CN105695483B - 长白落叶松LoERF017基因及其氨基酸序列和应用 - Google Patents

长白落叶松LoERF017基因及其氨基酸序列和应用 Download PDF

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Abstract

长白落叶松LoERF017基因及其氨基酸序列和应用，涉及一种长白落叶松LoERF017基因及其氨基酸序列和应用。本发明提供一种落叶松基因及其氨基酸序列和应用。该LoERF017基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在干旱胁迫下对LoERF017转基因拟南芥株系和WT的细胞的受损情况、生理指标进行了观察，发现在干旱胁迫下转基因株系细胞受损程度明显低于WT，并且生理指标的结果也验证了LoERF017基因的过表达株系抗逆能力明显高于WT。该基因可在提高植物在干旱胁迫下抗逆能力上应用。

Description

长白落叶松LoERF017基因及其氨基酸序列和应用
技术领域
本发明涉及一种长白落叶松LoERF017基因及其氨基酸序列和应用。
背景技术
逐渐增加的证据表明，森林越来越容易受到气候和相应的干扰而引起消亡。在过去 20年中，人们已经发现大多数树木的大量死亡是由于干旱和炎热的气候条件引起的。温度、降水、昆虫和病原体和像干旱这些更为严重的气候问题被预计为增加森林死亡率的主要因素。所以培育出抗旱的林木品种对改善森林结构具有重要作用和意义。传统的杂交育种由于依赖于优良品种资源，取得抗逆新品种的年限长、效果欠佳。随着现代分子生物学技术的发展，以及植物抗逆调控机制研究的不断深入，鉴定出一些重要的抗逆功能基因，并通过转基因方法成功运用于植物抗逆改良育种中。以往关于植物抗逆或材性方面的研究，主要在模式植物如拟南芥，经济作物如水稻、大豆中进行，对林木植物研究的较少，其中主要集中在对杨柳的抗逆研究方面，而对针叶树种的研究更少。长白落叶松是我国东北部山地的主要针叶用材树种，其木材重而坚实，抗压、耐腐蚀性和抗弯性好，是优质的加工木材，常被用于建造桥梁、道路等，更是北方针叶树中的一个重要的造纸树种。其根系浅、侧根发达，耐严寒；对土壤要求不高，有一定的耐旱性和耐水湿能力，属于速生树种。开展落叶松抗逆分子调控机制的研究和抗逆基因的挖掘研究，对于通过分子育种手段加速落叶松抗逆性状的遗传改良具有重要意义。
转录调控是植物生长发育、逆境反应、信号传导等一系列基因表达的最主要调控形式，转录因子在其中起重要作用。植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状， 单个基因表达的增强并不能从根本上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，转录因子能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的结合蛋白，从而激活或抑制下游基因的转录表达。在基因的表达调控过程中，转录因子起关键作用。
ERF是植物所特有的一类转录因子，参与植物多个信号传导途径的调控，同植物的生长发育、对生物胁迫和非生物胁迫的耐性密切相关。ERF是AP2/EREBP转录因子家族的一个亚家族，ERF型转录因子在这些激素介导的植物生物胁迫防御中起着纽带，桥梁的作用。同植物的生长发育、对生物胁迫和非生物胁迫的耐性密切相关。目前的研究显示，ERF具有优良的抗逆能力，调控了多种抗逆途径。从拟南芥中克隆到一个编码 AP2/ERF类转录因子基因HARDY，将该基因转入水稻中后能在干旱胁迫下提高植株的水分利用效率及生物量/用水量比率。此外，将该转录因子基因AtNF-YB1和ZmNF-YB2 分别转入拟南芥和玉米中，提高了植株的抗旱能力和缺水条件下玉米的产量。将大豆的 ERF基因GmERF3转入水稻后过表达发现植株的耐盐性、耐旱性和抗病性都提高了。因此，选择优质落叶松为材料分离、鉴定AP2/EREBP转录因子并分析其抗逆功能，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。
发明内容
本发明提供一种落叶松基因及其氨基酸序列和应用。
本发明长白落叶松LoERF017基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
