CN105294846A - Cic1蛋白在调控植物低温耐性中的应用 - Google Patents

Cic1蛋白在调控植物低温耐性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CIC1蛋白在调控植物低温耐性中的应用。本发明发现了突变体(cic1)，并构建了互补植株(cic1+CIC1)和转CIC1水稻，通过对突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和转CIC1水稻在低温条件下功能的研究，证明CIC1基因对植物低温耐性具有调控作用。本发明尝试阐述了水稻响应低温胁迫信号的通路，为提高水稻低温耐性提供理论依据，从而能够向广大北方地区进行推广种植。

Description

CIC1蛋白在调控植物低温耐性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CIC1蛋白在调控植物低温耐性中的应用。
背景技术
高等植物的叶绿体内进行着包括光合作用在内的多种重要活动，对于维持地球上能量固定和氧气再生起到了十分重要的作用。对叶绿体发育机制的研究不仅有助于我们对该领域相关科学问题的理解，还可能带来巨大的粮食作物生产的革命。水稻作为重要的粮食作物之一，单子叶模式植物，对其叶绿体发生机制进行深入研究受到了广泛重视。
水稻作为起源于热带、亚热带的植物对低温非常敏感，特别是在水稻发育的早期，往往由于低温对水稻的生长造成影响，最终使水稻减产。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下a)或b)或c)的蛋白质的新用途：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
本发明提供了上述蛋白质在调控植物抗逆性中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质在调控植物在低温条件下的表征中的应用。
上述应用中，所述表征为植物体内叶绿素的含量、植物叶绿体内基粒片层的厚度、植物叶绿体内基质片层的数量、植物光系统的活性、植物光合碳同化能力、植物叶绿体类囊体膜光系统复合物的含量、植物叶绿体类囊体膜ATP合酶的含量、植物体内活性氧清除酶类的活性和/或植物体内总GSH的含量。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料的新用途；
所述与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
本发明提供了与上述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用。
本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料在调控植物在低温条件下的表征中的应用；
所述表征为植物体内叶绿素的含量、植物叶绿体内基粒片层的厚度、植物叶绿体内基质片层的数量、植物光系统的活性、植物光合碳同化能力、植物叶绿体类囊体膜光系统复合物的含量、植物叶绿体类囊体膜ATP合酶的含量、植物体内活性氧清除酶类的活性和/或植物体内总GSH的含量。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物低温耐性；
所述调控植物在低温条件下的表征为如下1)-8)中至少一种：
1)提高植物体内叶绿素的含量：
2)增加植物叶绿体内基粒片层的厚度；
3)提高植物叶绿体内基质片层的数量；
4)提高植物光系统的活性；
5)提高植物光合碳同化能力；
6)提高植物叶绿体类囊体膜光系统复合物和/或ATP合酶的含量；
7)提高植物体内活性氧清除酶类的活性；
8)提高植物体内总GSH的含量。
上述应用中，
所述光系统复合物为D1蛋白和/或D2蛋白和/或CP43蛋白和/或CP47蛋白和/或PsaA/B蛋白；
所述ATP合酶为ATP合酶α亚基和/或ATP合酶β亚基。
本发明的第三个目的是提供上述蛋白质或与上述蛋白质相关的相关生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的相关生物材料在培育低温耐性提高的转基因植物中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的相关生物材料在培育低温条件下叶绿素含量高、叶绿体内基粒片层厚度高、叶绿体内基质片层数量多、光系统活性高、光合碳同化能力强、叶绿体类囊体膜光系统复合物含量高、叶绿体类囊体膜ATP合酶含量高、活性氧清除酶类活性高和/或总GSH含量高的转基因植物中的应用。
