CN116024256A - 一种水稻基因OsHSFA4d的基因工程应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻基因OsHSFA4d的基因工程应用，本发明采用禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子，构建了一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体，这种基因表达载体可以有效抑制OsNramp5基因的表达，进而限制水稻根系对镉的吸收和籽粒中镉的积累，使水稻籽粒中的镉积累含量降低60%以上，且不影响水稻对锰的吸收。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种水稻基因OsHSFA4d的基因工程应用，具体涉及一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体、其构建方法及应用。
背景技术
镉污染严重地影响着我国的食品安全。根据2014年《全国土壤污染状况调查公告》，我国耕地，林地和草原土壤中的重金属分别超标19.3％、10.1％和10.3％。其中，镉超标率占全国调查点的7％。有研究表明，在镉浓度超过3mg kg-1(干土)的土壤上种植的农作物存在镉含量超标的风险(Jarup,2003)。水稻作为我国人们主要的口粮因而被广泛种植。而有研究指出，水稻是镉积累能力很强的一种农作物(Jiang et al.,2013)。镉污染严重地影响着我国的食品安全。
植物体内存在着精细的基因表达调控系统，控制自身的发育和对逆境的响应(Spitz et al.,2012)。转录因子在这一过程中起到重要的作用。在小麦中已经报道了一个转录因子HsfA4a可以提高酵母对镉的耐性(Shim et al.,2010)。然而，对农作物如何调控镉吸收的过程却知之甚少。
OsNramp5是水稻镉吸收的主要转运体(Ishikawa et al.,2012；Sasaki et al.,2012)。该基因突变会极大地降低水稻对镉的吸收(Yang et al.,2019)。很多农业育种专家通过各种手段，如基因敲除、EMS诱变、射线诱变等方式获得OsNramp5突变或变异的群体来实现低镉积累水稻新品种的培育。然而，OsNramp5突变会导致水稻对锰的吸收不足，进而影响产量等农艺性状(Sasaki et al.,2012)。目前已经有许多研究通过转基因手段对OsNramp5基因进行敲除，获得了株高、分蘖数、千粒重、单株产量等水稻农艺性状未发生改，而籽粒中镉含量大幅降低的水稻材料。但是，因其过程繁琐并未得到普遍应用。
发明内容
发明目的：本发明的目的是1、提供一种能够降低水稻籽粒中镉积累的基因表达载体。2、提供这种基因表达载体的构建方法。3、提供利用这种基因表达载体制备水稻植株的方法。
技术方案：本发明的水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体，所述基因表达载体使用禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子构建。
水稻基因OsHSFA4d在Genbank的登录号为AB050095。
本发明还提供了一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)以水稻根部总RNA为模板，反转录得到cDNA；
(2)以所得cDNA为模板，分别以pOX-OsHSFA4d-F和pOX-OsHSFA4d-A为特异性引物，利用PCR扩增得到OsHSFA4d的编码序列；
(3)将OsHSFA4d的编码序列与pOX载体连接，构建由禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子驱动的pOX-OsHSFA4d载体。
进一步的，步骤(2)中所述的特异性引物pOX-OsHSFA4d-F和pOX-OsHSFA4d-A的核苷酸序列如下所示：
本发明还提供了一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体在调控水稻镉吸收中的应用。
本发明还提供了一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体在水稻种子中的应用。
本发明还提供了一种含有水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体的水稻种子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将pOX-OsHSFA4d载体转化到农杆菌EHA105菌株中；
(2)利用转化后的农杆菌EHA105菌株侵染水稻愈伤组织；
(3)筛选获得转pOX-OsHSFA4d的转基因水稻幼苗；
(4)种植转基因水稻幼苗得到OsHSFA4d过表达转基因水稻种子。
本发明的发明人在研究前期，使用35S强启动子在水稻中启动OsHSFA4d基因的表达，仅可以降低水稻籽粒中30％左右镉的积累，然而30％左右镉积累的降低在生产应用上应用价值并不高。后经过对载体的优化，使用禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子作为OsHSFA4d基因的启动子构建pUbi-OsHSFA4d过表达载体。使水稻籽粒中的镉积累含量降低60％以上。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明提供的OsHSFA4d的基因表达载体可以有效抑制OsNramp5基因的表达，进而限制水稻根系对镉的吸收和籽粒中镉的积累，使水稻籽粒中的镉积累含量降低60％以上，且不影响水稻水稻对锰的吸收。