本发明编码长白落叶松LoERF017基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明长白落叶松LoERF017基因的应用是指在提高植物在干旱胁迫下抗逆能力上的应用。
本发明长白落叶松LoERF017基因可提高植物在干旱胁迫下的抗逆能力上的应用。
本发明公开了落叶松中的LoERF017转录因子的编码基因和应用，本发明利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的拟南芥转基因株系有效地提高了植物对干旱胁迫下的耐受性的特征。在干旱胁迫下对LoERF017转基因拟南芥株系和WT(野生型拟南芥株系)的细胞的受损情况、生理指标进行了观察，发现在干旱胁迫下转基因株系细胞受损程度明显低于WT，并且生理指标的结果也验证了LoERF017基因的过表达株系抗逆能力明显高于WT。通过本发明首次克隆LoERF017基因全长，发现LoERF017提高植物在干旱胁迫下的抗性，可培育出耐干旱的转LoERF017基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。
附图说明
图1为落叶松RNA电泳图谱；
图2为LoERF017基因的3’RACE电泳图谱，M为DL2000 DNAMarker；
图3为落叶松LoERF017基因PCR产物的胶回收电泳图谱，M为DL2000 DNA；
图4为实时荧光定量PCR分析在PEG胁迫下落叶松根、茎、叶片中LoERF017基因的表达数据图；
图5为实时荧光定量PCR分析在NaCl胁迫下落叶松根、茎、叶片中LoERF017基因的表达数据图；
图6为实时荧光定量PCR分析在SNP胁迫下落叶松根、茎、叶片中LoERF017基因的表达数据图；
图7为实时荧光定量PCR分析在ABA胁迫下落叶松根、茎、叶片中LoERF017基因的表达数据图；
图8为LoERF017过表达载体转入农杆菌中PCR电泳检测图，M为DL5000 DNAMarker，1-2为LoERF017基因；
图9为LoERF017亚细胞定位分析；
图10为LoERF017转基因拟南芥在卡那霉素的1/2MS培养基筛选情况；
图11为被卡那霉素筛选后的T0代LoERF017转基因拟南芥基因组水平上的PCR检测，M为DL2000 DNAMarker，+为阳性对照，-为阴性对照，1～9为转基因植株；
图12为提取LoERF017转基因拟南芥阳性植株的转录水平上的PCR检测，M为DL2000 DNA Marker，+为阳性对照，-为阴性对照，line1～line9为转基因植株；
图13为在300mM的mannitol胁迫下WT和LoERF017转基因拟南芥的萌发率比较图；
图14为WT和LoERF017转基因拟南芥种在1/2MS培养基中生长8天的根部生长情况对比图；
图15为用300mmol mol/L的甘露醇(mannitol)溶液分别浇灌转基因和野生型拟南芥土培苗0h、24h和72h后取其叶片进行的NBT染色图；
图16生长4周的野生型和转基因拟南芥土培苗在经300mM甘露醇胁迫0h、24h、72h后取其叶片进行苯胺蓝染色；
图17为在甘露醇(manitol)胁迫下野生型(WT)和LoERF017转基因拟南芥植株 MDA含量测定图；
图18为在mannitol胁迫下WT和LoERF017转基因拟南芥植株SOD活性测定图；
图19为在mannitol胁迫下WT和LoERF017转基因拟南芥植株POD活性测定图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式长白落叶松LoERF017基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
具体实施方式二：本实施方式编码长白落叶松LoERF017基因的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
以下实施例中如无特别说明均为常规方法。
实施例1：长白落叶松LoERF017基因的获得方法如下：
一、目的基因的3’RACE
1、RNA的提取及3’cDNA第一链的合成
CTAB法提取高质量长白落叶松RNA，电泳图如图1，按照SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)说明，合成第一链cDNA，具体步骤如下：
