CN105505955B - 一种提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其应用，所述基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明首次证明了水稻GLP基因Os02g0532500是水稻稻瘟病抗性的功能基因，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻稻瘟病抗性的分子机制研究有重要的参考意义；过表达Os02g0532500基因的水稻转化过表达载体转化水稻后能大幅提高Os02g0532500的表达量，伴随着表达量的提高，转化植株的稻瘟病抗性明显增强，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变。本发明过表达Os02g0532500的技术可以应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障目前水稻病害频发的气候条件下的水稻生产安全。

Description

一种提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其 应用

技术领域

本发明属于作物遗传技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其应用。

背景技术

由真菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr引起的水稻稻瘟病是世界各稻区危害最严重的水稻病害之一，对全球稻作栽培产生毁灭性的影响。稻瘟病在水稻生长各个时期都可能发生，尤以叶瘟和穗瘟的危害最大。全球每年因稻瘟病造成的产量损失达11～30％，直接经济损失约50亿美元，损失的粮食足以养活6000 万人口。在我国，凡有水稻栽培的地方都有稻瘟病发生。南北稻区每年均受到不同程度危害，一般减产10～20％，重的达40～50％，局部田块甚至颗粒无收。

目前，利用品种的抗性，开展稻瘟病抗性育种被认为是最经济、有效和环境友好的防治途径。近年来，育种学家们利用常规育种技术培育出了许多水稻稻瘟病抗病品种。但是，大部分抗病品种推广应用2～3年后即丧失其稻瘟病抗性。如高抗稻瘟病品种“窄叶青8号”推广种植不到三年便丧失抗性，高产抗病优质品种“粳籼89”推广不到四年，其抗病性也明显下降。由此可见，水稻品种稻瘟病抗性周期短是水稻生产中一个普遍而突出的问题，延长水稻品种稻瘟病的持性寿命已成为我国乃至各水稻生产国水稻改良中需要优先解决的问题。

对稻瘟病持久抗性品种Moroberekan、谷梅2号和三黄占2号的抗病遗传分析结果表明，稻瘟病持久抗性由质量抗性和数量抗性两部分组成。由主效基因控制的稻瘟病抗性称为质量抗性(完全抗性)，其表现为水稻寄主与稻瘟病菌的不亲和性，具有小种专化性。在以往的稻瘟病抗性育种中往往只利用了个别的主效基因。这些品种大面积推广应用时，一旦遇到新的小种或病原菌毒性产生变异时就会丧失其抗病性。这是造成水稻品种稻瘟病抗性周期短的根本原因。与之相对应的是数量抗性(部分抗性)，有多个微效基因组成。数量抗性表现为寄主与病菌的亲和性，抑制稻瘟病菌繁殖，延缓发病进程，在形态上表现为叶片的病斑数少、病斑小。由于数量抗性的小种专化性不强，或由于其微效多基因的性质不容易被稻瘟病菌克服，因此数量抗性被认为与水稻稻瘟病持久抗性紧密相关，已成为研究的热点和前沿。

随着分子标记技术的发展和水稻抗病功能基因组的深入开展，国际上迄今已鉴定和定位了300多个稻瘟病数量抗性QTL，但是，尽管已标记鉴定出众多的稻瘟病数量抗性QTL，水稻稻瘟病数量抗性分子育种很少有成功的报道。其主要原因一方面在于数量抗性的微效多基因的性质，另一方面QTL作图的不精确性。应用QTL作图方法标记定位的QTL区间一般在10～30cM。在这一区间有数以百计基因的存在。分子标记选择时往往受到亲本多态性和重组的影响，使得稻瘟病数量抗性分子育种很难有效进行。可见，鉴定稻瘟病数量抗性的功能基因，是水稻稻瘟病数量抗性和持久抗性分子育种取得突破的关键。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种提高水稻穗瘟抗性的基因Os02g0532500、蛋白及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明采取了如下具体的技术方案：

一种提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500，所述基因具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种提高水稻稻瘟病抗性的蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

在其中一些实施例中，所述提高水稻稻瘟病抗性的蛋白由如SEQ ID No：1 所示的核苷酸序列编码。

本发明还提供了提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500在提高水稻稻瘟病抗性方面的应用。

由于控制稻瘟病数量抗性的基因多，单个基因的效应小，很难应用图位克隆的策略克隆其功能基因。近年来，越来越多的研究表明，防卫基因(Defense response，DR gene)与数量抗病性密切相关。本发明申请人前期用防卫基因对水稻稻瘟病数量抗性的研究结果表明，防卫基因与稻瘟病数量抗性密切相关，其中5个防卫基因与稻瘟病数量抗性QTL共定位，并进一步通过基因沉默技术验证位于第8染色体的稻瘟病数量抗性QTL区间内的防卫基因草酸氧化酶类蛋白 (GLP)基因家族具有稻瘟病数量抗性功能。应用候选防卫基因进行稻瘟病数量抗性分析将是分离、鉴定水稻稻瘟病功能基因一个很好的策略。

