生产周期长，且整齐度差，不能满足产业化生产的需求。因此利用组织培养快繁技术体系，不仅可在短时间内获得大量整齐一致的优质种苗，实现种苗的标准化、工厂化与规模化生产，而且还可为脱毒研究、新育株系快速扩繁及种质资源离体保存等工作的开展奠定良好的研究基础。目前国内外在南美水仙优质种苗快速繁殖方面的研究比较欠缺，国内外均无南美水仙通过成熟组织培养体系快速繁殖优质种苗的相关报道。仅瞿素萍等报道过“南美水仙组培外植体再生体系建立中的关键技术研究”(《种子》2004年第10期16-17页)，报道了通过对南美水仙不同外植体类型对再生体系的影响研究，初步摸索出适宜的处植体类型。但该报道未公开本发明的内容。
发明内容 本发明目的旨在提供一种针对性强，适用性好，操作简单易行，能实现种苗的标准化控制、工厂化与规模化生产的南美水仙组织培养的一组培养基和标准化快繁方法。
本发明建立起的组织培养体系还能应用于南美水仙种质资源的保存，在较小空间下实现大量种质资源的离体保存。因此，本发明对于南美水仙的可持续利用及产业化、规模化和标准化生产，以及种质资源保存等方面均具有积极作用和现实意义。
本发明的技术方案如下：
1、一组南美水仙组织培养的培养基，其特征在于，该组培养基由以下五个培养基组成：
(1)诱导培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～3.0mg/L
萘乙酸(NAA) 1.0～2.0mg/L
水解酷蛋白(CH) 200～300mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.0g/L
pH 5.6～6.0
(2)增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～1.0mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.5g/L
pH 5.6～6.0g/L
(3)继代增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～1.0mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.5g/L
pH 5.6～6.0g/L
(4)壮苗培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～1.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0g/L
(5)生根培养基：
MS基本培养液
吲哚乙酸(IAA) 0.1～0.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0/L
2、本发明提供另一组比较优选的南美水仙组织培养的培养基，其特征在于，所述的培养基由以下五个培养基组成：
(1)诱导培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 1.5mg/L
水解酷蛋白(CH) 250mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 5.5g/L
pH 5.8
(2)增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 5.5g/L
pH 5.8
(3)继代增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 5.5g/L
pH 5.8
(4)壮苗培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.8mg/L
萘乙酸(NAA) 0.8mg/L
蔗糖 20g/L
琼脂 6.0g/L
pH 5.8
(5)生根培养基：
MS基本培养液
吲哚乙酸(IAA) 0.3mg/L
萘乙酸(NAA) 0.3mg/L
蔗糖 20g/L
琼脂 6.0g/L
pH 5.8
3、、本发明提供的一种南美水仙(Eucharis grandiflora)组织培养的标准化快繁方法，按以下次序的几个步骤进行：
(1)、外植体的选择与灭菌：选择无病虫危害、生长健壮、无病毒症状表现、且种植2年以上的南美水仙鳞茎，将其外层1～2层鳞片剥去后，用自来水冲洗干净后，按常规放入洗衣粉水浸泡几分钟，自来水流水冲洗至无泡沫，在质量百分比为0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中处理15～25分钟，2％的次氯酸钠溶液中处理20～25分钟，无菌水洗3～4次后，将带鳞片的鳞茎基盘进行切块接种；
