CN108359674A

CN108359674A - 水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因OsSAPK8编码序列及其应用

Info

Publication number: CN108359674A
Application number: CN201810028168.1A
Authority: CN
Inventors: 明凤; 钟瑞龄; 王玉霞
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2018-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2018-08-03

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体为水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因OsSAPK8编码序列及其应用。本发明具体包括基因OsSAPK8的克隆、OsSAPK8基因的器官表达模式，不同激素、不同胁迫处理后OsSAPK8的表达量的变化。本发明还公开了基因OsSAPK8的Tilling突变体的测序鉴定。对于突变体的表型鉴定显示OsSAPK8在植物抵抗冷胁迫时起到了重要作用。该基因OsSAPK8可用于植物品种改良，例如用于改善水稻抗寒冷、干旱以及盐胁迫性能，提高水稻应对非生物胁迫的能力，提高水稻的产量。

Description

水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因OsSAPK8编码序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的OsSAPK8基因编码序列及其应用。

背景技术

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。我国的水稻种植面积约为世界水稻总面积的1/4，占全国粮食耕种面积的1/3，而产量占世界稻谷总产量的37%，全国总产量的45%。近年来随着全球气候变化，低温冷害频频发生，给农业生产造成巨大损失，尤其是一些对低温敏感的作物如水稻、小麦、大豆及多种热带与亚热带水果如香蕉、芒果、葡萄、桔子等会减产甚至绝产；近年来的持续低温使得粮食作物生产受到很大影响，有可能会影响到全国总粮食产量和安全问题。因此，提高水稻等作物耐低温耐性，增产增收，保证国家粮食安全迫在眉睫。而研究植物的低温应答机制是提高其耐低温性的重要途径，因而研究水稻如何应答低温胁迫的机制，对提高低温环境下的水稻产量有重大现实意义（Tomashow et al.,1999）。除此之外，干旱、高盐等非生物胁迫也对水稻等粮食作物的产量有较大的威胁，阐明植物在应对非生物胁迫中的分子机制对于探究粮食增产的方法有着积极的意义（Supratimet al.）。

SnRK家族是植物中一类广泛存在的Ser/Thr蛋白激酶家族，参与植物体内多种信号途径的转导，对植物的逆境生理起到重要的作用（Nikita et al., 2016）。拟南芥AtSnRK2.6基因（即SnRK2E/OST1）在植物的冷胁迫应答通路中起到重要的作用，SnRK2E的表达产物OST1蛋白激酶可通过转录调控ICE影响提高其稳定性，另外，OST1蛋白激酶还可以利用蛋白互作影响HOS1基因对ICE基因的调控（Ding et al., 2015; Zhan et al., 2015）。ICE是一种类似MYC的bHLH转录因子，可特异性结合到CBF启动子的MYC作用元件，并诱导CBF下游大量抗寒基因表达（Zhu et al., 2011; Hu et al., 2013; Kim et al., 2015）。因而推测水稻SAPK7、8基因的功能与OST1相近，通过调控ICE基因从而影响水稻的低温抗性。

SAPK7、8基因是水稻中SnRK家族成员之一（Kobayashi et al., 2004）。通过序列分析可知，水稻OsSAPK7、8基因与AtSnRK2.6同源性较高。因而推测水稻SAPK7、8基因的功能与OST1相近，通过调控ICE基因从而影响水稻的低温抗性。尽管关于SnRK2.6的下游信号机制以及对低温胁迫的敏感性已经有许多研究，但在水稻中的低温胁迫调控网络仍不明确，另外，SAPK7、8基因在植物干旱、高盐胁迫应答中的机制仍有待探究。

发明内容

本发明的目的在于提出一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列，并提供该水稻基因的应用。

本发明提供的水稻中表达的水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因OsSAPK8的序列及其应用，具体包括：OsSAPK8基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及基于水稻中花获得Tilling突变体，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。

