CN116574728A - 一种马铃薯组织特异性增强子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯组织特异性增强子及其应用；所述的增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的所提供的增强子，在作物精准分子设计育种中具有广阔应用前景。该组织特异性增强子可以通过与微小启动子或组成型启动子共同作用，在马铃薯的特定组织中增强目标基因的表达，同时在其他部位不会增强这个基因，不消耗植物多余的能量。采用增强子调控基因表达的模式能够避免组成型顺式调控元件非特异性启动基因表达，产生大量蛋白质或代谢产物对植物生长状况的影响。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种马铃薯组织特异性增强子及其应用。
背景技术
基因工程研究的关键是外源基因在细胞中的表达，组成型启动子较早应用于基因工程，在植物抗病工程中发挥了重要的作用，但因时空特异性差，在所有组织中都启动基因表达，一些负面效应渐渐显现，如基因沉默、植物能耗增加、生物量减少、出现疾病症状等。
增强子是DNA上一小段可与特定的转录因子结合的区域，一般情况下，增强子无法单独行使功能，往往需要与启动子共同作用去增强靶基因的表达。组织特异性增强子通过与微小启动子或组成型启动子共同作用，可增强目的基因在一定器官或组织部位特异性表达，促使目标产物在特定组织器官中累积，同时在非特定组织中低表达甚至不表达，从而避免植株营养的不必要浪费。因此，筛选和鉴定组织特异性增强子是本领域木技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种组织特异性增强子及其应用，为在基因工程中诱导植物组织特异表达关键基因提供功能元件。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种马铃薯组织特异性增强子，该增强子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该增强子全长367bp。
本发明提供的马铃薯组织特异性的增强子，能够用更为有效的调控元件代替组成型启动子增强目的基因的表达。在生产中，可以进行更加精准的分子育种，例如增加区域表达量，避免植物营养的不必要浪费。同时组织特异性增强子在植物器官发育、营养物质运输和贮藏、能量固定、抵抗生物和非生物胁迫以及植物与微生物互作方面也具有重要作用。利用组织特异性增强子与启动子结合的方式代替常规基因工程中的组成型启动子，可以使植物在其他部位低表达或不表达外源基因，不消耗植物多余的能量。
本发明采用如下方法得到所述增强子：通过分析马铃薯纯合二倍体材料DM 1-3516 R44(DM 1-3，Solanum tuberosum Phureja Group,2n＝2x＝24)的常温下块茎以及4℃处理14天后块茎的RNA-seq数据，发现冷处理后Invertase(StINV1，PGSC0003DMG400004790)基因表达上调了130倍，同时利用DNaseⅠ超敏感位点测序(DNase Ihypersensitive sites，DNase-seq)对此基因的开放染色质进行分析，发现此基因下游1kb以内存在一段低温特异的DNaseⅠ超敏感位点(DNase I hypersensitive sites，DHS)(chr08:52706554-52706828)。该增强子为所述低温诱导增强子。
一种用于扩增上述马铃薯组织特异性增强子的引物组，该引物组包括引物对1和引物对2，所述引物对1的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述引物对2的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
含有上述马铃薯组织特异性增强子的生物材料也属于本发明的保护范围，该生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
上述的马铃薯组织特异性增强子，或上述的生物材料在以下(1)或(2)中的应用：
(1)提高目的基因在植物不同组织中特异性表达；
(2)植物育种。
一种增强目标基因在植物不同组织中表达的方法，包括采用基因工程手段，在植物中利用上述的增强子或上述的生物材料实现目标基因在不同组织中的特异性表达。
上述的方法，其所述表达的方式为以下(1)或(2)中的一种或两种的组合：
(1)在植物中导入上述的增强子；
(2)在植物中导入上述的生物材料。
上述的方法，将上述的增强子和载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得包含重组载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，采用农杆菌介导转化目标植物，筛选转基因阳性植株。
上述的方法获得的转基因植物在植物育种或基因表达调控研究中的应用。
上述的植物为烟草、拟南芥或马铃薯，但不限于此。