(1)在微量离心管中加入1.0μL 3′-CDS PrimerA，1.0-3.75μL RNA(0.5μg)，然后用去离子水将体积定容为4.75μL。
(2)PCR仪中，72℃3min，42℃2min。
(3)14000×g，离心10s。
(4)向微量离心管中加入下列试剂(表1)，使总体积达到10μL。
表1
(5)PCR仪中，42℃90min，70℃10min。
(6)添加100μL Tricine-EDTABuffer稀释第一链反应产物。
2、目的基因的全长获得
3’RACE的引物如表2。
表2
引物用途 名称 引物序列
3’RACE反应 GSP2 TTCTGTCCCCAACATCCCGTCAGCGT
按照SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)说明，以3’cDNA为模板，进行3’RACE反应，反应程序为(94℃30s→72℃2min)5个循环，(94℃30s→70℃30s →72℃2min)5个循环，(94℃30s→68℃30s→72℃2min)25个循环→72℃1min。反应结束后取5μL反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
表33’RACE反应体系
试剂 使用量
PCR-Grade Water 34.5μL
10×Advantage 2 PCR Buffer 5μL
dNTP Mix(10mM) 1μL
50×Advantage 2 Polymerase Mix 1μL
3’-RACE-Ready cDNA 2.5μL
UPM(10×) 5μL
GSP2 1μL
Total 50μL
3、目的基因连接T载体测序
对3’RACE反应产物回收进行胶回收如图2。以此胶回收产物为模板将胶回收产物末端加A，PCR仪中，72℃10min，反应体系如下：
表4
试剂 使用量
10×LA PCR Buffer(TAKALA) 1μL
dNTP(25mM) 2μL
回收产物 6.8μL
LA Taq(TAKALA,5U/μL) 0.2μL
Total 10μL
将回收产物连接到T载体，大肠杆菌转化后进行蓝白斑筛选，将挑取5个白色菌落进行扩大培养PCR检测，提取阳性质粒后进行测序。
二、目的基因的克隆
1、目的基因序列的获得
用Contig、BioEdit 7.0.9.0等生物软件对所得序列进行比对，拼接。根据拼接后的全长序列，在开放阅读框内设计引物，引物序列如表5：
表5
利用CTAB法提取落叶总RNA，并且反转录成cDNA。以此cDNA为模板，使用LA Taq酶体系进行目的基因的克隆，反应条件为：95℃预变性3min；95℃1min，62℃30 min，72℃1min，循环数为35；最后72℃延伸7min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
表6PCR体系
试剂 使用量
cDNA(10μM) 1μL
Primer F (10μM) 1μL
Primer R (10μM) 1μL
dNTP(25mM) 1.6μL
10×LA PCR Buffer(TAKALA) 2μL
LATaq(TAKALA,5U/μL) 0.1μL
ddH<sub>2</sub>O 13.3μL
2、目的基因连接T载体测序
对目的片段产物进行胶回收如图3，将回收产物连接到T载体，热激发转入大肠杆菌后进行蓝白斑筛选，将挑取5个白色菌落进行扩大培养PCR检测，提取阳性质粒后进行测序。经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将该基因片段命名为LoERF017，由 624bp个碱基组成。其编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。
实施例2：落叶松LoERF017基因表达特性分析(qRT-PCR)
1、引物设计
设计LoERF017基因特异性荧光定量PCR引物F、R及α-tubulin内参引物α-tubulinF、α-tubulin R，如表7。
表7引物序列
2、对落叶松组培苗进行各种非生物胁迫处理
取生长健壮的生根培养50天、高约4-5cm的长白落叶松组培苗，分别对其进行200μM ABA、200mM NaCl、7％PEG和1mM SNP胁迫处理，处理时间为0h、3h、6h、12h、 24h；每种胁迫的各个时间段分别取3～6棵小植株；取下各个样品的根、茎、叶，提取RNA 并反转录为模板，进行实时荧光定量PCR，反应体系如下：
