CN105219785A - 毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用 - Google Patents

Abstract

毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用，它涉及一种毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用。其目的是提供毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用。毛果杨PtHSFAa基因的核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：1所示；氨基酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：2所示。该基因可以提高植物在高Zn胁迫下抗逆能力上的应用。本发明利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的拟南芥转基因株系有效地提高了植物对高Zn胁迫下的耐受性的特征。通过本发明可培育出抗高Zn的转PtHSFA4a基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。本发明应用于林木分子育种领域。

Description

毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用

技术领域

本发明涉及一种毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用。

背景技术

随着社会经济发展，环境污染日趋严重，原有的森林树种将会遇到与自然选择下有重大不同的环境胁迫压力。为保障人类生存环境和生活质量不再劣化，人类必须学会协助林木去更好更快地适应所遇到的各种随人类社会现代化而加剧和新出现的环境胁迫因素。由于林木生长周期长,遗传杂合性高，遗传机理不明，利用常规育种手段往往难以满足不同目的定向培育树木新品种的要求。近年来生物技术的发展以及分子育种研究的兴起，为利用基因工程手段改良林木、加速林木新品种的选育奠定基础。在植物抗逆分子育种中，作为一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达，与导入或改良个别功能基因相比，导入或改良一个转录因子是提高作物抗逆性更为有效的方法和途径。因此，研究抗逆相关的转录因子的调控机制对于研究植物的抗逆机理进而培育出抗逆性强的植物具有重要意义。毛果杨做为一个遗传背景清楚的模式植物，为林木遗传改良提供了很好的原材料。

锌(Zn)作为植物体内多种关键酶的辅因子，参与植物蛋白结合、酶活性的调节、转录水平调控、翻译水平调控及信号转导等生命活动，是植物生长发育所必需的微量元素之一。但是，Zn过量也会影响植物的正常生长发育，严重时甚至会导致植株死亡。研究发现，植物和其他生物主要通过对Zn的螯合、外排、隔离以及活性氧(ROS)清除等途径防御锌诱导的损伤。植物Zn抗性的分子机制主要集中在Zn转运子的研究上。而对其转录因子调控植物中重金属、特别是Zn解毒的作用机理研究的很少。

热激转录因子(HSFs)是一个重要的响应非生物胁迫的转录因子家族，在植物抗逆环境中发挥着十分重要的作用。是生物体在热胁迫和其他胁迫条件下基因转录激活信号转导通路中的重要成员。对于HSFs对重金属的抗逆调节，目前只发现水稻和小麦的HSFA4a基因特异性地参与对镉(Cd)胁迫的应答，在植物中还没有发现HSFs基因对其他重金属胁迫有特异性的抗性。

发明内容

本发明提供一种毛果杨基因及其氨基酸序列和应用。

本发明毛果杨PtHSFAa基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。

本发明编码毛果杨PtHSFAa基因的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。

本发明毛果杨PtHSFAa基因的应用是指在提高植物在高Zn胁迫下抗逆能力上的应用。

本发明公开了毛果杨中的PtHSFA4a转录因子的应用，本发明利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的拟南芥转基因株系有效地提高了植物对高Zn胁迫下的耐受性的特征。在高Zn胁迫下对PtHSFAa转基因拟南芥株系和WT(野生型拟南芥株系)的细胞的受损情况、生理指标进行了观察，发现在高Zn胁迫下转基因株系细胞受损程度明显低于WT并且生理指标的结果也验证了PtHSFA4a基因的过表达株系抗逆能力明显高于WT。通过本发明首次发现HSFs特异性的提高植物在高Zn胁迫下的抗性，可培育出抗高Zn的转PtHSFA4a基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为毛果杨HSFA4a基因PCR产物的胶回收电泳图谱，M为DL2000DNAMarker，1～5为PCR产物；

图2为实时荧光定量PCR分析在NaCl胁迫下毛果杨叶片中PtHSFA4a基因的表达数据图；其中a为胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫3h，d为胁迫10h；

图3为实时荧光定量PCR分析在ABA胁迫下毛果杨叶片中PtHSFA4a基因的表达数据图；a为胁迫0h，b为胁迫2h，c为胁迫4h，d为胁迫6h；

图4为实时荧光定量PCR分析在PEG6000胁迫下毛果杨叶片中PtHSFA4a基因的表达数据图；a为胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫3h，d为胁迫10h；