(2)、诱导培养：在无菌条件下，将灭菌鳞茎切除约1/4～1/3的上部鳞片，获得带部分鳞片的鳞茎基盘，将上述获得的鳞茎基盘切块接种到下列诱导培养基中培养，在温度为22±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度2000～3000Lx的环境条件下，培养40～60d，可见不定芽或小鳞茎自切口处生成；
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～3.0mg/L
萘乙酸(NAA) 1.0～2.0mg/L
水解酷蛋白(CH) 200～300mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.0g/L
pH 5.6～6.0
(3)、增殖培养：在无菌条件下，将步骤(2)获得的不定丛生芽或小鳞茎切分成2～3个一丛，转入下列的增殖培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～1.0mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.5g/L
pH 5.6～6.0g/L
在温度为25±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养30～45d，可使不定芽或鳞茎大量增殖，增殖率可达4～5倍；
(4)、继代增殖：将第(3)步骤增殖所获得的不定芽或小鳞茎在无菌条件下分切为单芽或2～3个一丛，接入与第(3)步骤同样的增殖培养基中，在与第(3)步骤相同的培养环境下进行培养，可得到大量的无根不定芽，增殖苗通常无叶或有叶1片，有叶片的叶色浓绿，生长健壮；
(5)、壮苗培养：将第(4)步骤增殖所获得的无叶不定芽或小鳞茎再进行重复继代，获得大量繁殖材料；而将带叶片的不定芽分切为单芽或2芽一丛，转入下列的壮苗培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～1.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0g/L
在温度为23±2℃，光照时间10～12小时/天，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养25～35d，可使不定芽的植株快速长高，株高达1.0～1.5cm，1～2片叶，叶色浓绿，生长健壮，且基部膨大成鳞茎形；
(6)、生根培养：将第(5)步骤通过壮苗培养获得的苗高约为1.0～1.5cm，具叶1～2片的无根健壮不定芽分切成单芽，转入下列的生根培养基中：
MS基本培养液
吲哚乙酸(IAA) 0.1～0.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0g/L
在温度为22±22，光照时间10～12小时/天，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养20～30d，可使不定芽基部或小鳞茎上长出根2～5条，根白色，基部具根毛，生根率高达90％以上，生根苗苗高约为2.0～3.0cm，2～3片叶，叶色浓绿，生长健壮；
(7)、移栽成活：将第(6)步骤获得的南美水仙生根苗从瓶内取出，洗净培养基，移入腐质土∶珍珠岩为1∶1的混合基质内，移栽时应避免将小鳞茎埋入基质内，但需将根埋入基质内。栽后浇足水，适当保湿，移栽1周内相对湿度应保持在80％以上，40～50d即移栽成活，成活率可达95％以上。
4、本发明提供一种比较优选的标准化快繁方法，除以下特征区别外，其余方法与上述南美水仙组织培养的标准化快繁方法相同，其特征区别在于：
第(2)步骤的诱导培养基为权利要求2(1)中诱导培养基(MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+CH250mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8)，光照时间11h/d，光照强度2500Lx的环境条件下，培养50d；
第(3)步骤的增殖培养基为权利要求2(2)中的增殖培养基(MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8)，光照时间11h/d，光照强度2000Lx的条件下，培养40d；
第(4)步骤的继代增殖培养基为权利要求2(3)中的继代增殖培养基(MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8)；
