CN108676804A - 拟南芥at5g49330基因在盐胁迫反应方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥AT5G49330基因在调控植物盐胁迫反应方面的应用。该基因通过调控、影响盐胁迫下的活性氧积累和盐胁迫信号转导途径调控、影响植物盐胁迫反应；将该基因突变后，突变材料对盐敏感；而将该基因超表达后，突变材料株系更加耐盐。本申请证明了：拟南芥AT5G49330通过调控盐胁迫下的活性氧积累及影响盐胁迫信号途径调节了植物对于盐胁迫的反应。该基因的缺失造成拟南芥在种子萌发及幼苗生长对于盐胁迫高度敏感表型，该基因的超表达促进植物盐胁迫耐性。而利用这一特性，极有可能利用这一基因为培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论基础和应用基础。

Description

拟南芥AT5G49330基因在盐胁迫反应方面的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥AT5G49330基因在调控植物盐胁迫反应方面的应用。
背景技术
生物或非生物胁迫是影响植物生长发育的重要原因之一，受限于我国多盐碱地的实际情况，因此高盐等非生物胁迫往往对于作物产量的提升具有重要影响。高盐胁迫条件下，植物细胞通常会受到离子毒害、渗透胁迫和氧化损伤等影响，因此，研究植物中盐胁迫反应重要组分及功能机制，对于深入理解植物盐胁迫反应机制，合理利用基因资源，培育耐盐、高产的农作物品种，具有重要的理论及现实意义。
拟南芥AT5G49330基因编码植物中R2R3-MYB类转录因子，其CDS长度为1026 bp，编码含有342个氨基酸的转录因子蛋白。针对R2R3-MYB类转录因子，现有研究中，虽然部分研究认为该家族的部分基因与植物抗性相关，但针对拟南芥AT5G49330基因而言，已有研究证实其调控拟南芥黄酮醇类次生代谢物质的生物合成，并未发现其在植物非生物胁迫中的功能及作用的相关报道。
发明内容
本申请目的在于提供拟南芥AT5G49330基因在植物盐胁迫反应方面的新用途，从而为拓展该基因的新用途、以及培育新的耐盐作物品种奠定一定理论和应用基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，该基因编码的蛋白质调控植物黄酮醇生物合成，其主要通过调控、影响盐胁迫下的活性氧积累和盐胁迫信号转导途径调控、影响植物盐胁迫反应；将该基因突变（失活、无法表达或无法正确表达原有蛋白）后，突变材料对盐敏感；而将该基因超表达后，突变材料株系更加耐盐。
具体而言：
拟南芥AT5G49330基因的T-DNA插入突变体及Cas9基因编辑株系，在种子萌发及幼苗生长对于盐胁迫的高度敏感；
而AT5G49330基因超表达（拟南芥）株系则表现出较高的耐盐性（具体例如：可耐受培养基质中不超过300 mM NaCl含量，具体例如可耐受培养基质中150 mM NaCl，此含量情况下对于植株生长发育不具有影响）；
分析表明：盐处理条件下，相对于野生型（WT），突变体植株中黄酮醇含量较低、活性氧积累较多（例如可通过活性氧清除酶SOD、POD、CAT对应基因含量情况进行监测判定）、抗氧化酶活性较低、抗氧化能力较弱；而转基因超表达株系则相反；
换言之，AT5G49330的表达受到盐胁迫的诱导，盐胁迫下突变体中黄酮醇合成途径关键酶基因、抗氧化酶相关基因、盐胁迫反应基因的表达水平显著低于野生型。
利用上述结论，可设计一种提高植物耐盐胁迫能力的转基因植物培育方法，即，通过基因工程技术，将AT5G49330基因进行超表达，进而提升新培育的转基因植物的耐盐能力；所述植物，具体例如为拟南芥。
现有技术中，虽然有对拟南芥AT5G49330基因功能有了一定的研究，但主要集中在其调控植物次生代谢影响黄酮醇生物合成方面，对于其在植物非生物胁迫方面的功能一直未见报道。
本申请中，发明人利用AT5G49330遗传材料，通过一系列的实验证明了：拟南芥AT5G49330通过调控盐胁迫下的活性氧积累及影响盐胁迫信号途径调节了植物对于盐胁迫的反应。具体而言：拟南芥AT5G49330基因所编码蛋白为一个R2R3-MYB转录因子家族成员，该基因的缺失造成拟南芥在种子萌发及幼苗生长对于盐胁迫高度敏感表型，该基因的超表达促进植物盐胁迫耐性。而利用这一特性，极有可能利用这一基因为培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论基础和应用基础。
