CN117551691A - 一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子育种领域，涉及甘蓝型油菜早熟且抗寒抗冻强的油菜品种的培育，特别是指一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。本研究利用生物育种技术分别将拟南芥基因AT3G04720(AtPR4)及AT4G16260(AtGlu)在甘蓝型油菜中过表达发现，这两个基因能够明显提高油菜在蕾薹期的抗寒抗冻性，且在遭受低温胁迫后不影响油菜正常开花，同时，能够在低温条件下明显提高油菜种子的萌发速率及发芽率。为培育抗寒抗冻早熟油菜新品种提供了新思路及新的基因资源。
Description
技术领域
本发明属于分子育种领域，涉及甘蓝型油菜早熟且抗寒抗冻强的油菜品种的培育，特别是指一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。
背景技术
甘蓝型油菜(Brassica napus AACC 2n=38)是我国重要的油料作物，在我国的食用植物油的供应中，菜籽油的占比超过55%。然而我国食用植物油自给率逐年走低，目前已经低于40%。所以，保证油菜生产是保证我国食物植物油安全的重要部分。在长江流域开发冬闲田扩种油菜；统筹油菜综合性扶持措施，推行稻油轮作，大力开发利用冬闲田种植油菜，成了国家推动早熟油菜育种的要求。早熟油菜生育期短，开花早，容易遭遇低温胁迫，因此，利用生物育种技术培育早熟抗寒抗冻油菜新品种对解决稻油轮作茬口矛盾，利用冬闲田种植油菜具有重要的现实意义。
转基因生物技术是现代生物技术的核心。转基因生物技术是指利用DNA重组、遗传转化等分子生物技术，将目的基因导入受体基因组中，并且目的基因能在后代中稳定表达，使受体生物获得预期的、定向的遗传改变，从而改良生物。目前，国际上转基因生物技术已经广泛应用于医药、工业、农业、环保、能源等领域，在农业领域，国际上已经培育了一大批具有抗虫、抗病、耐除草剂、优质、抗逆等优良性状的转基因作物新品种。转基因生物技术在农业领域的广泛应用，有效降低了农业生产人工成本，减少了农药使用量，减少灾害损失，在缓解资源约束、保护生态环境、改善和提高农产品质量和营养价值，推进绿色发展方面发挥了重大作用。
现有文献报道，在甘蓝型油菜中BnaCBF4基因的表达受冷诱导，并且BnaCBF4基因参与了油菜增强抗寒性的多分子途径，在胁迫的不同阶段表现为动态调控。甘蓝型油菜中BnaCBF17基因可通过提高CO2同化率和电子传递效率，在低温胁迫下保持光合作用系统运行。在酵母中过表达油菜BnCOR25基因能够显著提高细胞在冷胁迫下的存活率，在拟南芥中过表达油菜BnCOR25基因提高了拟南芥的抗寒抗冻性。在甘蓝型油菜中过表达拟南芥AtACBP6基因具有提高甘蓝型油菜抗寒抗冻性的潜力。这些低温胁迫基因的鉴定和分析为甘蓝型油菜抗性分子设计育种提供重要基因资源。目前，在油菜中尚未有很多抗寒抗冻基因的报道，因此亟需我们开展挖掘提高甘蓝型油菜抗寒抗冻基因的相关工作。
发明内容
本发明提出一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用，发现了可以明显提高油菜在蕾薹期的抗寒抗冻性，且在遭受低温胁迫后不影响油菜正常开花，同时，能够在低温条件下明显提高油菜种子的萌发速率及发芽率。为培育抗寒抗冻早熟油菜新品种提供了新思路及新的基因资源。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。
一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的萌发速率中的应用。
一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的发芽率中的应用。
上述拟南芥蛋白基因为AtPR4基因或AtGLU基因，拟南芥基因AtPR4，所述AtPR4基因的核苷酸序列与EnsemblPlants数据库数据库中AT3G04720序列相同，位于第3条染色体，含有2个外显子和1个内含子。拟南芥基因AtPR4，所述拟南芥基因AtPR4蛋白的氨基酸序列来源于EnsemblPlants数据库数据库。
拟南芥基因AtGLU，所述AtGLU基因的核苷酸序列与EnsemblPlants数据库数据库中AT4G16260序列相同，位于第4条染色体，含有3个外显子和2个内含子。拟南芥基因AtGLU，所述拟南芥基因AtGLU蛋白的氨基酸序列来源于EnsemblPlants数据库数据库。