本发明通过克隆水稻中编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因OsSAPK8，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示基因在各个器官中组成型表达，在叶中表达量较高，在茎中表达量较低。在接受IAA、6-BA、KT、ABA、GA处理后，OsSAPK8的表达量均显著升高。在进行冷胁迫（6℃）处理后表达量先上升，在2h时达到最高，而此后有降低；在进行干旱胁迫（20%PEG）处理8h后，表达量升至最高，而12h显著降低；盐胁迫（150mmol/L NaCl）处理2h时表达量显著上升并达到最大值，且4h后表达量基本不变。在水稻Zhonghua11的OsSAPK8突变体中，观察到突变体株系株高变矮，对寒冷、干旱以及盐胁迫的敏感程度提高，千粒重降低，结穗数增加，结实率减少，这为水稻在寒冷、干旱以及高盐的环境下生存并最终为产量提高提供基因来源与技术支持。

本发明首先从水稻中克隆出一种编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因，命名为OsSAPK8。为具有特定序列的DNA分子，全长5564bp，其中开放阅读框为1116bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供这种水稻OsSAPK8蛋白编码序列，有371个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供用于调取获得水稻样品中基因OsSAPK8的一对核苷酸引物。该引物根据基因OsSAPK8设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长1116bp的基因片段。具体的引物序列为：

Forward Primer：5' GGAATTCATGGCAGCGGCGGGGGCCGGGG 3' （SEQ ID NO.3）

Reverse Primer：5' CCATCGATTTACATCGCATAGACGATCTCG3' （SEQ ID NO.4）。

本发明还提供检测水稻基因OsSAPK8在不同器官表达模式的方法，即利用所述基因OsSAPK8的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列：

Forward Primer：5 GCTATTCTAAGTCTTCAGTTCTCC '3' （SEQ ID NO.5）

Reverse Primer：5' GCCATCGTATTCTTTCTTCAACAG 3' （SEQ ID NO.6）。

对水稻cDNA样品进行Real-time PCR, 然后检测该基因在茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

（1）提取水稻器官的总RNA (RNAiso plus，市售)；

（2）利用反转录试剂盒（TaKaRa PrimeScript® RT reagent Kit DRR037A，市售）将总RNA反转录成cDNA ，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，根据SEQ ID NO.1进行实时定量PCR检测。

结果显示，该基因为组成型表达，在叶中表达量最高，茎中表达量最少。

本发明提供检测水稻基因OsSAPK8在寒冷、高盐、干旱胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，即将水稻进行寒冷、高盐、干旱胁迫以及激素处理后，提取水稻叶片中的RNA (RNAiso plus，市售)；利用反转录试剂盒（TaKaRa PrimeScript® RT reagent KitDRR037A，市售）将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，进行Real-timePCR检测。其步骤如下：

（1）将两周大的水稻苗置于150mM氯化钠溶液中，28ºC培养高盐胁迫处理0、2、4、8、以及12 h；置于含20%PEG溶液中以进行干旱处理0、2、4、8以及12 h；置于6℃低温中以进行冷胁迫处理0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8以及12h；置于50µM IAA、6-BA、KT、ABA、GA中，28℃培养24h以进行激素处理；

（2）提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA(RNAiso plus，市售)；

（3）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA ，根据SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6设计引物，根据SEQ ID NO.1进行Real-time PCR检测。

结果显示，NaCl处理2h后表达量显著升高并达到最顶峰（图2B）；干旱下2h表达量显著升高，8h后达到顶峰（图2C）；6℃处理0.25h表达量显著升高，并在2h后达到顶峰（图2C,D）。IAA、6-BA、KT、ABA、GA处理后表达量均显著升高（图2E）。

本发明还提供检测OsSAPK8突变体的水稻与野生型水稻（Zhonghua11）对冷胁迫敏感程度的方法，其步骤如下：

（1）突变体株系与野生型的种子浸泡在水中24h，让种子充分吸涨。随后将种子玻璃培养皿内，放在水稻恒温培养箱内37℃催芽至露白，每天换水防止长霉。选取萌发一致的种子，将其转移至种子架上，置于基础营养液中，28℃培养箱培养；