附图说明
图1 为CRISPR/Cas9介导的AT5G49330基因的定点编辑检测图；其中：（A）用于稳定转化的Cas9- sgRNA- AT5G49330表达盒示意图；（B）PCR扩增鉴定结果；（C） CRISPR/Cas9介导AT5G49330的突变测序结果，右侧为突变的类型；（D）CRISPR/Cas9介导AT5G49330的纯合突变株系测序结果；
图2 为AT5G49330（MYB111）超表达植株的构建与鉴定；其中：（A）35S::YFP和35S::YFP:MYB111融合表达载体示意图；（B）AT5G49330超表达植株的RT-PCR鉴定；
图3为 AT5G49330相关遗传材料在盐胁迫下的种子萌发及幼苗生长表型；myb111为AT5G49330基因的T-DNA插入纯合体株系，myb111-d1和myb111-d2为该基因的Cas9基因编辑株系，OE-2和OE-8为转基因超表达株系；其中：
（A）AT5G49330相关遗传材料盐胁迫下9天后差异表型；
（B）正常条件下萌发率统计；
（C）100Mm NaCl条件下萌发统计；
（D）AT5G49330基因T-DNA插入纯合体150 mM NaCl下生长12天幼苗表型及根长统计；
（E）Cas9基因编辑株系200 mM盐胁迫下幼苗生长12天幼苗表型及根长统计；
（F）转基因超表达株系150 mM NaCl下生长12天幼苗表型及根长统计；
图4为 AT5G49330相关遗传材料盐处理后的活性氧积累检测；其中：（A）DAB染色原位检测H2O2积累状况；（B）NBT染色原位检测超氧阴离子积累状况；
图5为AT5G49330相关遗传材料盐胁迫下黄酮醇含量、抗氧化酶活性以及活性氧清除能力检测；其中（A）盐胁迫处理下黄酮醇含量测定；（B）关键抗氧化酶活性检测；（C）活性氧清除能力检测；
图6 为AT5G49330受盐胁迫的诱导表达检测；其中：（A）qRT-PCR检测盐处理过程中AT5G49330基因的表达状况；（B）GUS染色检查盐处理后的诱导表达状况；
图7为AT5G49330基因的突变对于黄酮醇生物合成关键酶基因、抗氧化酶基因以及盐胁迫相关基因表达的影响；其中：（A）黄酮醇生物合成关键酶基因盐处理过程中的表达检测；（B）抗氧化酶基因盐处理过程中的表达检测；（C）盐胁迫相关基因表达检测；
图8为 AT5G49330参与拟南芥盐胁迫反应的作用过程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
（一）生物材料
拟南芥AT5G49330基因，已有研究表明其编码一个R2R3-MYB类转录因子，该基因与拟南芥苯丙烷途径次生代谢物质（黄酮醇等）生物合成相关（具体可参考：https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObjectid=132181&type=locus），但关于该基因在植物应对盐、干旱等非生物胁迫中的功能未见报道。因此，本申请主要以拟南芥AT5G49330基因突变体及转基因拟南芥超表达株系为基础，对该基因在非生物胁迫下的功能进行了研究。
拟南芥AT5G49330基因T-DNA插入突变体（myb111）从拟南芥资源中心（ABRC，OhioState University）获得，由发明人根据现有技术进行纯合体表达、分析并最终进行鉴定。
（二）部分物质的检测方法
就下述实施例中涉及的部分物质的检测方法简要说明如下。
（1）黄酮醇及花青素检测方法
称取约0.1 g的样品，放入提前放有钢珠的2 mL的EP管中，液氮速冻后，用组织研磨器1000 rpm研磨40 s至粉末状，立即加入600 μL含1% HCl的甲醇溶液，上下剧烈震荡60 s，4℃旋转晃动4 h以上；
向上述EP管中加入600 μL氯仿（等体积）和300 μL蒸馏水，上下剧烈震荡，充分混匀，4℃、1200 rpm离心15 min，小心吸取上清液转至对应新的EP管中；
吸取50 μL上清液加入到酶标板中，迅速放入全波长酶标仪中，测定在340 nm、530 nm和657 nm处的吸光值；
总黄酮含量计算公式：A340/FW；花青素含量计算公式：(A530-0.33A657)/FV。
（2）O2-自由基清除能力检测
用植物提取液200 μL（提取方法与黄酮醇含量测定用植物提取液方法相同）与Tris-HCl (pH = 8.2)缓冲液900 μL、6 mM邻苯三酚溶液80 μL进行混合，反应4分钟后，加入200μL浓盐酸终止反应，测定320 nm处的吸光值；即可计算O2-自由基清除率。