上述应用是通过在甘蓝型油菜中过表达AtPR4基因和/或AtGLU基因基因实现的。
上述应用是通过将含有AtPR4基因和/或AtGLU基因的过表达载体转入甘蓝型油菜中实现的。
上述的应用，步骤为：
（1）以拟南芥的cDNA为模板，以拟南芥蛋白基因的第一引物对，对目的片段进行扩增，并回收目的片段；
（2）以步骤（1）的目的片段为模版，以第二引物对进行扩增，并回收产物；
（3）Pcambia3301-gfp载体经用XbaI与BglII双酶切处理并回收，与步骤（2）的回收产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌，经验证后获得拟南芥蛋白基因的过表达载体；
（4）步骤（3）的过表达载体经农杆菌转化至油菜种子，获得耐低温的甘蓝型油菜。
上述步骤（1）中拟南芥蛋白基因为AtPR4基因和/或AtGLU基因。
上述第一引物对为AtPR4-F/AtPR4-R或AtGLU-F/AtGLU-R，其中AtPR4-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、AtPR4-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示、AtGLU-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示、AtGLU-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述步骤（2）中第二引物对为AtPR4-VF/AtPR4-VF或AtGLU-VF/AtGLU-VF，其中AtPR4-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示、AtPR4-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示、AtGLU-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示、AtGLU-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明具有以下有益效果：
1、研究中，利用生物育种技术在早熟甘蓝型油菜（生育期110-140天）中分别过表达AtPR4及AtGlu基因提高了甘蓝型油菜蕾薹期的抗寒抗冻性，并且在正常条件下恢复7天后85%的过表达植株能够正常生长开花，有利于早熟耐迟播且抗寒抗冻性强的油菜品种的培育。早熟油菜生育期短，开花早，容易在开花期遭遇低温胁迫。本研究在早熟油菜中分别过表达AtPR4及AtGlu基因。通过对过表达AtPR4基因研究结果看出，与野生型相比，在-3℃冻处理完成后，OE1,OE2的表型与WT的并没有明显差别，植株均出现了萎蔫，水渍化的表型。通过相对电导率的检测结果发现，WT及OE1的相对电导率均在80%左右，OE2的相对电导率为60%左右，并且OE1,OE2的相对电导率与WT并没有显著性差异。说明过表达植株与野生型植株的受冻害程度基本一致。在正常条件下恢复后，OE1,OE2植株的长势明显好于WT，并且OE1,OE2的存活率在85%左右，WT的存活率在40%左右，OE1,OE2之间的存活率没有显著性差异，两个过表达株系存活率与WT之间存在显著性差异。在恢复第7天后,OE1,OE2约80%的植株正常开花，WT有一株植株正常开花。通过对过表达AtGLU基因研究结果看出，与野生型相比，在-3℃冻处理完成后，通过相对电导率的检测结果发现，WT的相对电导率在80%左右，OE的相对电导率为40%左右，OE与WT的相对电导率存在显著性差异，结果说明过表达植株较野生型植株的受冻害程度轻。在正常条件下恢复后， OE植株的长势明显好于WT，并且OE的存活率在80%左右，WT的存活率在30%左右，OE的存活率比WT 高50%左右。在恢复第7天后,OE材料约80%的植株正常生长且进入开花期，WT植株趋向死亡。