本发明提供上述的马铃薯组织特异性增强子增强目标基因在特定组织中的表达，及其在植物育种中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明的所提供的增强子，可以与微小启动子或组成型启动子共同作用，在马铃薯不同组织特异启动一些目的基因，如可能参与调控提高植物花药中目的基因的表达，同时在其他组织不会增强这些目的基因的表达，避免了异源蛋白在非预期组织中大量积累对植物生长状况产生影响，且能够精确的控制目的基因按照人们所期望的定位表达，不消耗植物多余的能量。
附图说明
图1为实验方法流程图。
图2为常温和4℃处理后的块茎RNA-seq数据中Invertase基因表达量差异图；其中，RT表示常温，cold表示冷处理。
图3为常温和冷诱导的马铃薯块茎的DNase-seq数据，Invertase基因区在常温与寒冷情况下染色质开放程度视化图。
图4为用于顺式调控元件功能验证的GUS载体图谱。
图5为GUS增强子功能验证载体构建示意图。
图6为马铃薯各个组织中GUS信号的分布。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1筛选马铃薯组织特异性增强子
如图1所示，通过分析马铃薯纯合二倍体材料DM 1-3 516 R44(DM 1-3，Solanumtuberosum Phureja Group,2n＝2x＝24)的常温下块茎以及4℃处理14天后块茎的RNA-seq数据，发现冷处理后Invertase(StINV1，PGSC0003DMG400004790)基因表达上调了130倍，同时利用DNaseⅠ超敏感位点测序(DNase I hypersensitive sites，DNase-seq)对此基因的开放染色质进行分析，发现此基因下游1kb以内存在一段低温特异的DNaseⅠ超敏感位点(DNase I hypersensitive sites，DHS)(chr08:52706554-52706828)，如图2和3所示。
所筛选的马铃薯组织特异性增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：构建GUS功能验证载体。
以马铃薯基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标片段整合到如图4所示的含有GUS报告基因的增强子功能验证载体中，根据图5所示构建启动子验证载体(DHS::GUS)进行功能验证。
(1)目标片段获取
以四川师范大学生命科学学院植物表观基因组与生物信息学实验室种植的的马铃薯纯合二倍体材料DM 1-3 516 R44(DM 1-3，Solanum tuberosum Phureja Group,2n＝2x＝24)DNA为模板扩增目标片段，需要进行两轮PCR，第一轮从基因组中获取目标片段(引物扩增范围可比目标片段大，正向引物如SEQ ID NO.2所示，反向引物如SEQ ID NO.3所示)，第一轮PCR反应程序如下：95℃5min、95℃30s、55℃45s、72℃30s、72℃10min、12℃∞，循环数为38；第二轮使用第一轮的PCR产物纯化后产物作为模板，使用的引物为目标片段两端序列加上载体同源序列的接头(正向引物如SEQ ID NO.4所示，反向引物如SEQ ID NO.5所示)，第二轮PCR反应程序如下：95℃5min、95℃30s、55℃45s、72℃30s、72℃10min、12℃∞，循环数为38；PCR反应体系如下：10×Buffer 2μL、MgCl2 1.6μL、dNTP 1.6μL、Ex Taq酶0.1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、模板1μL、ddH2O补齐至20μL。PCR扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若符合目标大小则切下目的片段胶块，按照琼脂糖凝胶试剂盒步骤回收目标片段，置于-20℃保存备用。
(2)线性载体的制备
根据如图4所示的GUS报告基因增强子功能验证载体上带有的XbaI、SpeI酶切位点并使用对应核酸内切酶进行切割，获得线性载体，具体反应体系如下：10×Buffer 2μL、核酸内切酶XbaI 1μL、核酸内切酶SpeI 1μL、质粒1μg、ddH2O补齐至20μL。反应温度为37℃，酶切时间为16h；酶切完成后65℃水浴20min终止反应，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性载体，置于-20℃保存备用。
(3)载体连接
将获得的目标片段与线性载体按照一定比例混合，用2x Basic Mix进行同源重组反应(50℃，15min)，室温过夜，连接反应体系如下：2x Basic Mix 2.5μL、线性载体2.2μL、目标片段0.3μL、ddH2O补齐至5μL，轻轻混匀，50℃反应15分钟，反应结束后，置于冰上冷却数秒，之后可将重组产物保存于-20℃备用或直接用于转化。
(4)大肠杆菌转化及菌落PCR验证