表8
按两步法反应程序进行扩增：94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火及延伸15s，78℃读板1s，循环数为45。将得到的数据输入Excel中，分析数据并使用2-ΔΔCt法进行数据计算，做图(如图4-图7，图中表示0h，表示3h，表示6h，表示12h，表示24h)。结果表明该基因在PEG胁迫下根茎叶都有上调表达的趋势，推测在干旱胁迫下，这个基因可能参与植物的调控作用。
实施例3：转基因手段分析LoERF017基因功能
一、设计引物
设计构建过表达载体的带有酶切位点的引物及载体检测引物，如下表。
表9引物序列
二、实验方法
1、pBI121-LoERF017-GFP过表达载体构建
LoERF017基因以ERF017F和ERF017R为引物扩增后，产物选取了XbaI和SalI两个酶切位点构建到表达载体pBI121-GFP(购买得到)上。经菌液PCR后电泳、质粒双酶切及测序检测后，确定载体构建成功。
2、农杆菌介导的拟南芥遗传转化
(1)将克隆pBI121-LoERF017-GFP载体转化到EHA105农杆菌细胞中，28℃培养。
(2)挑取单克隆农杆菌到5ml 50mg·L-1Kan和50mg·L-1Rif的LB液体培养基中，28℃进行小摇，第二天将500μL小摇的菌液加入250mL 50mg·L-1Kan的LB液体中28℃至菌液OD600为0.8～1.0，将菌液放入灭菌离心管4000rpm，4℃离心5min，用相同体积少于其体积的5％(5g蔗糖/100mL水)的蔗糖水对菌液进行重悬，加入SilwetL-77，加入量为每100mL加入20μL，然后作为侵染工程菌液。
(3)选取培养1个月生长健壮、高约4-8cm和具有大量的半开的花苞和极少数的果荚的拟南芥，将花苞在菌液中侵染3-5s，取出花苞用吸水纸吸去多余菌液，用保鲜膜包裹放入暗处16h-24h。
(4)等到拟南芥角果发黄，进行收集T0代种子，在37℃烘干24h，室温48h，放入4℃冰箱一周后备用。
3、LoERF017蛋白的亚细胞定位
将pBI121-LoERF017-GFP质粒和pBI121-GFP制备成DNA微弹，利用基因枪的方法打入新鲜洋葱的第4～7层鳞茎内表皮即使用基因枪瞬时转化洋葱细胞，利用激光共聚焦显微镜显微镜观察其亚细胞定位。
4、转基因拟南芥的PCR检测
分别以野生型(WT)和转基因拟南芥为材料，CTAB法提取拟南芥基因组DNA，方法参照实施例一。以pBI121-LoERF017-GFP重组质粒为阳性对照，以WT的总DNA为阴性对照，对筛选的转化植株进行PCR检测。
5、转基因拟南芥的多种胁迫
将转LoERF017基因的拟南芥T3代line 1，line 2，line3和WT(野生型拟南芥株系)的种子在20％的次氯酸钠溶液中消毒20min，最后用灭菌的蒸馏水漂洗5-6次，分别种入 1/2MS培养皿和含有300mM甘露醇的1/2MS培养基中，将其放置到温度22±2℃、光照强度80-100μmol·m-2·s-1、光周期16h/8h(日/夜)的人工培养室中培养14天，观察种子萌发率。
三、结果与分析
1、LoERF017过表达载体转入农杆菌
将本实施例步骤二的1中所说PCR检测和双酶切后编号测序，选取结果较好的序号电转农杆菌。涂板28℃培养后挑取单克隆摇菌PCR检测，跑电泳，结果如图8所示。从图中可以看出，在624bp处有条带，说明已将中间表达载体已经导入到农杆菌中。将阳性菌落存菌。
2、LoERF017蛋白的亚细胞定位
将打完基因枪的洋葱表皮附在载玻片上在激光共聚焦显微镜下观察并拍照如图9，发现LoERF017定位于细胞核上。
3、LoERF017基因过表达株系的筛选
T3代转基因株系的获得
在含有50mg·L-1的卡那霉素的1/2MS培养基中种入T0种子进行筛选有抗性的植株第一代，在7d左右，没有转入目的基因的植株根系较短，叶片发黄，未能长出四片真叶，甚至死亡。而转化的植株，根系较发达，可以长出真叶，在培养基中正常生长(图10)。继续收获种子为T1代。继续进行Kan筛选，直到T3代种子收获。这时转基因植株为纯合株系可以用于后期实验的研究。
4、LoERF017转基因拟南芥的PCR检测
(1)LoERF017转基因拟南芥基因水平上的PCR鉴定