第(5)步骤的壮苗培养基为权利要求2(4)中的壮苗培养基(MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH 5.8)，，光照时间11h/d，光照强度2000Lx的条件下，培养30d，
第(6)步骤的生根培养基为权利要求2(5)生根培养基(MS+IAA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH 5.8)，光照时间11h/d，光照强度2000Lx的条件下，培养30d。
本发明提供的各培养基的配制方法均按常规植物组织培养的培养基配制方法配制，无特殊要求，操作简易。
本发明的有益效果：
1、常规的南美水仙繁殖是采用分球或播种2种传统方法进行繁殖，繁育速度慢，生产周期长，且整齐度差，不能满足产业化生产的需求。本发明在前期初步探明南美水仙适宜外植体类型的基础上，针对上述南美水仙的传统方法繁育种苗的技术难点和缺陷，首次提供了一组配套的南美水仙离体组织培养的培养基及其配套的标准化快繁技术，实现了优质种苗的规模化与标准化生产。通过组织培养体系的成功构建，完成了外植体的选取、诱导培养、增殖培养、壮苗、生根、移栽等关键技术的研究，重点通过“诱导”、“增殖”与“生根”三个关键环节的研究，使本发明优化的组织培养基及其标准化快繁方法针对性强，适用性好，操作简单易行，标准化程度高，使增殖率达4～5倍，生根率达90％以上，移栽成活率达95％以上。
2、本发明的体系化极大地提高了种苗的繁殖速度，缩短了生产周期，有效地提高了种苗的品质与整齐性，降低了生产成本。
3、本发明采用南美水仙鳞茎盘等无性器官作为初始外植体，不仅提高外植体的诱导率，同时易于固定和保持其无性系的优良种性。
4、本发明还能应用于南美水仙种质资源的保存，在较小空间下实现大量种质资源的保存。
5、本发明通过不同外植体类型筛选的研究，推荐选择带部分鳞片的鳞茎盘作为外植体，产生最佳效果。
6、本发明的体系化设计，体现在考虑了增殖率与变异率的协调、增殖、壮苗、生根效果、生根率和移栽成活率、培养环境的调控等诸多因素。特针对不同的培养阶段，根据不同的培养目的，对培养基、激素配比、蔗糖浓度以及培养条件等关键因子进行调控，既达到高效增殖，又保证了不定芽的质量。如：不同阶段的培养基中BA的浓度范围随着下调；在增殖与生根两个步骤之间增加了壮苗的环节；根据南美水仙的生长温度偏冷凉，但不耐霜冻的习性，在不同培养阶段设置不同的培养温度的调控，使外植体尽早萌动、提高增殖、种苗质量和移栽成活率等等。这些从培养基的体系化设计到标准化快繁体系化的设计，使得用本发明的培养基和快繁方法能使生根率均达到90％以上，且移栽成活率高达95％以上。
本发明的一组培养基和标准化快繁方法中各步骤可单独使用，也可一起使用，推荐一组培养基成套使用和标准化快繁方法一体化采用。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案及其有益效果。但实施例仅是范例性的，并不对本发明构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，而这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例所采用的南美水仙(Eucharis grandiflora)，取南美水仙的健壮鳞茎作为供试材料。
以下实施例所用植物组织培养的培养基的配制方法均按常规植物组织培养培养基的配制方法培植，无特殊要求。
实施例1
南美水仙组织培养的培养基及其标准化快繁方法，按以下次序的几个步骤进行：
1、外植体的选择与灭菌：优选生长健壮、开花性状好、无病虫危害、无病毒症状表现及约2年生以上的南美水仙鳞茎作为外植体，剥去外层2层鳞片后，用自来水冲洗干净后，按常规放入洗衣粉水浸泡，浸泡三分钟后，自来水流水冲洗至无泡沫，在0.1％(质量百分比)的升汞(Hgcl2)溶液中处理15分钟，2％的次氯酸钠溶液中处理20分钟，无菌水洗3次后，将带鳞片的鳞茎基盘进行切块接种。
2、诱导培养：在无菌条件下，切去灭菌鳞茎约1/4的上部鳞片，将获得的鳞茎基盘切块接种到诱导培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+CH200mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L，pH 5.6)中进行培养，在温度为22±2℃，光照时间10h/d，光照强度2000Lx的环境条件下，培养40d，可见大量不定芽或小鳞茎自基盘切口处生成，每个基盘切块切口处平均可诱导出5.3个不定芽或小鳞茎，同时在不定芽与小鳞茎2种诱导类型中，该培养基诱导生成的不定芽所占比例更高。