草酸氧化酶类蛋白，又称类胚素蛋白(germin-like protein,GLP)，在植物的生长发育以及逆境胁迫中发挥着重要作用，是一种重要的防卫基因。草酸氧化酶属于草酸降解酶之一，广泛存在于高等植物(水稻、小麦等)以及细菌、真菌和苔藓中，它的作用是氧化草酸产生H₂O₂和CO₂，遏制病原菌的侵染，因此在植物的逆境胁迫及抗病防御中发挥着重要功能。本发明申请人采用候选基因的方法筛选与水稻稻瘟病叶瘟数量抗性相关的基因时，发现在水稻第8染色体的GLP 基因与叶瘟数量抗性密切相关，对减少病叶面积的贡献率达到30.0％。用基因沉默的方法沉默了整个第8染色体GLP基因家族之后，水稻叶片对稻瘟病菌的感病性明显增加。在进一步筛选与水稻叶瘟抗性和穗瘟抗性相关的基因时发现，另一位于水稻2号染色体的一个GLP基因Os02g0532500，在叶瘟和穗瘟接种后其表达量显著上调。因此该基因可能在水稻稻瘟病抗性中发挥了重要作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明首次证明了水稻GLP基因Os02g0532500是水稻稻瘟病抗性的功能基因，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻稻瘟病抗性的分子机制研究有重要的参考意义；

2.本发明提供了利用Camv35S启动子过表达Os02g0532500基因的水稻转化过表达载体。该载体转化水稻后能大幅提高Os02g0532500的表达量，伴随着表达量的提高，转化植株的稻瘟病抗性明显增强，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变。因此，本发明通过Camv35S启动子过表达Os02g0532500的技术可以应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，改良水稻的稻瘟病抗性，从而保障目前水稻病害频发的气候条件下的水稻生产安全。

附图说明

图1为实施例1中所使用的过表达载体PHQSN载体图谱；

图2为实施例2的转基因植株中Os02g0532500表达水平检测图；

图3为实施例3中过表达Os02g0532500对水稻植株的叶瘟抗性的影响，其中**表示与对照相比存在极显著差异；

图4为实施例3中过表达Os02g0532500对水稻植株的穗瘟抗性的影响，其中**表示与对照相比存在极显著差异。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1提高水稻稻瘟病抗性的基因及过表达载体的构建

(1)、取水稻稻瘟病高抗品种三黄占2号(SHZ-2)的幼苗叶片部位，用TriZolReagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)提取叶片总RNA，采用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量；

(2)、取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript(TAKARA公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物：F，CCGGAATTCAGTGACAGAACGAGCGTAGAAT(SEQ ID No：3)；R，GGAAGATCTTCACTAACGGGGAGTAACCTAA(SEQ ID No： 4)，进行PCR扩增，PCR所用的聚合酶为KOD FX(Toyobo公司)。反应体系为50uL，按照KOD FX的说明书配制PCR反应体系。反应条件为：94℃5min； 94℃30sec，56℃30sec，68℃50sec，35个循环；68℃10min。PCR扩增获得约783bp的片段；

(3)、采用PCR产物直接纯化的方法回收该片段后，用EcoRI和BglⅡ对片段和PHQSN载体(其载体图如图1所示，本领域技术人员可以参考文献：拟南芥AtNHX5基因的cDNA克隆及其正义、反义表达载体的构建；石乐义，李洪清，李美茹，陈贻竹；植物生理学通讯，2005年，第41卷，第5期构建而得)分别进行双酶切，37℃酶切6小时，酶切后分别回收目标片段和载体片段，用T4连接酶(NEB公司)16℃连接16小时，连接体系为：T4连接酶1ul， 10×buffer1ul，Os02g0532500基因片段2ul(35ng)，PHQSN载体2uL(50ng) ， 灭菌水4uL；

(4)、取全部连接产物，用电击法转化到大肠杆菌DH5α中，转化产物涂布卡那霉素抗性的LB固体培养基。37℃培养过夜，挑10个阳性白色单克隆进行提取质粒，酶切鉴定，选择两个阳性克隆进行测序。测序结果表明：该序列全长783个碱基，包含一个开放阅读框，即为Os02g0532500基因，其大小为 690个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其编码蛋白具有229个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