以提取DNA为模板，采用过表达载体构建/过表达株系检测引物(表9)，以pBI121-LoERF017-GFP重组质粒为阳性对照、WT(野生型拟南芥)为阴性对照进行PCR检测，转基因植株可以扩增出特异性条带，我们在WT中未出现特异性的条带长度为624bp(图 11)，可以初步得出结论，植株的转化成功。
(2)LoERF017转基因拟南芥RNA水平上的PCR鉴定
近一步对转基因植株分析，将DNA水平上有条带的19个转化植株提取高质量的RNA为模板，反转录成cDNA，再以其为模板进行PCR检测。PCR出的特异条带与质粒PCR 出的特异条带在一条线上为624bp(图12)，进一步证明LoERF017基因已经进行了转录。
5、转基因拟南芥的抗逆能力筛选
用同样的转基因拟南芥株系(line 1、line 2和line 3)T3代种子和非转基因对照拟南芥(WT)株系进行种子萌发率的实验，种子消毒后，用200μL的移液枪在含有各种胁迫的1/2MS培养基中分别点入一定数量的种子，光照培养7d后观察各种胁迫下的萌发率，观察到在甘露醇、NaCl、ABA、SA等条件下，发现结果表明：仅在甘露醇条件下，三个转基因株系T3代种子萌发率在各个梯度条件下明显高于野生型的种子，说明了这个基因特异性的提高了转基因株系的抗干旱的能力(如图13)。
实施例4：干旱胁迫下转基因拟南芥的抗逆性分析以及细胞受损情况研究
一、植物材料
转基因拟南芥(line 1、line 2和line 3)T3代种子以及非转基因对照拟南芥(WT)种子，以下实验至少重复三次。
二、实验方法
1、干旱胁迫下转基因拟南芥的抗逆性分析
将转LoERF017基因的拟南芥T3代的种子消毒种入1/2MS培养皿和含有甘露醇的1/2MS培养基中，观察萌发率。将生长在1/2MS培养基5-8d后的拟南芥放入胁迫条件300 mMmannitol下观察幼苗的根长及生长情况。
2、干旱胁迫下转基因拟南芥细胞受损情况研究
将转LoERF017基因的拟南芥T3代和WT的种子消毒种入培养基，培养7-8d待苗长出两叶一芯后种入土中，温室培养3-4周以后，用300mM mannitol胁迫24h、72h后取大小相同的叶片，这些叶片都进行NBT染色，观察染色情况。
苯胺蓝染色是分别取300mM甘露醇胁迫处理0h、24h、72h的野生型和转基因叶片放入离心管中，加入0.25％苯胺蓝染色液处理5h后，用蒸馏水反复清洗直到没有浮色。
3、甘露醇胁迫下转基因拟南芥的生理指标测定
(1)MDA含量测定
分别取未经胁迫处理和300mM甘露醇胁迫处理3天的WT、line1、line2、line3拟南芥植株，每个样取0.04g左右，用液氮速冻后进行研磨，迅速加入1.5mL的10％的三氯乙酸，4℃冰箱放置30min，11000rpm离心10min，吸取1mL的上清液于新的离心管中，然后加入 1mL的0.6％TBA混匀，沸水浴15min，立即放入冰上冷却10min，室温下12000rpm离心20 min；取上清液2mL在532nm和450nm下进行测OD值，对照管是1mL的0.6％TBA和1mL 的水。
根据以下公式即可计算样品提取液中的丙二醛的含量C和单位质量样品中的丙二醛的含量y，计算公式：C(MDA浓度μmol/L)＝6.45×OD523-0.56×OD450；y(μmol/g)＝(c×v) /w。
(2)SOD含量测定
现处理拟南芥植株用液氮对整个植株速冻之后对植物材料进行研磨，取0.02g样离心管中，之后加入1.5mL的1/15mol/L磷酸缓冲液，在4℃冰箱中放置30min，11000rpm离心20 min，去上清的酶液50μL放入新的2mL离心管中，之后加入1.5mL的SOD反应液和450μL 1/15mol/L磷酸缓冲液；30℃，6级光照培养10min，发现变蓝，随后立即测吸收光值(OD560) ，用缓冲液置于暗处进行调零，SOD反应液照光做为对照。
A1：0.5mL H2O+1.5mL SOD反应液光照后测OD值；A2：0.5mL酶液(已经稀释10 倍)+1.5mL SOD反应液光照后测OD值(每个样品重复三次)；2mL 1/15mol/L磷酸缓冲液放入暗处用于调零。
计算SOD的活性公式：SOD活性＝(N×ΔA)/(W×T×50％)；其中，ΔA＝(A1-A2)/A1；N 代表稀释倍数；T代表反应时间(min)；W代表物材料植物材料的净重。
(3)POD含量测定