（3）·OH自由基清除率测定
依次吸取9 mM硫酸亚铁溶液400 μL，9 mM的水杨酸-乙醇溶液400 μL和植物提取液样品400 μL到2 mL EP管中，颠倒混匀，最后加入8.8 mM过氧化氢溶液400 μL启动整个反应体系，37℃反应30 min后，迅速放入全波长酶标仪中，测定在512 nm处的吸光值。
（4）DPPH自由基清除率测定
吸取0.2 mM DPPH溶液500 μL，植物提取液样品500 μL到2 mL EP管中，颠倒混匀，室温黑暗反应30 min后，迅速放入全波长酶标仪中，测定在517 nm处的吸光值。
（5）SOD、POD、CAT活性检测
检测SOD、POD、CAT活性时，分别利用购自索莱宝的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶酶（POD）活性检测试剂盒，参考对应说明书进行相关检测操作。
（三）本申请中涉及到的部分检测用引物序列详列如下（序列均为5'-3'）
构建AT5G49330基因启动子驱动GUS基因重组载体（ProMYB111:GUS vector）过程中所用引物（引物序列如SEQ ID NO.1~2所示）设计如下：
ProMYB111:GUS-F：CGCGGATCCGACCAGTATAAGCCATTTGCC，
ProMYB111:GUS -R：CCGGAATTCTGCTTCTCGGTCTCTTCTGTC；
AT5G49330基因PCR扩增及定量PCR（qRT-PCR）检测用引物（序列如SEQ ID NO.3~4所示）设计如下：
AT5G49330-F：GAACAAGGAAGCGAGACAAAG，
AT5G49330-R：TCCCAATCAAGCAACTCCTC；
部分基因定量PCR（qRT-PCR）扩增检测时所用引物设计如下：
（1）针对PAL基因
PAL-F：ATCAGCAGTGAGTCAGGTGG，
PAL-R：CTTGAGACATTCCAACAACG；
（2）针对CHS基因
CHS-F：CGCATCACCAACAGTGAACAC，
CHS-R：TCCTCCGTCAGATGCATGTG；
（3）针对CHI基因
CHI-F：CCGGTTCATCGATCCTCTTC，
CHI-R：ATCCCGGTTTCAGGGATACTATC；
（4）针对F3H、F3’H基因
F3H-F：CAGATCGTTGAGGCTTGTGAGA，
F3H-R：GACGAGTCATATCCGCCACTAAGT；
F3’H-F：GCTCTCGCCGGAGTATTCAA，
F3’H-R: CCAGCGACGCCTTGTAAATC；
（5）针对FLS基因
FLS-F: CCGTCGTCGATCTAAGCGAT，
FLS-R: CGTCGGAATCCCGTGGT；
（6）针对SOD基因
SOD-F: ATGAGAAGTTCTATGAAGAG，
SOD-R: GTCTTTATGTAATCTGGT；
（7）针对CAT基因
CAT-F: GCAACTACCCCGAGTGGAAA，
CAT-R: TGTTCAGAACCAAGCGACCA；
（8）针对POD基因
POD-F: TCCGGGAGCCACACCATTGG，
POD-R: TGGTCGGAATTCAACAG；
（9）针对SOS1、SOS2、 SOS3基因
SOS1-F: CGTGAAGCAATCAAGCGGAAATT，
SOS1-R: AAATTGGGTAGTGGATCCATTAACTATCAGA；
SOS2-F: CGAAACTTCAAGACAAGGCTC，
SOS2-R: GTGCCACCTCGTAAATCTCTATC；
SOS3-F: GTAATGGTGGATAAGGCTTTCG，
SOS3-R: TGAGCGATGGATTCAAGGATAC；
（10）针对AVP1基因
AVP1-F: GCCCTAGTCTCCTTGGCTCT，
AVP1-R: AGAGCTGCACTTCCCACACT；
（11）针对RCD1基因
RCD1-F: GAGGTTCAGGAAGTGCAAACAGT，
RCD1-R: AACAGAGTAGGAAATGGCATCCA；
（12）针对CBL10基因
CBL10-F: AACAAATGGTTTCTGCTATTCTC，
CBL10-R: ATCTGCATCAGCAAATGTTTTATC。
实施例1
本申请在具体后续AT5G49330基因功能性探索实验中还涉及Cas9基因编辑株系（myb111-d1和myb111-d2）及转基因超表达株系（OE-2和OE-8）材料的应用，因此，本申请就这些转基因株系的获得及表达检测等鉴定过程简要介绍如下。
