CN103667308A

CN103667308A - 水稻AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因编码序列及其应用

Info

Publication number: CN103667308A
Application number: CN201210322514.XA
Authority: CN
Inventors: 明凤; 张文政; 金津
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-09-02
Filing date: 2012-09-02
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种在水稻中表达的属于AP2/EREBP类转录因子家族基因，记为OsAIL5的编码序列及其应用。具体包括基因OsAIL5的克隆、含有该基因的表达载体构建、基因OsAIL5基因器官表达模式，不同激素、不同胁迫处理后OsAIL5的表达量的变化。本发明还公开了基因OsAIL5在水稻中花11中过表达后，可以改变水稻对NH₄NO₃的敏感程度。该基因OsAIL5可用于植物品种改良。

Description

水稻AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因编码序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种在水稻中表达的AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因编码序列及其应用。具体涉及：AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，表达载体构建，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及转化此基因于水稻中花11号内，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。

背景技术

研究报道，AP2/EREBP家族转录因子是植物所特有的，也是植物中最大的转录因子家族之一，根据所包含的AP2结构域的序列和重复数，AP2/EREBP家族转录因子可以分为AP2,RAV,DREB,ERF以及其他类共五个亚家族（Nole-Wilson S.et al.2005）。AP2/EREBP结构域是由大约57-70个氨基酸残基组成的高度保守区,包括两个区：YRG区和RAYD区，YRG区有三个反向平行的β-折叠，主要参与识别各类顺式作用元件，RAYD区位于AP2/EREBP结构域的C-端，约含有40个氨基酸残基，其中约18个氨基酸残基组成的核心区可形成双亲性的α-螺旋。DNA结合区与DNA的结合依赖于YRG区，RAYD区是通过影响YRG区的构象或通过与其它蛋白发生相互作用调节AP2/EREBP结构域与DNA的结合(OKAMURO J.K.et al.1997)，具体是通过β-折叠中的Arg和Trp残基与DNA相互作用，虽然AP2/EREBP转录因子的二级结构与其他一些DNA结合蛋白相似，但是它们之间的序列却没有相似性（Magnani E.et al.2004）。AP2/EREBP转录因子与DNA结合也有特异性，如ERF亚族蛋白与GCC元件结合（Ohme-Takagi M.et al.1995），DREB亚族蛋白与脱水响应元件ERE结合（Yamaguchi-Shinozaki K.et al.1994）。

现有技术公开了在拟南芥（Nole-Wilson S.et al.2005）、挪威云杉（Vahala T.et al.2001）、矮牵牛（Maes T.et al.2001），玉米（Jiang F.et al.2012），烟草（Park J.M.et al.2001）等多种植物中均发现有AP2/EREBP家族转录因子。

据研究报道，AP2/EREBP转录因子的功能非常强大，遍及到植物整个的生命周期活动，参与包括信号、胁迫响应、植物自身防御、种子发育、细胞分裂和生长、器官形成和起始以及在信号网络中的交叉互作等很多生长发育过程（Sharoni A.M.et al.2011）。AIL5基因在拟南芥中参与种子休眠、发芽及其相关的植物激素代谢过程（Yamagishi K.etal.2009，Yano R.et al.2009），同时也有报道表明该基因在拟南芥由营养生长转为胚胎发生过程中起重要作用（Tsuwamoto R.et al.2010）。

与本发明相关的参考文献还有：

Yamaguchi-Shinozaki,K.and K.Shinozaki(1994).″A novel cis-Acting element in anArabidopsis gene is involved in responsiveness to drought,low temperature,or high-saltstress.″The Plant Cell 6:251-264.

Ohme-Takagi,M.and H.Shinshi(1995).″Ethylene-inducible DNA binding proteins thatinteract with an ethylene-responsive element.″The Plant Cell 7:173-182.

OKAMURO,J.K.and O.CASTER,et al.(1997).″The AP2 domain of APETALA2 defines alarge new family of DNA.″Proc.Natl.Acad.94:7076-7081.

Park,J.M.and C.J.Park,et al.(2001).″Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding anEREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack andosmotic stress in tobacco.″Plant Cell13(5):1035-46.

Maes,T.and N.Van de Steene,et al.(2001).″Petunia Ap2-like genes and their role in flowerand seed development.″Plant Cell13(2):229-44.