现处理拟南芥植株用液氮对整个植株速冻之后对植物材料进行研磨，取0.02g样加入2 mL的离心管中，之后向离心管中加入1.5mL的0.01mol/L磷酸缓冲液，每个样品3个生物学重复，在4℃冰箱中放置0.5h，11000rpm离心20min，取上清的酶液1mL加入2mL离心管中4℃冰箱保存，取酶液0.5mL酶液中加入0.5mL 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.2)，0.5mL愈创木酚溶液，充分混匀，30℃反应10min，在测定之前加入0.5mL 0.8％H2O2，混匀用722S分光光度计在470nm处测各样品的OD值，以dd H2O替代作为对照值，并以dd H2O进行调零。需要注意的是在测定的时候要迅速，测每30s读一次OD值，直到数不再变化为止，将这些点连起来，会形成一个曲线，酶液在所测定用时内的变化值一般取曲线初始线性部分的OD 变化值。POD活性计算：POD活性＝(N×ΔA)/(W×T)；其中ΔA＝(A1-A2)/A1；N代表稀释倍数；T代表反应时间(min)；W代表植物材料粉末的净重。
三、实验结果
(一)干旱胁迫下转基因LoERF017拟南芥的抗逆能力分析
1、干旱胁迫下转基因拟南芥幼苗的抗逆分析
选取转LoERF017基因的拟南芥T3代株系用于消毒，种在1/2MS培养基中，5-8d后移至分别含有300mM mannitol和150mM NaCl的培养基平板上，将平板竖直放置8d后，幼苗生长情况如图14所示。结果表明：转基因拟南芥的根系在mannitol胁迫下的长势和鲜重比野生型拟南芥强很多，说明了这个基因转入拟南芥后提高了拟南芥对干旱的抵抗力。
2、干旱胁迫下转基因拟南芥的萌发情况
实施例3中进行了种子萌发率的实验，结果表明：三个转基因株系T3代种子萌发率在各个梯度条件下明显高于野生型的种子，说明了转基因拟南芥株系在干旱胁迫下的耐受力强。
(二)干旱胁迫下转基因拟南芥细胞受损情况研究
NBT染色具有相同的处理条件：生长4周的野生型和转基因拟南芥土培苗在经300mM mannitol胁迫转基因拟南芥(line 1、line 2和line 3)和野生型拟南芥(WT)分别处理24h 和72h，取其叶片进行染色。
1、NBT染色法分析逆境下转基因植株细胞内超氧离子水平
NBT(Nitroblue Tetrazolium， 硝基四氮唑蓝)还原法，在植物体内NBT被超氧离子O2-氧化成蓝色甲腙，通过蓝色的深浅可以反映O2-含量的多少。取样进行染色如图15；结果表明：在正常生长条件下，野生型和转基因株系植株叶片染色情况相似，只有在取材部位分布着少量的蓝色斑块，说明O2 -含量基本一致；在甘露醇胁迫下，随着胁迫时间的增长，无论是野生型还是转基因株系，叶片上的蓝色斑块面积都逐渐增加，颜色也渐渐变深。在不同的胁迫时间下，过表达LoERF017基因株系line 1、line 2和line 3植株的蓝色斑块面积明显小于野生型，且染色也较浅。这说明在干旱胁迫下，与野生型相比，转LoERF017基因拟南芥植株体内的O2 -含量明显减少，对氧化伤害的抵抗性明显提高。
2、苯胺蓝染色法分析逆境下转基因植株细胞的受损情况
正常的细胞具有完整的功能正常的细胞膜，使外界的苯胺蓝无法进入细胞内部；如果功能不正常或者膜不完整的细胞，细胞膜通透性增加，细胞会被苯胺蓝染成蓝色；利用这一原理能够通过染色的深浅研究转基因拟南芥细胞的损伤情况。分别取干旱胁迫处理0h、 24h、72h的野生型拟南芥和各个转基因株系植株的叶片(每个株系3次重复)进行苯胺蓝染色。染色结果如图16，在正常生长条件下转基因株系和转基因植株叶片染色颜色较淡且无明显差异，说明细胞损伤的情况基本相同；在Mamitiol胁迫条件下，随着胁迫时间的增加，转基因株系和野生型植株叶片的颜色均变深。而过表达LoERF017的转基因株系叶片的颜色明显要比野生型叶片颜色浅。这说明转基因株系叶片在干旱胁迫条件的损伤程度比野生型植株的损伤程度少。试验结果表明LoERF017基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗旱功能。
(三)干旱胁迫下转基因拟南芥各项生理指标的研究
将野生型和转LoERF017基因拟南芥(Line1、Line2、Line3)的种子消毒后，种于1/2MS培养基平板上，7-9天后将幼苗移至培养土中继续培养4周。然后用300mM mannitol 溶液处理野生型和转基因植株，7天后分别取未处理和胁迫处理的拟南芥植株用于以下生理生化指标的测定。
1、MDA(丙二醛)含量的测定