（一）Cas9基因编辑株系（myb111-d1和myb111-d2）的获得
具体过程简介如下：
（1）借助CRISPR/Cas9的基因组编辑技术，针对AT5G49330的CDS序列，分别在该基因的三个外显子上各设计了一个特异的靶位点，构建了MYB111的三个sgRNA表达盒Cas9载体（示意图如图1 A所示）；
（2）利用sgRNA表达盒全长引物PB-L和PB-R进行PCR扩增鉴定（鉴定结果如图1 B所示），经测序比对无误后，转化重组载体至农杆菌GV3101菌株中；
（3）通过农杆菌介导的拟南芥花序侵染转化法，获得18个拟南芥PPT（phosphinothricin）抗性植株。
测序结果显示，12个株系均在目的基因第一个靶位点处发生了编辑（如图1 C所示），基因的编辑效率为66.6%，编辑的类型主要是碱基增加或缺失。
进一步地，经过两代自交，获得了61、67和77三个纯合编辑株系（图1 D），选择Cas9纯合编辑株系61中的两个，分别命名为myb111-d1 (Cas9 deletion plant 1)、myb111-d2进行后续实验。
（二）转基因超表达株系（OE-2、OE-8）的获得
具体过程简介如下：
（1）首先构建了组成型表达启动子35S驱动的AT5G49330的超表达载体35S::YFP:AT5G49330（示意图如图2 A所示）；
（2）将重组质粒经过质粒PCR、酶切和生工测序验证后，转化至农杆菌GV3101中；
（3）通过拟南芥花序侵染转化法，获得AT5G49330超表达株系35个。
对转基因阳性纯合体材料进行RT-PCR和qRT-PCR实验，结果显示，AT5G49330在4个超表达株系均呈现较高水平的表达（检测结果如图2 B所示），选取表达量最高的OE-2和OE-8两个株系进行后续研究。
实施例2
本实施例主要介绍一下关于拟南芥AT5G49330基因与植物盐胁迫反应相关的实验验证过程。
（1）对种子萌发影响
将myb111、WT、两个超表达株系（OE-2、OE-8）和两个CAS9株系（myb111-d1、myb111-d2）播种于含有100 mM NaCl的0.6% MS培养基中，经春化后移至光照培养间（光/暗周期为16/8h、温度19-21℃，相对湿度70%）中，观察并统计植物萌发状况。
结果如图3(A-C)所示，可以看出：在正常的MS上，WT、myb111、myb111-d1、OE-2和OE-8在第二天时几乎都全已萌发，且各个株系的植株长势基本相同，没有明显差异，在含有100 mM NaCl的MS培养基中，myb111和myb111-d的萌发与WT相比明显滞后，萌发率低；OE-2和OE-8萌发比WT稍微提前。
（2）对幼苗生长表型及根长影响
首先将各株系播种于1.2% MS固体培养基上的材料萌发并正常竖直生长5天，然后移至含有150 mM NaCl（不同株系处理浓度不同）的1.2% MS固体培养基上，观察各个株系在盐胁迫下植株生长情况。结果如图3（D-F）所示，myb111、myb111-d1、myb111-d2株系及转基因超表达株系正常生长12天时，平均根长均在80 mm左右，而150 mM NaCl胁迫下生长12天，myb111、myb111-d1的平均根长在25 mm，显著低于WT对照（35mm左右），而OE-2和OE-8平均根长在55 mm。即AT5G49330基因突变造成敏感的盐胁迫表型，而该基因的超表达赋予转基因植物促进的耐盐性。
综合上述实验结果可以看出，AT5G49330基因与植物盐胁迫反应紧密相关。
实施例3
由于盐等非生物胁迫会引起植物体内活性氧产生及氧化伤害，因此为进一步探索拟南芥AT5G49330基因在响应盐胁迫情况下的响应机制，发明人对拟南芥AT5G49330基因调控盐诱导的活性氧积累过程进行了进一步的实验验证，具体实验简要介绍如下。
对AT5G49330基因突变体、转基因超表达等遗传材料利用300mM盐处理后（10左右天幼苗进行相应浓度盐水浸泡）活性氧积累状况（采用DAB染色原位检测H2O2及NBT染色原位检测超氧阴离子）进行了检测。
结果如图4所示，分析表明：300 mM处理30 min后，myb111、myb111-d1、myb111-d2株系中积累了较多的H2O2和超氧阴离子，而OE-2和OE-8株系活性氧积累程度较轻。这一结果表明，拟南芥AT5G49330基因通过影响盐胁迫下植物体内活性氧的积累进一步调节了植物盐胁迫反应，在表达情况下，通过减少活性氧的积累从而减少盐胁迫对于植物的伤害性。
实施例4