3、增殖培养：在无菌条件下，将诱导培养获得的不定丛生芽或小鳞茎切分成2～3个一丛，转入增殖培养基((MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.0g/L，pH5.6)中进行增殖。培养温度为25±2℃，光照时间10h/d，光照强度为1500Lx的条件下，培养30d后，可使不定芽或鳞茎大量增殖，增殖率达4.8倍。
4、继代增殖：将第3步骤增殖培养所获得的不定芽或小鳞茎在无菌条件下分切为单芽或2～3个一丛，接入与第3步骤同样的增殖培养基中，在与第3步骤相同的培养环境下进行培养，可得到大量的无根不定芽，增殖苗通常无叶或有叶1片，有叶片的叶色浓绿，生长健壮。
5、壮苗培养：将第3步骤或第4步骤所获得的无叶不定芽或小鳞茎再进行重复继代，获得大量繁殖材料；而将带叶片的不定芽分切为单芽或2芽一丛，转入壮苗培养基中((MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，pH5.6)中进行壮苗。在温度为23±2℃，光照时间10h/d，光照强度1500Lx的条件下，培养25d后，可使不定芽的植株快速长高，株高平均达1.5cm，平均2.1片叶，叶色浓绿，生长健壮，且基部膨大成鳞茎形。
6、生根培养：将第5步骤壮苗培养获得的苗高平均为1.0cm，具1片叶以上的无根健壮不定芽分切成单芽，转入生根培养基中((MS+IAA0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L，pH5.6)中进行生根培养。在温度为22±2℃，光照时间10h/d，光照强度1500Lx的条件下，培养20d，可使不定芽基部或小鳞茎上长出根平均达2.5条，根白色，基部具根毛，生根率高达90％以上，生根苗苗高约为2.0cm，平均达2.1片叶，叶色浓绿，生长健壮。
7、移栽成活：将第6步骤获得的南美水仙生根苗从瓶内取出，洗净培养基，移入腐质土∶珍珠岩为1∶1的混合基质内，移栽时应避免将小鳞茎埋入基质内，但需将根埋入基质内。栽后浇足水，适当保湿，移栽1周内相对湿度应保持在80％以上，40～50d即移栽成活，成活率可达95％以上。
实施例2
南美水仙组织培养的的培养基及其标准化快繁方法，除以下步骤的条件不同外，其余实施步骤、顺序、方法和条件均与实施例1相同，不再累述。
1、外植体的选择与灭菌：
(1)将外植体如前处理后按常规放入洗衣粉水浸泡，浸泡5分钟；
(2)自来水流水冲洗至无泡沫，在0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中处理25分钟；
(3)2％的次氯酸钠溶液中处理25分钟，无菌水洗4次后，将带鳞片的鳞茎基盘进行切块接种。
2、诱导培养：
(1)切去灭菌鳞茎约1/3的上部鳞片；
(2)诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA 2.0mg/L+CH300mg/L+蔗糖35g/L+琼脂6.0g/L，pH6.0；
(3)光照时间12h/d；
(4)光照强度3000Lx的环境条件下，培养60d，可见大量不定芽或小鳞茎自基盘切口处生成，每个基盘切块切口处平均可诱导出8.1个不定芽或小鳞茎。
3、增殖培养：
(1)转入的增殖培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖35g/L+琼脂6.5g/L，pH6.0；
(2)光照时间12h/d；
增殖率可达5.2倍。
5、壮苗培养：
(1)转入的壮苗培养基是：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7.0g/L，pH6.0；
(2)光照时间12h/d；
(3)光照强度2000Lx的条件下，培养35d后，可使不定芽的植株快速长高，株高达1.0cm，平均1.2片叶，叶色浓绿，生长健壮，且基部膨大成鳞茎形。
6、生根培养：
(1)将壮苗培养获得的苗高约为1.5cm，具1片叶以上的无根健壮不定芽分切成单芽，转入的生根培养基是MS+IAA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7.0g/L，pH6.0；
(2)光照时间12h/d；
(3)光照强度2000Lx的条件下，培养30d，可使不定芽基部或小鳞茎上长出根平均达5.1条，根白色，基部具根毛，生根率高达90％以上，生根苗苗高约为3.2cm，平均达2.8片叶，叶色浓绿，生长健壮。
采用实施例2的技术方案实施，成活率也可达95％以上。
实施例3
