CN101679997A - 诱导棉花胚发生性愈伤组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于再生棉花植物的方法。在发育阶段中新型培养基组成、培养基添加剂和新的生长条件的使用导致胚发生、胚成熟和胚萌发的频率提高。该改进的方法导致转化的棉花植物的更高生产频率。

Description

诱导棉花胚发生性愈伤组织的方法
本申请要求2007年5月8日提交的美国临时申请60/916802号的优先权，该申请的全部公开内容通过引用并入本申请中。
技术领域
本发明涉及提高棉花植物生产效率的方法。更具体地，本发明公开了用于增强胚愈伤组织的产生和胚的发育的新型培养基组成和培育条件。
背景技术
新技术已经允许产生可商业实施的转基因作物并对农业产业具有重大的经济影响。这些进步使得能够产生含有需要的新型性状的新作物品种。为了使这些性状在市场上获得成功，尽可能缩短上市的时间是关键的。
基因组技术的发展已经使得确认和分离大量的基因成为可能，并使得需要可靠和有效的转化生产系统，用于通过将这些基因转化到经济上重要的作物(如棉花)中而测试这些基因的实用性。植物的遗传工程通常是需要植物细胞的转化和转基因植物的再生的多步骤过程。植物细胞通过引入通常整合到宿主细胞基因组中的核酸序列进行转化，接着从转化的细胞再生可有性繁殖的植物。在棉花的情况中，这一过程通常包括用土壤杆菌(Agrobacterium)接种外植体(explant)、形成未分化的愈伤组织(callus)、诱导胚发生性愈伤组织、诱导胚、胚成熟和萌发、及植物发育的步骤。
可以获得用于将核酸序列引入植物细胞的几种方法且这些方法是现有技术中公知的。用于转化双子叶植物的方法主要使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(在Potrykus，1991中进行了综述)。所报道的转基因植物包括棉花(例如，美国专利5004863号和美国专利5159135号)。这些报道描述了完整的再生过程，包括转化和转化的植物组织的选择、该组织的诱导以形成胚及这些胚的萌发以形成植物。报道了促进该过程的各种培养基组成。但是，胚发生历来需要几个月或更长的时间。
美国专利5244802、5583036和5695999公开了从体细胞再生棉花植物的方法。报道了可在再生过程的不同阶段使用的改良培养基组成。更具体地说，转化的植物组织在补充有葡萄糖的培养基中生长直到酚的分泌停止，由此该组织被转移到补充有蔗糖而不是葡萄糖的培养基中。许多测试的棉花种系形成转基因愈伤组织，但不发生胚发生及再生成植物。美国专利4672035号描述了利用培养基组成的改进再生棉花植物的过程。
棉花转化和转化的棉花植物再生的过程通常花费大致12至14个月的时间。这段时间的主要部分用于棉花植物的再生。因此，现有技术没有满足对于棉花植物转化和再生的改进方法的需求。本发明通过减少时间和提高从棉花植物组织获得棉花植物的效率而提供优于已公开的方法的改进，从而解决了这些需求。
发明内容
在一个方面，本发明提供提高棉花植物再生效率的方法，包括以下步骤：(a)在非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养棉花植物组织以产生愈伤组织；(b)在胚发生性愈伤组织诱导和胚形成培养基上培养所述愈伤组织以产生胚；(c)在胚成熟培养基上培养胚以产生成熟的胚；(d)在胚萌发培养基上培养成熟胚；和(e)从成熟的胚获得再生的棉花植物；其中所述方法进一步包括选自以下步骤的至少一个附加步骤：在胚发生性愈伤组织诱导培养基上进行培养之前增加蔗糖驱动(sucrose pulse)步骤；在含油菜素类固醇的培养基中培养棉花组织；在具有改变的空气组成的气氛中培养棉花愈伤组织和/或胚；在发生愈伤组织诱导的步骤(a)中提高乙烯并且在发生胚发生和胚成熟的步骤(b-d)中没有提高乙烯的情况下培养棉花植物组织；在30℃至大约34℃的温度下培养愈伤组织和/或胚；在包含ABA的非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养棉花植物组织；和在包含硝酸钙和硫酸钾的非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养棉花植物组织；与MS培养基中的盐相比，硝酸铵、氯化钙、硝酸钾、碘化钾或氯化钴的量降低；或与MS培养基中的盐相比，硫酸铜和硫酸锰的量提高；或没有硝酸钾。
在特定的实施方式中，棉花组织在包含硝酸钙和硫酸钾的非胚发生性愈伤组织诱导培养基上进行培养；与MS培养基中的盐相比，硝酸铵、氯化钙、硝酸钾、碘化钾和氯化钴的量降低；且与MS培养基中的盐相比，硫酸铜和硫酸锰的量提高。
在特定的实施方式中，所述方法进一步包括其中所述组织包含在步骤(b)或步骤(c)之前被异源DNA序列转化的细胞的步骤。在特别的实施方式中，转化的组织或细胞在包含卡那霉素、草甘膦或草铵膦的培养基上进行选择。在其它的实施方式中，所述方法进一步包括在转化之前在液体培养基中预浸(pre-soaking)所述组织至少1小时。在特定的实施方式中，所述液体培养基包含MSO葡萄糖培养基的基础盐(basal salt)和碳水化合物成分。在另外其它的实施方式中，所述组织是棉花胚轴或子叶外植体。
在再另外其它的实施方式中，所述非胚发生性愈伤组织诱导培养基包含WPSEL培养基的基础盐成分。在特别的实施方式中，所述非胚发生性愈伤组织诱导培养基是WPSEL培养基。
在特定的实施方式中，所述油菜素类固醇是油菜素内酯。所述方法可以进一步包括在低氧环境中培养棉花愈伤组织和/或胚，其中所述改变的空气气氛补充有选自乙烯、氮气和二氧化碳的一种或多种气体。
另外，在特定的实施方式中，所述愈伤组织和/或胚在补充有选自油菜素类固醇、乙烯和乙烯前体的一种或多种化合物的培养基中培养。
在另一个方面中，本发明提供了一种提高棉花植物再生效率的方法，包括以下步骤：(a)在大约0μEinsteins m-2sec-1至低于大约5μEinsteins m-2sec-1的暗照明条件下使棉花种子萌发和生长以获得包含胚轴的棉花幼苗；(b)切除胚轴以获得胚轴外植体；和(c)在导致形成胚发生性愈伤组织的条件下培养所述外植体。在特定的实施方式中，所述种子在暗照明条件下萌发和生长2-4天，接着在切除胚轴以前在大约20μEinsteins m-2s-1至大约200μEinsteins m-2s-1的光强度下生长1天。在特别的实施方式中，所述种子在暗照明条件下萌发和生长2-4天，接着在切除胚轴以前在大约30μEinsteins m-2s-1的光强度下生长1天。在特定的实施方式中，所述暗照明条件包括大约0μEinsteins m-2sec-1或大约5μEinsteins m-2sec-1的光强度。
具体实施方式
本发明提供从转化的和未转化的组织再生棉花植物的改进方法，其通过减少转化后棉花植物再生的时间产生了特别的益处，并提高了在棉花愈伤组织培养中获得更快的胚发生反应的效率。这些改进是通过控制环境和利用新型培养基组成增强胚发生性愈伤组织的产生和胚的发育而实现的。一种改进可以与下面描述的一种或多种其它处理进行组合以产生在棉花愈伤组织和胚发生性愈伤组织的形成、体细胞胚发生、胚萌发及获得棉花植物的水平和时机方面的额外的或协同的改进。
现发现，棉花细胞培养物的培养基组成的变化和棉花细胞培养物环境的变化使得早期棉花胚发生反应成为可能。因此，例如，发现使棉花非胚发生性愈伤组织细胞培养物经受“蔗糖驱动”增强了后续的细胞生长和胚发生。另外，发现包含明显与Murashige & Skoog(1962；“MS Salts”)的基础盐配方不同的基础盐配方的替代细胞培养物培养基在棉花细胞培养物生长过程的适当阶段使用时促进了胚发生。在特定的实施方式中，发现由McCown & Lloyd的“木本植物培养基(Woody Plant Medium)”(例如McCown & Lloyd，1981)中的盐配方提到的盐配方增强了胚发生。在特别的实施方式中，发现使用LM木本植物培养基(WPM)(McCown和Lloyd，1981)的基础盐配方增强了棉花胚发生。