图5为实时荧光定量PCR分析在FeCl₃胁迫下毛果杨根、茎、叶处的PtHSFA4a基因的表达数据图；a为胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫3h，d为胁迫10h；

图6为实时荧光定量PCR分析在CuSO₄胁迫下毛果杨根、茎、叶处的PtHSFA4a基因的表达数据图；a为胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫3h，d为胁迫10h；

图7为实时荧光定量PCR分析在CdCl₂胁迫下毛果杨根、茎、叶处的PtHSFA4a基因的表达数据图；a为胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫3h，d为胁迫10h；

图8为实时荧光定量PCR分析在ZnSO₄胁迫下毛果杨根、茎、叶处的PtHSFA4a基因的表达数据图；a胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫6h，d为胁迫16h；

图9为实时荧光定量PCR分析在AgNO₃胁迫下毛果杨根、茎、叶处的PtHSFA4a基因的表达数据图；a胁迫0h，b为胁迫1h，c为胁迫6h，d为胁迫16h；

图10为PtHSFA4a过表达载体转入农杆菌中PCR电泳检测图，M为DL2000DNAMarker，1-4为PtHSFA4a基因；

图11为PtHSFA4a基因的亚细胞定位分析；

图12为PtHSFA4a转基因拟南芥在卡那霉素的1/2MS培养基筛选情况；

图13为被卡那霉素筛选后的T₀代PtHSFA4a转基因拟南芥基因组水平上的PCR检测，M为DL2000DNAMarker，D为阳性对照，WT为阴性对照，1～22为转基因植株；

图14提取PtHSFA4a转基因拟南芥阳性植株的转录水平上的PCR检测，M为DL2000DNAMarker，D为阳性对照，1～12为转基因植株；

图15为野生型拟南芥植株根部荧光图；

图16为PtHSFA4a转基因拟南芥植株根部荧光图；

图17为在Zn胁迫下WT和PtHSFA4a转基因拟南芥的萌发率比较图；

图18为WT和PtHSFA4a转基因拟南芥种在1/2MS培养基中生长10天的根部情况对比图；

图19为WT和PtHSFA4a转基因拟南芥种在含ZnSO₄1mmol/L的1/2MS培养基中生长10天的根部情况图；

图20为野生型拟南芥和转基因拟南芥种入土中3周后苗生长情况图；

图21为对土培3周的苗进行1mol/L的ZnSO₄浇灌处理恢复10天后的苗生长情况图；

图22为用1mol/L的ZnSO₄溶液分别浇灌转基因和野生型拟南芥土培苗20h、40h和60h后取其叶片进行的NBT染色图；

图23为用1mol/L的ZnSO₄溶液分别浇灌转基因和野生型拟南芥土培苗20h、40h和60h后取其叶片进行的DAB染色图；

图24分别用取在培养基中培养6d的WT和转基因拟南芥苗，放入含0.5mol/L、1mol/L和1.5mol/L的ZnSO₄培养基中培养16h后在苯胺蓝中染色图；

图25为在Zn胁迫下WT和PtHSFA4a转基因拟南芥植株MDA含量测定图；其中a为WT，b为line2，c为胁迫line4，d为胁迫line5；

图26为在Zn胁迫下WT和PtHSFA4a转基因拟南芥植株SOD活性测定图；其中a为WT，b为line2，c为胁迫line4，d为胁迫line5；

图27为在Zn胁迫下WT和PtHSFA4a转基因拟南芥植株POD活性测定图；其中a为WT，b为line2，c为胁迫line4，d为胁迫line5；

图28为在Zn胁迫下WT和PtHSFA4a转基因拟南芥植株H₂O₂含量测定图；其中a为WT，b为line2，c为胁迫line4，d为胁迫line5；

图29为在Zn胁迫下WT和PtHSFA4a转基因拟南芥植株相对电导率测定图；其中a为WT，b为line2，c为胁迫line4，d为胁迫line5。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式毛果杨PtHSFA4a基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。

