CN117986333A - 一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1及编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1及编码基因与应用，通过转录组测序在白屈菜的转录组数据库中筛选鉴定到一个隐花色素基因CmCry，其与白屈菜的抗旱性相关，然后通过基因的克隆、构建重组表达载体，并利用农杆菌转化法将含有CmCry基因的重组表达载体导入到烟草植株中，得到转基因烟草植株；在经过干旱胁迫后，转基因烟草植物表现出较强的额抗旱性，表明本发明鉴定得到的CmCry基因是一种与植物抗旱性相关的基因，能够提高植物的抗旱性，CmCry基因可以作为一种抗旱基因资源用于提高植物抗旱性的分子育种中。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1及编码基因与应用。
背景技术
近年来，由于气候变化导致的温度升高和水资源匮乏已经成为一个亟待解决的全球性难题，近10年来由于干旱造成的农作物减产损失总计已经达到约300亿美加剧了干旱对农业生产的影响。干旱会严重限制植物的正常生长发育，植物体自身也已经进化出在干旱条件下防止水分流失、平衡对重要器官的最佳供水、维持细胞水分含量以及在干旱期间保持生存的策略，植物的这种能力被称为抗旱性。作物在干旱条件下维持生长的遗传性状来源于野生亲缘种的自然遗传变异或通过生物工程，传统育种一直是利用自然等位基因适应特征的遗传多样性改良植物的主要策略，但是其存在育种周期长，育种方向不确定等缺点。随着技术的发展，目前通过基因工程来引入新的外源基因、改变内源基因的表达水平、基因编辑工具和GWAS等，对挖掘可提高植物抗寒性和产量的等位基因以及应用方面发挥了巨大作用。
CN1293095C公开了一种植物抗旱相关蛋白及其编码基因与应用，其通过对拟南芥突变体的研究，发现了一种与植物抗旱先关蛋白——LEW2-1，并利用植物基因敲除技术将该基因敲除(或沉默)后，植物表现为抗旱；将该基因转入植物后，植物表现出旱敏感。CN109337917B公开了Nfdirp抗旱基因、其编码的氨基酸序列及其在提高植物抗旱性中的用途，其通过对发状念珠藻基因组的研究筛选到了Nfdirp抗旱基因，然后将Nfdirp抗旱基因构建表达载体，并转入到原核细菌细胞、植物细胞中，是的大肠杆菌和水稻在干旱条件下的抗旱能力增强。CN106566836B公开了一种编码甘薯肉桂酸羟化酶的IbC4H基因及其应用，其从甘薯中分离出编码肉桂酸羟化酶基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，然后通过农杆菌浸染法转化植物，得到转基因植物，发现转基因植物的多酚含量得到提高，耐旱能力得到增强。
新疆昌吉州为典型的大陆性干旱气候，在阜康县天山抽水蓄能水电站建设过程中对涂层破坏较大，同时由于土壤干旱缺水，扰动土层中生长的植物很少；而在当地调查中发现，由少量的白屈菜能够成片生长，表现出极强的抗旱性，因此推测白屈菜中有能够提高植物抗寒性相关的蛋白或基因。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1及编码基因与应用，通过转录组测序技术鉴定到了一种与白屈菜抗旱性相关的蛋白及编码基因CmCry1基因，将该基因转入到烟草植株中发现可以提高烟草的抗旱性，表明CmCry能够提高植物耐旱性，可以作为一种抗旱基因资源用于植物的抗旱育种。
为了实现上述目的，本发明提供一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1，所述蛋白CmCry1为白屈菜隐花色素蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明还提供一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1的编码基因，所述编码基因为CmCry1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明还提供一种扩增CmCry1基因的特异性引物对，所述特异性引物对的上游引物为CmCry-F1，序列为SEQ ID NO:3；下游引物为CmCry-R1，序列为SEQ ID NO:4。
本发明还提供一种含有CmCry1基因的重组表达载体PVX-LIC-CmCry。