上述应用中，
所述光系统复合物为D1蛋白和/或D2蛋白和/或CP43蛋白和/或CP47蛋白和/或PsaA/B蛋白；
所述ATP合酶为ATP合酶α亚基和/或ATP合酶β亚基。
本发明还有一个目的是提供一种培育低温耐性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育低温耐性提高的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；
所述转基因植物的低温耐性高于所述受体植物。
本发明的最后一个目的是提供一种培育低温条件下叶绿素含量高、叶绿体内基粒片层厚度高、叶绿体内基质片层数量多、光系统活性高、光合碳同化能力强、叶绿体类囊体膜光系统复合物含量高、叶绿体类囊体膜ATP合酶含量高、活性氧清除酶类活性高和/或总GSH含量高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育低温条件下叶绿素含量高、叶绿体内基粒片层厚度高、叶绿体内基质片层数量多、光系统活性高、光合碳同化能力强、叶绿体类囊体膜光系统复合物含量高、叶绿体类囊体膜ATP合酶含量高、活性氧清除酶类活性高和/或总GSH含量高的转基因植物的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；
所述转基因植物具有如下1)-8)中至少一种表征：
1)转基因植物叶绿素含量高于所述受体植物：
2)转基因植物叶绿体内的基粒片层厚度高于所述受体植物；
3)转基因植物叶绿体内的基质片层数量高于所述受体植物；
4)转基因植物叶绿体类囊体膜的光系统复合物和/或ATP合酶的含量高于所述受体植物；
5)转基因植物的光系统活性高于所述受体植物；
6)转基因植物的光合碳同化能力高于所述受体植物；
7)转基因植物体内活性氧清除酶类的活性高于所述受体植物；
8)转基因植物体内总GSH的含量高于所述受体植物；
所述光系统复合物具体为D1蛋白和/或D2蛋白和/或CP43蛋白和/或CP47蛋白和/或PsaA/B蛋白；
所述ATP合酶具体为ATP合酶α亚基和/或ATP合酶β亚基。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物为水稻，所述水稻具体为日本晴。
本发明构建了突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和转CIC1水稻，试验证明：本发明的CIC1基因对植物低温耐性具有调控作用，通过对突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和转CIC1水稻在低温条件下功能的研究，尝试阐述水稻响应低温胁迫信号的通路，为提高水稻低温耐性提供理论依据，尽可能地减少低温对水稻减产的影响，从而能够向广大北方地区进行推广种植。
附图说明
图1为野生型水稻(WT)、突变体(cic1)及互补植株(cic1+CIC1)在不同温度下的表型和叶绿素含量。图1A为野生型水稻(WT)、突变体(cic1)及互补植株(cic1+CIC1)在不同温度下的表型；其中，a为野生型水稻(WT)，b为突变体(cic1)，c为互补植株；图1B为野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的叶绿素含量分析。
图2为不同温度条件下野生型水稻(WT)、突变体(cic1)及互补植株(cic1+CIC1)的叶绿体超微结构。
图3为不同温度条件下野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的Fv/Fm。
图4为不同温度条件下野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的CO2同化速率。
图5为免疫印迹检测不同温度条件下野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的叶绿体蛋白。图5A为30℃条件下野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的叶绿体蛋白；图5B为22℃条件下野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的叶绿体蛋白。
图6为不同温度条件下野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的类囊体膜蛋白BN-PAGE。图6A为BN-PAGE一向电泳。图6B为BN-PAGE二向电泳。
