CN116732048B - 水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节氮素吸收中的应用 - Google Patents
水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节氮素吸收中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节水稻氮素吸收中的应用。本发明还公开了水稻转录因子基因OsbZIP48的过表达载体在获得高锌水稻籽粒中的应用。本发明还公开了水稻转录因子基因OsbZIP48的基因编辑载体在提高水稻氮素吸收并提高水稻的分蘖数方面的应用。本发明提供的水稻转录因子基因OsbZIP48的过表达载体，通过提高水稻中OsbZIP48基因的表达量可以显著提高水稻籽粒中的锌含量。本发明提供的水稻转录因子基因OsbZIP48的基因编辑载体，通过将OsbZIP48基因的第164位碱基T删除显著提高水稻对氮素的吸收。
Description
技术领域
本发明涉及水稻转录因子基因OsbZIP48在水稻籽粒高锌和调节氮素吸收中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
作为一种作物生长必需的微量元素，锌(Zinc，Zn)对所有细胞生物都至关重要。在植物体内，锌发挥着重要功能，它是许多酶的辅基，参与生长素的合成和碳的代谢，影响蛋白质的合成，并维持细胞膜的稳定性。由于水稻作为亚洲人们的主粮，因此提高水稻对锌的吸收能力并增加其籽粒中锌的含量将有利于水稻植株的生长和稻米的营养价值。
研究表明，水稻根中，锌铁转运蛋白基因OsZIP4和OsZIP8参与缺锌响应信号应答。OsZIP4参与锌优先向新生组织的转运，而OsZIP8被认为负责将锌向地上部的转运。另外也有研究表明过表达OsIRT1基因可以导致水稻地上部积累更多的锌。在水稻基因组中OsZIP5和OsZIP9两个转运体负责锌的吸收，oszip5oszip9双突变体对缺锌极为敏感，其中OsZIP9对锌的吸收起到主效作用。OsZIP9是一个高亲和力的锌转运蛋白。主要在水稻根中表达，且受缺锌强烈诱导。OsZIP9是水稻锌吸收的主效转运体(Huang et al.,2020；Tan et al.,2020；Yang et al.,2020)。水稻根中OsZIP9基因的表达调控信号能感知水稻地上部分的缺锌信号。OsZIP9基因敲除会导致水稻吸收锌的能力严重下降。而过表达OsZIP9基因可以提高水稻籽粒中锌的含量，使其高出对照组30％。并且过表达OsZIP9基因并不会影响水稻的农艺性状。然而由于存在严格的锌稳态调控机制，水稻籽粒中锌的含量很难更大幅度地提高。
植物细胞可以明显的感知根系周围土壤中有效锌浓度的波动。在拟南芥中，锌浓度感知蛋白由2个F-bZIP家族转录因子AtbZIP19和AtbZIP23所组成。在低锌条件下，AtbZIP19和AtbZIP23形成二聚体并结合靶基因启动子上的缺锌响应元件(ZincDeficiency Response Element,ZDRE,RTGTCGACAY)，以激活下游缺锌响应靶基因的表达。这些靶基因主要参与锌的吸收与活化动员，包括转运蛋白基因(AtZIP1/3/4/5/9/10/12和IRT3)和AtNAS基因，bZIP19和bZIP23之间有重叠但不完全相同的目的基因。目前有研究认为，bZIP19与bZIP23通过二聚化来调节锌稳态，而这一过程是通过锌2+直接结合到锌感知基序(Zinc Sensor Motif,ZSM)进行调控的，锌的结合抑制了二聚体的形成，使下游靶基因无法转录激活，从而使得bZIP19与bZIP23在根和地上部作为锌缺乏的局部感受器而行使功能。
本实验室前期研究结果显示，水稻转录因子OsbZIP48的氨基酸序列与AtbZIP19的氨基酸序列高度相似，是OsZIP4和OsZIP8的直接上游转录因子。水稻osbzip48突变体在缺锌条件下会出现水稻幼苗致死表型。这暗示着OsbZIP48可能在水稻缺锌信号调控途径中的起到核心作用。但具体调控效果还未明确。