南美水仙组织培养的的培养基及其标准化快繁方法，除以下步骤的条件不同外，其余实施步骤、顺序、方法和条件均与实施例1相同，不再累述。
1、外植体的选择与灭菌：
(1)将外植体如前处理后放入洗衣粉水浸泡5分钟；
(2)自来水清洗干净，在0.15％的升汞(Hgcl2)溶液中处理20分钟；
(3)2％的次氯酸钠溶液中处理20分钟，无菌水洗4次后，将带鳞片的鳞茎基盘进行切块接种。
2、诱导培养：
(1)切去灭菌鳞茎约1/3的上部鳞片；
(2)诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.5mg/L+CH250mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8；
(3)光照时间11h/d；
(4)光照强度2500Lx的环境条件下，培养50d，可见大量不定芽或小鳞茎自基盘切口处生成，每个基盘切块切口处平均可诱导出6.6个不定芽或小鳞茎。
3、增殖培养：
(1)转入的增殖培养基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8；
(2)光照时间11h/d；
增殖率可达5.0倍。
5、壮苗培养：
(1)转入的壮苗培养基是：MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8；
(2)光照时间11h/d；
(3)光照强度2000Lx的条件下，培养30d后，可使不定芽的植株快速长高，株高达1.0cm，平均1.3片叶，叶色浓绿，生长健壮，且基部膨大成鳞茎形。
6、生根培养：
(1)将壮苗培养获得的苗高约为1.2cm，具1片叶以上的无根健壮不定芽分切成单芽，转入的生根培养基是MS+IAA0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH5.8；
(2)光照时间11h/d；
(3)光照强度2000Lx的条件下，培养30d，可使不定芽基部或小鳞茎上长出根平均达3.5条，根白色，基部具根毛，生根率达91％，生根苗苗高约为3.5cm，平均达2.5片叶，叶色浓绿，生长健壮。
采用实施例3的技术方案实施，成活率也可达95％以上。
实施例4
不同外植体类型的筛选
外植体选取了带部分鳞片的鳞茎盘、不带鳞片的鳞茎盘、内层鳞片下部、外层鳞片下部、内层鳞片上部、外层鳞片上部、叶片和叶柄8种类型。诱导培养基经优化筛选，统一使用MS+6-BA3.0mg/L+NAA 2.0mg/L+CH300mg/L+蔗糖35g/L+琼脂6.0g/L，pH6.0为诱导培养基，培养条件统一为在温度为22±2℃，光照时间12h/d，光照强度3000Lx。以上5种外植体类型约取30个试验材料左右，重复3次，60d后统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率及小鳞茎诱导率等平均值，试验结果见表1。
表1：不同外植体类型的诱导情况比较
| 不同的外植体类型 | 接种的外植体数(块) | 愈伤组织 | 形成的不定芽或小鳞茎 | 每块外植体生成不定芽或小鳞茎的平均数量 | ||
| 数量(块) | 所占比例(％) | 数量(块) | 所占比例(％) | |||
| 带部分鳞片的鳞茎盘 | 93 | 0 | 0 | 93 | 100 | 8.1 |
| 不带鳞片的鳞茎盘 | 91 | 0 | 0 | 85 | 93 | 4.9 |
| 内层鳞片下部 | 89 | 3 | 3 | 52 | 58 | 3.0 |
| 外层鳞片下部 | 90 | 7 | 8 | 49 | 54 | 2.5 |
| 内层鳞片上部 | 92 | 2 | 2 | 50 | 54 | 2.1 |
| 外层鳞片上部 | 91 | 5 | 5 | 36 | 40 | 1.7 |
| 叶片 | 93 | 87 | 94 | 11 | 12 | 1.2 |
| 叶柄 | 91 | 80 | 88 | 2 | 2 | 1.0 |
通过以上的比较试验，得出在相同的诱导培养基下，以鳞茎盘的诱导率最高，每块外植体所诱导的不定芽或小鳞茎的数量也最多，并且不象叶片或鳞片一样需先形成愈伤组织，而是直接诱导产生不定芽或小鳞茎，使成功构建组织培养体系的时间缩短，有效缩短了诱导培养的周期。因此，在本发明的组织培养技术体系快速繁殖南美水仙优质种苗的方法中，外植体的选择以带部分鳞片的鳞茎盘为最佳。
实施例5
增殖培养基的筛选
表2不同激素浓度及配比对南美水仙增殖继代的影响
| 培养基 | 接种数(个) | 产生不定芽数或小鳞茎总数(个) | 增殖倍数(倍) | 有效芽数(个) | 变异率％ | |
| 基本成分 | 激素配比(mg/L) | |||||