植物在逆境条件下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，可通过检测MDA的含量来检测膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度和植物的抗逆性，结果如图17所示，其中表示Control，表示300mM mannitol。结果表明：在正常生长条件下，野生型和转基因株系植株的MDA含量基本相同。在干旱胁迫下，转基因和野生型拟南芥的MDA含量都增大了，但转基因株系在胁迫情况下，MDA含量要低于野生型。采用单因素方差进行组内比较，发现在干旱胁迫下转基因株系Line1、Line2、Line3中的 MDA含量与野生型拟南芥中的MDA含量差异极显著。也就是说在干旱胁迫下，转基因株系MDA含量增加的程度没有野生型大，试验结果表明转LoERF017基因在拟南芥植株内起着非常重要的抗旱功能。
2、SOD(超氧化物歧化酶)活性的测定
SOD能够通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O2-)，生成H2O2和O2，抵御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，增强了植物的抗逆功能，如图18，其中表示Control，表示300mM mannitol。结果表明：在未经胁迫情况下，WT和转基因株系的SOD活性大致相同，而经过干旱胁迫的WT和转基因株系清除O2. -的能力都有所增加，而转基因株系的SOD活性明显高于野生型。这说明LoERF017基因能够正向地调节 SOD活性，可以增加植株对活性氧的清除能力。试验结果表明：LoERF017基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗旱功能。
3、(过氧化物酶)活性的测定
POD是生物体内酶促防御系统的重要保护酶，能够清除植物体内氧自由基，提高其抗逆性。结果如图19所示，其中表示Control，表示300mM mannitol。结果如下：WT和转基因株系在正常生长状态下，POD活性基本持平。在干旱胁迫下，WT和转基因株系的POD活性都提高了，说明在胁迫下，植物清除H2O2的能力增强。采用单因素方差进行组内比较，在干旱胁迫条件下，当A＝0.05时，P<0.01，差异极其显著。这说明在干旱胁迫下，转基因株系的POD活性显著高于野生型，也就是说转基因植株的抗干旱胁迫能力明显优于野生型植株。试验结果表明LoERF017基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗旱功能。
以上实施例中所用药品皆为市售产品。从实施例可知，利用农杆菌介导法在拟南芥中表达该基因，获得转基因拟南芥发现在干旱胁迫下转基因株系的萌发率高。为了更进一步的验证实验结果，通过对不同生长阶段的T3代纯合植系和WT进行干旱条件下的抗逆能力分析。在根长实验中，转基因株系的根长比WT长而且侧根也比较多，转基因拟南芥在mannitol胁迫下的长势和鲜重比野生型拟南芥强很多。说明LoERF017基因在干旱胁迫下具有很重要的抗逆功能。同时通过DAB染色、苯胺蓝染色对转基因株系和WT在干旱胁迫下细胞的受损情况进行了观察，发现在干旱胁迫下WT细胞受损程度明显高于转基因株系，也验证了上面的结论。通过各项生理指标的测定，发现在干旱胁迫条件下， LoERF017基因的过表达株系的抗逆能力明显高于WT。本实验说明LoERF017基因转入拟南芥植株体内提高了植物在干旱胁迫下的抗逆能力。

Claims (4)

1.长白落叶松LoERF017基因，其特征在于LoERF017基因的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示。
2.权利要求1所述的长白落叶松LoERF017基因在提高植物在干旱胁迫下的抗逆能力上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述LoERF017基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述LoERF017基因在植物中表达，得到在干旱胁迫下抗逆能力提高的转基因植物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物为拟南芥。
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