在农业生产中，生产者为追求更高的水稻产量，通常在水稻种植中增加肥料投入，特别是氮肥施用量的增加成为提高水稻产量的主要途径。而稻田土壤对氮肥的利用率仅为30％-40％，这种低效高投入的施肥模式导致未被利用的氮素在地表径流、淋溶等作用下进入稻田周边沟渠、河流和湖泊而流失，引起水体氮含量的增加，造成水体氮素污染。研究表明，由农业生产引起巢湖流域氮负荷高达70％，而来自氮肥源占18％-30％。在水稻种植区中的河流水体中的氮以硝态为主，同时水体中57％的铵态氮来源于农业面源污染。
氮肥在生产和运输过程中需要消耗大量的化石能源，这无疑增加了农业生产成本和碳排放量。而在农田中，氮肥被无节制的使用又会造成诸多环境问题，如农业面源污染、水体富营养化、温室气体排放等。氮高效水稻品种的种植可以很大程度节约氮肥的施用。因此，氮高效水稻品种的研制与大面积推广是未来水稻种植产业的趋势。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供了水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节水稻氮素吸收中的应用。本发明的第二目的是提供了水稻转录因子基因OsbZIP48的过表达载体在获得高锌水稻籽粒中的应用。本发明的第三目的是提供了一种培育高锌水稻籽粒的方法。本发明的第四目的是提供了水稻转录因子基因OsbZIP48的基因编辑载体在提高水稻氮素吸收并提高水稻的分蘖数方面的应用。本发明的第五目的是提供了一种提高水稻氮素吸收并获得高分蘖数水稻的方法。
技术方案：本发明提供了水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节水稻氮素吸收中的应用。
本发明还提供了水稻转录因子基因OsbZIP48的过表达载体在获得高锌水稻籽粒中的应用。
进一步地，所述过表达载体为pOX-OsbZIP48。
本发明还提供了培育高锌水稻籽粒的方法，包括如下步骤：
(1)将水稻转录因子基因OsbZIP48的过表达载体转化到农杆菌中；
(2)利用转化后的农杆菌侵染水稻愈伤组织；
(3)筛选获得OsbZIP48过表达转基因水稻幼苗；
(4)转基因水稻幼苗常规种植后得到OsbZIP48过表达转基因水稻种子即得。
进一步地，步骤(1)中所述过表达载体的构建步骤包括：
(1)以日本晴水稻幼苗叶片总RNA为模板，反转录得到cDNA；
(2)以所得cDNA为模板，利用PCR扩增得到OsbZIP48的编码序列；
(3)将OsbZIP48的编码序列与pOX载体连接，构建得到Ubiquitin基因启动子驱动的pOX-OsbZIP48载体。
进一步地，步骤(2)中所述的PCR扩增的特异性引物包括pOX-OsbZIP48-F和pOX-OsbZIP48-R，所述pOX-OsbZIP48-F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的pOX-OsbZIP48-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明使用禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子作为OsbZIP48基因的启动子构建pOX-OsbZIP48过表达载体。再使用转基因技术构建粳稻pOX-OsbZIP48过表达株系，过表达株系根中OsbZIP48的相对表达量达到300倍左右。
本发明还提供了水稻转录因子基因OsbZIP48的基因编辑载体在提高水稻氮素吸收并提高水稻的分蘖数方面的应用。
本发明还提供了提高水稻氮素吸收并获得高分蘖数水稻的方法，包括如下步骤：
(1)将水稻转录因子基因OsbZIP48的基因编辑载体转化到农杆菌中；
(2)利用转化后的农杆菌侵染水稻愈伤组织；
(3)筛选获得osbzip48突变体幼苗。
进一步地，步骤(1)中所述载体pRGEB31-OsbZIP48构建步骤包括：根据位于OsbZIP48基因的编码序列的5`端的gRNA核苷酸序列作为CRISPR/Cas9系统的靶序列设计引物gRNA-bZIP48-F和gRNA-bZIP48-R，所述gRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述gRNA-bZIP48-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述gRNA-bZIP48-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；将引物gRNA-bZIP48-F和gRNA-bZIP48-R分别经过退火反应，然后将退火后的引物与BsaI酶酶切后的pRGEB31载体连接即得。