Magnani,E.and K.S.Lander,et al.(2004).″From endonucleases to transcription factors:evolution of the AP2 DNA binding domain in plants.″The Plant Cell16:2265-2277.

Nole-Wilson,S.and T.L.Tranby，et al.(2005).″AINTEGUMENTA-like(AIL)genes areexpressed in young tissues and may specify meristematic or division-competent states.″Plant Mol Biol57(5):613-28.

Sharoni,A.M.and M.Nuruzzaman,et al.(2011).″Gene structures,classification andexpression models of the AP2/EREBP transcription factor family in rice.″Plant Cell Physiol52(2):344-60.

Jiang,F.and M.Guo,et al.(2012).″Mutations in an AP2 transcription factor-like gene affectinternode length and leaf shape in maize.″PLoS One 7(5):e37040.

Tsuwamoto,R.and S.Yokoi,et al.(2010).″Arabidopsis EMBRYOMAKER encoding an AP2domain transcription factor plays a key role in developmental change from vegetative toembryonic phase.″Plant Mol Biol 73(4-5):481-92.

Yamagishi,K.and K.Tatematsu,et al.(2009).″CHOTTO1,a double AP2 domain protein ofArabidopsis thaliana,regulates germination and seedling growth under excess supply ofglucose and nitrate.″Plant Cell Physiol 50(2):330-40.

Yano,R.and Y.Kanno,et al.(2009).″CHOTTO1,a putative double APETALA2 repeattranscription factor,is involved in abscisic acid-mediated repression of gibberellinbiosynthesis during seed germination in Arabidopsis.″Plant Physiol151(2):641-54.。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列，并提供该水稻基因的应用，具体涉及水稻AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因编码序列及其应用。具体包括：AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，表达载体构建，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后的表达模式变化进行分析鉴定，以及转化此基因于水稻中花11号内，进行分子鉴定和胁迫实验，检测其基因表达量变化及抗性改变等。

本发明通过克隆水稻中AP2/EREBP家族转录因子基因OsAIL5，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，结果显示基因在各个器官中组成型表达。在接受KT和IAA激素处理后，OsAIL5的表达量上升；盐胁迫处理1天或4天、干旱处理4天、低温处理1天后，OsAIL5的表达量上升；在GA、ABA、6-BA激素、PEG处理1天后，OsAIL5的表达量并没有变化，在JA处理1天后表达量反而有所下调。将OsAIL5转入水稻中花11后，观察到转基因株系种子发芽对高浓度NH₄NO₃敏感，结果表明OsAIL5基因在种子休眠过程中起作用。

本发明能为研究水稻种子胚胎发育过程打下基础，从而为通过提高水稻种子活性和发芽率，增强种子质量最终实现产量提高提供基因来源与技术支持。

具体而言，本发明从水稻中克隆出一种新的AP2/EREBP家族转录因子基因，命名为OsAIL5，为具有特定序列的DNA分子，其中ORF为1.488kbp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供所述水稻OsAIL5蛋白编码序列，有495个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，与其他物种中AP2/EREBP家族基因中的成员进行同源性比对。

本发明还提供了用于调取获得水稻样品中基因OsAIL5的一对核苷酸引物；该引物根据基因OsAIL5设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长1.488kbp的基因片段。具体的引物序列为：

Forward Primer：5’CGCAGATCTGTAGCTCGCAGAAAAATAC 3’(Bgl Ⅱ)(SEQ ID NO.3）

Reverse Primer：5’CG ACTAGTACATTACCTCTCTTTTCCC3’(Spe Ⅰ)（SEQ ID NO.4）

本发明提供了一种检测水稻基因OsAIL5在不同器官表达模式的方法，其特征在于，其包括，利用所述基因OsAIL5的核苷酸序列作为设计引物的保守区段，调取其序列的引物序列：

Forward Primer：5’AGCACCAGCATCAGCA3’（SEQ ID NO.7）

Reverse Primer：5’CATTACCTCTCTTTTCCCC3’（SEQ ID NO.8）

对水稻cDNA样品进行Real-timePCR,然后检测该基因在花、茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA；其步骤如下：