本实施方式公开了毛果杨中的PtHSFA4a转录因子的编码基因和应用，本实施方式利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的拟南芥转基因株系有效地提高了植物对高Zn胁迫下的耐受性的特征。在高Zn胁迫下对PtHSFAa转基因拟南芥株系和WT(野生型拟南芥株系)的细胞的受损情况、生理指标进行了观察，发现在高Zn胁迫下转基因株系细胞受损程度明显低于WT并且生理指标的结果也验证了PtHSFA4a基因的过表达株系抗逆能力明显高于WT。通过本发明首次发现HSFs特异性的提高植物在高Zn胁迫下的抗性，可培育出抗高Zn的转PtHSFA4a基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。

具体实施方式二：本实施方式编码毛果杨PtHSFA4a基因的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。

具体实施方式三：本实施方式毛果杨PtHSFA4a基因的应用是指在高Zn胁迫下抗逆能力提高上的应用。

实施例一、毛果杨PtHSFA4a基因的获得以及表达特性分析如下：

1.1目的基因的克隆

1.1.1目的基因序列的获得

在目的基因序列两端设计引物如表1。

表1

利用CTAB法提取毛果杨总RNA，并且反转录成cDNA。以此cDNA为模板，使用LATaq酶体系进行目的基因的克隆，反应程序为95℃5min→(95℃30s→58℃30s→72℃90s)35个循环→72℃7min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR体系为

1.1.2.目的基因连接T载体测序

对目的片段产物进行胶回收如图1，将回收产物连接到T载体，大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，将挑取9个白色菌落进行扩大培养PCR检测，提取阳性质粒后进行测序。经检测,核苷酸序列如SEQIDNO：1所示,将该基因片段命名为PtHSFA4a，由1221bp个碱基组成。

1.2毛果杨PtHSFA4a基因表达特性分析(qRT-PCR)

1.2.1.引物设计

设计PtHSFA4a基因特异性引物A4aF、A4aR及Actin内参引物ActinF、ActinR，如表2。

表2引物序列

1.2.2.对毛果杨组培苗进行各种非生物胁迫处理

组培苗毛果杨植株在NaCl、ABA和PEG6000胁迫下取其叶片，在FeCl_3、CuSO₄、CdCl₂、ZnSO₄和AgNO₃胁迫下取其根、茎和叶片提取RNA并且反转录的产物为模板，进行实时荧光定量PCR反应，体系如下：

按两步法反应程序进行扩增：预变性95℃30s；95℃5s→64℃30s45个循环，从55℃逐步升温到99℃，每隔0.5℃收集1次荧光。将得到的数据输入excel中，分析数据并使用2^-ΔΔCt法进行数据计算，做图(图2～9)。结果表明该基因在过量Zn胁迫下根茎叶都有上调表达的趋势，推测在高Zn胁迫下，这个基因可能参与植物的调控作用。

实施例二、转基因手段分析PtHSFA4a基因功能

2.1设计引物

设计构建过表达载体的带有酶切位点的引物及载体检测引物，如下表。

表3引物序列

2.2实验方法

2.2.1pBI121-PtHSFA4a-GFP过表达载体构建

PtHSFA4a基因以HSFA4aF和HSFA4aR为引物扩增后，产物选取了SalI和XbaI两个酶切位点构建到表达载体pBI121MCS-GFP上。经PCR后电泳、双酶切及测序检测后，确定载体构建成功。

2.2.2农杆菌介导的拟南芥遗传转化

1.将克隆pBI121-PtHSFA4a-GFP载体转化到EHA105农杆菌细胞中，28℃培养2天。

2.挑取单克隆农杆菌到5ml50mg/LKan的LB液体培养基中，28℃进行小摇，第二天将500μL小摇的菌液加入250mL50mg/LKan的LB液体中28℃至菌液OD600为0.8～1.0，将菌液放入灭菌离心管4000rpm，4℃离心5min，用相同体积的5％(5g蔗糖/100mL水)的蔗糖水对菌液进行重悬，加入SilwetL-77，加入量为每100mL加入20μL，然后作为侵染工程菌液。

3.选取培养1个月生长健壮、高约4-6cm和具有大量的半开的花苞和极少数的果荚的拟南芥,将花苞在菌液中侵染3-5s，取出花苞用吸水纸吸去多余菌液，用保鲜膜包裹放入暗处16h-24h。