图7为CIC1蛋白的亚细胞和生化定位。图7A为GFP亚细胞定位；图7B为叶绿体生化定位。
图8为不同温度条件下野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的叶绿体光系统相关基因的转录情况。图8A为CIC1基因在水稻中的组织表达特异性分析；图8B为CIC1基因不同温度条件下的表达情况；图8C为RT-PCR检测叶绿体光合作用相关基因的表达；图8D为实时荧光定量PCR检测叶绿体光合作用相关基因的表达。
图9为不同温度条件下野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的活性氧清除系统相关酶活性的测定。
图10为不同温度条件下野生型水稻(WT)和突变体(cic1)体内的GSH含量分析。
图11为不同温度条件下野生型水稻(WT)、突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和T3代转CIC1水稻纯合株系OE2的表型及叶绿素含量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的野生型水稻日本晴(O.sativassp.japonica)在文献“Gong,L.H.etal.ProgressinGeneticResearchintoGrainShapeinRice.ChinBullBot,2011,46(6):597-605”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的GFP表达载体pBI221在文献“Chiweiet.al.ThepentratricopeptiderepeatproteinDELAYEDGREENING1isinvolvedintheregulationofearlychloroplastdevelopmentandchloroplastgeneexpressioninArabidopsis.Plantphysiology.2008”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的粳稻日本晴EMS诱变库在文献“Liuet.al.OsSPX1suppressesthefunctionofOsPHR2intheregulationofexpressionofOsPT2andphosphatehomeostasisinshootsofrice.PlantJ.2010”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的pSN1301载体(含潮霉素B抗性基因)在文献“Sunet.al.FormationofDEG5andDEG8complexesandtheirinvolvementinthedegradationofphotodamagedphotosystemIIreactioncenterD1proteininArabidopsis.Plantcell2007”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的pSN1301载体在文献“Sunet.al.FormationofDEG5andDEG8complexesandtheirinvolvementinthedegradationofphotodamagedphotosystemIIreactioncenterD1proteininArabidopsis.Plantcell2007”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的农杆菌C58菌在文献“Chi.et.al.ThepentratricopeptiderepeatproteinDELAYEDGREENING1isinvolvedintheregulationofearlychloroplastdevelopmentandchloroplastgeneexpressioninArabidopsis.Plantphysiology.2008”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
实施例1、CIC1蛋白在提高植物低温耐性中的应用
一、突变体(cic1)的获得
从粳稻日本晴EMS诱变库中得到一个低温敏感突变体，将其命名为cic1(chillinginducedchlorosis1)。通过测序表明：和野生型日本晴相比，突变体(cic1)仅是序列表中序列1所示的cic1基因的第379位核苷酸发生突变，由G突变成A，从而造成了谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，突变体(cic1)基因组的其余序列与野生型日本晴全部相同。