（2）分别提取突变体以及野生型对照组中的总DNA，利用引物进行PCR检测，确定突变位置以及筛选纯合株系。对应的引物序列为：

5' TCATCCTTGGCTCTCTGTGAAAAG 3' （SEQ ID NO.7）

5' GCCGCTGCTATCAACATCAATATC 3' （SEQ ID NO.8）；

（3）将两周大的水稻苗置于6℃低温中进行冷胁迫处理12h；

（4）观察处理组与对照组的表型差异，进行NBT染色，测量转基因幼苗与野生型幼苗在两种培养条件下的电导率（电导率仪：上海精科，雷磁DDS-307）以及叶绿素含量。

结果显示，突变体sapk-6的1222位碱基T发生缺失（图3A），突变体sapk-8的1226位碱基C突变为T，密码子由CUC变成AUC，氨基酸由亮氨酸变成异亮氨酸（图3B），突变体sapk-11的60位碱基A发生缺失（图3C）。

本发明还提供OsSAPK8tilling突变体水稻与野生型水稻在成熟期株高及产量改变的方法，其步骤如下：

（1）突变体株系与野生型的种子浸泡在水中24h，让种子充分吸涨。随后将种子玻璃培养皿内，放在水稻恒温培养箱内37℃催芽至露白，每天换水防止长霉；

（2）将催芽后的种子均匀地散在苗床上，表面不能积水，种子播撒后，用手抹平，让种子陷入泥中，不应太深；

（3）育苗3-4周后，苗呈三叶，根系发达方可移苗。过早会造成根部损伤，后期发育不良。移苗后1-2周可按每颗苗0.5g尿素少量施肥。浇水一般提前将水放在温室内1天温热后再浇；

（4）成熟期测量突变体与野生型水稻的株高，并统计结穗数、千粒重与结实率。

结果显示，突变体水稻sapk8与野生型Zhonghua11相比，其株高变低（图5B），穗数增多（图5C,D）。但千粒重（图5E）、结实率（图5F）都相对较低。

可见，本发明提供的水稻基因OsSAPK8可用于植物品种改良，如帮助阐明水稻抵抗寒冷、干旱以及盐胁迫的机理，用于改善水稻抗寒冷、干旱以及盐胁迫性能，提高水稻应对非生物胁迫的能力，从而提高水稻的产量。

附图说明

图1为 OsSAPK8在水稻不同器官中的表达谱。

图2 为野生型水稻经过50mM NaCl、20%PEG干旱处理和6℃低温处理处理后，OsSAPK8基因的表达量随时间的变化情况。其中，A为三种胁迫处理后4h水稻的OsSAPK8基因表达量变化；B 为150mM NaCl处理0-12h后水稻的OsSAPK8基因表达量变化；C为 6℃低温处理0-12h后水稻的OsSAPK8基因表达量变化；D为用20%PEG干旱处理处理0-12h后水稻的OsSAPK8基因表达量变化；E为 50µM IAA、6-BA、KT、ABA、GA浸泡处理8h后水稻的OsSAPK8基因表达量变化。

图3为野生型水稻与sapk突变体水稻的分子鉴定。突变体sapk-6（A）、sapk-8以及sapk-11碱基的突变情况。

图4为突变体sapk8-6，sapk8-8，sapk8-11突变体以及野生型水稻在低温胁迫下的表型以及生理生化指标比较。其中，A为 6℃低温处理12h后叶片损伤表型；B为 6℃低温处理12h后电导率的测定；C为 6℃低温处理12h后叶片的NBT染色；D为 6℃低温处理12h萎蔫率的测定。

图5突变体株系sapk8与野生型水稻的表型与产量指标分析。其中，A为表型图；B为株高对比照相；C，D为穗数照片以及比较；E为千粒重统计；F为结实率对比。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989）中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1，水稻基因OsSAPK8的克隆