例如，与基于MS基础盐的培养基中的成分相比愈伤组织诱导培养基中铵、硝酸根或其它离子的量或比例的改变可以允许增强的胚发生和更快的胚成熟和植物再生。非限制于特定的理论，MS基础盐与WPM基础盐成分(表17)的对比表明这些组成之间的主要差异涉及氮、钙、钾、硫、铜和钴的量和来源。因此，例如，WPM基础盐包含低于MS基础盐的水平的硝酸根，且硝酸根并非来自硝酸铵和硝酸钾，而是源自硝酸铵和硝酸钙。在WPM中比MS培养基存在总体更少的盐。较少的盐可降低组织上的水应力，从而允许更快速的初始生长。另外，在WPM中存在比MS高4倍的Ca，其可能具有调节效应。在WPM中还存在比MS培养基高4倍的硫酸根。硫至少在紫花苜蓿体细胞胚发育中被确认为是充分的胚成熟所需要的。最终，在WPM中不存在KI或Co。
如上所述，本发明的特定实施方式在培养基中使用了替代的基础盐配方。例如，在有或没有选择剂的情况下在前胚发生或非-胚发生性愈伤组织诱导阶段中可以采用基于LM木本植物基础盐(WoodyPlant Basal Salts)(例如Phytotech L-154；PhytoTechnologyLaboratories，Shawnee Mission，Kansas)的培养基(例如，“WPSEL”；参见表12)，而不是基于MS基础盐的培养基(例如，“UMSEL”；参见表6)。本发明提供改良的基础盐成分(例如在McCown木本植物培养基(WPM)中发现的基础盐成分)在棉花细胞培养过程的各个不同步骤中的用途，包括例如取代通常在愈伤组织诱导步骤中使用的MS盐。
本发明可以使用用于从转化或非转化的棉花愈伤组织再生棉花植物的基础盐培养基，其补充有，例如Gamborg’s B5维生素、植物生长素、细胞分裂素和碳水化合物源，并称为改良的木本植物培养基。为从棉花愈伤组织再生棉花植物，植物组织培养物培养基可以补充一种或多种选自特别是，油菜素类固醇如油菜素内酯或其它相关多羟基甾醇、乙烯前体、植物生长素、细胞分裂素、抗坏血酸、抗坏血酸前体、酪蛋白水解产物和脱落酸的化合物。在一个实施方式中，补充有例如油菜素内酯的MS基础盐培养基用于从转化或非转化的棉花愈伤组织再生棉花植物。或者，基于WPM的基础盐培养基可以补充，例如油菜素内酯以用于从转化或非转化的棉花愈伤组织再生棉花植物。
在特别的实施方式中，包括油菜素类固醇(如油菜素内酯或其它相关多羟基甾醇)或乙烯前体的一种或多种化合物可以补充本发明中使用的培养基，以增强从所描述的棉花细胞培养物再生棉花植物的效率和速度。这些化合物可以在该过程的任何一个或多个阶段(例如从切除胚轴组织到转化、愈伤组织形成或诱导、胚发生的诱导、胚的成熟、胚的萌发和再生植物的生长)中作用于棉花细胞。
另外，与先前的报道相反，当乙烯存在于棉花细胞培养过程的适宜阶段时，发现它增强胚发生和胚成熟。据发现，当乙烯添加到前胚发生性愈伤组织中时，如果它在胚组织形成前移除的话，乙烯有助于后续的胚发生。因此，只要在胚形成之前从培养基或细胞环境中移除，乙烯、乙烯前体或促进乙烯合成的化合物可以添加到前胚发生性棉花愈伤组织中，以促进后续的胚形成。
在再另一种实施方式中，基于WPSEL的培养基中可以补充上面所列的一种或多种另外的成分，包括例如Gamborg’s B5维生素、植物生长素、细胞分裂素和碳水化合物源，并称为改良的木本植物培养基，特别是油菜素类固醇如油菜素内酯或其它相关多羟基甾醇、乙烯前体、抗坏血酸、抗坏血酸前体、酪蛋白水解产物和脱落酸，以增强胚发生和胚成熟。
所描述的增强棉花植物再生效率和速度的方法也可以进行结合。因此，改良的基于WPSEL的基础盐成分可以与例如，油菜素类固醇、乙烯增强剂或另一种培养基或气氛补充剂、生长条件或可替代的条件一起使用以增强再生。还发现，胚轴外植体在尝试转化前进行预浸，例如预浸在液体MSO葡萄糖培养基中，增强了后续的胚发生性愈伤组织形成。
油菜素类固醇(例如油菜素内酯)可以加到棉花细胞培养物中以增强胚发生和胚成熟，因此，在特定的实施方式中，发现在愈伤组织的胚发生性生长过程中大约2μM至大约100μM浓度的油菜素类固醇(如油菜素内酯)的存在增加了所形成的胚的数目以及表现出发育更好的形态的胚(如鱼雷期胚)的数目。在低氧环境(例如大约9％的O2而不是21％的O2)中棉花细胞培养物的生长进一步增强了油菜素内酯促进胚发生的效应。在特别的实施方式中，5-50μM的油菜素内酯可以允许这一效应。
增加棉花组织培养物的环境中的乙烯水平的物质可以包括乙烯本身或增强乙烯合成的物质，举例来说，例如乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)或乙烯利(ethephon)。当存在于前胚发生性愈伤组织形成过程中时，乙烯如果在开始胚发生前除去，则增强后续的转化或非转化棉花细胞的胚发生性愈伤组织形成。在特定的实施方式中，在愈伤组织形成(例如，在如UMSEL培养基上的前胚发生生长)期间ACC以例如0.01mM-1mM的浓度存在导致后续的胚发生的增强。在其它的示例性实施方式中，在WPSEL培养基或具有类似基础盐组成的培养基上棉花愈伤组织生长期间大约10-150μM浓度的ACC的存在导致后续胚发生生长过程中胚发生性愈伤组织形成的增强。
按照本公开，“愈伤组织”指的是体外细胞或组织的未分化的增殖块(proliferating mass)。类似地，“胚发生性愈伤组织”指的是能够分化成体细胞胚的愈伤组织类型。“非胚发生性愈伤组织”指的是由还未经历胚发生的未分化的、通常高度空泡的细胞组成的愈伤组织类型。
“非胚发生性愈伤组织诱导培养基”或“前胚发生性愈伤组织诱导培养基”指的是用于促进非胚发生性愈伤组织形成的培养基。
“胚发生性愈伤组织诱导培养基”指的是用于促进胚发生性愈伤组织形成的培养基。“胚形成培养基”指的是用于促进从胚发生性愈伤组织形成体细胞胚的培养基。“胚成熟培养基”指的是用于促进体细胞胚的发育和成熟的培养基。“胚萌发培养基”指的是用于促进体细胞胚的萌发及根、芽和最终植物的发育的培养基。
术语“转化”指的是将外源核酸序列(例如，载体、重组核酸分子)引入细胞或原生质体的过程，其中该外源核酸被整合到染色体中或能够自主复制。“外源”或“异源”意思是来源于包含该核酸序列的分子所引入的植物细胞以外的核酸分子。
为启动按照本发明的转化过程，有必要构建重组核酸载体。“载体”指的是携带外源DNA进入宿主生物体的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。因此“转化载体”定义能够转化植物细胞或植物组织的载体。有时候，转化载体也称作重组核酸载体。本质上转化载体包含一个或多个表达单元或表达盒，其包含：5’启动子、任选的5’非翻译序列、编码序列或其它感兴趣(例如，具有农业用途)的核酸序列、多腺苷酸化信号。编码序列可以是用于感兴趣的基因或用于标志基因。标志基因可以是可选择的或可筛选的。本质上，转化载体或重组核酸载体包含足以用于一个或多个希望的mRNA在植物细胞中的转录的调节元件。一个或多个表达单元通常与至少一个有助于表达单元转移到植物细胞中的T-DNA边界区相邻。制备植物转化载体的方法是本领域中公知的。
通过植物转化载体或构建体的构建，重组核酸载体可以引入合适的宿主如大肠杆菌(Escherichia coli)中并交配到另一合适的宿主如土壤杆菌中，或者可选择地，直接转化到具有繁殖能力的土壤杆菌中。这些技术是本领域技术人员公知的，并且对于许多植物系统，包括棉花进行了描述(美国专利5004863和5159135号)。