二、互补植株(cic1+CIC1)的获得
1、重组载体的构建
(1)用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对含有目的基因的日本晴cDNA克隆进行双酶切，回收得到大小为1.5kb的DNA片段。
(2)用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对pSN1301载体(含潮霉素B抗性基因)进行双酶切，回收得到大小为8.9kb的骨架载体。
(3)利用T4连接酶连接步骤(1)获得的大小为1.5kb的DNA片段和步骤(2)获得的大小为8.9kb的骨架载体，得到重组载体pSN1301-CIC1。
对重组载体pSN1301-CIC1进行测序，测序结果表明：重组载体pSN1301-CIC1为将序列3所示的DNA分子替换pSN1301载体的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点间的DNA片段，且保持pSN1301载体的其他序列不变得到的载体。
2、重组菌的获得
通过电击的方法分别将上述重组载体pSN1301-CIC1和pSN1301载体转入农杆菌C58中，得到重组菌pSN1301-CIC1/C58和重组菌pSN1301/C58。
3、互补植株(cic1+CIC1)
分别用步骤2获得的重组菌pSN1301-CIC1/C58和重组菌pSN1301/C58侵染上述步骤一获得的突变体(cic1)，分别得到互补植株(cic1+CIC1)和对照植株。具体步骤如下：
(1)将步骤一获得的灌浆约15-20天的突变体(cic1)的籽粒表面进行消毒(75％乙醇1分钟，33％次氯酸钠加1滴吐温1.5-2小时)。
(2)在严格灭菌的超净台挤出幼胚大面朝上放入N6培养基，28℃避光培养4-6天诱导胚性愈伤组织。
(3)4-6天后将重组菌pSN1301-CIC1/C58和重组菌pSN1301/C58培养扩大至OD为0.6-0.8。
(4)低温4℃4000rpm离心10min收集菌体，用含有100μMAS(乙酰丁香酮)的AAM悬浮液悬浮。
(5)将愈伤转入无菌小培养皿，悬浮液浸染愈伤20分钟，期间轻轻摇匀几次。
(6)将菌液吸干后把愈伤放置于含有100μMAS(乙酰丁香酮)的N6D2C培养基上28℃避光共培养36-48小时。
(7)去根和芽后用含有25mg/L潮霉素B和600mg/L头孢的CCS培养基筛选抗性愈伤14天，28℃避光培养。
(8)再用含有50mg/L潮霉素B和300mg/L头孢的CCS培养基筛选抗性愈伤28天，其间继代一次，28℃避光培养。
(9)获得的抗性愈伤经CCA培养基预分化培养14天，28℃避光培养。
(10)获得的抗性愈伤经MSR培养基分化26℃光照培养直至成苗，14天继代一次。
(11)小苗在1/2MS培养基上26℃光照培养，生根壮苗30天左右，移栽至大田培养，分别得到互补植株(cic1+CIC1)和对照植株。
4、互补植株(cic1+CIC1)的分子鉴定
对上述步骤3获得的互补植株(cic1+CIC1)和对照植株进行PCR鉴定(PCR鉴定的引物为潮霉素基因的一对引物：F2:5’-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3’和R2:5’-CGAAATTGCCGTCAACCAAG-3’)。
PCR鉴定结果表明：互补植株(cic1+CIC1)PCR扩增得到大小为500bp的条带，而对照植株扩增不到大小为500bp的条带。说明本发明得到表达CIC1蛋白的突变体(cic1)。
三、突变体和互补植株的低温耐性的检测
1、叶绿素含量
将野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的幼苗在不同温度(20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃)下进行处理，处理一周后，观察野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)在不同温度下(20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃)的表型，并检测野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)在不同温度下新生叶的叶绿素含量，检测的具体步骤参照文献“张其德.1985”中的方法。