在实施例3基础上，为进一步探讨盐胁迫条件下，AT5G49330基因调控影响活性氧积累的原因，发明人进行了进一步的实验验证和检测，具体实验简要介绍如下。
作为植物黄酮醇类物质生物合成调节子，我们利用在MS+100 mM NaCl上生长15天左右的AT5G49330基因遗传材料（myb111、myb111-d1、myb111-d2、OE-2和OE-8）中黄酮醇类物质的含量检测。
结果如图5A所示，分析可以看出，突变体相关株系在正常及盐胁迫条件下的黄酮醇含量均较WT低，而超表达株系黄酮醇积累显著较高。作为非酶抗氧化剂，黄酮醇含量的含量差异显然是盐胁迫条件下植物活性氧积累改变的原因之一。
在检测黄酮醇含量的同时，发明人对于重要的活性氧清除酶（SOD、POD、CAT）活性的变化情况也进行了检测。
结果如图5 B所示，分析可以看出，盐胁迫条件下，突变体相关株系SOD、POD及CAT活性也均低于WT，而转基因超表达株系中SOD、POD及CAT显著较高。因此，抗氧化酶活性的差异显然也是盐胁迫下活性氧积累程度改变的重要原因。
同时，发明人对于盐胁迫下的O2-、·OH和DPPH自由基清除率能力检测显示，结果如图5 C所示。分析可以看出，与WT相比，盐胁迫下突变体株系对于O2-、·OH和DPPH自由基的清除能力显著较低，而转基因超表达株系的清除能力显著较高。
综上结果可以看出，盐胁迫下植物体内黄酮醇的含量及抗氧化酶活性的差异是引起植物盐胁迫下氧自由基清除能力改变及活性氧积累差异的原因。
实施例5
发明人对于盐胁迫条件下，AT5G49330基因的表达变化情况进行了检测分析，相关过程简要介绍如下。
分别以15天左右、300 mM NaCl溶液浸泡（分别浸泡30 min、60 min、90 min和120min）处理的拟南芥幼苗作为样本材料，提取RNA并反转录为cDNA，利用反转录的cDNA为模版、AT5G49330基因特异引物（利用罗氏定量PCR反应液，20 μL体系进行，引物序列参见前述内容），进行基因表达量的实时检测。
结果如图6 A所示，分析可以看出，与对照相比，随着处理时间的推移，AT5G49330基因表达水平逐渐上升，即AT5G49330基因的表达受到盐胁迫的诱导。
进一步地，发明人构建了AT5G49330基因启动子驱动的报告基因GUS表达载体，转化拟南芥获得稳定转基因材料。具体过程为：
（1）利用特异引物（启动子扩增引物参见前述内容）扩增AT5G49330基因的启动子片段；
（2）对扩增的片段及质粒（pCMBIA1391）分别在37℃条件下酶切3小时，纯化酶切后的DNA及质粒片段，利用T4 DNA连接酶将启动子片段连入pCMBIA1391质粒构成重组载体；
（3）转化重组载体至农杆菌感受态细胞；然后利用农杆菌介导的拟南芥花转化进行拟南芥花序侵染。收获转化种子，并进行阳性转基因植株筛选。
对于三个独立的转基因株系进行盐胁迫下的GUS染色，结果如图6 B所示。分析可以看出：盐胁迫处理后，GUS着色明显受到促进，这进一步说明盐诱导了AT5G49330基因的表达。
实施例6
本实施例主要探索盐胁迫条件下，AT5G49330基因对黄酮醇合成关键酶、抗氧化酶及盐胁迫反应相关基因的表达影响情况。
对15天左右的突变体及野生型进行300 mM NaCl溶液浸泡30 min、60 min、90 min和120 min处理，检测黄酮醇合成关键酶基因（PAL、CHS、CHI、F3H、F3'H、FLS）的表达进行qRT-PCR检测（定量检测用特异引物参见前述内容）。结果如图7 A所示，分析可以看出，AT5G49330基因的突变，抑制盐胁迫下CHS、CHI、F3H、FLS的表达，从而造成黄酮醇合成及积累的受限。
类似地，对活性氧清除酶基因SOD、POD、CAT（定量检测用特异引物参见前述内容）的表达进行了定量检测，结果如图7 B所示。分析可以看出，AT5G49330基因的突变体myb111在正常及盐胁迫过程中的三种抗氧化酶基因的表达明显低于WT，显示AT5G49330对于抗氧化酶基因表达的正调控作用。
同样地，对于盐胁迫下myb111突变体和WT中SOS1、SOS2、SOS3、AVP1、RCD1、CBL10的表达量的检测显示。结果如图7 C所示，分析可以看出：SOS1、SOS2、SOS3、AVP1、RCD1、CBL10的表达受到盐胁迫的诱导，但在突变体中的诱导程度明显较弱。显示AT5G49330影响盐胁迫信号转导。