4.等到拟南芥角果发黄，进行收集T₀代种子，在37℃烘干24h，室温48h，放入4℃冰箱一周后备用。

2.2.3PtHSFA4a基因的亚细胞定位

将pBI121-PtHSFA4a-GFP质粒和pBI121-GFP制备成DNA微弹，利用基因枪的方法打入新鲜洋葱的第4～7层鳞茎内表皮即使用基因枪瞬时转化洋葱细胞，利用激光共聚焦显微镜显微镜观察其亚细胞定位。

2.2.4转基因拟南芥的PCR检测

分别以野生型(WT)和转基因拟南芥为材料，CTAB法提取拟南芥基因组DNA，方法参照实施例一。以pBI121-GFP为阳性对照，以WT的总DNA为阴性对照，对筛选的转化植株进行PCR检测。

2.2.5转基因拟南芥的多种胁迫

将转PtHSFA4a基因的拟南芥T₃代line2，line4，line5和WT(野生型拟南芥株系)的种子在20％的次氯酸钠溶液中消毒20min，最后用灭菌的蒸馏水漂洗5-6次，分别种入1/2MS培养皿和含有CuSO₄、ZnSO₄、CdCl₂、NaCl、ABA和甘露醇的培养基中，观察其萌发率。

2.3结果与分析

2.3.1PtHSFA4a过表达载体转入农杆菌

将上边的双酶切的号测序，结果选取最好的号进行转农杆菌。挑取板上的单菌落PCR检测，跑电泳，结果如图10所示。从图中可以看出，在1221bp处有条带，说明已将中间表达载体已经导入到农杆菌中。将阳性菌落存菌。

2.3.2PtHSFA4a基因的亚细胞定位

将打完基因枪的洋葱表皮附在载玻片上在激光共聚焦显微镜下观察并拍照如图11，发现PtHSFA4a基因定位于细胞核、细胞质和细胞膜上。

2.3.3PtHSFA4a基因过表达株系的筛选

T₃代转基因株系的获得

在含有50mg/L的卡那霉素的1/2MS培养基中种入T₀种子进行筛选有抗性的植株第一代，在7d左右，没有转入目的基因的植株根系较短，叶片发黄，未能长出四片真叶，甚至死亡。而转化的植株，根系较发达，可以长出真叶，在培养基中正常生长(图12)。继续收获种子为T₁代。继续进行Kan筛选，直到T₃代种子收获。这时转基因植株为纯合株系可以用于后期实验的研究。

2.3.4PtHSFA4a转基因拟南芥的PCR检测

2.3.4.1PtHSFA4a转基因拟南芥基因水平上的PCR鉴定

以提取的DNA为模板，将PtHSFA4a的特异性引物(表3)，以pBI121-GFP为阳性对照、WT(野生型拟南芥)为阴性对照进行PCR检测，转基因植株可以扩增出特异性条带，我们在WT中未出现特异性的条带长度为1221bp(图13)，可以初步得出结论，植株的转化成功。

2.3.4.2PtHSFA4a转基因拟南芥RNA水平上的PCR鉴定

近一步对转基因植株分析，将DNA水平上有条带的19个转化植株提取高质量的RNA为模板，反转录成cDNA，再以其为模板进行PCR检测。PCR出的特异条带与质粒PCR出的特异条带在一条线上为1221bp(图14)，进一步证明PtHSFA4a基因已经进行了转录。

2.3.5PtHSFA4a转基因拟南芥的表达水平上的荧光检测

连接目的基因的载体上有GFP荧光蛋白，如果这个基因在细胞内表达，同时导致GFP蛋白的共表达，导致细胞发绿色荧光。选取转录水平上比较亮的转基因植株和WT用荧光正直显微镜观察发现转基因株系荧光亮度比对照的强很多如图15和16中可以观察到。

2.3.6转基因拟南芥的抗逆能力筛选

用同样的转基因拟南芥株系(line2、line4和line5)T₃代种子和非转基因对照拟南芥(WT)株系进行种子萌发率的实验，种子消毒后，用200μL的移液枪在含有各种胁迫的1/2MS培养基中分别点入一定数量的种子，光照培养7d后观察各种胁迫下的萌发率，观察到在CuSO₄、ZnSO₄、CdCl₂、NaCl、ABA和甘露醇这6个条件下，发现结果表明：仅仅在Zn条件下，三个转基因株系T₃代种子萌发率在各个梯度条件下明显高于野生型的种子，说明了这个基因特异性的提高了转基因株系的抗高Zn的能力如图17。