| MS+蔗糖30g/L+琼脂5.0g/L，pH5.6 | BA0.5+NAA0.2 | 12 | 18 | 1.5 | 18 | 0 |
| BA0.5+NAA0.5 | 14 | 22 | 1.6 | 22 | 0 | |
| BA0.5+NAA1.0 | 15 | 23 | 1.5 | 23 | 0 | |
| BA1.0+NAA0.2 | 12 | 58 | 4.8 | 56 | 3.4 | |
| BA1.0+NAA0.5 | 14 | 67 | 4.8 | 66 | 3.0 | |
| BA1.0+NAA1.0 | 15 | 72 | 4.8 | 69 | 4.2 | |
| BA2.0+NAA0.2 | 15 | 77 | 5.1 | 71 | 7.8 | |
| BA2.0+NAA0.5 | 14 | 71 | 5.1 | 66 | 7.0 | |
| BA2.0+NAA1.0 | 13 | 68 | 5.2 | 62 | 8.8 | |
| BA3.0+NAA0.2 | 15 | 110 | 7.3 | 48 | 56.4 | |
| BA3.0+NAA0.5 | 15 | 110 | 7.3 | 51 | 53.6 | |
| BA3.0+NAA1.0 | 14 | 102 | 7.3 | 45 | 55.9 | |
从表2可以看出，随BA浓度增加，增殖率逐步提高，但变异率也随之提高，尤其是随着培养物继代次数的增加，变异明显增加，主要表现为不定芽矮化、叶片不展开，皱缩及黄化，再生的小鳞茎变扁，矮化皱缩，有时几个连在一起，无法分切。因此，在兼顾增殖率与变异率的前提下，BA适宜的浓度范围应为1.0～2.0mg/L，NAA对增殖率和变异率的影响不大，范围可设置为0.2～1.0mg/L。值得注意的是，在培养物的前期继代过程中，由于激素累积较少，BA可选择适宜范围内的较高浓度，随着培养物继代次数的增多，激素累积较多时，激素尤其是BA等细胞分裂素类的浓度要适当下调，可选择较低浓度进行继代，这样交替使用，才能在获得较高增殖倍数的前提下，降低变异率，从而提高种苗质量，获得高品质的优质产品。同样根据以上试验结果，为进一步提高种苗的质量，特在增殖与生根两个步骤之间增加了壮苗的环节，可获得品质更优的不定芽，进一步提高了生根率和移栽成活率。
实施例6
生根的调控
从表3可见，单独使用NAA或IAA，以及NAA和IAA配合使用，均能使南美水仙的不定芽长根，但生根率和移栽成活率差距较大，以吲哚乙酸(IAA)0.1～0.5mg/L配合萘乙酸(NAA)0.1～0.5mg/L的生根效果较好，30d时统计的生根率均达到90％以上，且移栽成活的情况也比较好，成活率高达95％以上。
表3不同生长素对南美水仙生根和成活的影响
| 培养基(mg/L) | 接种芽数(个) | 初始生根时间(天) | 30d生根率％ | 30d平均根数(条) | 30d平均根长(cm) | 移栽成活率(％) |
| IAA0.1+NAA0.1 | 50 | 15 | 90 | 2.5 | 2.0 | 95 |
| IAA0.1+NAA0.3 | 50 | 16 | 92 | 3.2 | 2.1 | 95 |
| IAA0.3+NAA0.3 | 50 | 15 | 91 | 3.5 | 2.3 | 96 |
| IAA0.3+NAA0.5 | 50 | 16 | 94 | 4.2 | 2.8 | 97 |
| IAA0.5+NAA0.5 | 50 | 16 | 95 | 5.1 | 3.2 | 98 |
| IAA0.7+NAA0.7 | 50 | 23 | 87 | 6.1 | 1.9 | 87 |
| IAA1.0+NAA1.0 | 50 | 25 | 78 | 3.7 | 1.1 | 80 |
| NAA0.1 | 50 | 26 | 56 | 1.3 | 2.2 | 79 |
| NAA0.3 | 50 | 21 | 62 | 1.5 | 2.5 | 82 |
| NAA0.7 | 50 | 19 | 67 | 1.8 | 2.9 | 88 |
| NAA1.0 | 50 | 20 | 59 | 2.1 | 2.7 | 81 |
| 培养基(mg/L) | 接种芽数(个) | 初始生根时间(天) | 30d生根率％ | 30d平均根数(条) | 30d平均根长(cm) | 移栽成活率(％) |
| IAA0.1 | 50 | 27 | 60 | 1.2 | 3.1 | 77 |
| IAA0.3 | 50 | 23 | 65 | 1.4 | 3.5 | 80 |
| IAA0.7 | 50 | 20 | 68 | 1.7 | 2.9 | 91 |
| IAA1.0 | 50 | 21 | 60 | 1.9 | 1.7 | 79 |