2、在甘蓝型油菜中分别过表达AtPR4及AtGlu基因提高了油菜的低温萌发速率及发芽率，有利于早熟油菜的迟播。为了完善稻油轮作栽培模式，油菜播期被推迟，所以，研究出早熟耐迟播且抗寒抗冻性强的油菜品种具有重要的现实意义。通过对过表达AtPR4基因研究结果看出，在正常条件下，WT,OE1及OE2均在第1天种子开始萌发，且在第2天萌发率达到90%，在第3天萌发率达到100%，说明进行实验的种子材料种子发芽力基本一致。在4℃低温处理条件下，与WT相比，OE1在第4天开始发芽，OE2在第3天开始发芽，WT在第6天开始发芽，OE1,OE2比WT萌发速度快3天。OE1,OE2在第7天发芽率分别为95%及100%，WT为20%，OE1,OE2的发芽率明显高于WT。通过对过表达AtGLU基因研究结果看出，在正常条件下，WT,OE1及OE2均在第1天种子开始萌发，且在第2天萌发率达到90%，在第3天萌发率达到100%，说明进行实验的种子材料种子发芽力基本一致。在4℃低温处理条件下，与WT相比，OE1,OE2在第4天开始发芽， WT在第6天开始发芽，OE1,OE2比WT萌发速度快2天。OE1,OE2在第7天发芽率分别为97%及100%，WT为40%，OE1,OE2的发芽率明显高于WT。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为转基因甘蓝型油菜AtPR4基因表达量检测PCR电泳图。
图2为转基因甘蓝型油菜AtGLU基因表达量检测PCR电泳图。
图3为低温胁迫对AtPR4转基因甘蓝型油菜种子萌发的影响。
图4为冻害胁迫下AtPR4转基因甘蓝型油菜的抗性表现。
图5为低温胁迫对AtGLU转基因甘蓝型油菜种子萌发的影响。
图6为冻害胁迫下AtGLU转基因甘蓝型油菜的抗性表现。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。
一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的萌发速率中的应用。
一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的发芽率中的应用。
上述拟南芥蛋白基因为AtPR4基因或AtGLU基因，拟南芥基因AtPR4，所述AtPR4基因的核苷酸序列与EnsemblPlants数据库数据库中AT3G04720序列相同，位于第3条染色体，含有2个外显子和1个内含子。拟南芥基因AtPR4，所述拟南芥基因AtPR4蛋白的氨基酸序列来源于EnsemblPlants数据库数据库。
拟南芥基因AtGLU，所述AtGLU基因的核苷酸序列与EnsemblPlants数据库数据库中AT4G16260序列相同，位于第4条染色体，含有3个外显子和2个内含子。拟南芥基因AtGLU，所述拟南芥基因AtGLU蛋白的氨基酸序列来源于EnsemblPlants数据库数据库。
上述应用是通过在甘蓝型油菜中过表达AtPR4基因和/或AtGLU基因基因实现的。
上述应用是通过将含有AtPR4基因和/或AtGLU基因的过表达载体转入甘蓝型油菜中实现的。
上述的应用，步骤为：
（1）以拟南芥的cDNA为模板，以拟南芥蛋白基因的第一引物对，对目的片段进行扩增，并回收目的片段；
（2）以步骤（1）的目的片段为模版，以第二引物对进行扩增，并回收产物；
（3）Pcambia3301-gfp载体经用XbaI与BglII双酶切处理并回收，与步骤（2）的回收产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌，经验证后获得拟南芥蛋白基因的过表达载体；
（4）步骤（3）的过表达载体经农杆菌转化至油菜种子，获得耐低温的甘蓝型油菜。
上述步骤（1）中拟南芥蛋白基因为AtPR4基因和/或AtGLU基因。
上述第一引物对为AtPR4-F/AtPR4-R或AtGLU-F/AtGLU-R，其中AtPR4-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、AtPR4-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示、AtGLU-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示、AtGLU-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述步骤（2）中第二引物对为AtPR4-VF/AtPR4-VF或AtGLU-VF/AtGLU-VF，其中AtPR4-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示、AtPR4-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示、AtGLU-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示、AtGLU-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