结果如图1所示：从图1可以看出：在24℃以上时野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的表型基本一样，叶绿素含量也无明显差异；而当处理温度降到22℃时，突变体(cic1)叶片开始萎黄，叶绿素含量也大幅度下降，野生型和互补植株还能够基本保持正常生长，叶绿素含量稍微下降；当处理温度降到20℃时，突变体(cic1)完全白化，野生型和互补植株也有一定程度黄化，且都生长缓慢。说明水稻生长对温度有一定范围要求，突变体(cic1)在22℃及以下叶绿体功能严重受损。
2、叶绿体超微结构
为了研究不同温度下水稻叶绿体发育情况，用透射电子显微镜分别对在30℃、22℃和20℃条件下培养两周的野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)叶片的叶绿体超微结构进行观察。
结果如图2所示：在30℃时，突变体(cic1)和野生型水稻都能够很好的形成垛叠结构和淀粉粒，基粒片层清晰，互补植株的结果和野生型基本一致；在22℃时，突变体(cic1)较野生型水稻基粒片层变薄，基质片层变多，且叶绿体较小；而在20℃时，突变体(cic1)的叶绿体没有明显片层结构，而且叶绿体显著变小，野生型和互补植株则较30℃稍有膨胀，但片层结构明显。与野生型相比，突变体(cic1)的叶绿体超微结构在低温(22℃)条件下发生明显变化。为了便于进行深入分析，选择在30℃和22℃条件下培养一周的野生型水稻和突变体(cic1)为实验对象进行下述研究。
3、光系统活性和光合碳同化能力
为了检测突变对光系统活性和光合碳同化速率的影响，分别对30℃和22℃条件下培养两周的野生型水稻(WT)和突变体(cic1)进行叶绿素荧光光谱分析，分析方法参照文献“Bilgeretal.1990”中的方法。光合气体交换分析采用英国PPsystem公司的Ciras-1型光合作用测定系统测定。以田间生长不同发育期剑叶为材料，测定净CO2同化速率(Pn)。测定的条件为大气CO2浓度360±5μmolmol-1，湿度60-70％，温度28℃。其他光合测定时参数设置为：测定叶面积1cm2，气体流量200mls-1。
光系统活性的检测结果如图3所示：在30℃条件下，突变体(cic1)的Fv/Fm(光系统II最大光化学效率)为0.80，略低于野生型(0.82)，而在22℃条件下，突变体(cic1)的Fv/Fm为0.45，显著低于野生型(0.79)。
光合碳同化速率的检测结果如图4所示：在30℃条件下，突变体(cic1)的光合碳同化速率和野生型水稻(WT)无显著性差异，而在22℃条件下，突变体(cic1)的光合碳同化速率降到野生型水稻(WT)的1/3左右。
上述结果说明：在低温条件下，和野生型水稻(WT)相比，突变体(cic1)的光系统活性明显降低，光合碳同化能力下降。说明cic1突变体的叶绿体光系统II受损严重，对光能的吸收和利用能力下降。
4、叶绿体蛋白和光系统功能复合物含量的检测
(1)蛋白免疫印记技术检测
用蛋白免疫印记技术检测了不同温度(30℃、22℃)条件下的野生型水稻(WT)、突变体(cic1)和互补植株(cic1+CIC1)的叶绿体类囊体膜光系统复合物和暗反应蛋白含量差异。蛋白免疫印记技术的具体步骤如下：
SDS-Urea-PAGE电泳完毕后，切去浓缩胶部分，分离胶部分经180mA，1.5h电转移到PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的TTBS溶液(10mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl，0.05％Tween20)封闭2h。之后用含1％脱脂奶粉的TTBS以1：2,000加入D1、D2、CP43、CP47、PsaA/B、LHCII、ATPaseβ亚基和细胞色素复合物f亚基等的抗体4℃孵育6h以上或过夜。TTBS溶液漂洗一抗，3次5min后，用含1％脱脂奶粉的TTBS溶液以1：10,000加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔HRP抗体)4℃反应2-3h，再次用TTBS溶液漂洗二抗，3次5min后，按照发光工作液操作要求曝光印迹。
30℃条件下的检测结果如图5A所示：突变体(cic1)的叶绿体基因组编码的光系统II亚基D1、D2、CP43和CP47比野生型减少20％-40％，光系统I核心蛋白PsaA/B减少到野生型的85％；而核基因组编码的放氧复合物蛋白PsbO和光系统II外周天线蛋白LHCII较野生型无明显差异。ATP合酶CF1α亚基减少到野生型的50％，而β亚基则稍微减少。细胞色素b6/f复合物f亚基(CytF)则较野生型有少许增加。叶绿体编码的暗反应核心蛋白Rubisco大亚基(RbcL)减少到野生型的70％左右，而核基因组编码的Rubisco活化酶(Rca)含量则与野生型无明显差异。互补植株(cic1+CIC1)的叶绿体蛋白含量和野生型无显著差异。