实施例三、Zn胁迫下转基因拟南芥的抗逆性分析以及细胞受损情况研究

3.1植物材料

转基因拟南芥(line2、line4和line5)T₃代种子以及非转基因对照拟南芥(WT)种子，以下实验至少重复三次。

3.2实验方法

3.2.1Zn胁迫下转基因拟南芥的抗逆性分析

将转PtHSFA4a基因的拟南芥T₃代的种子消毒种入1/2MS培养皿和含有ZnSO₄的1/2MS培养基中，观察萌发率。将生长在1/2MS培养基4d后的拟南芥放入胁迫条件ZnSO₄1mmol/L下观察幼苗的根长及生长情况。将转基因株系及WT培养基培养7d后，种入土中3周后进行胁迫处理ZnSO₄1mmol/L灌溉处理40h恢复生长10d后观察成苗的抗逆能力。

3.2.2Zn胁迫下转基因拟南芥细胞受损情况研究

将转PtHSFA4a基因的拟南芥T₃代和WT的种子消毒种入培养基，培养7-8d待苗长出两叶一芯后种入土中，温室培养3-4周以后，用ZnSO₄1mmol/L浇灌后取大小相同的叶片，这些叶片都进行NBT、DAB染色，将在1/2MS培养平板上生长6d的拟南芥分别放入不同浓度Zn胁迫下，对根部进行苯胺蓝染色。

苯胺蓝染色是将组培苗放入干净的2mL的离心管中，加入0.25％苯胺蓝染色液5h后，用蒸馏水反复清洗直到没有浮色。

3.2.3Zn胁迫下转基因拟南芥的生理指标测定

3.2.3.1MDA含量测定

分别取对照和两种胁迫下的12个样，每个样取0.04g左右，用液氮速冻后进行研磨，迅速加入1.5mL的10％的三氯乙酸，4℃冰箱放置30min，11000rpm离心10min，吸取1mL的上清液于新的离心管中，然后加入1mL的0.6％TBA混匀，沸水浴15min，立即放入冰上冷却10min，室温下12000rpm离心20min；取上清液2mL在532nm和450nm下进行测OD值，对照管是1mL的0.6％TBA和1mL的水。

根据以下公式即可计算样品提取液中的丙二醛的含量C和单位质量样品中的丙二醛的含量y，计算公式：C(MDA浓度μmol/L)＝6.45×OD523-0.56×OD450；y(μmol/g)＝(c×v)/w。

3.2.3.2SOD含量测定

现处理拟南芥植株用液氮对整个植株速冻之后对植物材料进行研磨，取0.02g样离心管中，之后加入1.5mL的1/15mol/L磷酸缓冲液，在4℃冰箱中放置30min，11000rpm离心20min，去上清的酶液50μL放入新的2mL离心管中，之后加入1.5mL的SOD反应液和450μL1/15mol/L磷酸缓冲液；30℃，6级光照培养10min，发现变蓝，随后立即测吸收光值(OD560),用缓冲液置于暗处进行调零，SOD反应液照光做为对照。

A1：0.5mLH₂O+1.5mLSOD反应液光照后测OD值；A2：0.5mL酶液(已经稀释10倍)+1.5mLSOD反应液光照后测OD值(每个样品重复三次)；2mL1/15mol/L磷酸缓冲液放入暗处用于调零。

计算SOD的活性公式：SOD活性＝(N×ΔA)/(W×T×50％)；其中，ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀释倍数；T代表反应时间(min)；W代表物材料植物材料的净重。

3.2.3.3H₂O₂含量测定用的是试剂盒的方法。

3.2.3.4POD含量测定

现处理拟南芥植株用液氮对整个植株速冻之后对植物材料进行研磨，取0.02g样加入2mL的离心管中，之后向离心管中加入1.5mL的0.01mol/L磷酸缓冲液，每个样品3个生物学重复，在4℃冰箱中放置0.5h，11000rpm离心20min，取上清的酶液1mL加入2mL离心管中4℃冰箱保存，取酶液0.5mL酶液中加入0.5mL0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)，0.5mL愈创木酚溶液，充分混匀，30℃反应10min，在测定之前加入0.5mL0.8％H2O2，混匀用722S分光光度计在470nm处测各样品的OD值，以ddH₂O替代作为对照值，并以ddH₂O进行调零。需要注意的是在测定的时候要迅速，测每30s读一次OD值，直到数不再变化为止，将这些点连起来，会形成一个曲线，酶液在所测定用时内的变化值一般取曲线初始线性部分的OD变化值。POD活性计算：POD活性＝(N×ΔA)/(W×T)；其中ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀释倍数；T代表反应时间(min)；W代表植物材料粉末的净重。