（1）提取水稻器官的总RNA(Trizol，市售)；

（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA，根据SEQ ID NO.7和SEQID NO.8设计引物，根据SEQ ID NO.1，跨越ORF区和3`UTR的308bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明提供了一种检测水稻基因OsAIL5在高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理下的表达模式变化的方法，其特征在于，其包括，将水稻进行高盐、低温、干旱胁迫以及激素处理后，提取水稻叶片中的RNA；利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8，进行定量PCR检测，其步骤如下：

（1）将两周大的水稻苗置于200μM氯化钠溶液中，28℃培养1d、4d以进行高盐胁迫处理；置于水中，4℃培养1d以进行低温处理；置于10μM IAA、10μM KT、50μM ABA、5μM GA、10μM 6-BA中，28℃分别培养24h以进行激素处理；置于10%PEG中，28℃培养1d、4d以进行干旱胁迫处理；置于100μM JA中，28℃培养1d进行处理；置于水中，28℃培养1d、4d作为对照；

（2）提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA(Trizol，市售)；

（3）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA反转录成cDNA，根据SEQ ID NO.7和SEQID NO.8设计引物，根据SEQ ID NO.1，跨越ORF区和3`UTR的308bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。

本发明提供了一种检测水稻基因OsAIL5在水稻萌发生长2～10天表达模式改变的方法，其步骤如下：

（1）野生型日本晴的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至MS培养基上，同时置于28℃培养箱培养；

（2）每天取水稻叶片和根，提取水稻器官的总RNA(Trizol，市售)；

本发明提供了一种构建pCAMBIA1304-OsAIL5表达载体的方法，其步骤如下：

（1）以pCRBlunt-OsAIL5载体质粒为模板，利用：

Forward Primer：5’CGCAGATCTGTAGCTCGCAGAAAAATAC3’(Bgl Ⅱ)（SEQ ID NO.5）

Reverse Primer：5’CG ACTAGTACATTACCTCTCTTTTCCC 3’(Spe Ⅰ)（SEQ ID NO.6）设计引物，克隆出含有SEQ ID NO.1的序列；

（2）将上述序列构建到pCAMBIA 1304载体中，酶切位点分别为5’-BglⅡ，3’-SpeⅠ，经转化，进行阳性克隆的PCR验证。

本发明提供了一种检测转入外源OsAIL5基因的水稻与野生型水稻对NH₄NO₃胁迫敏感程度改变的方法，其步骤如下：

（1）转基因株系与野生型的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至添加60和70mMNH₄NO₃以及未添加NH₄NO₃的MS培养基上，同时置于28℃培养箱培养；

（2）观察统计每天实验组与对照组的发芽率和生根率情况，并在第6天时，观察并测量转基因株系与野生型株系的株高、最长根长、鲜重、地上部分鲜重以及地下部分鲜重，并分别做比较；

本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体以及质粒。

本发明提供的水稻基因OsAIL5可用于植物品种改良，如用于改善水稻抗低温、干旱胁迫、激素胁迫的等性能，释放种子休眠，加速种子发芽，从而提高水稻产量。

附图说明

图1，对OsAIL5推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析。

图2，最小进化法对不同物种中AP2亚家族基因氨基酸序列的进化分析。

图3，水稻OsAIL5的表达模式分析，其中，图3a为OsAIL5在水稻不同器官中的表达谱；图3b为不同激素处理后OsAIL5的表达谱；图3c为不同胁迫处理条件下OsAIL5的表达谱，其中ck为对照，PEG1d，4d为PEG处理后1天和4天；NaCl 1d，4d为NaCl处理后1天和4天；4℃1d、JA1d为4℃低温处理1天和JA处理1天。

图4，OsAIL5转基因水稻的分子鉴定。其中，OX1和OX2为35S：OsAIL5过表达的两个株系。

图5，水稻萌发生长初期2～10天OsAIL5的表达模式分析。

图6，NH₄NO₃处理后OsAIL5转基因水稻株系5天后OX1和OX2与野生型水稻WT的种子发芽情况分析。其中，图6A为OX1和OX2与WT萌发5天后的平皿照相；图6B为OX1和OX2与WT在60mM和70mMNH₄NO₃胁迫下连续5天的发芽率分析。

图7，OsAIL5转基因水稻株系OX1和OX2与野生型水稻WT在NH₄NO₃胁迫下早期苗的生长情况分析，其中，图7A为OX1和OX2与WT在60mM和70mMNH₄NO₃胁迫5天后的长势比较；图7B为60mM和70mMNH₄NO₃胁迫5天后的相对生根率，图7C为60mM和70mMNH₄NO₃胁迫5天后的株高分析。