进一步地，步骤(3)中所述的osbzip48突变体中OsbZIP48基因的第164位碱基T被删除。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的水稻转录因子基因OsbZIP48的过表达载体，通过提高水稻中OsbZIP48基因的表达量可以显著提高水稻籽粒中的锌含量，使植株糙米中锌的浓度提高80％。本发明提供的水稻转录因子基因OsbZIP48的基因编辑载体，通过将OsbZIP48基因的第164位碱基T删除显著提高水稻对氮素的吸收，使分蘖数显著提高。
附图说明
图1为OsbZIP48过表达水稻株系中OsbZIP48的相对表达量分析，其中WT为对照组，OE1、OE2、OE3和OE4为OsbZIP48过表达株系；
图2为OsbZIP48过表达水稻株系糙米中锌含量，其中WT为对照组，OE1、OE2、OE3和OE4为OsbZIP48过表达株系；
图3为OsbZIP48过表达水稻株系的农艺性状，其中WT为对照组，OE1、OE2、OE3和OE4为OsbZIP48过表达株系；A为株高，B为分蘖数，C为千粒重，D为单株产量；
图4为低氮施肥条件下水稻的生长表型(A)和分蘖数(B)，其中，WT为对照组，osbzip48为osbzip48突变体。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1OsbZIP48基因克隆及过表达载体pOX-OsbZIP48的构建
提取日本晴水稻幼苗(在1/2木村营养液中培养14天，25℃)叶片总RNA(采用TaKaRa生物科技有限公司RNA提取试剂盒，TaKaRa MiniBEST Plant RNAExtraction Kit,Code No.9769)。将提取的叶片总RNA反转录合成总cDNA(采用TaKaRa生物科技有限公司cDNA合成试剂盒，TaKaRa PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix,CodeNo.6215A)。以合成的总cDNA为模板使用特异性引物，扩增OsbZIP48的编码序列(采用Vazyme生物科技有限公司高保真酶2×Phanta Max Master Mix，CodeNo.P515-01)。pOX-OsbZIP48-F：5’-GTTTGCTCTCCATTGCCAGCTGCC-3’(SEQ ID NO.5)；pOX-OsbZIP48-R：5’-CAGAAAGGAAACATAACTGACCT-3’(SEQ ID NO.6)。扩增体系为：5×PrmierSTAR GXL缓冲液(含Mg2+)5μL；dNTPs Mixture即dNTPs混合物(2.5mM)2μL；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase DNA聚合酶(1.25U/μL)0.5μL；引物1(pOX-OsbZIP48-F,10mM)1μL；引物2(pOX-OsbZIP48-R,10mM)1μL；cDNA 0.5μL；ddH2O 15μL，总体系共25μL。PCR程序为：1.95℃5min；2.95℃25s；3.58℃25s；4.72℃30s；5.35个循环，重复步骤2到步骤4；6.72℃5min。将上述扩增的OsbZIP48的编码序列(SEQ ID NO.1)与pOX载体(由Addgene公司提供)连接(采用南京Vazyme生物科技有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit，Code No.C115-01)，构建pOX-OsbZIP48载体。将新构建的pOX-OsbZIP48载体转化至大肠杆菌感受态(DH5α)，挑单克隆测序(送至安升达生物科技有限公司测序)，获得所有OsbZIP48编码序列碱基正确的单克隆(含pOX-OsbZIP48载体)进行下一步实验。
实施例2OsbZIP48基因过表达水稻幼苗和种子的制备及分析
将实施例1制备的pOX-OsbZIP48载体转化到农杆菌EHA105菌株中，利用转化有pOX-OsbZIP48载体的农杆菌EHA105侵染野生型日本晴水稻愈伤组织，筛选获得转pOX-OsbZIP48的转基因水稻幼苗。大田种植并得到OsbZIP48过表达转基因水稻种子。