1. 水稻品种Zhonghua11在培养箱(SPX-250-GB,Shanghai,China) 中培养：生长条件为光周期16h /8h (L/D)，28℃；

2. DNA提取。取500毫克左右新鲜的水稻植物组织材料，加入80 μl Lysis Buffer，用研磨棒将植物组织研碎，加入120 μl ddH₂O。12000rpm离心15min后将上清转移至新的离心管，测OD值，电泳检测；

3. 基因的克隆。通过对应的拟南芥的AtSnRK2.6基因进行生信分析与基因文库中比对与搜索，目标基因与拟南芥的基因AtSnRK2.6同源性为78%以上。以提取的水稻DNA为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID NO.1。

实施例 2 ，水稻OsSAPK8基因器官表达模式分析

分别提取水稻根、茎、叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行Real-time PCR检测（图1）。结果显示，该基因为组成型表达，在叶中表达量最高，茎中表达量最少。

实施例3，水稻基因OsSAPK8在干旱、高盐胁迫以及植物激素处理下的表达模式分析

对两周大的水稻幼苗分别进行150mM NaCl、20%PEG干旱处理和6℃低温处理都为4h，提取根中的总RNA。利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，进行Real-time PCR检测。发现此基因对非生物胁迫极其敏感，尤以干旱诱导最为明显（图2A）。之后对以上三种非生物胁迫进行时序性的诱导表达模式进行研究，即150mMNaCl、20%PEG干旱处理12h，分别提取处理0、2、4、8、12h后的根中的总RNA；进行6℃低温处理12h，分别提取处理0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、12h后的叶中的总RNA；进行50µM IAA、6-BA、KT、ABA、GA浸泡处理8h，提取根中总RNA。利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行Real-time PCR检测。结果显示，NaCl处理2h后表达量显著升高并达到最顶峰（图2B）；6℃处理0.25h表达量显著升高，并在2h后达到顶峰（图2C）；干旱下2h表达量显著升高，8h后达到顶峰（图2D）；。IAA、6-BA、KT、ABA、GA处理后表达量均显著升高（图2E）。

实施例4 ，OsSAPK8 tilling突变体的分子鉴定

分别提取突变体以及野生型对照组中的总DNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行PCR检测。结果显示，突变体sapk-6的1222位碱基T发生缺失（图3A），突变体sapk-8的1226位碱基C突变为T，密码子由CUC变成AUC，氨基酸由亮氨酸变成异亮氨酸（图3B），突变体sapk-11的60位碱基A发生缺失（图3C）。

实施例5，sapk8突变体低温胁迫敏感性检测

分别选取sapk8-3，sapk8-6，sapk8-8突变体以及野生型对照组两周龄水稻苗，置于培养箱中，设置对照组和冷胁迫处理组，进行6℃低温处理12h后拍照对比叶片损伤表型（图4A）。选取典型表型的叶片，进行电导率（图4B）的测定。分别选取典型表型的叶片，进行NBT染色，对比染色程度（图4C）。选取典型表型的叶片，进行萎蔫率（图4D）的测定。结果表明，低温处理后，突变体低温胁迫敏感性高于野生型，叶片黄化、萎蔫、过氧化氢积累、过氧化物酶积累都要高于野生型，电导率比野生型更高，都说明突变体对于低温胁迫更加敏感。

实施例，6 sapk8突变体水稻株高和产量的改变

大田培养的突变体株系sapk8与野生型Zhonghua11对照组，在收获后进行照相（图5A），并且进行株高、穗数、千粒重及结实率统计。结果显示，突变体水稻sapk8与野生型Zhonghua11相比，其株高变低（图5B），穗数增多（图5C，图5D）。但千粒重（图5E）、结实率（图5F）都相对较低。

[参考文献]

[1] Thomashow M F. PLANT COLD ACCLIMATION: Freezing Tolerance Genes andRegulatory Mechanisms[J] - Annual Review of Plant Physiology and PlantMolecular Biology, 50(1):571.