土壤杆菌用于将DNA序列引入植物细胞中是本领域中公知的(Fraley等，1987；Rogers等，1987a)。另外，T-DNA的整合是相对精确的过程，很少导致重排。被转移的DNA序列由使得干扰DNA序列插入植物基因组中成为可能的边界序列限定。
土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌中以及在土壤杆菌中复制，从而允许方便地操作(Klee等，1985)。此外，最近在载体结构方面的技术进步简化了将特定DNA编码序列以适当的方向插入载体中的过程。这些载体的结构改进包括含多个限制性位点的方便的多克隆区域、侧翼5’启动子区域和3’多腺苷酸化位点。感兴趣的基因连接到多克隆位点中并因此可操作地与必要的3’和5’调节元件连接(Rogers等，1987b)。另外，可以使用同时包含武装的(armed)和卸甲的(disarmed)Ti基因的土壤杆菌。
这些类型的载体有许多变型，且包含用于在植物细胞中从插入的DNA编码序列产生mRNA的必要元件的载体适于参与到本发明中。在土壤杆菌介导的转化有效的那些植物种中，由于基因转移的温和(facile)和定义的特性，使用土壤杆菌是优选的。
本发明包括使用细菌菌株将基因引入棉花植物中。除了土壤杆菌种以外，也可以使用其它的细菌菌株转化棉花细胞。例如，来自根瘤菌(Rhizobium)属的细菌也可以用于转化棉花植物细胞。可以用于实施本发明的根瘤菌隔离群(isolates)和种包括：根瘤菌种、根瘤菌NGR234种、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)麦迪逊菌株、豌豆根瘤菌USDA2370菌株、豌豆根瘤菌USDA2408菌株、豌豆根瘤菌USDA2668菌株、豌豆根瘤菌2370G菌株、豌豆根瘤菌2370LBA菌株、豌豆根瘤菌2048G菌株、豌豆根瘤菌2048LBA菌株、豌豆根瘤菌菜豆生物型(R.leguminosarum bv.phaseoli)、豌豆根瘤菌菜豆生物型2668G菌株、豌豆根瘤菌菜豆生物型2668LBA菌株、豌豆根瘤菌RL542C菌株、豌豆根瘤菌蚕豆生物型(R.leguminosarum bv.viciae)、豌豆根瘤菌三叶草生物型(R.leguminosarum bv.trifolii)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)USDA 9032菌株、菜豆根瘤菌菜豆生物型(R.etli bv.phaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)种、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)ML542G菌株、百脉根中慢生根瘤菌ML4404菌株、中华根瘤菌(Sinorhizobium)菌株、草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)SD630菌株、草木樨中华根瘤菌USDA1002菌株、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)USDA205菌株、费氏中华根瘤菌SF542G菌株、费氏中华根瘤菌SF4404菌株、费氏中华根瘤菌SM542C菌株、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)种、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)USDA 6菌株和大豆慢生根瘤菌USDA 110菌株。在特别的实施方式中，根瘤土壤杆菌用于转化。根瘤土壤杆菌菌株可以包括胭脂氨酸(nopaline)菌株如C58、章鱼氨酸(octopine)菌株如LBA4404和农杆氨酸(agropine)菌株如EHA105、EHA101和EHA109。
转化通常在特定类型的植物组织上进行。本发明与任何可再生的棉花组织(即，能够形成分化的植物的组织)相容。这样的组织包括细胞悬浮液、愈伤组织、分生组织、胚轴、子叶、根、花组织、叶柄、花药、叶和未成熟的胚。在实施本发明时，可再生的组织优选为胚轴或子叶组织。
制备用于外植体接种的土壤杆菌通常是本领域技术人员公知的。为了本发明的目的，土壤杆菌培养通过接种含培养基(如具有选择抗生素的琼脂中的Luria-Bertani(LB)培养基)的陪替氏(Petri)培养皿开始。选择剂的浓度及所使用的特定选择剂是可变的且取决于宿主菌株。本领域技术人员也明白，对于特定的转化系统，培养生长的时机、培养温度和宿主细菌的浓度可能是不同的。接种平板可以在大约23℃-大约28℃或大约26℃-28℃下孵育数天。单独分离的菌落用于接种含选择抗生素的LB液体培养物并生长到适当浓度。新鲜的液体培养物再次传代培养，然后用于随后的胚轴外植体的接种。
由棉花种子产生的胚轴外植体组织的制备是本领域技术人员公知的(例如，美国专利5159135号)。简单地说，棉花种子经表面灭菌并且在适宜培养基上按黑暗或暗/亮方案萌发。在一个实施方式中，含有1/2x MS盐与Gamborg’s B5维生素和糖(如葡萄糖或蔗糖)的萌发培养基(下面表1)用于使棉花种子萌发。种子通常在大约3-12天内萌发，且优选在大约3-8天内萌发。从幼苗上除去胚轴段。胚轴段被切成大约3mm至大约10mm长度的小段。注意在从胚轴导管上切除时到用带有重组核酸载体的土壤杆菌接种时为止保持胚轴为含水的。在一个实施方式中，胚轴段在MSO葡萄糖培养基(下面表2)中孵育/预浸。在另一个实施方式中，胚轴段在室温下在培养基中孵育大约2小时。这一步骤的孵育时间可以在用带有重组核酸载体的土壤杆菌接种之前从大约30分钟到几个小时之间变化(例如8个小时)。胚轴在MSO葡萄糖培养基中的孵育/预浸令人惊讶地导致在组织培养的后面阶段中酚类物质产生减少和导致在较短时间内产生更多愈伤组织方面更好的胚发生反应(参见表14)。对于接种，胚轴组织或任何另外的棉花组织通过在土壤杆菌悬浮液中浸泡外植体大约20分钟而用土壤杆菌悬浮液进行处理。在接种步骤后，通过在无菌滤纸上吸干外植体除去过量的土壤杆菌悬浮液。
然后接种的外植体在室温(即，大约22℃-24℃)下与土壤杆菌共培养1-5天，优选1-3天。随后共培养的组织转移到含有一种或多种抗生素的选择培养基(下面表5)中以阻止土壤杆菌的生长。抑制性抗生素的范围可以根据所使用的土壤杆菌菌株发生变化。本领域技术人员熟悉用于抑制残留在培养物中的土壤杆菌而同时允许转基因的外植体组织生长的抗生素。可用于实施本发明的土壤杆菌抑制抗生素的例子包括羧苄青霉素和头孢噻肟。
除了抑制土壤杆菌生长的抗生素外，添加选择剂以促进转化的植物组织的生长。转化剂是对于非转化棉花细胞有毒但对转化的细胞无毒的物质。转化的细胞一般以适合赋予对选择剂的抗性的水平包含和产生可选择的标志蛋白。所使用的选择剂通常可以是任何与本发明相容的选择剂。选择剂可以是例如浓度为15mg/L-150mg/L，优选40mg/L-70mg/L的卡那霉素。或者，选择剂可以是例如，浓度为0.1mM-2.5mM的草甘膦，例如在MUSEL或WPSEL培养基中是2mM和在UMO培养基中是0.1mM，或者是例如，浓度为2.5mg/L-10mg/L(如大约5mg/L)的草铵膦。其它合适的选择剂可以包括植物生长素样除草剂如麦草畏、2，4-D或MCPA、乙酰乳酸合酶抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、羟基苯-丙酮酸-双加氧酶抑制剂、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素(paramomycin)、G418或其它氨基糖苷、壮观霉素、链霉素、潮霉素B、博来霉素、脉霉素、磺胺类、链丝菌素、氯霉素、氨甲喋呤、2-脱氧葡萄糖、甜菜碱醛、S-氨乙基L-半胱氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、苄基腺嘌呤-N-3-葡萄糖苷酸酶。编码可以使这些选择剂去毒的蛋白质的基因是本领域技术人员公知的。本领域技术人员可以理解，这些选择剂的浓度可以随所使用的培养物培养基、所使用的外植体的类型、生长条件以及使用的特定选择剂而发生变化。