将日本晴水稻幼苗作为对照组(WT)，与四株转pOX-OsbZIP48的转基因水稻幼苗(OE1、OE2、OE3和OE4)共同培养在温室中1/2木村培养液中，苗龄为2周。分别检测株系根中OsbZIP48的相对表达量，结果如图1所示，转基因水稻幼苗根中OsbZIP48的相对表达量达到对照组(日本晴)的300倍左右，这表明pOX-OsbZIP48过表达材料中OsbZIP48基因的表达确实被显著提高了。
将日本晴水稻糙米作为对照组(WT)，取四种大田种植的OsbZIP48过表达转基因水稻糙米(OE1、OE2、OE3和OE4)，分别检测糙米中的锌浓度，结果如图2所示，OsbZIP48过表达植株糙米中锌的浓度显著高于对照组(日本晴)，高达180％。数据代表平均值±SD(n＝4)。通过独立样本t-检验，将相应野生型的显着性差异确定为**P<0.01。这表明利用Ubiquitin启动子在粳稻中过表达OsbZIP48基因可以极显著提高水稻籽粒中锌的积累。
并且在水稻的成熟期，四种OsbZIP48过表达株系的株高、分蘖数、千粒重和单株产量与野生型水稻(WT)均无差异(图3A-D)。数据代表平均值±SD(n＝4)。通过独立样本t-检验，将相应野生型的显着性差异确定为*P<0.05。这表明在粳稻中过表达OsbZIP48基因不影响水稻在田间的农艺性状。实施例3OsbZIP48敲除载体pRGEB31-OsbZIP48的构建设计基于CRISPR-Cas9基因编辑体系的gRNA序(5`-CAGTGAGAGG TCATGCACAG-3`，SEQ ID NO.12)。gRNA序列位于OsbZIP48基因的编码序列的5’端。把浓度均为100μM的gRNA-bZIP48-F：5’-GGCAGTGAGAGGTCATGCACAGGC-3’(SEQ ID NO.7)和gRNA-bZIP48-R：5’-AAACGCCTGTGCATGACCTCTCAC-3’(SEQ ID NO.8)引物混合并经金属浴退火复性，反应温度程序：95℃60sec；75℃5min；40℃5min；25℃，5min。反应体系：gRNA-bZIP48-F(100μM)和gRNA-bZIP48-R(100μM)各2μL；10×T4 DNAligase buffer 1μL。退火复性成为双链短DNA片段，再使用ddH2O稀释1000×备用(记为寡聚gRNA引物)。再将pRGEB31载体(由Addgene公司提供)用BsaI酶37℃酶切4h。酶切体系如下：pRGEB31载体2μg，10×NEB buffer 2μL，Bsa I(NEB)1μL，加ddH2O至20μL。产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行割胶回收，并利用分光光度计检测其质量与浓度，将酶切产物与退火后的引物用T4连接酶在25℃条件下连接4h，反应体系如下：pRGEB31线性化载体50ng，寡聚gRNA引物2μL，10×T4 DNA ligase buffer 1μL，T4ligase(NEB)1μL，加ddH2O至10μL。最后将连接产物采用冻融法转化至大肠杆菌感受态DH5α。将-75℃保存的农杆菌感受态EHA105置于冰上解冻；然后在超净工作台内加入2μL重组质粒于20μL感受态EHA105中，吸打均匀后，液氮速冻5min后，置于37℃水浴锅中热击5min；取出后在超净工作台内加600μL YEB液体培养基，于28℃，250rpm震荡培养3hr，6000rpm离心5min，在超净工作台中除去上清，吸打均匀后，吸取全部菌液均匀涂布于YEB固体培养基(含卡那霉素：100mg/L；利福平：50mg/L)，置于28℃培养箱，暗培养3天。对转化成功的大肠杆菌分别用gRNA-bZIP48-F与M13-R(通用引物SEQ ID NO.9：5’-AGGAAACAGCTATGACC-3’)进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的菌落摇菌后送苏州金唯智公司进行测序，将测序正确(和SEQ IDNO.1序列一致)的菌液扩大培养，提取质粒-20℃保存备用。
实施例4水稻osbzip48突变体材料的制备