3.2.3.5相对电导率的测定

取各种胁迫下的植物叶片，用水洗去上面的灰尘，然后用双蒸馏水流动冲洗多次，用滤纸吸净表面水分，取面积大小几乎一样的叶片放入三角瓶中，加入50mL的蒸馏水，3-5h后，用电导仪测其电导值S1，然后将三角瓶置于水浴锅中90℃热浴20min，注意期间不要将三角瓶弄撒。随后冷却到室温，测这时候的电导值S2，相对电导值为S1/S2,需要注意的是在测电导值之前需要对电导仪进行校正。所有数据分析采用Execl中的单因素分析。

3.3实验结果

3.3.1Zn胁迫下转基因PtHSFA4a拟南芥的抗逆能力分析

3.3.2.1Zn胁迫下转基因拟南芥幼苗的抗逆分析

选取转PtHSFA4a基因的拟南芥T₃代株系用于消毒，种在1/2MS培养基中，待种子发芽4d后种入含ZnSO₄1mmol/L的培养基中(1/2MS培养基中琼脂含量为11g/L)，光照垂直培养，未处理WT和PtHSFA4a转基因拟南芥(line2、line4和line5)种在1/2MS培养基中生长10d前后的根部情况对比图如图18所示；WT和PtHSFA4a转基因拟南芥(line2、line4和line5)种在含ZnSO₄1mmol/L的1/2MS培养基中根部情况图如图19所示。结果表明：转基因拟南芥在Zn胁迫下的长势比野生型拟南芥强很多，说明了这个基因转入拟南芥后提高了拟南芥对高Zn的抵抗力。

3.3.2.2Zn胁迫下转基因拟南芥的萌发情况

实施例二2.3.6中进行了种子萌发率的实验，结果表明：三个转基因株系T₃代种子萌发率在各个梯度条件下明显高于野生型的种子，说明了转基因拟南芥株系在过量Zn下的耐受力强。

3.3.2.3Zn胁迫下转基因拟南芥成苗的抗逆分析

将转基因拟南芥(line2、line4和line5)和WT种子消毒后，播种于1/2MS培养基上，等到种子生长7d后，移栽入土中继续生长3周如图20转基因拟南芥和WT长势一致。用含有1mol/LZnSO₄水溶液浇灌处理植株，恢复生长10d后如图21，观察各植株的长势情况，转基因的生长状况明显比WT好的多，结果表明：将PtHSFA4a基因转入拟南芥后提高了拟南芥抗过量Zn胁迫的能力。

3.3.3Zn胁迫下转基因拟南芥细胞受损情况研究

NBT和DAB染色具有相同的处理条件：取生长到3周后的土培苗，用1mol/L的ZnSO₄浇灌转基因拟南芥(line2、line4和line5)和野生型拟南芥(WT)分别处理20h、40h和60h，取其叶片进行染色。

3.3.3.1NBT染色法分析逆境下转基因植株细胞内超氧离子水平

NBT(NitroblueTetrazolium,硝基四氮唑蓝)还原法，在植物体内NBT被超氧离子O^2-氧化成蓝色甲腙，通过蓝色的深浅可以反映O^2-含量的多少。取样进行染色如图22；结果表明：在正常生长条件下，转基因株系和野生型株系叶片上分布着很少的蓝色斑块，且并无明显的变化，说明O^2-含量基本一致；在Zn胁迫条件下，随着胁迫时间的增加不同转基因株系植株以及WT植株叶片上的斑块的颜色和面积均有明显的变化。PtHSFA4a过表达株系植株叶片上的蓝色斑块明显少于WT的植株叶片，颜色明显浅于WT的植株叶片，说明转基因株系中的O^2-的含量比WT植株叶片内的O^2-含量少。