许多不同形式的培养基适用于转化细胞的选择。本领域技术人员熟悉在适当地补充时支持植物组织生长和发育的培养基种类。例如，MS培养基(Murashige和Skoog，1962)、Gamborg’s培养基(Gamborg等，1968)、LM木本植物培养基(WPM)(McCown和Lloyd，1981)、Nitsch和Nitsch培养基(Nitsch和Nitsch，1969)及Schenk和Hildebrandt培养基(Schenk和Hildebrandt，1972)。具有补充剂(包括维生素如B5(Gamborg)、植物激素如2，4-D和激动素及碳水化合物源如葡萄糖)的MS培养基可用于棉花植物的再生。
按照本发明，术语“蔗糖驱动”指的是在生长(即非胚发生性愈伤组织生长)的愈伤组织形成阶段中棉花外植体或细胞培养物从给定的生长培养基转移到类似、但是额外包含蔗糖的生长培养基中一段限定的时间，随后在给定的培养基上进一步生长。在特定的实施方式中，蔗糖驱动在包含大约0.1g/L蔗糖的培养基上进行大约1周。给定的生长培养基可以包含，例如MS基础盐或LM木本植物培养基基础盐。
在特别的实施方式中，使用木本植物培养基(WPM)基础盐而不是MS培养基基础盐来制备用于选择转化的愈伤组织的改良WPM培养基(表12)。
本发明提出改变用于棉花组织培养的细胞气体环境。本领域技术人员可以通过几种手段主动地改变棉花组织培养的气体环境，例如通过可以影响培养物周围空气的组成的物理或化学手段添加或除去任何物质。组织培养可以在封闭的系统(如陪替氏培养皿)中和/或在可以控制其它参数(包括光和温度)的培养箱中进行。在本发明的一个实施方式中，生长培养基的化学组成配制成增加可以改变生长环境的气体组成的气体或其它代谢物的产生。这种配方的例子是在细胞培养过程的适当阶段在生长培养基中添加乙烯前体，以在生长培养基中产生更高的乙烯浓度。
在另一个实施方式中，生长环境的空气组成可以通过在环境中添加气体或从环境中移除气体而改变。添加乙烯或任何需要的气体可以轻易地通过使气体流过培养箱来完成。棉花组织培养物生长环境的空气组成也可以通过在培养箱中施加完全或部分真空来改变。棉花组织培养环境的空气组成也可以通过放置化学物质来完成，例如在培养箱中放置浓氢氧化钠溶液可以从培养的气体环境中除去二氧化碳。“低氧环境”指的是其中O2含量低于通常在大气中发现的氧含量但仍适于正常生长和发育的植物细胞培养物生长环境。例如，包含大约5-10％的O2，优选大约9％的O2的气氛是低氧环境。
因此，本发明的一个实施方式提出放置能够从培养环境中除去气体的化学物质，从而改变环境的组成和改变细胞的生长。在本发明的另一个实施方式中，棉花组织培养环境的空气组成可以通过密封其中进行棉花组织培养的组织培养容器而改变。棉花组织培养容器的密封可以通过例如使用能够影响培养的气体交换的带或膜进行。其实例是用PARAFILM、SARAN包装材料或另一种塑料膜、帆布包(turkey bag)、拉链包等密封棉花组织培养容器。举例来说，大气的主要成分的海平面组成在表1中给出(Lide等，1997)。按照本公开，改变的气氛组成包括其中所列气体的比例与表1的比例相比发生主动改变的空气组成(即气体环境)。
表1：空气的海平面组成(以15℃的温度和101325Pa压力下的体积百分比计)
Figure G2008800153940D00131
Figure G2008800153940D00141
改变棉花细胞的气体环境的时机也可以影响环境对培养物及其生长和胚发生的效应。因此，在一个实施方式中，在例如“蔗糖驱动”步骤之后，乙烯、乙烯前体或其它提高乙烯水平的物质可以在细胞生长的愈伤组织诱导阶段中，例如在棉花细胞与UMSEL、WPSEL或者UMSEL-或WPSEL-样培养基接触时，添加到培养物培养基中或添加到环境中(例如，烧瓶、容器、平板、培养箱、室内气流等)，但前提是在胚发生诱导步骤开始时停止乙烯增强。
本领域技术人员很清楚可以在组织培养条件中进行改变的其它重要变量。温度就是一种这样的其它变量。棉花细胞转化和再生过程一般在大约20℃至大约30℃的温度范围内进行，且20℃至28℃是用于棉花愈伤组织诱导和棉花植物的再生的典型温度范围。类似地，棉花胚发生的诱导、胚成熟和胚萌发通常在大约20℃至28℃的温度下进行。本发明在特定的实施方式中设想＞28℃的温度用于棉花愈伤组织诱导、棉花胚发生的诱导、胚成熟和胚萌发。处理的棉花细胞和组织在升高的温度下生长可以与一种或多种其它所述的处理结合以产生在形成胚发生性愈伤组织、可萌发的胚和得到棉花植物的水平和时机方面的额外或协同的改善。在特别的实施方式中，用于棉花的这些步骤中的一个或多个可以在超过大约30℃到大约35℃的温度下完成。
除非具体规定了其它的条件，棉花植物组织通常在16小时白天和8小时夜晚的光周期下用大约20μEinsteins m-2s-1至大约200μEinsteins m-2s-1的光强度进行培养。在棉花细胞培养的多个阶段(包括种子萌发、愈伤组织形成、胚发生性愈伤组织诱导阶段和胚增殖阶段)中，棉花组织可以保持在黑暗中以促进胚发生、胚形成或成熟(例如，在UMSEL、WPSEL或UMO培养基上)。在一个实施方式中，棉花种子可以萌发，然后在0μEinsteins m-2sec-1的暗照明条件下生长，以获得包含胚轴的棉花幼苗。胚轴可以从萌发的幼苗上切除以获得随后可以进一步生长或在进一步生长前进行转化的胚轴外植体。
在一些实施方式中，种子可以萌发并在0μEinsteins m-2sec-1的暗照明条件下生长2-4天，例如3天，然后在使用萌发的种子进行愈伤组织诱导之前置于光中生长12-24小时，随后在导致形成胚发生性愈伤组织的所述条件下培养。在特定的实施方式中，愈伤组织形成培养基包含MS基础盐，如在UMSEL培养基中发现的基础盐。在其它的实施方式中，愈伤组织形成培养基包含改良的基础盐，如在WPSEL培养基或类似培养基中发现的基础盐。外植体也可以在发生转化(例如，与含感兴趣的基因的土壤杆菌培养物进行共培养)之前浸泡在液体培养基中，如含有葡萄糖的MSO培养基。
转化的组织可以保持在选择培养基或等同的培养基上大约2-10周，优选大约4-9周。可以按照需要进行转移，一般每3-5周进行转移。愈伤组织可以从胚轴块上除去并转移到适于诱导胚发生性愈伤组织的培养基上。如上所述，培养基的多种组成适用于植物转化和再生。本发明可以使用UMO用于胚发生性愈伤组织诱导步骤。
本文中所描述的培养基可以包含胶凝剂如
Figure G2008800153940D00151
或GelzanTM(Gelzan是CP Kelco U.S.，Inc.，Houston，TX的商标；GELRITE是CPKelco的注册商标)或者PHYTAGEL(PHYTAGEL是Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO的注册商标)。胶凝剂通常以大约2g/L-大约3.5g/L的浓度加入。愈伤组织诱导培养基通常包含碳水化合物。例如，葡萄糖或麦芽糖可以用作碳源。平板可以在大约30℃的温度下以大致16/8小时的日/夜周期进行孵育。例如，光强度可以在大约20μEinsteins m-2s-1至大约100μEinsteins m-2s-1的范围内。