实施例7
培养环境的调控
从本发明可看出，对不同步骤的培养环境也进行了适当的调控，主要表现在培养温度的调节上，如在诱导培养阶段，由于外植体才进入组培阶段，而南美水仙的生长温度偏冷凉，但不耐霜冻，生长适宜温度为20℃～25℃，因此在初始诱导的培养温度尽量调节至南美水仙生长适宜温度，设置为22±2℃，以使初始外植体在与其原生长相似的培养温度下尽早萌动形成不定芽或小鳞茎。而在增殖阶段，由于南美水仙的生长习性决定其组培苗生长较慢，所需继代时间较长，因此将继代增殖的培养温度适当调高，设置为25±2℃，在保证增殖率的前提下，促进组培苗的生长，缩短继代周期。在壮苗与生根阶段，为提高种苗的内在品质及生根率，特别将培养温度再调整至南美水仙的适宜生长温度，分别设置为23±2℃与22±2℃，使壮苗阶段能兼顾适当增殖与壮苗，而较冷凉培养温度能促进不定芽生根，且能有效提高其移栽成活率。
Claims (4)
1.南美水仙组织培养的一组培养基，其特征在于该组培养基由以下五个培养基组成：
(1)诱导培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～3.0mg/L
萘乙酸(NAA) 1.0～2.0mg/L
水解酪蛋白(CH) 200～300mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.0g/L
pH 5.6～6.0；
(2)增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～1.0mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.5g/L
pH 5.6～6.0；
(3)继代增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～1.0mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.5g/L
pH 5.6～6.0；
(4)壮苗培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～1.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0；
(5)生根培养基：
MS基本培养液
吲哚乙酸(IAA) 0.1～0.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0。
2.权利要求1所述的南美水仙组织培养的一组培养基，其特征在于所述的一组培养基由以下五个培养基组成：
(1)诱导培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 1.5mg/L
水解酪蛋白(CH) 250mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 5.5g/L
pH 5.8；
(2)增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 5.5g/L
pH 5.8；
(3)继代增殖培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5mg/L
蔗糖 30g/L
琼脂 5.5g/L
pH 5.8；
(4)壮苗培养基：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.8mg/L
萘乙酸(NAA) 0.8mg/L
蔗糖 20g/L
琼脂 6.0g/L
pH 5.8；
(5)生根培养基：
MS基本培养液
吲哚乙酸(IAA) 0.3mg/L
萘乙酸(NAA) 0.3mg/L
蔗糖 20g/L
琼脂 6.0g/L
pH 5.8。
3.一种南美水仙组织培养的标准化快繁方法，按以下次序的几个步骤进行：
(1)、外植体的选择与灭菌：选择无病虫危害、生长健壮、无病毒症状表现、且种植2年以上的南美水仙鳞茎，将其外层1～2层鳞片剥去后，用自来水冲洗干净后，按常规放入洗衣粉水浸泡几分钟，自来水流水冲洗至无泡沫，在质量百分比为0.1～0.2％的HgCl2溶液中处理15～25分钟，2％的次氯酸钠溶液中处理20～25分钟，无菌水洗3～4次后，将带鳞片的鳞茎基盘进行切块接种；
(2)、诱导培养：在无菌条件下，将灭菌鳞茎切除约1/4～1/3的上部鳞片，获得带部分鳞片的鳞茎基盘，将上述获得的鳞茎基盘切块接种到下列诱导培养基中培养，在温度为22±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度2000～3000Lx的环境条件下，培养40～60d，使不定芽或小鳞茎自切口处生成；