利用实施例3制备的转化有pRGEB31-OsbZIP48载体的农杆菌EHA105侵染水稻愈伤组织，筛选获得转pRGEB31-OsbZIP48的转基因水稻幼苗。osbzip48突变位点鉴定:(1)取T0代转基因水稻幼苗叶片，液氮研磨；(2)加650μL TPS提取液(TPS：100mM Tris-HCl，1M KCl，10mM EDTA)，摇匀后65℃水浴30min；(3)12000rpm离心10min，吸取上清液到1/2体积的异丙醇中，轻轻翻转数次，直到有白色絮状物生成；(4)12000rpm离心10min，弃上清，加800μL70％乙醇悬浮沉淀；(5)12000rpm离心5min，弃上清后置于37℃烘干；(6)加50μL ddH2O溶解DNA，4℃保存备用。选取位于OsbZIP48基因组gRNA位点上下游各500bp的序列设计引物JD-OsbZIP48-F：5’-GTAACGACTCCCTATCTTCGCTG-3’(SEQ ID NO.10)和JD-OsbZIP48-R：5’-CAGGCACCTTGCCCCAACACCTG-3’(SEQ ID NO.11)，使PCR产物跨过gRNA位点。以T0代转基因幼苗的DNA为模板，用JD-OsbZIP48-F/R对gRNA突变位点的转基因苗进行PCR鉴定，PCR反应条件为：94℃，3min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；步骤2～4循环32次，72℃延伸10min。四个样品的PCR产物各取6μL，经1％琼脂糖凝胶电泳检测存在明亮单一条带后，将样品剩余PCR产物送苏州金唯智公司进行测序。将测序结果与OsbZIP48基因组序列进行比对，发生碱基突变或者片段缺失的材料即为osbzip48突变体。以T0代osbzip48突变体DNA为模板，进行PCR，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收，利用分光光度计检测其质量与浓度后，与T载体pMD19-T(TaKaRa公司,D102A)连接，并转化大肠杆菌DH5α，利用JD-OsbZIP48-F/R进行菌落PCR鉴定，每份突变体材料选取3个阳性单克隆菌落摇菌后送测序。将测序结果与OsbZIP48基因组序列进行比对，3个单克隆都发生DNA突变的即OsbZIP48突变体纯合植株(记为osbzip48)。osbzip48纯合突变体中OsbZIP48突变核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，其中OsbZIP48突变序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
将筛选出的osbzip48纯合突变体水稻植株种植在大田(低氮75kg/ha)中直至其完成整个生育期。在田间实验中，将水稻种植在亚热带长日照条件的中国南京白马南京农业大学基地(119°02'E-3165N)，此地点夏季(水稻生长委节)平均白昼长度为13.5小时，夜晚长度为10.5小时。稻田中土壤为黄棕土，其基本属性为pH值6.9，总氮含量0.63g/kg；可提取磷为2.7mg/kg，NH4OAc可提取钾为74g/kg。施用的氮肥总量为75kg/ha(低氮)，施用氮肥品种为尿素和NH4HPO4。在移栽前一天、苗期/分期和开花期分别施用总氮量的50％、25％和25％。在移栽前，总共施用65kg/ha磷(NH4HPO4)和78kg/ha钾(K2SO4)作为基础肥料。育秧30天后，将水稻幼苗移栽到种植田中，种植密度为20cm*20cm，种植小区为9棵*9棵。
将日本晴水稻作为对照组(WT)，对日本晴水稻和种植出的osbzip48突变体水稻进行表型(图4A)和分蘖数分析(图4B)，可以看出，osbzip48突变体水稻植株分蘖数显著高于对照组(WT)高达150％，这表明在粳稻中OsbZIP48基因突变可以显著提高水稻对低氮的利用率。
Claims (1)
1.水稻转录因子基因OsbZIP48在低氮环境下提高水稻的分蘖数方面的应用，其特征在于，所述水稻转录因子基因OsbZIP48的第164位碱基T被删除，水稻转录因子基因OsbZIP48的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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