图8，OsAIL5转基因水稻株系OX1和OX2与野生型水稻WT幼苗的NH₄NO₃胁迫生态学指标分析，其中，图8A-8E分别为OX1和OX2与WT在60mM和70mMNH₄NO₃胁迫6天后的最长根长、根数目、植株鲜重、植株地上部分鲜重和植株地下部分鲜重分析。

具体实施方式

下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1水稻基因OsAIL5的克隆

1.水稻品种Nipponbare（Oryza sativa Japonica）在培养箱(SPX-250-GB,Shanghai,China)中培养：生长条件为光周期16h/8h(L/D)，28℃；

2.RNA提取取100毫克左右新鲜的水稻植物组织材料，液氮充分研磨。加1mlTrizol试剂，涡旋15s后室温放置5min。加0.2ml氯仿，去蛋白，12000rpm离心10min后上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min，12krpm离心10min，弃上清，用DEPC处理过的水配制的75%乙醇1ml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5-10min，溶于20μl DEPC水中，测OD值，电泳检测；

3.基因的克隆通过对应的拟南芥的AtAIL5基因进行生信分析与基因文库中比对与搜索，目标基因与拟南芥的基因AtAIL5同源性为80%以上。以逆转录的水稻cDNA第一链为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得基因全长，具体序列信息如SEQ ID NO.1所示。

实施例2水稻基因OsAIL5的同源性以及进化树分析

利用Clustal.X程序对OsAIL5推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析；结果显示，在OsAIL5中明显的AP2亚家族所特有的YRG-RAYD区域（如图1所示）。

利用Mega4软件，最小进化法进行AP2亚家族成员的系统进化分析（如图2所示）；所挑选的序列均系根据已发表的成果或通过BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）在线搜索获得，结果显示，OsAIL5与拟南芥AtAIL5同源性最高，其次与AtPLT2，AtBBM亲缘关系也很近，所以推测OsAIL5，AtAIL5可能与这两个基因的功能类似。

实施例3水稻OsAIL5基因器官表达模式分析

分别提取水稻花、茎、幼叶、老叶、根等中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测（如图3a所示），结果显示，该基因为组成型表达，在幼叶中表达量最高，茎和花中表达量也很高，在成熟叶，老叶和根中表达量相对较少。

实施例4水稻基因OsAIL5在低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理下的表达模式分析

对两周大的水稻幼苗分别进行10μM KT、10μM 6-BA、10μM IAA、5μM GA、50μM ABA、10μM KT、100μM JA、4℃低温分别处理24h，10%PEG、200μM NaCl处理1d、4d，并同无处理的对照组一起，分别提取叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，不同激素处理，目标基因OsAIL5受KT和IAA的诱导，与GA、ABA和6-BA处理无关（如图3b所示）。，PEG处理1天后OsAIL5的表达量无明显变化，处理4天后被诱导，NaCl处理1天后即被诱导，4天后比处理1天表达量稍有提高，低温处理1天后表达量明显上调，JA处理1天后表达量有所下调（如图3c所示）。

实施例5水稻基因OsAIL5在萌发2～10天表达模式分析

分别提取野生型日本晴水稻种子发芽生长第2～10天叶片和根中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，该基因在水稻种子发芽前期表达量较低，至第5天表达量开始升高，第7天时到达顶峰，第8天开始又渐渐下降，恢复至较低水平（如图4所示）。

实施例60sAIL5转基因水稻的分子鉴定

分别提取35S：OsAIL5两个株系OX1、OX2以及野生型中花11对照组中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行实时荧光定量PCR检测（如图5所示），结果显示，OX1和OX2中OsAIL5基因表达量比野生型明显要高。之后实验即选用OX1和OX2两个株系作为实验材料。

实施例7转入基因OsAIL5的水稻对高硝酸盐抗性的改变

1.35S：OsAIL5转基因株系OX1、OX2以及野生型WT的种子经消毒液处理，无菌水清洗，置于无菌操作台晾干后，将其转移至添加60和70mMNH₄NO₃以及未添加NH₄NO₃的MS培养基上，同时置于28℃培养箱培养，5天后拍照（如图6A所示）；