优选的，所述重组表达载体是通过在载体PVX-LIC的LIC1和LIC2位点间插入目的基因，获得含有CmCry1基因的重组表达载体PVX-LIC-CmCry。
本发明还提供一种含有重组表达载体的农杆菌宿主细胞GV3101/PVX-LIC-CmCry。
本发明还提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，将CmCry1基因转入到植物中，得到抗旱性提高的转基因植物。
优选的，所述CmCry1基因是通过重组表达载体GV3101/PVX-LIC-CmCry导入到植物中的。
优选的，所述植物为PVX能够侵染的植物。
进一步优选的，所述植物为烟草。
本发明的有益效果在于：
1、在大陆性干旱气候区的新疆昌吉州阜康县调查中发现有少量白屈菜能够在干旱缺水的土壤中成片生长，表现出极强的抗旱性，然后通过构建白屈菜转录组数据库，并经过测序鉴定出了一个隐花色素基因CmCry能够响应干旱胁迫，表明CmCry基因与白屈菜的抗旱性相关。
2、克隆CmCry基因，并将该基因插入到载体PVX-LIC的LIC1和LIC2位点间，构建得到了重组表达载体，可以对CmCry基因进行超量表达，然后将重组表达载体转入到根癌农杆菌GV3101中，获得含有重组表达载体的农杆菌宿主细胞GV3101/PVX-LIC-CmCry。
3、将含有重组表达载体的农杆菌宿主细胞GV3101/PVX-LIC-CmCry通过农杆菌注射法注射到烟草叶片中，得到了瞬时表达的转基因烟草，并通过干旱胁迫实验验证了成功转染了GV3101/PVX-LIC-CmCry的转基因烟草在干旱胁迫后不发生严重萎蔫，表现出良好的抗旱性，表明CmCry基因能够显著提高烟草抗旱性，该基因能够用于植物或作物的抗旱分子育种。
附图说明
图1为实施例1中CmCry基因在干旱和对照条件下的相对表达量。
图2为实施例2中CmCry基因的凝胶电泳图，图中M为D2000 Plus Marker，从上至下的条带大小依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。
图3为实施例3中重组载体PVX-LIC-CmCry的菌落PCR凝胶电泳图，图中M为D2000Plus Marker，1-7为单克隆编号。
图4为实施例6转基因烟草植株的CmCry基因和Tublin基因的RT-PCR产物的凝胶电泳图，图中M为D2000 Plus Marker。
图5为实施例7中干旱胁迫后烟草植物的萎蔫程度图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步解释说明，值得注意的是，下述实施例仅为本发明的优选实施例，而不应理解为对本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的内容为准。本领域技术人员在没有做出创造性劳动而对本发明的技术方案做出的修改、替换均落入到本发明的保护范围之内。
下述实施例中，测序工作由武汉贝纳生物科技有限公司完成。
试剂盒：
MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit购买于赛默飞世尔科技公司；
PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit、2×Es Taq Master Mix购买于TAKARA。
实施例1白屈菜中与抗旱相关的蛋白或基因的筛选
(1)收集位于新疆昌吉州阜康县天山抽水蓄能水电站扰动土层(东经87.98°，北纬44.16°)的野生白屈菜种子，在温室中播种于由蛭石和营养土按照质量比为3：1混合的培养基质中，正常管理至白屈菜长至3叶期；
(2)将3叶期的白屈菜分为两组，一组进行断水干旱处理(实验组)，另一组正常水分管理(对照组)，分别处理7d；
(3)7d后分别进行取样，即将白屈菜叶片剪下并用液氮速冻，然后通过PacBio三代测序结合HiSeq二代测序技术获取白屈菜的de novo参考转录组基因序列；
(4)利用表达定量得到转录组基因序列在各个样品中的表达量reads count数据，并采用DESeq2(版本：1.26.0)进行差异表达分析，筛选阈值为padj<0.05且|log2FoldChange|>1的基因。
经差异表达分析，发现CmCry基因在干旱处理叶片和对照叶片中的表达量比值达到8.3(图1)，因而选择其作为干旱胁迫响应的候选基因；其中CmCry的氨基酸序列为SEQ IDNO：1，核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