下面结合具体实施例进行说明：
实施例1
一、克隆拟南芥基因AtPR4与AtGLU基因全长序列
设计AtPR4与AtGLU基因的全长引物，以拟南芥的cDNA为模板，进行 PCR 扩增。AtPR4与AtGLU基因克隆的PCR的扩增体系根据2×Rapid Taq Master Mix说明书进行配制。AtPR4与AtGLU基因克隆的PCR反应条件为95 ℃预变性3 min ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s,72℃ 15 s 进行32个循环；72 ℃ 5 min 延伸。对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，根据条带大小初步判断是否是我们的目标基因产物。将符合预期的PCR产物送公司测序。
引物：
AtPR4-F: ATGAAGATCAGACTTAGCATAACC
AtPR4-R：TCAAACGCGATCAATGGC
AtGLU-F：ATGACCACGTTATTCCTCCT
AtGLU-R：TCACTCAACCGCCGTAC
二、构建过表达载体
1、设计带有酶切位点序列和重组反应的接头引物AtPR4-F，AtPR4-R，AtGLU-F,AtGLU-R引物序列。以1.1中获得的测序结果正确的AtPR4、AtGLU基因全长PCR产物为模板，进行PCR扩增，获得带有接头序列的PCR片段，其中两者引物序列。PCR扩增体系根据2×Rapid Taq Master Mix说明书进行配制。PCR反应条件为95 ℃ 预变性3 min ；95℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s 进行32个循环；72 ℃ 延伸5 min。PCR扩增完成后进行凝胶电泳检测。
AtPR4-VF：AAGTCCGGAGCTAGCTCTAGAATGAAGATCAGACTTAGCATAACC
AtPR4-VR：TGTAATTCACACGTGTTAAGATCTTCAAACGCGATCAATGGC
AtGLU-VF：AAGTCCGGAGCTAGCTCTAGAATGACCACGTTATTCCTCCT
AtGLU-VR：TGTAATTCACACGTGTTAAGATCTTCACTCAACCGCCGTAC
下划线处为重组接头序列，双划线为酶切位点。
2、目的片段克隆至植物表达载体及阳性克隆筛选
Pcambia3301-gfp载体用XbaI与BglII双酶切处理并回收，与AtPR4、AtGLU的PCR扩增产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌（DH5a），涂卡那霉素抗性LB平板，37°C培养过夜。挑选克隆摇菌，用引物AtPR4-VF与PCA-seqE；AtGLU-VF与PCA-seqE菌落PCR证阳性克隆，然后进行测序验证。测序正确的阳性克隆摇菌、扩繁，提取质粒；然后进行农杆菌（GV3101）转化，挑选克隆，最后进行阳性克隆的PCR检测。阳性农杆菌克隆扩繁后用甘油保存于-80℃冰箱，后续用于油菜转化。
PCA-seqE：CACGTGTGAATTACAGGTGA。
实施例2：转基因油菜的阳性鉴定与表达量检测
对每一代获得的阳性材料继续种植，进行阳性鉴定和表达量检测，直到出现表达量高且纯合的株系。本次我们进行到T3代获得三个以上过表达的纯合株系。阳性材料表达量检测操作如下：对阳性植株根据试剂盒提取RNA，将得到的总RNA反转合成cDNA，以cDNA为模板进行半定量PCR表达量检测。以甘蓝型油菜的BnaActin基因 (BnaC05g34300D) 作为内参基因，分析基因的相对表达量。从（图1）中可看出，内参基因的条带亮度基本一致，说明模板浓度一致。与野生型相比，AtPR4的4条带都很亮，野生型没有条带，说明这4株系为高表达植株。从（图2）中可看出，内参基因的条带亮度基本一致，说明模板浓度一致。与野生型相比，AtGLU的6条带都很亮，野生型没有条带，说明这6个株系为高表达植株。本次结果表明，我们获得了4个甘蓝型油菜AtPR4过表达株系和6个甘蓝型油菜AtGLU过表达株系。
