CN111197045A

CN111197045A - 一种保卫细胞特异性启动子及用途

Info

Publication number: CN111197045A
Application number: CN202010028234.2A
Authority: CN
Inventors: 赵泉胜; 祁智; 铁英
Original assignee: Mengshu Ecological Construction Group Co Ltd
Current assignee: Mengshu Ecological Construction Group Co Ltd
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-05-26

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体提供的一种保卫细胞特异性启动子，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述启动子具有极强的活性，且具有高特异性，仅在植物的保卫细胞中特异性表达，如幼苗植株的子叶和新叶中保卫细胞，成熟植物的轮座叶的保卫细胞、茎上叶片的保卫细胞、茎的保卫细胞上特异性表达，将有利于研究保卫细胞的结构和功能，进一步有利于分析植物气孔，为培育耐、抗逆性如干旱、低温、病害的作物中具有重要的意义，具有重大的应用价值和市场前景。

Description

一种保卫细胞特异性启动子及用途

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种保卫细胞特异性启动子及用途。

背景技术

启动子(promoter)是一段位于结构基因5'端上游，能够被RNA聚合酶识别并结合，起始转录的DNA序列。启动子决定了基因表达的时间及空间特异性。按照功能和作用方式的不同，可以将启动子分为三类：组成型、诱导型和组织特异性启动子。组成型启动子驱动的目的基因能够在转基因植株的所有生育期和组织中稳定表达。诱导型启动子是指在某些特定的物理、化学或生物信号的刺激下，该类型启动子可以大幅度提高下游基因的转录水平。组织特异性启动子只能驱动目的基因在某些特定的器官或组织部位表达。根据不同的目的和需求选择合适功能的启动子。

保卫细胞结构为新月形，由1对保卫细胞包围形成了高等植物的气孔。保卫细胞能够灵敏而准确地响应一系列外源和内源的刺激，如光、干旱以及植物激素等，并通过复杂的信号转导网络改变其膨压使气孔处于最适宜的开闭状态，进而调节植物与环境间的水分和气体交换。保卫细胞是单细胞水平上研究高等植物细胞信号转导途径及其网络的模式体系和良好实验系统，因此，对于保卫细胞的标记就变得至关重要，进而提供一种在保卫细胞中特异性表达的启动子，将有利于研究其结构及功能，同时也为其他相关研究奠定基础。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种保卫细胞特异性启动子及用途。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种保卫细胞特异性启动子，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种表达盒，包含所述的启动子。

在所述的表达盒中，还包括编码序列，所述启动子可操纵连接的所述编码序列。

一种载体，包含所述的启动子或所述的表达盒。

一种细胞，包含所述的启动子、所述的表达盒或所述的载体。

在所述的细胞中，所述细胞为保卫细胞或农杆菌。

一种生物材料，包含所述的启动子、所述的表达盒、所述的载体或所述的细胞。

在所述的生物材料中，所述生物材料包括植物组织或器官；

优选的，所述植物组织或器官包括叶片或茎；

优选的，所述叶片包括子叶、轮座叶或新叶。

所述的启动子包括下述S1-S6中任一项所述的用途：

S1、在植物中启动目的基因表达中的用途；

S2、在植物的组织或器官中启动目的基因表达中的用途；

S3、在植物的保卫细胞中启动目的基因表达中的用途；

S4、在培育转基因植物中的用途；

S5、在研究保卫细胞结构和功能的用途；或

S6、在筛选保卫细胞中特异性基因的用途。

在所述的用途中，所述植物为拟南芥。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种保卫细胞特异性启动子，所述启动子具有极强的活性，且具有高特异性，仅在植物的保卫细胞中特异性表达，如幼苗植株的子叶和新叶中保卫细胞，成熟植物的轮座叶的保卫细胞、茎上叶片的保卫细胞、茎的保卫细胞上特异性表达。

2.本发明提供的保卫细胞特异性启动子将有利于研究保卫细胞的结构和功能，进一步有利于分析植物气孔，为培育耐、抗逆性如干旱、低温、病害的作物中具有重要的意义，具有重大的应用价值和市场前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2中的pORE R1质粒图谱；

图2是本发明实验例1中幼苗GUS染色结果；

图3是本发明实验例1中成熟植物GUS染色结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中所用的野生型拟南芥Col-0购买自美国拟南芥信息资源网https://www.arabidopsis.org/，后经内蒙古大学祁智实验室自行繁种；