3.3.3.2DAB染色法分析逆境下转基因植株细胞内过氧化氢水平

DAB(Diaminobenzidine,二氨基苯胺)是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。用于定位过氧化酶活性的具体部位和活性。可以通过染色的深浅，准确的可以反映出H₂O₂含量的多少。取样进行染色如图23；结果表明：在正常生长条件下，转基因株系的叶片和WT植株的叶片上分布着很少的棕色斑块，无明显的差异，说明H₂O₂含量基本相同；在Zn胁迫条件下，随着胁迫时间的增加，转基因株系植株以及WT植株叶片上的斑块的颜色和面积均有明显的变化。而且过表达株系叶片上的棕色斑块明显少于WT的植株叶片而且颜色浅，很好的说明了转基因株系叶片内的H₂O₂的含量比WT株系的植株叶片内的H₂O₂含量少。试验结果说明在胁迫条件下PtHSFA4a转基因拟南芥比WT拟南芥抗逆能力强。

3.3.3.3苯胺蓝染色法分析逆境下转基因植株细胞的受损情况

苯胺蓝染色法原理是正常的细胞具有完整的功能正常的细胞膜，使外界的苯胺蓝无法进入细胞内部，如果功能不正常或者膜不完整的细胞，导致被苯胺蓝染成蓝色。分别用取在培养基中培养6d的组培苗，放入含0.5mol/L、1mol/L和1.5mol/L的ZnSO₄培养基中培养16h后在苯胺蓝中染色16h如图24。结果表明：在正常生长条件下，所有株系根部上的蓝色比较淡且无明显差异，说明细胞损伤的情况基本相同；在Zn胁迫条件下，随着胁迫时间的增加转基因株系植株以及WT植株根部的颜色均明显变深。过表达株系根部的颜色明显比WT植株叶片的颜色浅，说明转基因植株根部的损伤程度较WT损伤程度小。试验结果说明PtHSFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高Zn作用。

3.3.4Zn胁迫下转基因拟南芥各项生理指标的研究

将转基因拟南芥(line2、line4和line5)和野生型拟南芥(WT)T₃代纯合系的种子消毒后，播种于1/2MS培养基上，待种子萌发7d后，移入土中继续生长3周后。之后用ZnSO₄溶液浇灌处理40h后，取不同植株的叶片用于以下生理生化指标的测定分析，用正常生长条件下植株的叶片作为对比。

3.3.4.1MDA(丙二醛)含量的测定

植物在逆境条件下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，可通过检测MDA的含量来检测膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度和植物的抗逆性，结果如图25所示：结果如下：在胁迫条件下，转基因株系和WT的MDA值都有提高，在Zn胁迫条件下，转基因株系及WT的MDA的含量改变的程度不同。采用单因素方差分析先进行组内比较，发现当a＝0.05，P<0.01,在Zn胁迫条件下转基因株系的MDA值相对WT的MDA值差异极显著。很好的说明了转基因株系中MDA活性的升高没有WT的MDA活性升高的程度大，过表达株系的MDA含量明显低于WT，说明了转基因植株的抗高Zn胁迫能力明显优于WT，试验结果表明PtHSFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高Zn功能。

3.3.4.2SOD(超氧化物歧化酶)活性的测定

SOD能够通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O^2－)，生成H₂O₂和O₂，抵御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，增强了植物的抗逆功能，如图26，结果如下：WT和转基因株系在在各种胁迫下SOD活性都比正常情况下有所增加，说明了在胁迫下WT和转基因株系都增加了清除超氧自由基(O^2－)的能力，对各种条件进行组内单因素分析，在正常生长条件下(control)，当a＝0.05，0.01<P<0.05，WT与转基因株系差异显著，说明在正常情况下转基因株系比WT的SOD活性高一些；在Zn胁迫条件下，当a＝0.05，P<0.01，WT与转基因株系差异极显著，说明了在Zn胁迫下转基因株SOD活性比WT的SOD活性高很多。PtHSFA4a基因的过表达株系的抗逆境胁迫能力明显优于WT试验结果表明：PtHSFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高Zn功能。