将储存于-80℃的大肠杆菌感受态细胞取出，置于冰上融化，每管分装25μL感受态细胞，加入1-2μL按照(3)获得的重组产物，混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入250μL纯LB培养基，37℃，200rpm，震荡培养1h，吸取菌液(10-100μL)涂布在含有大观霉素的LB培养基上，37℃，过夜培养。挑取单菌落，进行菌落PCR验证，其反应体系如下：2×PCR mix5μL、正向引物(如SEQ ID NO.6所示)0.5μL、反向引物(如SEQ ID NO.7所示)0.5μL、模板不计体积、ddH2O补齐至10μL，PCR反应程序按照目标片段获取的反应程序设定，扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳观察结果；将菌落PCR验证正确的菌落挑至含有大观霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养，扩繁菌体后送去公司进行测序进一步验证；测序验证正确的菌液按照美国OMEGA生物试剂公司质粒提取试剂盒步骤提取质粒，质粒可保存于-20℃备用或直接用于转化；
本实施例中，通过转化大肠杆菌可以从GUS增强子功能验证载体pKGWSF7.03的连接体系中筛选构建成功的增强子验证载体，由于构建成功的载体才具有的抵抗大观霉素的能力，因此可以通过添加了大观霉素培养基来筛选构建成功的载体，然后对能够在抗性培养基上生长的大肠杆菌菌落进行PCR检测目标片段是否在该菌落中，排除菌落的假阳性。之后比对公司返回的测序结果确定构建的载体无误，提取质粒并保存以备使用。
GUS增强子验证载体pKGWSF7.03来源于Bo Zhu等人2015年(The Plant Cell,2015,27(9):2415-26.Genome-Wide Prediction and Validation of IntergenicEnhancers in Arabidopsis Using Open Chromatin Signatures)已发表的文献。
(5)农杆菌转化
将储存于-80℃的农杆菌感受态细胞取出，置于冰上融化，每管分装25μL感受态细胞，加入1-2μL由步骤(4)构建的质粒，混匀，冰浴5分钟，置于液氮中处理5分钟，28℃水浴5分钟，冰浴5分钟，加入700μL纯LB液体培养基，于控温摇床中28℃，200rpm震荡培养2-3h，6000rpm、1min收集菌液，吸取10-100μL菌液涂布在含有相应抗生素的LB培养基上，28℃培养2d，挑取单菌落进行菌落PCR验证(反应体系和程序同大肠杆菌PCR验证一致)。将菌落PCR验证正确的菌落至含有相应抗生素的的液体LB培养基中，28℃、200rpm过夜培养。菌液与甘油1：1体积比混合置于-80℃保存备用。
实施例3：
将构建好的GUS载体通过农杆菌介导马铃薯稳定转化导入马铃薯基因组，筛选转基因阳性，通过GUS染色，证明本发明提供的增强子具有组织特异性。
(1)农杆菌介导的马铃薯遗传转化
a、吸取含有重组质粒(GUS功能验证载体)的农杆菌GV3101菌液于含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜，使菌活化；向50mL离心管中加入适量的培养物，8000rpm离心6min，去除上清液，加入液体MS培养基重新悬浮使OD600为0.6-0.8，终体积为20-40mL。
b、以马铃薯纯合二倍体试管苗的茎段(不含腋芽)以及叶片(切除叶柄，垂直于主叶脉每隔3mm进行切割，形成切口)作为外植体，将外植体置于农杆菌菌液中侵染5-10min。
c、侵染完成后，倒掉菌液，将外植体置于滤纸上除去多余的农杆菌菌液，转移外植体(叶片正面朝下放置)至共培养的培养基中，将平板放置于光照培养箱中培养，以4层纱布覆盖营造低光照环境。
d、共培养3天后，用无菌水清洗外植体，重复三次，置于无菌滤纸上风干后，将外植体转移至愈伤组织诱导培养基上培养(每板最多放置20个茎段)，诱导愈伤组织形成。
e、在愈伤组织诱导培养基上培养12天后，将外植体转移至再生小苗分化培养基上，诱导分化再生小苗，每隔14天更换一次培养基。
f、当芽长至约1.5-2厘米时，将其切下，转移到带有相应筛选抗性的马铃薯繁殖培养基中诱导生根。
g、提取马铃薯再生小苗DNA，进行PCR验证，筛选并扩繁转基因阳性植株用于后续实验。
马铃薯遗传转化实验方法参照Ducreux等人2005年(Plant Cell Reports,2005,24(1):10-14.Agrobacterium-mediated transformation of Solanum phureja)已发表的实验方法。
(2)组织取材以及GUS染色
a、将筛选的转基因阳性马铃薯试管苗移栽到土壤中培养，开花期分别取其叶片、茎段、根、花并避光浸泡于GUS染色缓冲液中，37℃避光培养过夜；
b、将筛选的转基因阳性马铃薯植株移栽到土壤中培养，待块茎收获后，放置于阴凉处晾干块茎表面水分，将块茎切片避光浸泡于GUS染色缓冲液中，37℃避光培养过夜；