胚发生性愈伤组织诱导培养基可以包含抗氧化剂以促进胚发生过程。据发现抗氧化剂的组合降低了葡萄-土壤杆菌相互作用中的组织坏死(Perl等，1996)。本领域技术人员熟悉可获得的大范围的抗氧化剂。
大致每8周，例如每6-8周，活跃生长的组织和小胚被移除并置于包含具有所描述的支持基质的新鲜半固体培养基(例如被灭菌Whatman滤器覆盖的半固体培养基)的陪替氏培养皿上另外8-12周。这一胚发生性组织可以每4-6周传代培养到相同的培养基上。培养皿可以在大约28-30℃温度下在黑暗中培养。
大于大约5mm的胚单独地转移到胚萌发培养基上。这一培养基是例如Stewart和Hsu(SHSU)培养基(Stewart和Hsu，1977)。萌发培养基通常包含大约1.0％(w/v)-大约10.0％(w/v)浓度，更优选大约5.0％(w/v)浓度的葡萄糖作为碳水化合物。其它碳水化合物(如麦芽糖)也预想在低浓度下具有类似的用途，并且落入本发明的范围内。以大致16/8小时的日/夜周期在萌发培养基中孵育可以进行例如，大约2-8周，且通常为大约3周-大约4周。
常规地对胚的萌发情况进行监测。已形成2-3片叶子的胚一般转移到较大的培养容器中并在萌发培养基中进一步培养。萌发的胚或小植物在大约28-30℃温度下以大约16/8小时的日/夜周期且通常以大约50-300μEinsteins m-2s-1的光强度保持培养。
当小植物具有总共4-6片真叶和发育良好的根系时，小植物移植到土壤中，在生长室中生长并随后转移到温室中。在一个实施方式中，使用补充有缓释肥料的MetroMix 350(Hummerts Inc.，St.Louis，MO)。许多的土壤混合物是可得的且可以用于实施本发明。植物可以在大约28℃温度下以16/8小时的日/夜周期生长以获得成熟的再生棉花植物。
使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物通常包含插入到一个染色体中的单一的简单重组DNA序列，并称为转基因事件。这样的转基因植物可以说对于插入的外源序列是杂合的。对于转基因来说纯合的转基因植物可通过与包含单一外源基因序列的独立转基因植物(例如R0植物)有性繁殖获得，从而获得R1种子。如果R0植物自体受精，则所产生的R1种子的四分之一对于转基因是纯合阳性的。萌发的R1种子产生植物，可以通常使用允许区分杂合子和纯合子的SNP分析或热扩增分析(即接合性(zygosity)分析)或者本领域技术人员已知的其它分析方法测试该植物的接合性。
为确认转基因植物中外源DNA或“转基因”的存在，可以进行多种分析。这类分析包括，例如，“分子生物学”分析如DNA印迹和RNA印迹及PCRTM、INVADER分析，“生物化学”分析如通过例如免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶学作用检测蛋白质产物的存在，植物部分分析如叶和根的分析，及通过分析再生植物整体的表型。
一旦转基因被引入植物中，该基因可以通过杂交引入到任何与该第一植物性别上相容的植物中，而无需直接转化第二植物。因此，如本文中所使用的术语“后代”代表按照本发明制备的亲本植物的任何世代的后裔，其中所述后代包含选择的DNA构建体。因此“转基因植物”可以是任何世代。使植物“杂交”以提供相对于起始植物种系具有一种或多种加入的转基因或等位基因的植物种系，这定义为通过杂交起始种系和包含转基因或等位基因的供体植物种系而导致特定序列被引入植物种系中的技术。为达到这一目的，例如可以进行以下步骤：(a)种植第一(起始种系)和第二(包含需要的转基因或等位基因的供体植物种系)亲本植物的种子；(b)使第一和第二亲本植物的种子生长为开花的植物；(c)用来自第二亲本植物的花粉给来自第一亲本植物的花授粉；和(d)收获在带有受精的花的亲本植物上产生的种子。
本发明还提供通过本发明的方法产生的植物部分或植物。植物部分非限制性地包括果实、种子、胚乳、胚珠、花粉、叶子、茎和根。在本发明的优选实施方式中，植物部分是种子。
实施例
下面的实施例用于演示本发明的实施方式。但是，本领域技术人员根据本公开应当理解，可以对所公开的特定实施方式进行许多变化和替换并仍然获得相同或相似的结果而不会脱离本发明的精神和范围。
实施例1
种子灭菌、萌发和组织制备
棉花种子(cv.Coker 130)为保持长期存活力在黑暗中储存在4℃温度和30％或低于30％的湿度下。种子从4℃的储存处取出并加到1升的一次性瓶子中。将大约1/4匙的无磷去污剂如LABTONE去污剂(VWR International，West Chester，PA)与大约800mL灭菌水加到瓶子中。瓶子加盖并摇动种子以使其浸泡10分钟。在浸泡过程中偶而使瓶子旋转以彻底清洗种子。然后种子用灭菌水进行漂洗以帮助除去任何残留的去污剂泡沫。在排干所有水后，加入大约200ml的70％乙醇以覆盖瓶中的所有种子，随后缓缓旋转2-3分钟。排干乙醇且种子再次用无菌水清洗。大约800ml的50％漂白液、3滴TWEEN 20(EMD BIOSCIENCES，San Diego，CA)与实验室磁棒一起加入装有种子的瓶子中，且种子在磁力搅拌台上温和地低速搅拌大约30分钟。30分钟后，从瓶子中排干溶液且种子用无菌去离子水清洗2-4次。种子在一高组织培养容器中的萌发培养基(表2)如PHYTATRAY(PHYTATRAY是Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO的注册商标)上在暗或限光条件下萌发大约5-10天。从暗或限光生长的幼苗上切下胚轴段并切成小片。在接种前，这些胚轴段的切片在室温下液体MSO葡萄糖培养基(表3)中孵育1-3小时。
表2：种子萌发培养基的组成
Figure G2008800153940D00181
Figure G2008800153940D00191
表3：MSO葡萄糖培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech.)   4.33g
  Gamborg’s B5维生素(Phytotech)(500X)   2ml
  葡萄糖   30g
  pH   5.7
实施例2
用于接种实施例1中制备的棉花胚轴段的土壤杆菌细胞的制备
土壤杆菌菌株C58从甘油贮存液划线涂布到每升含有以下选择抗生素的Luria Broth培养平板(10g/L氯化钠、5g/L酵母提取物、10g/L细菌用胰蛋白胨，用15g/L琼脂固化在陪替氏培养平板上，称作“LB培养平板”)上：壮观霉素(50mg/mL原液1mL)、链霉素(50mg/mL原液1mL)、氯霉素(25mg/mL原液1mL)和卡那霉素(50mg/mL原液1mL)。平板在大约28℃孵育大约3天。1-3个菌落用于接种包含上述选择抗生素的2mL LB液体培养物。这一液体培养物允许在旋转振动器上28℃的温度下生长大约20小时以生成活跃的细菌液体培养物。2mL活跃的液体培养物用于接种含有选择抗生素的20mL液体LB培养基并使其在旋转振动器上28℃的温度下生长大约20小时。细菌培养物进行离心、清洗并重悬浮在MSO培养基(表4)中，除了碳水化合物源外该MSO培养基类似于表3的培养基。测量MSO培养基中重悬浮的细菌细胞的光密度(OD660)并将其调整到大约0.1-1.0。
表4：MSO培养基的组成
Figure G2008800153940D00192
Figure G2008800153940D00201
实施例3
用土壤杆菌接种棉花胚轴段