实施例2 Os02g0532500基因在转基因植株中的过表达效果鉴定

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将过表达载体转入正常粳稻品种日本晴中。转化原代(T₀代)通过PCR及定量PCR检测，从DNA水平和RNA水平鉴定阳性转化植株，证明目标基因Os02g0532500已经转化入水稻中，并且实现目标基因Os02g0532500的表达量提高。

在受控的温室中把转基因阳性植株自交得到纯合阳性转基因1代(T₁代) 株系，每个株系选择10株经PCR检测为阳性的植株繁种，得到T₂代植株，T₂代株系再进行PCR检测，找到来源于不同T₀代植株的T₂代纯合株系3个(OX-2、 OX-11、OX-15)。对3个株系的幼苗叶片进行荧光定量PCR，检测目标基因 Os02g0532500的表达量，以野生型结果为对照。

荧光定量PCR鉴定Os02g0532500基因在转基因植株中过表达效果程序如下：

1、取PCR检测阳性的转基因植株始穗期的小穗进行总RNA提取，采用的试剂为TriZol Reagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)，根据该试剂的说明书的步骤进行，并用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA 的纯度及量；

2、取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript (Takara公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物532500F和532500R引物对检测Os02g0532500基因的表达情况；引物序列如下：532500F，GGCTGGAGAAGAGGTTCGGC(SEQ ID No： 5)；532500R，CGTCACTAACGGGGAGTAACCT(SEQ ID No：6)；

3、采用水稻管家基因EF1α基因的EF1αF和EF1αR引物对检测水稻 EF1α基因的表达作为内参，定量PCR试剂为Premix Ex Taq^TM (TAKARA)，定量PCR仪器为CFX 96(BioRAD公司)，

EF1αF，TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT(SEQ ID No：7)；

EF1αR，GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA(SEQ ID No：8)。

3个转基因纯合株系(OX-2、OX-11、OX-15)和野生型植株中Os02g0532500 的相对mRNA表达水平结果如图2所示，图2结果表明3个株系相对于野生型，Os02g0532500的表达量都大幅度提高50-80倍。

实施例3 Os02g0532500过表达转基因植株稻瘟病抗性的鉴定

1、叶瘟表型鉴定

把实施例2中纯合的3个过表达转基因T₂代株系(OX-2、OX-11、OX-15) 和野生型水稻种子在32℃发芽，2天后将幼芽分别移至装有泥土的塑料盘中播种，每个株系及野生型分别播种30粒，一个塑料盘包含3个转基因株系和野生型株系，3个生物学重复。幼苗在自然条件下生长到3叶期时将幼苗移栽到人工气候箱进行接种。

人工气候箱设置如下：温度，25℃；光照，16000LUX；12h昼夜交替；湿度，100％。采用的稻瘟病菌株为日本晴敏感的GD08-T13。菌株(浓度为1x 10⁶ spores/ml)喷洒到叶片后，前24h全黑暗培养，此后采用12h昼夜交替培养。接种5天后调查发病结果，结果见图3，结果表明Os02g0532500过表达株叶瘟抗性明显增强，与野生型相比，病叶面积明显减小。

2、穗瘟表型鉴定

把实施例2中纯合的3个过表达转基因T₂代株系(OX-2、OX-11、OX-15) 和野生型水稻种子在32℃发芽，2天后将幼芽分别移至装有泥土的塑料盘中播种，待其长到3叶期时将幼苗移栽到大型塑料桶中，每桶种4株，每个株系至少种10株。网室中自然生长至抽穗期进行接种。所用菌株同叶瘟接种。

待稻穗抽出2～8cm左右时，用手播出稻穗，取小片棉花包裹住稻穗的下缘 1/3处，然后吸取2ml的孢子液(1x 10⁶spores/ml)注入到棉花中，棉花外面用锡箔纸包裹以防菌液蒸发。在网室中，每隔2小时喷水2分钟，以保证湿度利于孢子萌发。3周后调查发病结果，结果见图4，结果表明Os02g0532500过表达株穗瘟抗性明显增强，与野生型相比，稻穗主轴的感病长度明显减小。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种提高水稻稻瘟病抗性的基因Os02g0532500在提高水稻稻瘟病的抗性方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因Os02g0532500的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因Os02g0532500编码一种提高水稻稻瘟病抗性的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。