[2] Basu S, Roychoudhury A. Expression profiling of abiotic stress-inducible genes in response to multiple stresses in rice (Oryza sativa L.)varieties with contrasting level of stress tolerance[J]. Biomed ResearchInternational, 2014, 2014(4):706890.

[3] Bhatnagar N, Min M K, Choi E H, et al. The protein phosphatase 2Cclade A protein OsPP2C51, positively regulates seed germination by directlyinactivating OsbZIP10[J]. Plant Molecular Biology, 2017, 93(4-5):1-13.

[4]Ding, Yanglin, Li, et al. OST1 Kinase Modulates Freezing Tolerance byEnhancing ICE1 Stability in Arabidopsis[J]. Developmental Cell, 2015, 32(3):278-89.

[5] Zhan X, Zhu J K, Lang Z. Increasing Freezing Tolerance: KinaseRegulation of ICE1.[J]. Developmental Cell, 2015, 32(3):257-258.

[6]Zhu Y, Yang H, Mang H G, et al. Induction of BAP1 by a moderatedecrease in temperature is mediated by ICE1 in Arabidopsis.[J]. PlantPhysiology, 2011, 155(1):580-588.

[7] Hu Y, Jiang L, Wang F, et al. Jasmonate regulates the inducer of cbfexpression-C-repeat binding factor/DRE binding factor1 cascade and freezingtolerance in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2013, 25(8):2907-2924.

[8]Ye S K, Lee M, Lee J H, et al. The unified ICE–CBF pathway provides atranscriptional feedback control of freezing tolerance during coldacclimation in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology, 2015, 89(1-2):187-201.

[9] Kobayashi Y, Yamamoto S, Minami H, et al. Differential activation ofthe rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 family byhyperosmotic stress and abscisic acid.[J]. The Plant cell, 2004, 16(5):1163-77.。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 水稻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因OsSAPK8编码序列及其应用

<130> 001

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcagcgg cgggggccgg ggcgggggcg ccggatcggg cggcgctgac ggtgggcccg 60

gggatggaca tgccgatcat gcacgacagc gaccggtacg agctcgtgcg cgacatcggc 120

tccggcaact tcggcgtcgc ccgcctcatg cgcgaccgcc gcaccatgga gctcgtcgcc 180

gtcaagtaca tcgagcgcgg cgagaagata gatgataatg tccagcgtga gattataaat 240

caccgatcgt tgaaacatcc taacattatt aggtttaagg aggttatttt aaccccaact 300

catcttgcta ttgtcatgga atatgcctct ggtggtgagc ttttcgagag aatttgtaag 360

aatgtacggt tcagtgaaga tgaggctcgc tacttcttcc agcagcttat ctcgggagtc 420

agctactgcc attcaatgca agtatgccac cgtgatttga agttggagaa tacactgctg 480

gatggaagcc ctgctccacg cttgaaaata tgtgactttg gctattctaa gtcttcagtt 540

ctccattcac aaccaaaatc cactgtagga acccctgctt atattgcacc tgaagttctg 600

ttgaagaaag aatacgatgg caagactgct gatgtatggt cctgtggtgt gactctatat 660

gttatggtag ttggtgcata tcctttcgag gatccagaag agcctaagaa cttccgtaaa 720

acaattcagc gtatcttgaa tgttcagtac tcaattccag aaaacgtgga catatctcca 780

gaatgtaggc atctaatttc gaggattttt gtcggggatc cgtctttgag gataacaatc 840

ccagaaatac ggagccatgg ctggttcttg aagaaccttc ctgcagattt gatggacgat 900

gatagtatga gcagccagta tgaggaacct gatcagccaa tgcaaaccat ggatcagatc 960

atgcaaattt taactgaggc caccatacca cctgcttgct ctcgaataaa ccacatccta 1020

actgatggac tcgacctaga cgatgacatg gatgacctcg attccgactc agatattgat 1080

gttgatagca gcggcgagat cgtctatgcg atgtaa 1116

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Pro Asp Arg Ala Ala Leu

1 5 10 15

Thr Val Gly Pro Gly Met Asp Met Pro Ile Met His Asp Ser Asp Arg

20 25 30

Tyr Glu Leu Val Arg Asp Ile Gly Ser Gly Asn Phe Gly Val Ala Arg

35 40 45

Leu Met Arg Asp Arg Arg Thr Met Glu Leu Val Ala Val Lys Tyr Ile

50 55 60

Glu Arg Gly Glu Lys Ile Asp Asp Asn Val Gln Arg Glu Ile Ile Asn

65 70 75 80

His Arg Ser Leu Lys His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys Glu Val Ile