综合上述实施例，发明人认为，拟南芥AT5G49330基因翻译、表达的蛋白，作为一种R2R3类MYB转录因子，通过影响盐胁迫下的活性氧积累（调控黄酮醇合成和影响ROS清除酶基因的表达及活性）及盐胁迫反应基因表达调控参与植物对于盐胁迫的响应（作用模式如图8所示）。本研究为解析AT5G49330非生物胁迫反应中的功能机制提供研究基础和理论依据。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 拟南芥AT5G49330基因在盐胁迫反应方面的应用
<130> none
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
cgcggatccg accagtataa gccatttgcc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
ccggaattct gcttctcggt ctcttctgtc 30
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
gaacaaggaa gcgagacaaa g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 4
tcccaatcaa gcaactcctc 20

Claims (8)

1.拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，该基因通过调控、影响盐胁迫下的活性氧积累和盐胁迫信号转导途径调控、影响植物盐胁迫反应；将该基因突变后，突变材料对盐敏感；而将该基因超表达后，突变材料株系更加耐盐。
2.如权利要求1所述拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，拟南芥AT5G49330基因的T-DNA插入突变体及Cas9基因编辑株系，在种子萌发及幼苗生长阶段对盐胁迫高度敏感；而AT5G49330基因超表达株系则表现出较高的耐盐性。
3.如权利要求2所述拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，AT5G49330基因超表达株系耐培养基质中不超过300 mM NaCl含量。
4.如权利要求1所述拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，构建AT5G49330基因超表达株系时，PCR扩增AT5G49330基因时，引物序列设计如下：
AT5G49330-F：GAACAAGGAAGCGAGACAAAG，
AT5G49330-R：TCCCAATCAAGCAACTCCTC。
5.如权利要求1所述拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，所述通过调控、影响盐胁迫下的活性氧积累途径调控、影响植物盐胁迫反应，具体为：将该基因超表达后，突变材料活性氧积累程度变轻。
6.如权利要求1所述拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，对于活性氧积累程度进行监测判定时，通过活性氧清除酶SOD、POD、CAT对应基因含量情况进行监测判定。
7.如权利要求1所述拟南芥AT5G49330基因在在盐胁迫反应方面的应用，其特征在于，形象化检测显示AT5G49330基因表达量变化时，通过构建、转染AT5G49330基因启动子驱动的报告基因GUS表达载体进行实现，具体过程为：
（1）利用特异引物扩增AT5G49330基因的启动子片段；所述特异引物设计如下：
ProMYB111:GUS-F：CGCGGATCCGACCAGTATAAGCCATTTGCC，
ProMYB111:GUS -R：CCGGAATTCTGCTTCTCGGTCTCTTCTGTC；
（2）对扩增的片段及质粒pCMBIA1391分别酶切，并进行连接构建重组载体；
（3）转化重组载体至农杆菌感受态细胞；然后利用农杆菌介导的拟南芥花转化进行拟南芥花序侵染；最终收获转化种子，并进行阳性转基因植株筛选。
8.一种提高植物耐盐胁迫能力的植物培育方法，其特征在于，通过基因工程技术，将AT5G49330基因进行超表达。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229824A (zh) * 2019-05-10 2019-09-13 上海交通大学 盐芥TsHKT1;3启动子的克隆与应用
CN114836432A (zh) * 2022-04-13 2022-08-02 江西农业大学 一种提高种子在黑暗和盐胁迫条件下萌发率的拟南芥pif1基因及其应用