2.观察统计每天实验组与对照组的发芽率(图6B)和相对生根率情况（如图7B所示），并在第6天时，观察并测量转基因株系与野生型株系的株高（如图7C所示）、最长根长（如图8A所示）、根数目（如图8B所示）鲜重（如图8C所示）、地上部分鲜重（如图8D所示）以及地下部分鲜重（如图8E所示），并分别做比较。

结果显示，转基因过表达OX1和OX2两个株系的发芽和生长抑制情况均比wt更为严重，过表达株系的发芽率、相对生根率、株高、鲜重（地上部分鲜重和地下部分鲜重）都显著低于wt。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 水稻AP2/EREBP家族转录因子OsAIL5基因编码序列及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

atggacatgg acacctcgca ccactatcca tggctcaact tctccctcgc ccaccactgt 60

gaaatggagg aggaggagag gggcgcggcg gccgagctgg ccgcgatagc cggggcggct 120

ccgccgccga aactggagga cttcctcggc ggcggctgca acgggggatc aagcggtggc 180

gcttgcccgc cggtccagac gacggcgccg acggccgccg agctgtacga gtcggagctc 240

aagtttctcg ccgccggctt ccagctgagc ggcgcggctg gggcggcgcc gccggtgccc 300

gcgctgttgc cggcggctgc tctagagcag accgacgaga cgaagcagct ggccttgccg 360

ccgcaggccg cggtggcgcc gccgccggag cagaagaagg cggtggactc gttcgggcag 420

agaacgtcta tctaccgcgg cgtcacacgg catcggtgga ccggaaggta cgaggcgcat 480

ctgtgggata acagctgccg gcgtgagggc cagagccgca agggacgcca agtgtacttg 540

ggtggctatg ataaggagga gaaagcggcg agggcgtatg atcttgccgc gttgaagtac 600

tggggtccta gcaccacaac caactttccg gttgccgagt acgaaaagga gcttgaggag 660

atgaagcata tgacacgcca ggagtttgta gcttcactta ggaggaagag cagtggattc 720

tctcgtggtg cttctatata caggggtgtt acaagacatc accagcatgg gcgatggcaa 780

gcaaggatcg gaagagtggc tggcaacaag gatctctacc tcggaacatt cggcactgag 840

gaggaagctg cagaagctta tgacatcgcg gcgatcaagt tccgtggcct gaatgctgtc 900

accaactttg agatcggccg gtataacgtg gagagcataa tcagtagcaa ccttccaatc 960

gggagcatgg ccggcaaccg gagcaccaag gccggcctag agctcgctcc gtcgagctcc 1020

gccgacgcca tcgccgccac cgaagcgaac cacaccggcg tcgcgccacc gtcgacgctt 1080

gcgttcacag ctcttccaat gaagtatgat caggcagatt acctgtcata cctcgcattg 1140

cagcatcacc agcaaggaaa ccttcagggg ctaggcttcg gtctctacag ctcaggtgta 1200

aacctggatt tcgcaaatgc caatggcaat ggagccatgt caaattgcta caccaatgtc 1260

tcattacatg agcagcagca gcaacatcag caccagcatc agcaggagca gcagcaagat 1320

caacaggatg atcagtcaca aagctccaac aacagctgcg gctccattcc gtttgcaaca 1380

cccatagctt tcagtgggtc atatgaaagc tccatgacag cagcaggcac ctttggatac 1440

tacccaaatg ttgcagcctt tcagacacca atctttggga tggaatga 1488

<210> 2

<211> 495

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Asp Met Asp Thr Ser His His Tyr Pro Trp Leu Asn Phe Ser Leu

1 5 10 15

Ala His His Cys Glu Met Glu Glu Glu Glu Arg Gly Ala Ala Ala Glu

20 25 30

Leu Ala Ala Ile Ala Gly Ala Ala Pro Pro Pro Lys Leu Glu Asp Phe

35 40 45

Leu Gly Gly Gly Cys Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ala Cys Pro Pro