实施例2白屈菜蛋白CmCry基因的克隆
(1)将CmCry基因的序列进行分析，设计特异性扩增引物CmCry-F1和CmCry-R1，序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
(2)取生长于温室的白屈菜根、茎、叶、花为材料，用MagMAX mirVana Total RNAIsolation Kit提取总RNA，用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)反转录获得cDNA；
(3)以步骤(2)得到的cDNA为模板，步骤(1)设计的引物扩增，用2×Es Taq MasterMix扩增CmCry基因，其中扩增体系见表1，扩增程序见表2；
表1PCR扩增体系
表2PCR扩增程序
(4)将PCR反应得到的扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见根、茎、叶、花、都可以扩增出清晰明亮的2040bp目的条带(图2)。对叶片中扩增得到的PCR产物进行回收纯化，得到纯化的CmCry基因。
实施例3构建CmCry基因的重组表达载体
(1)将含有ccdB和氯霉素耐药基因的LIC盒通过替换原多克隆位点插入PVX T-DNA载体中生成PVX-LIC，然后转入大肠杆菌DB3.1感受态细胞中进行扩增和保存；
(2)提取PVX-LIC质粒，然后用SmaI限制性内切酶进行酶切，然后将酶切产物与dTTP(0.5mM)和DTT(1mM)混合，在37℃下用T4 DNA聚合酶处理30min，产生14nt的粘性5’端，然后将体系置于75℃下20min，使T4 DNA聚合酶失活，最后用苯酚提取和乙醇沉淀纯化得到具有粘性5’端的PVX-LIC载体；
(3)将实施例2得到的纯化的CmCry基因与dATP(0.5mM)和DTT(1mM)混合，在37℃下用T4 DNA聚合酶处理30min，产生14nt的粘性5’端，然后将体系置于75℃下20min，使T4 DNA聚合酶失活，最后用乙醇沉淀纯化，得到CmCry基因；
(4)将步骤(2)得到的具有粘性5’端的PVX-LIC载体与步骤(3)得到的CmCry基因等体积混合，再加入T4 DNA聚合酶，混匀后置于37℃下孵育30min，然后全部转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；
经菌落PCR检测结果证实，该重组载体PVX-LIC-CmCry为在载体PVX-LIC的LIC1和LIC2位点间插入了序列表序列2所示2040bp的DNA片段(图3)，表明成功构建了重组载体PVX-LIC-CmCry。
实施例4重组根癌农杆菌的构建
(1)取50μL根癌农杆菌GV3101感受态细胞，冰上解冻，然后加入1.0μL实施例3制备得到的重组载体PVX-LIC-CmCry，轻柔混合后冰浴5min，然后迅速置于液氮中冷冻5min，再取出后再37℃下水浴5min；
(2)在水浴处理的感受态细胞中加入1mLTEB液体培养基，28℃下轻摇孵育3h；
(3)将孵育后的菌液在5000rpm/min下离心，倒去大部分上清液，剩余50μL并重悬菌体；
(4)将重悬菌体涂布在含有50μg/mL利福霉素、50μg/mL链霉素和50μg/mL卡拉霉素的YEB平板培养基上，28℃培养至平板上长出单菌落；
(5)挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，其中能扩增得到CmCry基因的菌落即为含有重组载体PVX-LIC-CmCry的根癌农杆菌，将其命名为GV3101/PVX-LIC-CmCry；
(6)利用步骤(1)-(5)所述的方法将空载体PVX-LIC转化至根癌农杆菌GV3101终，获得含有空载体PVX-LIC的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/PVX-LIC。
实施例5转基因烟草的获得
(1)将烟草种子波终于培养基质(草炭：蛭石：珍珠岩为1:3:0.5体积比混合)中，在人工温室中培养至烟草生长到4-5叶；
(2)28℃下培养GV3101/PVX-LIC-CmCry(实验组)和GV3101/PVX-LIC(空载对照组)，分别获得菌液；