胚轴段或外植体在无菌状态下置于无菌陪替氏培养皿上并用足量的细菌悬浮液覆盖。给陪替氏培养皿加盖并频繁地旋转大约20分钟以确保细菌悬浮液与外植体的良好接触。20分钟后将细菌悬浮液从平皿中吸出并且外植体在无菌状态下用无菌滤纸吸干以除去过量的悬浮液。这些外植体作为单层置于具有TrCO培养基(表5)的共培养平板上。平板用塑料袋覆盖，在加盖的盒中培养并以10小时光照/14小时黑暗的光周期在22-24℃下孵育大约2-3天。
表5：TrCO培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech)   0.433g
  Gamborg’s B5维生素(Phytotech)(500X)   2ml
  2，4-D(1mg/ml)   0.1ml
  激动素(0.5mg/ml)   0.2ml
  葡萄糖   30g
  pH   5.8
  琼脂(Sigma)   9g
实施例4
转化细胞的选择和棉花非胚发生性愈伤组织的产生
接种(及如上述实施例中所述对外植体进行处理)后2-3天，胚轴外植体转移到具有含适当选择剂的UMSEL(表6)的陪替氏培养皿上。陪替氏培养皿用Parafilm密封并在28℃下以16/8(日/夜)周期孵育大约4周。4周后胚轴转移到蔗糖驱动培养基(例如，包含如表7中所列的成分)中。胚轴在平皿用PARAFILM密封后在28℃下以16/8(日/夜)周期在蔗糖驱动培养基中再孵育大约一周，之后胚轴片在如上所述的相同条件下在UMSEL培养基(表6)中再孵育4周。4周后，愈伤组织团与胚轴末端分离并置于具有UMO培养基(表7)的陪替氏培养皿上。平皿用PARAFILM密封并在28℃的温度下黑暗中孵育以产生胚发生性愈伤组织。
表6：UMSEL选择培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech)   4.33g
  Gamborg’s B5维生素(Phytotech)(500X)   2ml
  2，4-D(1mg/ml)   0.1ml
  激动素(0.5mg/ml)   1ml
  葡萄糖   30g
  pH   5.8
  植物凝胶(Phytagel)(Sigma)   2.5g
  羧苄青霉素(250mg/ml)   1.7ml
  头孢噻肟(100mg/ml)   1ml
  卡那霉素(50mg/ml)   0.9ml
表7：蔗糖驱动培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech)   4.33g
  Gamborg’s B5维生素s(Phytotech)(500X)   2ml
  2，4-D(1mg/ml)   0.1ml
  激动素(0.5mg/ml)   1ml
  葡萄糖   30g
  pH   5.8
  植物凝胶(Sigma)   2.5g
  羧苄青霉素(250mg/ml)   1.7ml
  头孢噻肟(100mg/ml)   1ml
  成分   量/L
  卡那霉素(40-50mg/ml)   0.9ml-1.0ml
  蔗糖   0.1g
实施例5
从非胚发生性愈伤组织产生胚发生性愈伤组织和胚成熟
来自上述实施例的愈伤组织在黑暗中28℃下孵育6-8周。6-8周后根据生长率，将愈伤组织分成几个团块。来自各团块的两块愈伤组织置于新鲜UMO培养平板(表8)上并用PARAFILM密封。这些平板再次在黑暗中28℃下孵育8-10周。在大约6周至大约10周后，检查平板的胚发生性愈伤组织(以脆弱或密实的愈伤组织团的离散单元为特征)产生的情况和/或体细胞胚的各种不同成熟阶段。胚发生性愈伤组织和体细胞胚很容易通过其形态外观进行识别并通常通过其用镊子探测时的感觉进行区分。相反，非胚发生性愈伤组织在这一阶段较软而没有有组织的离散愈伤组织团。
表8：UMO选择培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech)   4.33g
  Gamborg’s B5维生素(Phytotech)(500X)   2ml
  葡萄糖   30g
  pH   5.8
  植物凝胶(Gelrite)(Kelco)   3.5g
  羧苄青霉素(250mg/ml)   1.7ml
  头孢噻肟(100mg/ml)   1ml
  卡那霉素(50mg/ml)   1ml
  抗坏血酸   100mg
以上获得的具有胚的胚发生性愈伤组织置于用于使胚成熟的TRP+培养基(表9)上并如上所述进行孵育。在大约3个月时间内，活跃生长的组织和小胚每3-5周转移到新鲜TRP+培养基平板上直到胚达到大约5mm的大小。
表9：TRP+培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech)   4.33g
  Gamborg’s B5维生素(Phytotech)(500X)   2ml
  葡萄糖   30g
  硝酸钾   1.9g
  酪蛋白水解产物   0.1g
  pH   5.8
  植物凝胶(Gelrite)(Kelco)   3.5g
  羧苄青霉素(250mg/ml)   1.7ml
  头孢噻肟(100mg/ml)   1ml
  苯菌灵(Benlate)(50mg/ml)   1ml
在无菌状态下仔细地移除5mm或更大的胚并转移到具有SHSU培养基(表10)的新鲜平板上。具有TRP+培养基的老平板重新密封并放回以进行孵育和产生更多的成熟胚。具有SHSU培养基的新平板也用PARAFILM密封以在28℃下以16/8(日/夜)周期用高达100μEinsteins m-2s-1的最大光照进行孵育。每4-6周，检查这些平板上的嫩苗的生长和发育情况。具有3-4片叶子和发达的根系的各嫩苗转移到具有新鲜SHSU培养基的圣代杯(sundae cup)上并进一步在30℃下以16/8(日/夜)周期进行孵育。嫩苗进行孵育直到它们达到4-5片叶的阶段并观察到大量的新根生长。具有4-5片叶和成熟的根系的嫩苗转移到具有土壤的罐中以获得成熟的棉花植物。
表10：SHSU培养基的组成
  成分   量/L
  Stewart和Hsu主要成分(majors)(10X)   100ml
  Stewart和Hsu次要成分(minors)(100X)   10ml
  Steward和Hsu有机物(100X)   10ml
  螯合铁(100X)   1.5ml
  葡萄糖   5g
  pH   6.8
  植物凝胶(Gelrite)(Kelco)   2.2g
  苯菌灵(50mg/ml)   1ml
实施例6
油菜素类固醇增强棉花胚形成的效应
油菜素甾醇植物生长调节剂用于增强棉花胚形成。油菜素内酯(即24-表油菜素内酯；Super-Grow，Montreal，CA)以2-100μM的浓度加入到TRP+培养基(表9)中。然后，来自UMO培养基(表8)的胚发生性愈伤组织在含有油菜素内酯的TRP+培养基上培养。与未处理的对照相比，在通过油菜素内酯处理生长的培养物中观察到所产生的胚的数目大幅度增加，在该实验中5-10μM的油菜素内酯是最佳的。除了胚整体产生量的增加外，由油菜素内酯处理产生的许多胚是5-6mm长的心形胚(发育更好)，而在对照处理中这一阶段并没有这样的胚。这些结果清楚地表明，油菜素内酯或另一种油菜素类固醇可以用于提高从胚发生性愈伤组织发育和生长棉花胚的可能性以及提高发育的程度。结果显示于表11中。
表11：油菜素内酯处理对从胚发生性棉花愈伤组织产生胚的效应
Figure G2008800153940D00241
实施例7
油菜素内酯、低氧供应和两者的组合对增强棉花胚成熟的效应