22℃条件下的检测结果如图5B所示：突变体(cic1)光系统II蛋白D1、D2、CP43和CP47分别减少到野生型的25％或更少，PsbO和LHCII减少到野生型的75％左右。PsaA/B减少到野生型的大约20％。CytF减少到野生型的60％。ATP合酶α亚基减少到野生型的25％，β亚基减少到野生型的85％。RbcL减少到野生型的40％，而Rca含量则只减少到不足野生型的10％。
综上所述，突变体(cic1)的叶绿体编码蛋白积累减少，光系统功能复合物形成减少，尤其是在低温条件下，突变体(cic1)中的上述相关蛋白的积累又比其他叶绿体蛋白更为敏感。说明CIC1蛋白具有调控叶绿体编码的光系统核心蛋白、ATP合酶和Rbisco大亚基等叶绿体能量传递、合成和消耗的反应中心蛋白含量的功能。
(2)蓝绿温和胶电泳检测
分别对在30℃、22℃条件下处理后的野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的叶绿体类囊体膜蛋白进行蓝绿温和胶电泳检测。
结果如图6所示：低温条件下，和野生型(WT)相比，突变体(cic1)的光系统功能复合物(D1、D2、CP43、CP47、PsaA/B和LHCII)形成严重受阻。说明CIC1蛋白具有调控植物光系统功能蛋白复合物含量的功能。
5、CIC1蛋白的亚细胞定位
将序列表中序列1所示的CIC1基因的替换GFP表达载体pBI221的XbaI和BamHI酶切位点间的DNA片段，且保持GFP表达载体pBI221的其他序列不变，得到重组载体。并将重组载体转化水稻原生质体，用激光共聚焦显微镜(Confocal)进行观察。
结果如图7所示：从图中可以看出：CIC1蛋白定位于叶绿体。
6、叶绿体中PEP和NEP的转录水平
检测在30℃、22℃条件下处理后的野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的PEP和NEP的转录水平。检测PEP(质体编码的RNA聚合酶)转录水平主要通过检测光系统I(classI)、光系统II(classII)核心亚基的等组分的转录水平来体现的。而NEP(核编码的RNA聚合酶)转录水平主要通过检测PEP核心亚基rpoA、rpoB等组分的转录水平来体现的。具体检测步骤如下：
(1)mRNA的提取：
采用Invitrogen公司的RNA提取Trizol试剂提取在30℃、22℃条件下处理后的野生型水稻(WT)和突变体(cic1)叶片的RNA。
(2)RNA浓度的测定
将5μL的RNA样品稀释至0.5mL，用分光光度计DU-800测定其在260nm和280nm的吸收值。当OD260＝1时，RNA的浓度为40μg/mL。如果RNA提取的好，OD260/OD280＝2.0。如果RNA样品中污染有DNA和蛋白质，其比值低于2.0。
(3)RT-PCR
使用Takara公司的反转录试剂盒，第一链的合成以Oligod(T)为引物，第二链的合成使用基因特异性引物，同时用actin基因的表达为对照保证使用相同RNA的量。
结果如图8所示：从图中可以看出：突变体(cic1)的PEP(classI)基因转录水平明显下降，而NEP基因(classII，classIII)转录水平则明显上升，核编码基因转录变化不明显。
7、活性氧清除酶活性、GSH含量的检测
检测在30℃、22℃条件下处理后的野生型水稻(WT)和突变体(cic1)的活性氧清除酶系统(脱氢抗坏血酸脱氢酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸脱氢酶(MDHAR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD))和GSH含量。其中，脱氢抗坏血酸脱氢酶(DHAR)和单脱氢抗坏血酸脱氢酶(MDHAR)活性测定参照文献“HossainandAsada，1984”中的方法；GR(glutathionereductase)测定参照文献“Gonzále等，1998”中的方法。APX(ascorbateperoxidase)测定参照文献“Gonzále，1998”中的方法；CAT(catalase)测定方法参照文献“Córdoba-Pedregosa等，2003”中的方法。