c、去除缓冲液，加入80％酒精脱色，不定期更换酒精，直至脱色完全；完全脱色后观察GUS信号强弱以及组织分布。
GUS染色缓冲液：100mM(pH7.0)磷酸钠缓冲液；1mM K4Fe(CN)6(亚铁氰化钾)；0.1g/100ml N-laurylsarcosine(十二烷基肌氨酸纳)；10mM Na2EDTA；1mM K3Fe(CN)6(铁氰化钾)；0.5mg/mL X-Gluc；0.1％(体积百分比)Triton X-100。
GUS信号强弱说明导入的序列的基因表达量的多少，间接说明增强子的活性高低，即信号强说明增强子活性高，信号弱说明增强子活性弱，因此通过组织分布观察可以知道该序列的表达是否有组织特异性。
根据图6所示，在马铃薯植株中，GUS信号主要分布在花药中，这表明本发明所述的增强子确实为具有组织特异性的增强子，说明目标序列是一个具有组织特异性增强子这一实验结果真实可信。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO.1(马铃薯组织特异性增强子)
AATTCAAGCAAAGGACGTTAAAATCTCTTTTTAAATTGTGTTAAAAGAATATACAAAATTAAAATACACTTGCAATAGTTATTGTTTAACATTAATACATTACATAATTTTTTAGCGAAGAATGTGCATTAAACCACGTCCCTTCACCTAATCATGGGGTGGAGGAGTTAAACATAAATTAGTGTTTTTCTTGAGGATGAAACTGTTTGTTTGAAGCATGTTCCCACAAGTTCATTGACTTTGACTATTATCTTCTGCATGCCCTCACATGCACAAATCACTATTGGATTGTTAAGCTAATAATATAAGTTATTAGTGTAATTTCATCTACTATAGTTAGTGGTATACGTATGACTTTTCATAAGTG
SEQ ID NO.2(正向引物1，第一轮PCR反应的正向引物)
GAGTCAGAAATTCAAGCAAAGGAC
SEQ ID NO.3(反向引物1，第一轮PCR反应的反向引物)
CACTTATGAAAAGTCATACGTATACCAC
SEQ ID NO.4(正向引物2，第二轮PCR反应的反向引物)
CCGGGGATCCTCTAGAAATTCAAGCAAAGGACGTTAAAATCT
SEQ ID NO.5(反向引物2，第二轮PCR反应的反向引物序列)
TATTGGCGGGACTAGTCACTTATGAAAAGTCATACGTATACCAC
SEQ ID NO.6(大肠杆菌和农杆菌菌落PCR正向引物)
CTTAGCTCATTAAACTCCAGAAACC
SEQ ID NO.7(大肠杆菌和农杆菌菌落PCR反向引物)
CTGAACTTGTGGCCGTTTAC。
Claims (9)
1.一种马铃薯组织特异性增强子，该增强子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种用于扩增权利要求1所述马铃薯组织特异性增强子的引物组，其特征在于，该引物组包括引物对1和引物对2，所述引物对1的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述引物对2的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
3.含有权利要求1所述马铃薯组织特异性增强子的生物材料，该生物材料为表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
4.权利要求1中所述的马铃薯组织特异性增强子，或权利要求3中所述的生物材料在以下(1)或(2)中的应用：
(1)提高目的基因在植物不同组织中特异性表达；
(2)植物育种。
5.一种增强目标基因在植物不同组织中表达的方法，其特征在于，包括采用基因工程手段，在植物中利用权利要求1所述的增强子或权利要求3所述的生物材料实现目标基因在不同组织中的特异性表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表达的方式为以下(1)或(2)中的一种或两种的组合：
(1)在植物中导入权利要求1所述的增强子；
(2)在植物中导入权利要求3所述的生物材料。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的增强子与载体连接后，转化大肠杆菌，筛选获得包含重组载体的大肠杆菌，并提取大肠杆菌的质粒，转化农杆菌，采用农杆菌介导转化目标植物，筛选转基因阳性植株。
8.权利要求5～7中任一所述的方法获得的转基因植物在植物育种或基因表达调控研究中的应用。
9.权利要求4中所述的应用，权利要求5～7任意一种中所述的方法，权利要求8中所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草、拟南芥或马铃薯。
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