大肠杆菌感受态DH5α：菌种购自北京全式金生物技术有限公司，后经内蒙古大学祁智实验室自行制备；

农杆菌感受态GV3101：菌种购自生物风http://www.biofeng.com，后经内蒙古大学祁智实验室自行制备；

表达载体pORE R1质粒由Dwayne D.Hegedus实验室构建并馈赠，后经内蒙古大学祁智实验室自行保存，其质粒图谱如图1所示；(原始文献：Catherine Coutu,JamesBrandle,Dan Brown,Kirk Brown,Brian Miki,John Simmonds,Dwayne D.Hegedus,pORE:amodular binary vector series suited for both monocot and dicot planttransformation(2007),Transgenic Res,16:771–781,DOI 10.1007/s11248-007-9066-2)。

所用的分子克隆相关试剂pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶均购于北京全式金生物技术有限公司；

试剂甘油、MES、蔗糖、卡那霉素、利福平、LB培养基成分、MQA培养基成分均购买于sigma aldrich公司。

表1 MQA CK培养基配方

液体LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，调节pH 7.0，(固体培养基补加至终浓度为15g/L的琼脂)，121℃灭菌20min。

GUS染色液包括如下组分：

0.1mol/L磷酸缓冲液(含0.2mol/L KH₂PO₄，和0.2mol/L K₂HPO₄，PH7.0)；

100mM X-Gluc(10mg X-Gluc固体溶于0.2ml N,N-二甲基甲酰胺)；

5mmol/L铁氰化钾(0.1647g铁氰化钾溶于100ml水中)；和

5mmol/L亚铁氰化钾(0.2112g亚铁氰化钾溶于100ml水中)。

配制GUS染色液的方法：首先吸取10μL 100mM X-Gluc，再将790μL 0.1mol/L磷酸缓冲液、100μL 5mmol/L铁氰化钾、100μL 5mmol/L亚铁氰化钾、1μL Triton-X 100依次加入，混匀备用。

实施例1保卫细胞特异性启动子的获得

1、野生型拟南芥DNA基因组提取

(1)将培养皿中生长12d的拟南芥幼苗(野生型拟南芥Col-0)放入2ml离心管中并加入一颗瓷珠；

(2)液氮速冻，于高通量组织研磨器中研磨成粉末；

(3)加入500μl的CTAB DNA提取液，迅速颠倒混匀；

(4)55℃恒温烘箱消化细胞30min，释放基因组DNA，期间每隔10min进行一次摇晃混匀；

(5)加入500μl氯仿：异戊醇(24:1)溶液，涡旋混匀；

(6)13000rpm，22℃，离心3min；

(7)吸取上清400μl于新的2ml离心管中，加入400μl预冷的异丙醇和40μl的7.5M的NH₄Ac，上下颠倒混匀，并置于-20℃冰箱中1h以上，以使基因组DNA充分析出；

(8)20000g，4℃，离心10min；

(9)弃上清并加入预冷的体积百分比70％乙醇，涡旋混匀，使融入基因组中的盐被充分洗出；

(10)20000g，4℃，离心5min；

(11)弃上清并将离心管倒置于灭菌的滤纸上，5min；

(12)正置放于恒温金属浴中，65℃，晾干5min；

(13)65℃金属浴预热的超纯水60μl溶解DNA，并补加终浓度10μg/ml RNaseA，涡旋混匀；

(14)继续置于65℃恒温金属浴中20min去除RNA；

(15)提取的DNA保存于-20℃冰箱备用。

2、PCR扩增

以步骤1获得的野生型拟南芥Col-0的DNA基因组为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara)，以如下引物扩增At5G04220基因的启动子片段如SEQ ID NO.1所示，PCR反应体系如表2，正向引物promoter-F如SEQ ID NO.2所示，反向引物promoter-R如SEQ IDNO.3所示；

按照下述表2配制PCR反应体系(50μL)：

表2 PCR反应体系

成分	体积(μL)
		正向引物promoter-F(10μM)	1.5μL
反向引物promoter-R(10μM)	1.5μL
		dNTPs(2.5mM)	4μL
10×buffer	20μL
		DNA模板	1μL
DNA聚合酶(2.5U/μL)	0.5μL
		纯水	7.8μL
总体积	50μL