附图说明
图1为水稻植株中镉含量示意图，其中日本晴为对照组，OX1、OX2、OX3、OX4为OsHSFA4d过表达植株；
图2为水稻植株的农艺性状示意图，其中日本晴为对照组，OX1、OX2、OX3、OX4为OsHSFA4d过表达植株；A为株高，B为分蘖数，C为千粒重，D为单株产量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明提供了一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体，使用禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子构建。可达到限制水稻根系对镉的吸收和籽粒中镉积累的效果，具体制备步骤如下。
实施例1水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体的构建
1、水稻根部总RNA的提取
(1)将样品称重50mg，加入2mL进口无RNase(核酸酶)离心管内，加入1粒钢珠(直径2.3mm)，放入液氮中速冻；
(2)在振荡研磨器中65rpm离心65s，重复一次；
(3)每管加入450μL Buffer RL，混合均匀；在12000rpm、4℃条件下离心5min；
(4)取上清液至新的1.5mL无RNase(核酸酶)管中；加入1/2体积的无水乙醇，混合均匀；
(5)将液体包括沉淀全部转移至RNA Spin Column(RNA收集柱)中(每次加入的体积不要超过600μL)；在12000rpm条件下离心1min弃滤液；
(6)加入500μL Buffer RWA至RNA Spin column中；在12000rpm条件下离心30s；
(7)加入600μL Buffer RWB至RNA Spin Column中，在12000rpm条件下离心30s(沿管壁四周加入RWB)；
(8)向RNA Spin Column膜中央加入50μL DNase I反应液，室温静置15min；
(9)向RNA Spin Column膜中央加入350μL的buffer RWB，12000rpm，30s弃滤液；
(10)重复操作步骤(7)弃滤液，在12000rpm条件下离心2min；
(11)将RNA Spin Column安置于1.5mL EP管，在膜中央处加50μL无RNA酶超纯水，室温静置5min；在12000rpm条件下离心2min；
(12)若想提高回收量，可以二次洗脱；
(13)检测RNA纯度和浓度，并记录；
(14)RNA分装置于-80℃冰箱中保存。
提取过程中DNase I反应液的配制：取5μL 10×DNase I buffer，4μLRecombinant DNase I,41μL ddH2O至1.5mL EP管中；
2、RNA反转录合成cDNA
(1)在无RNA酶PCR管中按表1依次加入试剂配置反转录体系：
表1反转录的反应体系液配制
| 试剂 | 计量 |
| 总RNA | 1μg |
| 寡dT(50μM) | 1μL |
| dNTPs(2.5mM each) | 4μL |
| 5×first-standbuffer | 4μL |
| <![CDATA[无RNA酶ddH<sub>2</sub>O]]> | up to 18μL |
(2)混匀后在65℃条件下放置5min后，立刻放置冰上冷却；
(3)向管中依次加入1μL M-MLV反转录酶(200U/μL)和1μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，混匀；
(4)反转录反应条件：42℃，30min；70℃，10min；
(5)放置冰上冷却；
(6)使用ddH2O稀释5倍，分装；
(7)-20℃保存。
3、PCR扩增
1)PCR循环条件：(1)95℃，3min；(2)95℃，30s；(3)62℃，30s；(4)72℃，1min；(5)34个循环，重复步骤2到步骤4；(6)72℃，5min；(7)16℃保存。
2)扩增体系(50uL)：10μL 5X PrmierSTAR GXL缓冲液(含Mg2+)，4μL dNTPsMixture即dNTPs混合物(2.5mM)，1μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase DNA聚合酶(1.25U/uL)，各2μL上下游引物(10mM)，1μL cDNA，ddH2O补足到50uL。
4、构建pOX-OsHSFA4d载体
采用南京诺唯赞生物科技有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒，具体方法参见官网说明。
实施例2转pOX-OsHSFA4d的转基因水稻幼苗的制备
1、农杆菌EHA105感受态制备及转化
材料配制：YEB 1L，pH7.2，配方：酵母提取物1g，牛肉浸膏5g，蛋白胨1g，蔗糖5g，七水硫酸镁0.5g。
实验步骤：(1)挑取EHA105单菌落于10mL YEB液体培养基中(含利福平25mg/L),在28℃、220rpm条件下振荡培养过夜；
(2)取过夜培养菌液2mL接种于100mL YEB(25mg/L)液体培养基(250mL锥形瓶)中，在28℃、220rpm振荡培养(12-16hr)至OD600为1.0-1.5；
(3)将菌液分装在50mL的离心管中，迅速配平；
(4)将液体培养基置于冰上10min，期间不断振荡，同时将离心机、10mM CaCl2和50％甘油预冷；
(5)在4℃，5000rpm条件下离心5min，去除上清，加入40mL CaCl2用枪头轻轻吹打，悬浮细胞，冰上放置30min；