活性氧清除酶含量的检测结果如图9所示：当温度为30℃时，突变体(cic1)和野生型的活性氧清除酶活性基本一致，而当温度为22℃时，叶绿体内主要的几个活性氧清除酶类(脱氢抗坏血酸脱氢酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸脱氢酶(MDHAR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD))活性都明显上升，为野生型的2-3倍，这说明低温胁迫使植物体内产生了过多的活性氧成分。
GSH含量的检测结果如图10所示：低温条件下，突变体(cic1)体内总GSH含量(总GSH含量包括GSH含量和GSSG含量)较野生型明显上升，GSH/GSSG值严重降低，主要是由于氧化型的GSSG含量大幅度增加，从而造成体内氧化还原失衡。
实施例2、转CIC1水稻的获得及抗逆性分析
一、转CIC1水稻的获得
1、重组载体的构建
(1)以序列表中序列1所示的DNA分子为模板，采用引物1：5’-AGTCTAGATATCCATCCCCAAATCCG-3’和引物2：5’-TAGGATCCAGGAGCAGGAACAGCAA-3’进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(2)用限制性内切酶X-balI和BamHI对步骤(1)获得的PCR扩增产物进行双酶切，得到大小为1404bp的DNA片段。
(3)用限制性内切酶X-balI和BamHI对pSN1301载体进行双酶切，得到大小为8.9kb的骨架载体。
(4)连接步骤(2)获得的大小为1404bp的DNA片段和步骤(3)获得的大小为8.9kb的骨架载体，得到重组载体pSN1301-CIC1。
对重组载体pSN1301-CIC1进行测序，测序结果表明：pSN1301-CIC1为将序列1所示的DNA分子替换pSN1301载体的X-balI和BamHI酶切位点间的DNA片段，且保持pSN1301载体的其他序列不变得到的载体。
2、重组菌的获得
将步骤1获得的pSN1301-CIC1导入农杆菌C58菌，得到重组菌pSN1301-CIC1/C58；
将pSN1301载体导入农杆菌C58中，得到重组菌pSN1301/C58。
3、转CIC1水稻的获得
将重组菌pSN1301-CIC1/C58稻愈伤组织法侵染野生型水稻，将侵染过的水稻植株进行培养，得到T0代转CIC1水稻种子。将T0代转CIC1水稻种子表面消毒后，播种于含有潮霉素的1/2MS培养基上筛选，得到T1代转CIC1水稻幼苗。如此重复，直至得到T3代转CIC1水稻纯合体株系OE1-OE30。
按照上述方法用重组菌pSN1301/C58稻愈伤组织法侵染野生型水稻，得到T3代转空载体水稻。
采用潮霉素基因的一对引物F2:5’-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3’和R2:5’-CGAAATTGCCGTCAACCAAG-3’，对T3代转CIC1水稻纯合体株系OE1-OE30和T3代转空载体水稻进行分子鉴定。
鉴定结果表明：T3代转CIC1水稻纯合体株系OE1-OE30均可扩增得到大小为500bp的目的条带，而T3代转空载体水稻扩增无大小为500bp的条带。选取阳性的T3代转CIC1水稻纯合体株系OE2进行抗逆性分析。
二、转CIC1水稻的抗逆性分析
将野生型水稻(WT)、突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和T3代转CIC1水稻纯合体株系OE2的幼苗在不同温度(22℃和30℃)下进行处理，处理一周后，观察野生型水稻(WT)、突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和T3代转CIC1水稻纯合体株系OE2在不同温度下(22℃和30℃)的表型，并检测野生型水稻(WT)、突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和T3代转CIC1水稻纯合体株系OE2在不同温度下新生叶的叶绿素含量，检测的具体步骤参照文献“张其德.1985”中的方法。
结果如图11所示：在处理温度为30℃时，野生型水稻(WT)、突变体(cic1)、互补植株(cic1+CIC1)和T3代转CIC1水稻纯合体株系OE2的表型无显著差异，叶绿素含量也基本一致；而当处理温度降到22℃时，突变体(cic1)的叶绿素含量显著下降，野生型水稻(WT)和互补植株(cic1+CIC1)的叶绿素含量稍微下降，但和野生型水稻相比，T3代转CIC1水稻纯合体株系OE2的叶绿素含量有所上升，表现出低温抗性。

Claims (10)

1.如下a)或b)或c)的蛋白质在调控植物抗逆性中的应用；
或如下a)或b)或c)的蛋白质在调控植物在低温条件下的表征中的应用；