PCR反应程序如下：

PCR结果：将上述PCR扩增产物进行凝胶电泳，然后进行胶回收；

3、克隆测序：

(1)连接：

将上述胶回收产物与克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector连接。连接反应体系如下：胶回收产物，4μL；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，1μL。然后于25℃反应10min(恒温金属浴操作)，得到连接产物。

(2)大肠杆菌感受态热击转化

将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，具体步骤如下：取5μl连接产物于冰上刚刚融化的50μl大肠杆菌感受态DH5α中，冰浴30min，随后于42℃热击90s，然后冰浴2min，于超净工作台中加入平衡至室温(25℃)的液体LB培养基300μl，取120μl涂布于含有Kan抗生素的LB平板上，吹干后倒置放于37℃恒温培养箱培养14h左右进行阳性菌落的筛选。

(3)菌落PCR：

挑取阳性单菌落进行菌落PCR验证，按照下述配制PCR反应体系如下(15μL)：正向引物promoter-F(10μM)，0.3μL；反向引物promoter-R(10μM)，0.3μL；2×EasyTaq PCRSuper Mix，7.5μL；纯水，6.8μL。

PCR反应程序如下：

(4)双酶切

将上述扩增的产物进行双酶切，按照下述配制体系：10×FastDigest GreenBuffer，1μL；扩增的产物质粒DNA，2μL；纯水，6.5μL；限制性内切酶NheI，0.25μL；限制性内切酶XhoI 0.25μL；酶切条件为37℃20min，按照上述体系进行双酶切验证，然后送至北京天一辉远公司进行测序，测序结果与SEQ ID NO.1所示的一致，保留测序结果正确的菌落。

实施例2保卫细胞特异性启动子重组载体的构建

1、含有pORE R1质粒的大肠杆菌

取5μL的pORE R1质粒于冰上刚刚融化的50μl大肠杆菌感受态DH5α中，冰浴30min，随后于42℃热击90s，然后冰浴2min，于超净工作台中加入平衡至室温(25℃)的液体LB培养基300μl，取120μl涂布于含有Kan抗生素的LB平板上，吹干后倒置放于37℃恒温培养箱培养14h左右进行阳性菌落的筛选，然后进行菌落PCR，双酶切验证，然后送至北京天一辉远公司进行测序，保留测序结果正确的菌落。

2、双酶切

将实施例1中测序正确的含有目的基因At5G04220启动子的大肠杆菌及含有pORER1(含gus)质粒的大肠杆菌同时摇菌后提取质粒(全式金质粒提取试剂盒)，同时使用NheI及XhoI限制性内切酶对上述提取的两种质粒进行双酶切，按照下述配制体系：10×FastDigest Green Buffer，1μL；扩增的产物质粒DNA，2μL；纯水，6.5μL；限制性内切酶NheI，0.25μL；限制性内切酶XhoI 0.25μL；酶切条件为37℃20min，按照上述体系进行双酶切，然后分别胶回收(全式金胶回收试剂盒)含有相同粘性末端的目的基因和载体片段。

3、连接

使用T4 DNA连接酶(全式金)连接目的基因与表达载体片段，后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有Kan抗生素的LB平板上于37℃恒温培养箱培养14h左右进行阳性菌落的筛选。挑取阳性单菌落进行菌落PCR验证(实验步骤同实施例1中的(3)菌落PCR)，同时摇菌后提取质粒进行双酶切验证(实验步骤同实施例1中的(4)双酶切)，得到含有目的基因At5G04220启动子的重组pORE R1质粒，即构建得到含有目的基因At5G04220启动子的GUS表达载体。

实施例3保卫细胞特异性启动子重组载体转化农杆菌

将实施例2中获得的并验证正确的含有目的基因At5G04220启动子的重组pORE R1质粒通过电转化的方法导入农杆菌GV3101中，具体操作如下：将2μL构建好的含有目的基因At5G04220启动子的重组pORE R1质粒及2μL溶解质粒的EB buffer(作为对照)分别加到50μl解冻的农杆菌GV3101感受态中；混匀后放于冰上静置30min，然后放于电转杯中，使用电转仪2500V，5ms进行电击转化，于超净工作台中加入平衡到室温的液体LB培养基500μl，28℃恒温摇床，200rpm，孵育1h；取120μL涂布在含有50μg/mL Rif+100μg/mL Kan的LB平板上，后放于28℃恒温培养箱培养36h左右，进行阳性菌落的筛选。挑取阳性单菌落进行菌落PCR验证(实验步骤同实施例1中的(3)菌落PCR)，同时摇菌后提取质粒进行双酶切验证(实验步骤同实施例1中的(4)双酶切)。