实施例3：AtPR4、AtGLU过表达甘蓝型油菜的种子在萌发期的抗逆性分析
一、AtPR4过表达甘蓝型油菜的种子在萌发期的抗逆性分析
对过表达植株的种子进行了4℃低温萌发实验，三次生物重复。选取同时期收获，且大小基本一致的种子于直径为90mm培养皿中进行实验，培养皿中铺有一层滤纸，滤纸用自来水湿润。将铺好种子的培养皿分别放于正常条件（22℃）及4℃条件下进行萌发实验，统计每天种子的发芽数，拍照记录。发芽标准为胚根大于种子的二分之一为发芽。从（图3a,b）可看出，在常温中野生型材料和过表达材料OE1,OE2的萌发率均能在第3d达到在100%左右，且种子萌发率达到90%的时间均为2d，说明供试种子为发芽势基本一致的正常种子。在4℃低温处理中，与野生型相比，过表达材料OE1,OE2萌发率在第4d开始萌发，在萌发第5d发芽率达到80%，在萌发第7d发芽率达到95%。WT在第6d开始萌发，第7d发芽率为20%左右。数据结果表明，与野生型材料相比，过表达材料OE1,OE2在低温条件下，萌发速度快于野生型材料2d，且发芽率远高于野生型材料60%左右，结果表明过表达AtPR4基因能够提高油菜种子的低温耐性。
二、AtGLU过表达甘蓝型油菜的种子在萌发期的抗逆性分析
对过表达植株的种子进行了4℃低温萌发实验，三次生物重复。选取同时期收获，且大小基本一致的种子于直径为90mm培养皿中进行实验，培养皿中铺有一层滤纸，滤纸用自来水湿润。将铺好种子的培养皿分别放于正常条件（22℃）及4℃条件下进行萌发实验，统计每天种子的发芽数，拍照记录。发芽标准为胚根大于种子的二分之一为发芽。从（图5a,b）可看出，在常温中野生型材料WT和过表达材料OE1,OE2的萌发率均能在第3d达到在100%，且种子萌发率达到90%的时间均为2d，说明供试种子为发芽力基本一致的正常种子。在4℃低温处理中，与野生型相比，过表达材料OE1,OE2萌发率在第4d开始萌发，在萌发第5d发芽率达到80%，在萌发第7d发芽率达到95%。野生型在第6d开始萌发，第7d发芽率为40%左右。数据结果表明，与野生型材料相比，过表达材料OE1,OE2在低温条件下，萌发速度快于野生型材料2d，且发芽率高于野生型材料60%，结果表明过表达AtPR4基因能够提高油菜种子的低温耐性。
实施例4：AtPR4、AtGLU过表达甘蓝型油菜在蕾期的抗寒性分析
一、AtPR4过表达甘蓝型油菜在蕾期的抗寒性分析
对AtPR4基因过表达材料于光照培养箱中20℃ (14 h光照:am 6:00-pm 8:00) /16℃ (10 h黑暗:pm8:00- am 6:00) 进行4周的培养。4周后进行冻处理，处理条件为从常温降温到0℃，再从0℃开始每小时降1℃的梯度降温，降到-3℃处理7h。从图4b中看出，与野生型材料相比，WT与OE1的相对电导率均在80%左右，OE2的相对电导率60%。过表达材料的相对电导率与野生型没有显著差异；在图4c中，野生型的存活率为40%左右，过表达材料的存活率均在90%左右，存活率高于野生型50%；此外，图4a中看出，在-3℃处理恢复4天后，OE1,OE2开始抽薹，恢复7天后超过50%的油菜开花，野生型有1株开花。从以上数据结果表明，过表达材料的低温耐性明显高于野生型。所以过表达AtPR4基因能够显著提高油菜的低温抗性，减少低温对油菜的伤害。
以上结果均能表明，过表达AtPR4基因能够提高油菜的抗寒抗冻性。
二、AtGLU过表达甘蓝型油菜在蕾期的抗寒性分析
对AtGlu基因过表达材料于光照培养箱中20℃ (14 h光照:am 6:00-pm 8:00) /16℃ (10 h黑暗:pm8:00- am 6:00) 进行4周的培养。4周后进行冻处理，处理条件为从常温降温到0℃，再从0℃开始每小时降1℃的梯度降温，降到-3℃处理7h。
每株油菜的冻害程度分为5个等级，采用如下标准进行等级划分。0级，油菜未受损伤；1级，少数大叶局部或者大部萎缩而受害，有灰白色冻害斑点出现，心叶未受害；2级，半数叶片局部或大部萎缩、焦枯而受害，心叶未受害； 3级全部叶片局部或大部萎缩、焦枯而受害，心叶正常或受害较轻，能够恢复生长；4级全部大叶和心叶均焦枯而受害，植株趋向死亡。处理3天后对材料进行存活率统计。每株油菜的冻害程度调查之后，按照如下公式进行计算：
植株存活百分率；
冻害指数。