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
所述表征为植物体内叶绿素的含量、植物叶绿体内基粒片层的厚度、植物叶绿体内基质片层的数量、植物光系统的活性、植物光合碳同化能力、植物叶绿体类囊体膜光系统复合物的含量、植物叶绿体类囊体膜ATP合酶的含量、植物体内活性氧清除酶类的活性和/或植物体内总GSH的含量。
2.与权利要求1中所述的蛋白质相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
或与权利要求1中所述的蛋白质相关的生物材料在调控植物在低温条件下的表征中的应用；
所述表征为植物体内叶绿素的含量、植物叶绿体内基粒片层的厚度、植物叶绿体内基质片层的数量、植物光系统的活性、植物光合碳同化能力、植物叶绿体类囊体膜光系统复合物的含量、植物叶绿体类囊体膜ATP合酶的含量、植物体内活性氧清除酶类的活性和/或植物体内总GSH的含量；
所述与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码权利要求1中所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗逆性为提高植物低温耐性；
所述调控植物在低温条件下的表征为如下1)-8)中至少一种：
1)提高植物体内叶绿素的含量：
2)增加植物叶绿体内基粒片层的厚度；
3)提高植物叶绿体内基质片层的数量；
4)提高植物光系统的活性；
5)提高植物光合碳同化能力；
6)提高植物叶绿体类囊体膜光系统复合物和/或ATP合酶的含量；
7)提高植物体内活性氧清除酶类的活性；
8)提高植物体内总GSH的含量。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：
所述光系统复合物为D1蛋白和/或D2蛋白和/或CP43蛋白和/或CP47蛋白和/或PsaA/B蛋白；
所述ATP合酶为ATP合酶α亚基和/或ATP合酶β亚基。
6.权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2中所述的相关生物材料在培育低温耐性提高的转基因植物中的应用；
或权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2中所述的相关生物材料在培育低温条件下叶绿素含量高、叶绿体内基粒片层厚度高、叶绿体内基质片层数量多、光系统活性高、光合碳同化能力强、叶绿体类囊体膜光系统复合物含量高、叶绿体类囊体膜ATP合酶含量高、活性氧清除酶类活性高和/或总GSH含量高的转基因植物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述光系统复合物为D1蛋白和/或D2蛋白和/或CP43蛋白和/或CP47蛋白和/或PsaA/B蛋白；
所述ATP合酶为ATP合酶α亚基和/或ATP合酶β亚基。
8.一种培育低温耐性提高的转基因植物的方法，包括将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；
所述转基因植物的低温耐性高于所述受体植物。
9.一种培育低温条件下叶绿素含量高、叶绿体内基粒片层厚度高、叶绿体内基质片层数量多、光系统活性高、光合碳同化能力强、叶绿体类囊体膜光系统复合物含量高、叶绿体类囊体膜ATP合酶含量高、活性氧清除酶类活性高和/或总GSH含量高的转基因植物的方法，包括将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；
所述转基因植物具有如下1)-8)中至少一种表征：
1)转基因植物叶绿素含量高于所述受体植物：
2)转基因植物叶绿体内的基粒片层厚度高于所述受体植物；
3)转基因植物叶绿体内的基质片层数量高于所述受体植物；
4)转基因植物叶绿体类囊体膜的光系统复合物和/或ATP合酶的含量高于所述受体植物；
5)转基因植物的光系统活性高于所述受体植物；
6)转基因植物的光合碳同化能力高于所述受体植物；
7)转基因植物体内活性氧清除酶类的活性高于所述受体植物；
8)转基因植物体内总GSH的含量高于所述受体植物；
所述光系统复合物具体为D1蛋白和/或D2蛋白和/或CP43蛋白和/或CP47蛋白和/或PsaA/B蛋白；
所述ATP合酶具体为ATP合酶α亚基和/或ATP合酶β亚基。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
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