实施例4转基因植物拟南芥的构建

1、植物材料的培养

取野生型拟南芥Col-0的种子采用体积百分比75％酒精消毒10min后，均匀播种到灭菌MQA CK培养基上，4℃春化3天，然后放到光照培养室光照培养，光强75～100umol/m2·s，光周期为16h光照，8h黑暗，温度为22±1℃，培养14天后移植到土培盒中(营养土：蛭石＝1:1(体积比))，每盒5株植物，继续光照培养。

2、植物侵染

将实施例3中转化成功的农杆菌过夜培养，培养基为液体LB培养基(含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平)，培养条件为28℃，当菌液OD600为1.0时，10000rpm离心2min，弃去上清，加入悬浮液调节菌液OD600至0.8，所述悬浮液为含有0.5％(w/v)蔗糖和0.02％(体积比)Silwet L-77的水溶液，轻轻吹吸重悬菌体。用滴管将重悬的菌体滴在步骤1中培养的野生型拟南芥Col-0的花序上，连续4-6次，每次间隔时间5d-7d。

3、阳性苗的筛选

收获步骤2中完成侵染的野生型拟南芥Col-0的种子，标记为T1。将T1种子撒播在含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的MQA CK培养基上，选择能够在抗性皿上正常生长的植物，移苗至营养土中培养，单株收种，标记为T2。将T2种子撒播在含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的MQA CK培养基上，选择在抗性皿上正常生长植物与死亡植物数量比为3：1的T2植物，移苗至营养土中培养，单株收种，标记为T3。将T3种子撒播在含有卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的MQA CK培养基上，选择在抗性皿上全部植物均正常生长的T3植物，即单基因插入纯合株系，移苗至营养土中培养，待用，即得。

实验例1保卫细胞特异性启动子的活性和特异性

1、幼苗GUS染色

将实施例4中获得的T3代纯合种子播种在MQACK培养基上，光照14d后，用镊子将植物幼苗浸泡在GUS染色液中，37℃下黑暗处理过夜。用0.1mol/L磷酸缓冲液(含0.2mol/LKH₂PO₄，和0.2mol/L K₂HPO₄，PH7.0)清洗染色植物后，按照GUS染色后脱色方法对植物进行脱色，GUS染色后脱色方法为将植物采用FAA固定液(含乙醇：乙酸：甲醛＝10：3：7(体积比)的水溶液)固定1h，体积百分比50％酒精浸泡30min，体积百分比75％酒精浸泡30min，体积百分比100％酒精浸泡，直至完全脱色。样本保存在质量百分比20％甘油中。将脱色完成后的植物样本保存在质量百分比20％甘油中，制片，使用Nikon倒置荧光显微镜拍照。

2、成熟植物GUS染色

将实施例4中获得的T3代纯合种子播种在MQA CK培养基上，光照14d后，将拟南芥幼苗移栽至营养土中培养直至植株成熟。用镊子将成熟植物浸泡在GUS染色液中，其染色过程同步骤1的幼苗GUS染色。

3、染色结果

(1)观察幼苗GUS染色结果如图2中所示，可知，本发明的保卫细胞特异性启动子主要在子叶的保卫细胞、新叶的保卫细胞中启动gus基因表达，由此可得出，本发明的保卫细胞特异性启动子具有极强活性，且在植物叶片保卫细胞中特异性表达。

(2)观察成熟植物GUS染色结果如图3中所示，可发现，本发明的保卫细胞特异性启动子启动gus基因主要在轮座叶的保卫细胞、茎上叶片的保卫细胞、茎的保卫细胞上特异性表达，由此可得出，本发明的保卫细胞特异性启动子具有极强活性，且在植物轮座叶、茎上叶片、茎的保卫细胞中特异性表达。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 蒙树生态建设集团有限公司