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～3.0mg/L
萘乙酸(NAA) 1.0～2.0mg/L
水解酪蛋白(CH) 200～300mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.0g/L
pH 5.6～6.0；
(3)、增殖培养：在无菌条件下，将步骤(2)获得的不定丛生芽或小鳞茎切分成2～3个一丛，转入下列的增殖培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.2～1.0mg/L
蔗糖 25～35g/L
琼脂 5.0～6.5g/L
pH 5.6～6.0；
在温度为25±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养30～45d，使不定芽或鳞茎大量增殖；
(4)、继代增殖：将第3步骤增殖所获得的不定芽或小鳞茎在无菌条件下分切为单芽或2～3个一丛，接入与第(3)步骤同样的增殖培养基中，在与第(3)步骤相同的培养环境下进行培养，得到大量的无根不定芽，增殖苗通常无叶或有叶1片，有叶片的叶色浓绿，生长健壮；
(5)、壮苗培养：将第(4)步骤增殖所获得的无叶不定芽或小鳞茎再进行重复继代，获得大量繁殖材料；而将带叶片的不定芽分切为单芽或2芽一丛，转入下列的壮苗培养基中：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.5～1.0mg/L
萘乙酸(NAA) 0.5～1.0mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0；
在温度为23±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养25～35d，使不定芽的植株快速长高；
(6)、生根培养：将第(5)步骤通过壮苗培养获得的苗高约为1.0～1.5cm，具叶1～2片的无根健壮不定芽分切成单芽，转入下列的生根培养基中：
MS基本培养液
吲哚乙酸(IAA) 0.1～0.5mg/L
萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L
蔗糖 20～25g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
pH 5.6～6.0；
在温度为22±2℃，光照时间10～12h/d，光照强度1500～2000Lx的条件下，培养20～30d，可使不定芽基部或小鳞茎上长出根；
(7)、移栽成活：将第(6)步骤获得的南美水仙生根苗从瓶内取出，洗净培养基，移入腐质土∶珍珠岩为1∶1的混合基质内，移栽时应避免将小鳞茎埋入基质内，但需将根埋入基质内，栽后浇足水，适当保湿，移栽1周内相对湿度应保持在80％以上，40～50d即移栽成活。
4.权利要求3所述的标准化快繁方法，其特征在于：
第(2)步骤的诱导培养基为权利要求2(1)中诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+CH250mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8，光照时间11h/d，光照强度2500Lx的环境条件下，培养50d；
第(3)步骤的增殖培养基为权利要求2(2)中的增殖培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8，光照时间11h/d，光照强度2000Lx的条件下，培养40d；
第(4)步骤的继代增殖培养基为权利要求2(3)中的继代增殖培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH 5.8；
第(5)步骤的壮苗培养基为权利要求2(4)中的壮苗培养基MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH 5.8，光照时间11h/d，光照强度2000Lx的条件下，培养30d；
第(6)步骤的生根培养基为权利要求2(5)生根培养基MS+IAA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH 5.8，光照时间11h/d，光照强度2000Lx的条件下，培养30d。
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