50 55 60

Val Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Ser Glu Leu

65 70 75 80

Lys Phe Leu Ala Ala Gly Phe Gln Leu Ser Gly Ala Ala Gly Ala Ala

85 90 95

Pro Pro Val Pro Ala Leu Leu Pro Ala Ala Ala Leu Glu Gln Thr Asp

100 105 110

Glu Thr Lys Gln Leu Ala Leu Pro Pro Gln Ala Ala Val Ala Pro Pro

115 120 125

Pro Glu Gln Lys Lys Ala Val Asp Ser Phe Gly Gln Arg Thr Ser Ile

130 135 140

Tyr Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu Ala His

145 150 155 160

Leu Trp Asp Asn Ser Cys Arg Arg Glu Gly Gln Ser Arg Lys Gly Arg

165 170 175

Gln Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala Arg Ala

180 185 190

Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Pro Ser Thr Thr Thr Asn

195 200 205

Phe Pro Val Ala Glu Tyr Glu Lys Glu Leu Glu Glu Met Lys His Met

210 215 220

Thr Arg Gln Glu Phe Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser Gly Phe

225 230 235 240

Ser Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His Gln His

245 250 255

Gly Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys Asp Leu

260 265 270

Tyr Leu Gly Thr Phe Gly Thr Glu Glu Glu Ala Ala Glu Ala Tyr Asp

275 280 285

Ile Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Asn Ala Val Thr Asn Phe Glu

290 295 300

Ile Gly Arg Tyr Asn Val Glu Ser Ile Ile Ser Ser Asn Leu Pro Ile

305 310 315 320

Gly Ser Met Ala Gly Asn Arg Ser Thr Lys Ala Gly Leu Glu Leu Ala

325 330 335

Pro Ser Ser Ser Ala Asp Ala Ile Ala Ala Thr Glu Ala Asn His Thr

340 345 350

Gly Val Ala Pro Pro Ser Thr Leu Ala Phe Thr Ala Leu Pro Met Lys

355 360 365

Tyr Asp Gln Ala Asp Tyr Leu Ser Tyr Leu Ala Leu Gln His His Gln

370 375 380

Gln Gly Asn Leu Gln Gly Leu Gly Phe Gly Leu Tyr Ser Ser Gly Val

385 390 395 400

Asn Leu Asp Phe Ala Asn Ala Asn Gly Asn Gly Ala Met Ser Asn Cys

405 410 415

Tyr Thr Asn Val Ser Leu His Glu Gln Gln Gln Gln His Gln His Gln

420 425 430

His Gln Gln Glu Gln Gln Gln Asp Gln Gln Asp Asp Gln Ser Gln Ser

435 440 445

Ser Asn Asn Ser Cys Gly Ser Ile Pro Phe Ala Thr Pro Ile Ala Phe

450 455 460

Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Ser Met Thr Ala Ala Gly Thr Phe Gly Tyr

465 470 475 480

Tyr Pro Asn Val Ala Ala Phe Gln Thr Pro Ile Phe Gly Met Glu

485 490 495

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

gagatagagg ataacccac 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

aagagagtag aggaaaata 19

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

cgcagatcta ggagatagag gataacccac 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

cactagtctg catcccgagg tcag 24

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

aggaattcgt ttgccctaat aacgctg 27

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

cgtctagatg aagacacctg gaaaat 26

Claims

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因，记为OsAIL5，全长1488bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的基因OsAIL5编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码495个氨基酸残基，分子量53.556kDa，等电点为5.72，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.用于调取获得水稻样品中基因OsAIL5的引物序列，其特征在于，根据权利要求1所述基因OsAIL5设计，所述序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.用于构建pCAMBIA1304-OsAIL5载体的引物序列，其特征在于，根据权利要求1所述基因OsAIL5开放阅读框设计，含有BglⅡ/Spe Ⅰ酶切位点，所述序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.一种检测水稻基因OsAIL5mRNA表达模式的方法，其特征在于，利用权利要求1所述基因OsAIL5的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，对水稻cDNA样品进行Real-time PCR，然后检测该基因在花、茎、叶、根中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA；其步骤包括：

提取水稻不同器官的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行定量PCR检测。

6.一种检测水稻在低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后基因OsAIL5表达含量变化的方法，其特征在于，其包括步骤：将水稻进行低温、干旱、高盐胁迫以及植物激素处理后，提取水稻的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行定量PCR检测。

7.一种检测水稻中花11在转入基因OsAIL5后水稻中基因OsAIL5表达含量变化的方法，其特征在于，其包括步骤：提取转入OsAIL5基因和野生型对照组水稻的总RNA；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，进行定量PCR检测。

8.如权利要求1所述的水稻基因OsAIL5在改良植物品种中的应用。