观察到油菜素内酯在氧气(O2)存在的情况下增强棉花胚的形成。当胚发生性愈伤组织在9％或21％的O2的情况下置于含有油菜素内酯的TRP+培养基(表9)上时，在9％的O2的情况下油菜素内酯处理产生比21％的O2的情况下更多的胚。较低水平的10μM油菜素内酯在9％的O2的情况下产生最大的反应，但100μM水平的油菜素内酯在21％的O2的情况下更有利。观察到较低水平的O2有利于产生比较高水平的O2更多的胚(表12)。不同水平的O2通过在生长室(例如Percival Scientific，Inc.，Perry，IA)中按照制造商的说明(BioSpherix，Redfield，NY)使用PRO-OX 110氧控制设备产生。表12中的结果表明，油菜素内酯促进胚从棉花胚发生性愈伤组织的生长和发育。
表12：油菜素内酯在9％和21％的O2水平下对胚产生的效应
Figure G2008800153940D00251
实施例8
通过在愈伤组织诱导步骤中使用LM木本植物培养基(WPM)基础盐混合物和其它培养基补充剂加速胚发生性棉花愈伤组织的诱导的方法
在培养基中，WPM基础盐混合物用于在愈伤组织诱导步骤中取代MS基础盐混合物。新的改良培养基称为WPSEL培养基(表13)。如表15中所示(处理10中)，当WPSEL在愈伤组织诱导步骤中使用时，它促进了棉花的早期体细胞胚发生。
除了测试改良的基础盐混合物(如在木本植物培养基中发现的)外，还测试了在液体MSO葡萄糖培养基(表3)中预浸胚轴和在不同温度下的愈伤组织诱导的效应。在2小时的预浸后，外植体置于UMSEL(表6)或WPSEL(表13)培养基上。除了处理9(表15)外，平板在这一步骤除去包裹物并在特定的温度下培养以进行愈伤组织诱导。在4周时间段的末尾产生的愈伤组织转移到用于胚发生性愈伤组织诱导的UMO培养基上。平板的一半被包裹，而另一半除去包裹物以用于各项处理。
表13：WPSEL培养基的组成
  成分   量/L
  LM木本植物基础盐(Phytotech).   2.3g
  Gamborg’s B5维生素(Phytotech)(500X)   2ml
  2，4-D(1mg/ml)   0.1ml
  激动素(0.5mg/ml)   1ml
  葡萄糖   30g
  植物凝胶(Sigma)   2.5g
  羧苄青霉素(Phytotech)   425mg
  头孢噻肟(Midwest)   100mg
  pH   5.8
表14：接种培养基的组成
  成分   量/L
  MS基础盐(Phytotech)   2.165g
  MS维生素(100x)(Phytotech)   10ml
  蔗糖(Phytotech)   68.5g
  葡萄糖(Phytotech)   36g
  脯氨酸(Fisher)   0.115g
  pH   5.4
表15中所示的结果证明，WPM盐与外植体在MSO培养基中预浸和在包裹平板的情况下于30℃培养相组合(处理6)显著提升胚发生性愈伤组织的诱导。这一方法不仅更早地显示出胚发生性愈伤组织诱导的较高频率(处理2、4、6、8、10)，而且产生比对应的基于MS盐的培养基(处理1、3、5、7、9)大得多的胚发生性愈伤组织块。
另外，当培养基补充剂如抗坏血酸(0.03、0.15、0.75mg/L)加入到WPSEL培养基中时，如表16所示胚发生性愈伤组织的产生进一步提高。
另外，表17比较了幼苗生长条件对胚发生性愈伤组织(EC)产生的效应。在黑暗中生长并在WPSEL上培养的胚轴更快地产生更多的胚发生性愈伤组织。从首先在黑暗中生长且然后在光中生长的幼苗上取得的胚轴和子叶也更快地产生更多的胚发生性愈伤组织。同样另人惊异的是看到，从首先在黑暗中生长且然后在光中生长的幼苗上取得的胚轴甚至在UMSEL培养基上也产生更多的胚发生性愈伤组织，这与仅在黑暗中生长的胚轴相反，从而表明对于幼苗生长的光条件操作本身对胚发生性愈伤组织的产生具有有益效果。
表15：不同基础盐、预浸外植体和愈伤组织诱导步骤中的温度对胚发生性愈伤组织的产生的效应。％EC(胚发生性愈伤组织)形成表示为显示出胚发生性愈伤组织形成的愈伤组织(与胚发生性愈伤组织的大小无关)的数目除以外植体的总数x100
Figure G2008800153940D00271
Figure G2008800153940D00281
表16：抗坏血酸与WPSEL组合对胚发生性愈伤组织产生的影响
％EC(胚发生性愈伤组织)表示为显示出胚发生性愈伤组织形成的愈伤组织(与胚发生性愈伤组织的大小无关)数目除以外植体的总数x100
表17：幼苗生长条件对胚发生性愈伤组织(EC)产生的效应
Figure G2008800153940D00283
％EC(胚发生性愈伤组织)表示为显示出胚发生性愈伤组织形成的愈伤组织(与胚发生性愈伤组织的大小无关)数除以外植体的总数x100。暗：种子在黑暗中萌发4天；暗-亮：种子的萌发在黑暗中进行3天和在光照(例如大约30μE，16/8日夜周期)中进行1天。
MS和LM木本植物基础盐组成之间的差异显示于表18中。具有与LM木本植物培养基基础盐类似的组成和单个成分浓度的另一种培养基也适用于实施本发明。本领域技术人员现在能够操作WPM的单个成分并采用那些可用于加速棉花胚发生性愈伤组织诱导的成分。
表18：MS基础盐和WPSEL基础盐组成的比较
  成分(mg/L)   MS盐   WPM盐
  硝酸铵   1650   400
  硼酸   6.2   6.2
  氯化钙，无水   332.2   72.5
  硝酸钙   -   386
  氯化钴·6H2O   0.025   -
  硫酸铜·5H2O   0.025   0.25
  Na2EDTA   37.26   37.3
  硫酸亚铁·7H2O   27.8   27.85
  硫酸镁   180.7   180.7
  硫酸锰·H2O   16.9   22.3
  钼酸(Na盐)·2H2O   0.25   0.25
  碘化钾   0.83   -
  硝酸钾   1900   -
  磷酸二氢钾   170   170
  硫酸钾   -   990
  硫酸锌·7H2O   8.6   8.6
实施例9
用于通过应用乙烯前体加速棉花中胚发生性愈伤组织诱导的方法
作为乙烯前体，1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在形成未分化愈伤组织的步骤中加入并在胚发生前除去，以加速胚发生性愈伤组织的形成。
进行了三项研究以确定ACC增强胚发生性愈伤组织的形成的效应。在表19中总结的第一实验中，胚轴外植体置于含有不同浓度的ACC(处理2-6)或不含有ACC(处理7)的UMSEL培养基上。平板除去包裹物并置于两个独立的盒子中(在一个盒子中进行处理2-6和在另一个盒子中进行处理7-12)，在28℃下以16小时光照/8小时黑暗的光周期进行培养。在愈伤组织诱导4周后，愈伤组织转移到没有ACC的UMO培养基中(处理2-6)或转移到UMO+不同浓度的ACC中(处理8-12)以进行胚发生性愈伤组织诱导。在这一阶段中平板用PARAFILM进行包裹。
如表19中所示，在胚发生性愈伤组织诱导过程中而不在愈伤组织诱导过程中添加ACC具有很少的积极效应，且在某些情况中降低了胚发生性愈伤组织的诱导(处理8-12)，而在愈伤组织诱导过程中添加ACC并随后在诱导胚发生之前除去则明显地促进早期的胚发生性愈伤组织形成(处理2-6，表19)。在转移到用于胚发生性愈伤组织诱导的UMO培养基中后7周和9周，当在胚发生诱导之前的愈伤组织生长过程中在培养基中包括10μM的ACC时，分别有80％和＞90％的起始材料产生胚发生性愈伤组织，这与对照组中仅10％和20％的比率形成对比。大约0.01mM-大约1mM的ACC浓度范围与对照(无ACC)相比产生更好的胚发生性愈伤组织形成。
表19：1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在愈伤组织诱导或胚发生性愈伤组织诱导步骤中的效应