85 90 95

Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr Ala Ser Gly Gly

100 105 110

Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Lys Asn Val Arg Phe Ser Glu Asp Glu

115 120 125

Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly Val Ser Tyr Cys His

130 135 140

Ser Met Gln Val Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Thr Leu Leu

145 150 155 160

Asp Gly Ser Pro Ala Pro Arg Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Tyr Ser

165 170 175

Lys Ser Ser Val Leu His Ser Gln Pro Lys Ser Thr Val Gly Thr Pro

180 185 190

Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Leu Lys Lys Glu Tyr Asp Gly Lys

195 200 205

Thr Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr Val Met Val Val

210 215 220

Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Glu Glu Pro Lys Asn Phe Arg Lys

225 230 235 240

Thr Ile Gln Arg Ile Leu Asn Val Gln Tyr Ser Ile Pro Glu Asn Val

245 250 255

Asp Ile Ser Pro Glu Cys Arg His Leu Ile Ser Arg Ile Phe Val Gly

260 265 270

Asp Pro Ser Leu Arg Ile Thr Ile Pro Glu Ile Arg Ser His Gly Trp

275 280 285

Phe Leu Lys Asn Leu Pro Ala Asp Leu Met Asp Asp Asp Ser Met Ser

290 295 300

Ser Gln Tyr Glu Glu Pro Asp Gln Pro Met Gln Thr Met Asp Gln Ile

305 310 315 320

Met Gln Ile Leu Thr Glu Ala Thr Ile Pro Pro Ala Cys Ser Arg Ile

325 330 335

Asn His Ile Leu Thr Asp Gly Leu Asp Leu Asp Asp Asp Met Asp Asp

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Ser Asp Ile Asp Val Asp Ser Ser Gly Glu Ile Val

355 360 365

Tyr Ala Met

370

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattcatg gcagcggcgg gggccgggg 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatcgattt acatcgcata gacgatctcg 30

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctattctaa gtcttcagtt ctcc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccatcgtat tctttcttca acag 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcatccttgg ctctctgtga aaag 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccgctgcta tcaacatcaa tatc 24

Claims

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因，记为OsSAPK8，全长5564bp，其中开放阅读框为1116bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种如权利要求1所述的基因OsSAPK8编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码371个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一对用于调取获得水稻样品中基因OsSAPK8的引物序列，其特征在于，根据权利要求1所述基因OsSAPK8设计，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.一种检测水稻基因OsSAPK8 mRNA表达模式的方法，其特征在于，利用权利要求1所述基因OsSAPK8的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列为SEQID NO.5和SEQ ID NO.6，对水稻cDNA样品进行Real-time PCR，然后检测该基因在茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA 经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

（1）提取水稻不同器官的总RNA；

（2）利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行Real-timePCR检测。

5.一种检测水稻在寒冷、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后，基因OsSAPK8表达含量变化的方法，其特征在于，具体步骤为：将水稻进行寒冷、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后，提取水稻的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA ，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，进行Real-time PCR检测。

6.一种检测水稻Tilling突变体中基因OsSAPK8表达含量变化的方法，其特征在于，具体步骤为：提取突变体和野生型对照组水稻总DNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行PCR检测。

7.如权利要求1所述的水稻基因OsSAPK8在植物品种改良中的应用。

8.如权利要求8所述的应用，其特征在于用于改善水稻抗寒冷、干旱以及盐胁迫性能，提高水稻应对非生物胁迫的能力，从而提高水稻的产量。