3.3.4.3POD(过氧化物酶)活性的测定

POD是生物体内酶促防御系统的重要保护酶，能够清除植物体内氧自由基，提高其抗逆性。结果如图27所示：结果如下：WT和转基因株系在胁迫下POD活性都比正常情况下有所增加，说明了在胁迫下WT和转基因株系都增加了清除体内氧自由基的能力，采用单因素方差分析进行组内比较，发现在正常生长条件下(control)，a＝0.05，P>0.05，差异不显著，转基因株系以及WT的POD活性基本相同；在Zn胁迫条件下，a＝0.05，P<0.01，差异极显著，转基因株系以及WT的POD活性都发生显著的改变。PtHSFA4a基因的过表达株系POD活性都高于WT，说明转基因植株的抗高Zn胁迫能力明显优于WT株系。试验结果表明PtHSFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高Zn功能。

3.3.4.4H₂O₂含量的测定

H₂O₂是体内活性氧代谢的产物。H₂O₂的产生可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，从而使细胞膜遭受损害，加速了细胞的衰老和解体，H₂O₂的含量越高代表细胞的受损伤程度越大，结果如图28所示：

结果如下：WT和转基因株系相对于正常生长情况在各种胁迫下H₂O₂含量都有所升高，在正常生长条件下(control)，利用单因素分析，当a＝0.05时，P>0.05，说明了WT与三个不同转基因株系的H₂O₂含量差别不显著；在ZnSO₄生物胁迫条件下，当a＝0.05时，P<0.01，WT与各个转基因株系的H₂O₂含量差别极显著，说明了在Zn胁迫条件下PtHSFA4a基因的过表达株系Line2、line4和line5中H₂O₂含量明显低于WT，说明line2、line4和line5的抗高Zn胁迫能力明显高于WT。试验结果说明PtHSFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高Zn作用。

3.3.4.5相对电导率含量的测定

相对电导率是衡量细胞膜透性情况的一个生理指标，细胞膜在逆境胁迫下受损最后导致了细胞内的电解质外渗，相对电导率越大表明细胞膜的破坏程度越大最后影响植物的抗逆能力。结果如图29所示：

结果如下：WT和转基因株系相对于正常生长情况在各种胁迫下相对电导率都有所升高，在正常生长条件(control)、ZnSO₄非生物胁迫条件下，进行组内单因素分析，当a＝0.05时，P<0.01，说明了WT和line2、line4和line5三个不同转基因株系的相对电导率差异极显著。PtHSFA4a基因的过表达株系比WT的相对电导率小很多，说明这三个株系抗逆程度基本相同且远强于WT株系。试验结果说明PtHSFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高Zn作用。

实施列1～3中所用药品皆为市售产品。从实施例可知，利用农杆菌介导法将包括PtHSFA4a基因的pBI121-GFP的质粒转入野生型拟南芥植株。获得转基因株系，选取过表达植株中基因表达量比较高的三个株系line2、line4和line5和野生型拟南芥株系WT用于各种非生物胁迫下萌发率的观察，最后发现在高Zn胁迫下转基因株系的萌发率高。于是我们更进一步的验证实验结果，通过对不同生长阶段的T₃代纯合植系和WT进行高Zn条件下的抗逆能力分析。在根长实验中，转基因株系的根长比WT长而且侧根也比较多。对成苗在胁迫条件下的长势研究表明，在胁迫后恢复生长发现转基因株系的长势明显强于WT植株。再一次说明PtHSFA4a基因在高Zn胁迫下具有很重要的抗逆功能。同时通过DAB染色、NBT染色、苯胺蓝染色对转基因株系和WT在高Zn胁迫下细胞的受损情况进行了观察，发现在高Zn胁迫下WT细胞受损程度明显高于转基因株系，也验证了上面的结论。通过各项生理指标的测定，发现在高Zn胁迫条件下，PtHSFA4a基因的过表达株系的抗逆能力明显高于WT，其中line2的抗逆能力最高。本实验说明PtHSFA4a基因转入拟南芥植株体内提高了植物在高Zn胁迫下的抗逆能力。

Claims (3)

1.毛果杨PtHSFA4a基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。

2.编码权利要求1所述的毛果杨PtHSFA4a基因的氨基酸序列，其特征在于该基因的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。

3.如权利要求1所述的毛果杨PtHSFA4a基因的应用，其特征在于它在提高植物在高Zn胁迫下抗逆能力上的应用。