Figure G2008800153940D00301
Figure G2008800153940D00311
％EC(胚发生性愈伤组织)表示为显示出胚发生性愈伤组织形成的愈伤组织(与胚发生性愈伤组织的大小无关)数目除以外植体总数x100
添加ACC对于从转化的组织产生胚发生性愈伤组织产生了类似的增强效应。胚轴外植体用包含带有赋予卡那霉素耐受性的表达单元的植物转化载体pMON15722的土壤杆菌进行接种。外植体在接种前在MSO葡萄糖培养基(表3)中预浸2小时。在大约24℃共培养2天后，接种的胚轴块置于含有45mg/L卡那霉素的WPSEL培养基上4周以用于愈伤组织诱导。在愈伤组织诱导后，外植体再次转移到WPSEL培养基上另外4周。不同浓度的ACC在该步骤加入培养基中。实验设计在表20中给出。在另一实验中，从愈伤组织产生的5mm胚的数目是22％、19％(WPSEL+ACC)和17％、15％(WPSEL)，从而表明更高数目的胚可以通过在选择培养基中包括ACC产生。
本领域中已知的其它乙烯合成前体或乙烯释放化合物(如乙烯利(2-氯乙基磷酸))也可以取代ACC或与ACC一起使用。
表20：1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在愈伤组织诱导步骤中对转化的棉花组织的效应
  处理   在非胚发生性愈伤组织生长过程中的ACC浓度(μM)  在具有卡那霉素的UMO培养基上6周后带有EC的块％
  1   0  16.8
  2   10  18.4
  3   30  22.1
  4   60  21.6
  5   100  26.5
  6   150  44.0
实施例10
通过在愈伤组织诱导步骤中使用木本植物培养基(WPM)基础盐混合物增加转基因棉花植物的产生
胚轴外植体用包含带有赋予卡那霉素耐受性的基因表达单元的植物转化载体的土壤杆菌进行接种。然后外植体进行共培养，并再置于用于愈伤组织诱导的包含45mg/L卡那霉素的WPSEL培养基上，然后依次转移到UMO培养基、TRP+培养基、SHSU培养基中，并再转移到土壤中以再生转化的棉花植物。表21表明，在包含卡那霉素抗性表达单元的植物转化载体中提供三种不同的感兴趣基因的7个不同实验中，在WPSEL上培养的胚轴外植体一贯地产生更高数目的胚发生性愈伤组织，从而产生更高数目的嫩苗和1-2个对于产品开发优选的复制事件。拷贝数通过
Figure G2008800153940D00321
分析(Third WaveTMTechnologies，Madison，WI)确定。这一实施例确认了在实施例8中获得的非胚发生性愈伤组织诱导步骤中使用WPM盐在后面的步骤中增加胚发生性愈伤组织和胚的产生的数据。
表21：使用WPM基础盐混合物的转基因棉花植物的产生
Figure G2008800153940D00322
*****
本文所公开和要求的所有组合物和方法可以按照本公开进行制备和实施而不需要过度的试验。尽管本发明的组合物和方法已经就优选的实施方式进行了描述，但本领域技术人员很清楚，可以对该组合物和方法适用多种变化而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地说，很清楚，同时在化学上和生理上相关的特定物质可以取代本文中所描述的物质而获得相同或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员显而易见的类似取代和改进被认为包括在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和思想内。
参考文献
下面所列的参考文献通过引证并入本申请中以对本发明中采用的方法、技术和/或组合物达到补充、解释、提供背景或教导的程度。美国专利4,672,035号；美国专利5,004,863号；美国专利5,159,135号；美国专利5,244,802号；美国专利5,583,036号；美国专利5,695,999；
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Claims (15)

1.一种提高棉花植物再生效率的方法，包括以下步骤：
(a)在非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养棉花植物组织以产生愈伤组织；
(b)在胚发生性愈伤组织诱导和胚形成培养基上培养所述愈伤组织以产生胚；
(c)在胚成熟培养基上培养所述胚以产生成熟的胚；
(d)在胚萌发培养基上培养所述成熟胚；和
(e)从所述成熟的胚获得再生的棉花植物；
其中所述方法进一步包括选自以下步骤的至少一个附加步骤：在含油菜素类固醇的培养基中培养棉花组织；在具有改变的空气组成的气氛中培养棉花愈伤组织和/或胚；在发生愈伤组织诱导的步骤(a)中提高乙烯并在发生胚发生和胚成熟的步骤(b-d)中没有提高的乙烯的情况下培养棉花植物组织；在30℃至大约34℃的温度下培养愈伤组织和/或胚；在包含ABA的非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养棉花植物组织；和在包含硝酸钙和硫酸钾的非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养棉花植物组织；与MS培养基中的盐相比，硝酸铵、氯化钙、硝酸钾、碘化钾或氯化钴的量降低；与MS培养基中的盐相比，硫酸铜和硫酸锰的量提高，或没有硝酸钾。
2.权利要求1所述的方法，其中所述棉花组织在包含硝酸钙和硫酸钾的非胚发生性愈伤组织诱导培养基上培养；与MS培养基中的盐相比，硝酸铵、氯化钙、硝酸钾、碘化钾和氯化钴的量降低；且与MS培养基中的盐相比，硫酸铜和硫酸锰的量提高。
3.权利要求1所述的方法，其中所述组织包含在步骤(b)或步骤(c)之前被异源DNA序列转化的细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述转化细胞在包含卡那霉素、草甘膦或草铵膦的培养基上进行选择。
5.权利要求3所述的方法，进一步包括在转化之前在液体培养基中预浸所述组织至少1小时。
6.权利要求5所述的方法，其中所述液体培养基包含MSO葡萄糖培养基的基础盐和碳水化合物成分。
7.权利要求5所述的方法，其中所述组织是棉花胚轴或子叶外植体。
8.权利要求1所述的方法，其中所述非胚发生性愈伤组织诱导培养基包含WPSEL培养基的基础盐成分。
9.权利要求1所述的方法，其中所述非胚发生性愈伤组织诱导培养基是WPSEL培养基。
10.权利要求1所述的方法，其中所述油菜素类固醇是油菜素内酯。
11.权利要求1所述的方法，进一步包括在低氧环境中培养棉花愈伤组织和/或胚。
12.权利要求1所述的方法，其中所述改变的空气气氛补充有选自乙烯、氮气和二氧化碳的一种或多种气体。
13.权利要求1所述的方法，其中所述愈伤组织和/或胚在补充有选自油菜素类固醇、乙烯和乙烯前体的一种或多种化合物的培养基中培养。
14.一种提高棉花植物再生效率的方法，包括以下步骤：
(a)在大约0μEinsteins m-2sec-1至小于大约5μEinsteins m-2sec-1的暗照明条件下使棉花种子萌发和生长以获得包含胚轴的棉花幼苗；
(b)切出胚轴以获得胚轴外植体；和
(c)在导致形成胚发生性愈伤组织的条件下培养所述外植体。
15.权利要求14所述的方法，其中所述种子在暗照明条件下萌发和生长2-4天，接着在切出胚轴之前在大约20μEinsteins m-2s-1至大约200μEinsteins m-2s-1的光强度下生长1天。
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