(3)用一次性注射器分别吸取1mL菌液，将注射器针头去掉，用手指抵住烟草叶片下部，轻轻用力将注射器内菌液压送并渗透到叶片组织中，每棵烟草注射2片叶子，分别注射5株植物；
(4)将注射后的烟草植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中，25℃，16h光照/8h黑暗的光周期下培养；同时以未注射农杆菌的烟草作为野生型对照，相同生长条件培养，分别得到注射GV3101/PVX-LIC-CmCry的实验组、注射GV3101/PVX-LIC的空载对照组以及野生型对照组。
实施例6转基因烟草的分子检测
(1)取实施例5中得到的实验组、空载对照组以及野生型对照组的烟草植株叶片，分别提取总RNA，反转录获得cDNA；
(2)分析CmCry基因的序列，并设计RT-PCR引物，其中上游引物为CmCry-F2，序列为SEQ ID NO:5，下游引物为CmCry-R2，序列为SEQ ID NO:6；以白屈菜Tublin为内参，设计RT-PCR引物，其中上游引物为Tub-F，序列为SEQ ID NO:7，下游引物为Tub-R，序列为SEQ IDNO:8；
(3)以步骤(1)得到的cDNA作为模板，以步骤(2)中的两对引物分别作为内参和引物，用2×Es Taq Master Mix(TAKARA)进行RT-PCR扩增，扩增体系同表1，扩增程序为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，30个循环；延伸72℃5min。
结果如图4所示，空载对照组和野生型对照组中的植株不表达目的基因CmCry，而实验组中的植株表达目的基因CmCry，表明通过农杆菌注射法获得了CmCry瞬时表达的转基因烟草株系。
实施例7转基因烟草的抗旱表型
取实施例5中得到的实验组、空载对照组以及野生型对照组的烟草植株，在注射农杆菌7d后，采用完全不浇水的方式进行干旱胁迫处理。
干旱胁迫15d后土壤的含水量降低至7.16％，此时空载对照组以及野生型对照组中的烟草植株严重萎蔫，而实验组中的烟草植株仍有数片叶片保持伸展状态，呈现轻度萎蔫状态(图5)，表明注射PVX-LIC-CmCry基因的实验组烟草抗旱性良好，说明CmCry基因能够显著提高烟草抗旱性，可以用于植物或作物抗旱育种。
Claims (10)
1.一种增强植物抗旱性的蛋白CmCry1，其特征在于：所述蛋白CmCry1为白屈菜隐花色素蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种如权利要求1所述的增强植物抗旱性的蛋白CmCry1的编码基因，其特征在于：所述编码基因为CmCry1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种扩增权利要求2所述CmCry1基因的特异性引物对，其特征在于：所述特异性引物对的上游引物为CmCry-F1，序列为SEQ ID NO:3；下游引物为CmCry-R1，序列为SEQ ID NO:4。
4.一种含有权利要求2所述CmCry1基因的重组表达载体PVX-LIC-CmCry。
5.根据权利要求4所述的一种含有CmCry1基因的重组表达载体PVX-LIC-CmCry，其特征在于：所述重组表达载体是通过在载体PVX-LIC的LIC1和LIC2位点间插入目的基因，获得含有CmCry1基因的重组表达载体PVX-LIC-CmCry。
6.一种含有权利要求4所述的重组表达载体的农杆菌宿主细胞GV3101/PVX-LIC-CmCry。
7.一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，其特征在于：将权利要求2所述的CmCry1基因转入到植物中，得到抗旱性提高的转基因植物。
8.根据权利7所述的方法，其特征在于：权利要求2所述的CmCry1基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体PVX-LIC-CmCry导入到植物中的。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述植物为PVX能够侵染的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为烟草。
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