(6)在4℃5000rpm条件下离心5min，去除上清；加入700μL CaCl2用枪头轻轻吹打悬浮细胞(即为感受态细胞)，同时加入300μL甘油，混匀；
(7)分装在预冷的1.5mL的离心管中，每一管分50μL；
(8)放入液氮中速冻5min，保存在-70℃；
(9)在50μL刚融化的感受态细胞中加入2-5μL质粒DNA，冰上30min；
(10)液氮中5min；
(11)37℃水浴5min；
(12)冰上静置5min；
(13)加入1mL YEB(25mg/L),在28℃，200rpm条件下离心3hr；
(14)5000rpm离心5min,去部分上清，留400μL菌液涂布与抗性的25mg/L利福平的YEB平板上；
(15)在超净工作台上吹干，28℃倒置培养2-3天至长出菌落；
(16)PCR鉴定。
2、诱导愈伤组织(3-4周)
(1)挑选成熟健康的粳稻种子，去壳；
(2)用70％酒精消毒1min；
(3)用2.5％次氯酸钠溶液消毒30min；
(4)无菌水洗涤五遍；
(5)在无菌滤纸上吸干多余的水分，用镊子将种子整齐放置在N6D培养基上，用胶带密封平板；
(6)30℃，黑暗培养30-40天。
3、愈伤组织和农杆菌的准备(3-7天)
(1)选取单克隆农杆菌涂在AB培养基上23℃培养2-3天；。
(2)收集农杆菌，用30mL MSL培养基(50mL进口离心管)稀释至OD600为0.1，加30μL乙酰丁香酮。
(3)将愈伤组织倒入到农杆菌液体中，轻轻振荡3min；
(4)用5mL的移液体器快速将菌液吸干，在无菌滤纸上吸干多余菌液；
(5)用0.5mL含乙酰丁香酮的MSL培养液滴在一张无菌滤纸上，将无菌滤纸放置在2N6-AS培养基上，将侵染的愈伤组织放置在无菌滤纸上；
(6)23℃黑暗培养3天。
注：1.乙酰丁香酮是关键，不可以省去。乙酰丁香酮是诱导EHA105侵染毒性的诱导因子；
2.高活性的EHA105原始菌株也极为重要；
3.每次侵染愈伤不超过100个，要挑选淡黄色，球形结构紧密，半粒米到一粒米大小为最宜。
4、筛选抗性愈伤组织(3-4周)
(1)将感染的愈伤组织用无菌水冲洗10遍；
(2)在最后一遍清洗时，在无菌水中加入30μL羧苄青霉素,轻柔振荡3min，倒掉无菌水，将愈伤组织放置在无菌滤纸上，再换一份无菌滤纸，尽量除去多余的水分；
(3)将愈伤组织转移到N6DS培养基上，每板25个；
(4)用封口膜将平板密封，30℃，黑暗，培养两周(抗性愈伤有明显长大的时候)。
(5)待两周时，同样的方法进行第二次筛选。
注：有些侵染区域大(细胞)的很快长出，有些抗性愈伤生长较慢，一般一个月为期限。
5、再分化(3-4周)
(1)将继续膨大的抗性愈伤组织，放置在MS-NK培养基上，每个抗性愈伤组织必须分开放置(不是一个转化事件，要分开)。放置密度要小，不然影响再生。培养十天更换培养基；
(2)用封口膜将平板密封，放置在30℃，连续光照，4.5K Lux条件培养箱中(2-4周)出绿苗；
6、生根(1-2周)
将生长到3-4cm的转化植株转移到MS-HF培养基上，诱导生根。
实施例3OsHSFA4d过表达水稻性能测试
将五种水稻材料(日本晴、OX1、OX2、OX3和OX4)种植在添加氯化镉(0.4mg/Kg)的桶中(含18L农田土壤)培养至其完成整个生育期，其中日本晴为对照组。对水稻糙米中镉浓度进行分析，结果如图1所示，OsHSFA4d过表达植株糙米中镉的含量显著低于对照组，表明pOX-OsHSFA4d载体极抑制水稻籽粒中镉的积累。通过学生氏t-检验，将相应野生型的极显著性差异确定为**P<0.01。
在成熟期时，四种OsHSFA4d过表达株系的株高、分蘖数、千粒重和单株产量与野生型水稻(WT)均无差异，结果如图2所示，这表明在粳稻中转入pOX-OsHSFA4d载体不影响水稻在田间的农艺性状。通过学生氏t-检验，将相应野生型的显著性差异确定为*P<0.05。
Claims (5)
1.一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体，其特征在于：采用禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子构建基因表达载体。
2.根据权利要求1所述的一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以水稻根部总RNA为模板，反转录得到cDNA；
(2)以所得cDNA为模板，分别以pOX-OsHSFA4d-F和pOX-OsHSFA4d-A为特异性引物，利用PCR扩增得到OsHSFA4d的编码序列；
(3)将OsHSFA4d的编码序列与pOX载体连接，构建由禾本科植物玉米泛素Ubiquitin基因启动子驱动的pOX-OsHSFA4d载体。
3.根据权利要求2所述的一种水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述的特异性引物pOX-OsHSFA4d-F和pOX-OsHSFA4d-A的核苷酸序列如下所示：
pOX-OsHSFA4d-F 5`-ACGGCCAGTGCCAAGATGGCCGCCGTTCTTGAT-3`
pOX-OsHSFA4d-A 5`-CTGCAGGCATGCAAGAGTATCAGTGGAGGAGGC-3`。
4.一种权利要求1所述的水稻基因OsHSFA4d的基因表达载体在调控水稻镉吸收中的应用。
5.一种低镉积累水稻植株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将pOX-OsHSFA4d载体转化到农杆菌EHA105菌株中；
(2)利用转化后的农杆菌EHA105菌株侵染水稻愈伤组织；
(3)筛选获得转pOX-OsHSFA4d的转基因水稻幼苗。
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