其中，N1、N2、N3、N4分别未1-4级受冻害油菜植株的株数，NT为调查总植株。
从图6b中看出，与野生型材料相比，OE的相对电导率显著低于WT;在图6c中，野生型的存活率为30%左右，过表达材料的存活率在80%左右，存活率高于野生型50%,图6d中冻害指数的统计结果与存活率结果相符，说明冻害指数越高的株系存活率越低；此外，图6a中看出，在-3℃处理恢复1天后，OE开始抽薹，恢复3天后超过OE油菜开花，野生型趋向死亡。从以上数据结果表明，过表达材料的低温耐性明显高于野生型。所以过表达AtGlu基因能够显著提高油菜的低温抗性，减少低温对油菜的伤害。
以上结果均能表明，过表达AtGlu基因能够提高油菜的抗寒抗冻性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。
2.一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的萌发速率中的应用。
3.一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的发芽率中的应用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述拟南芥蛋白基因为AtPR4基因或AtGLU基因，AtPR4基因的核苷酸序列与EnsemblPlants数据库数据库中的AT3G04720序列相同，AtGLU基因与EnsemblPlants数据库数据库中的AT4G16260序列相同。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是通过在甘蓝型油菜中过表达AtPR4基因和/或AtGLU基因基因实现的。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用是通过将含有AtPR4基因和/或AtGLU基因的过表达载体转入甘蓝型油菜中实现的。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤为：
（1）以拟南芥的cDNA为模板，以拟南芥蛋白基因的第一引物对，对目的片段进行扩增，并回收目的片段；
（2）以步骤（1）的目的片段为模版，以第二引物对进行扩增，并回收产物；
（3）Pcambia3301-gfp载体经用XbaI与BglII双酶切处理并回收，与步骤（2）的回收产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌，经验证后获得拟南芥蛋白基因的过表达载体；
（4）步骤（3）的过表达载体经农杆菌转化至油菜种子，获得耐低温的甘蓝型油菜。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中拟南芥蛋白基因为AtPR4基因和/或AtGLU基因。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述第一引物对为AtPR4-F/AtPR4-R或AtGLU-F/AtGLU-R，其中AtPR4-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、AtPR4-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示、AtGLU-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示、AtGLU-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中第二引物对为AtPR4-VF/AtPR4-VF或AtGLU-VF/AtGLU-VF，其中AtPR4-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示、AtPR4-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示、AtGLU-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示、AtGLU-VF的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
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