CN115772534A (zh) * 2022-08-25 2023-03-10 河南农业大学 Nua基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用
CN115772529A (zh) * 2022-08-25 2023-03-10 河南农业大学 Esd4基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用
CN116694647A (zh) * 2023-03-02 2023-09-05 中国农业科学院郑州果树研究所 猕猴桃盐胁迫响应基因AvMYB08及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100007772A (ko) * 2008-07-10 2010-01-22 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 내염 및 내한발성 유전자 ＳｔＭｙｂ 및 이의 용도
CN104357479A (zh) * 2014-11-18 2015-02-18 西南大学 干扰黄色色素表达同时超量表达番茄红素在制备红色花瓣芸薹属植物中的应用
CN105647883A (zh) * 2016-03-04 2016-06-08 河南大学 拟南芥tt4基因在植物抗盐方面的新应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100007772A (ko) * 2008-07-10 2010-01-22 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 내염 및 내한발성 유전자 ＳｔＭｙｂ 및 이의 용도
CN104357479A (zh) * 2014-11-18 2015-02-18 西南大学 干扰黄色色素表达同时超量表达番茄红素在制备红色花瓣芸薹属植物中的应用
CN105647883A (zh) * 2016-03-04 2016-06-08 河南大学 拟南芥tt4基因在植物抗盐方面的新应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STRACKE,R. ET AL.: "Arabidopsis thaliana putative transcription factor (At5g49330) mRNA, complete cds GenBank: AF371977.1", 《GENBANK》 *
崔心红: "《长三角滨海绿化耐盐植物应用》", 31 July 2016, 武汉大学出版社 *
樊若楠: "MYB111调控拟南芥盐胁迫反应的功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
许玲 等: "大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析", 《中国农业科学》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229824A (zh) * 2019-05-10 2019-09-13 上海交通大学 盐芥TsHKT1;3启动子的克隆与应用
CN110229824B (zh) * 2019-05-10 2021-07-20 上海交通大学 盐芥TsHKT1；3启动子的克隆与应用
CN114836432A (zh) * 2022-04-13 2022-08-02 江西农业大学 一种提高种子在黑暗和盐胁迫条件下萌发率的拟南芥pif1基因及其应用
CN115772534A (zh) * 2022-08-25 2023-03-10 河南农业大学 Nua基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用
CN115772529A (zh) * 2022-08-25 2023-03-10 河南农业大学 Esd4基因在植物盐胁迫抗性调控中的应用
CN116694647A (zh) * 2023-03-02 2023-09-05 中国农业科学院郑州果树研究所 猕猴桃盐胁迫响应基因AvMYB08及其应用

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