<120> 一种保卫细胞特异性启动子及用途

<130> HA201904099

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1800

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttctcgtata atgtgttatg ttttcctttt aatttctttt tcaacatggc aacgcactgt 60

atctctcatc agaagtagaa gtctaaaatc gttgctgacg ttgccgcgca acaaagcaca 120

attgtctttg ctaggcactc cacactttgt taactgttaa aggttaacgg aaagccttaa 180

aatctaatca aacggggaat cataaaaggc taatctttgc aagacactca acaagttgtt 240

gttatcgaca gcaaaaaaga aacgataatg ttgagaaaaa agttgaaata aataaagaag 300

gatgttgaaa tttgaaagta gtacactaaa gattttgaac aaaacaaaag taataataat 360

tgaatgacca gaaaagtata attgcataat tcataattca ggatatatat tgttgttggg 420

agacaagtag cctagtggcg gctctttctc tcttacacca ctcaacatgc ggtggattaa 480

catctctcaa attagactta tgttgaaaaa agcgatagcc gatagcgttc cttagatatt 540

cattaacatg ttgacaaaat ttagatgttc gatcgataat ctaaaagatt acacgattgg 600

cgtatatatg tggaatgaaa atgacatgtg aatcagttca agggaaacat aatttattga 660

aatttataac gactgagatg tcaaaacgtc gtctttctcg tgatagattt tgattatcaa 720

taaaataatt attgggttta gactttgggt tatattcccc gtttttgcct cttattcttc 780

gccacggata gactttgggt tttccgcatt tttttctcaa atctacgttt ggtttgtcca 840

aatgtgtact tcacggagaa taaaatttag gataaataga atatttgtca ttgtccgata 900

atcaatgcat gcagatatta acacacgtca cacgctattt gattgaaagt attgaaagca 960

gcggctttcg ggtcggagtt tggttcacat ttgggatgtt ggtccaacat tgattatctt 1020

aaaaaaaagt aaagaattaa aatatcaaaa aactaaacac aaatattttt aatggcaaca 1080

gaaaattcac caaaatcctt cagttaaaaa aaaaagaact aaacacaccc aaaaaacgga 1140

aaaatatttg gtattttctt taagtaggat aataataaaa gtattaaaac gcgtatacta 1200

taataacagt acacagattt tctcacatta gtacattact ataagaagtt tcgatacaat 1260

ttaattttaa caaatctgtt atactataaa atttgactat atcaaaaact aaaaaggtaa 1320

tattataact cacccaatca atttcgtgta tttatttgtt agttccaata gtagtccaac 1380

aatttgtagt tgggaccata aaagtaatta attatcgtga tcttctttta tttccaagaa 1440

agctaaaaaa tccaagctga ttattaggcc aacaaacaaa atcacaagca atccacacaa 1500

gaaaataaaa agatagataa aaaccatttt cacgtcggct tcggaaatct cgtgattttt 1560

ttttgtttct cttatgcaaa aaaaaaaaag agtaaccaat cggaaaaaac cttttagtca 1620

catagaaaaa gattttggcg gttggaaaca gaagggctct ctcttcttcg ttaccgtttt 1680

ggacccgatt ccttctcctt cgtgtttcct tattactgac tctgactcgt tctttctttt 1740

attaattctc ttgctttttt tttctttaaa gattttcatc gggaaaaaca aaacaaaaac 1800

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成（promoter-F）

<400> 2

ttgctagctt ctcgtataat gtgttatgtt ttccttttaa 40

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成（promoter-R）

<400> 3

ggctcgaggt ttttgttttg tttttcccga tgaaaatc 38

Claims

1.一种保卫细胞特异性启动子，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，还包括编码序列，所述启动子可操纵连接的所述编码序列。

4.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子或权利要求2或3所述的表达盒。

5.一种细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子、权利要求2或3所述的表达盒或权利要求4所述的载体。

6.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞为保卫细胞或农杆菌。

7.一种生物材料，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子、权利要求2或3所述的表达盒、权利要求4所述的载体或权利要求5或6所述的细胞。

8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括植物组织或器官；优选的，所述植物组织或器官包括叶片或茎；优选的，所述叶片包括子叶、轮座叶或新叶。

9.权利要求1所述的启动子包括下述S1-S6中任一项所述的用途：

S1、在植物中启动目的基因表达中的用途；

S2、在植物的组织或器官中启动目的基因表达中的用途；

S3、在植物的保卫细胞中启动目的基因表达中的用途；

S4、在培育转基因植物中的用途；

S5、在研究保卫细胞结构和功能的用途；或

S6、在筛选保卫细胞中特异性基因的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述植物为拟南芥。