CN101418040A - 植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物JA信号传导相关蛋白活性的蛋白质。该蛋白可调节植物对茉莉酸敏感性，对植物中抗病虫基因的分离和功能研究提供了重要手段。将该蛋白的编码基因导入植物中还可提高植物对病虫害的抗性。

Description

植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一个植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因以及它们在调控茉莉酸信号传导、以及提高植物抗病性和/或抗虫性中的应用。

背景技术

茉莉酸(jasmonic acid，JA)作为一种重要的植物激素，其主要生物学功能表现在两个方面：一是调节植物生长发育，包括种子萌发、根系生长、植物育性、块茎形成、果实成熟以及衰老等各个方面，二是调节植物对各种生物和非生物胁迫的抗性反应。生物胁迫主要有昆虫侵害与病原菌侵染，非生物胁迫主要有机械损伤、臭氧损伤、低温、干旱以及盐胁迫等。因此茉莉酸信号传导的研究对植物生长发育调控的理解、作物抗逆性的提高具有十分重要的意义。

在拟南芥中，JA抑制主根的伸长，调节花粉发育，花药开裂，以及调控植株对昆虫侵害和病原菌的侵染的抗性反应。JA所调控的抗性反应相关基因主要有VSPs(vegetative storage proteins)，Thi2.1(thionin)和PDF1.2(plant defensin)。基于JA抑制主根生长和诱导抗性基因表达的特点，通过正向遗传学的方法，筛选对JA敏感性降低的突变体，得到JA信号途径中的一些正调控因子，如COI1、AtMYC2和JAR1；通过JA反应的启动子融合报告基因的方法也筛选得到一些对JA反应敏感性降低或超敏感的突变体，目前通过这种筛选方法成功分离并克隆到的基因只有CEV1；另外筛选JA信号途径中的重要组分COI1的抑制子也得到了COS1基因。最近对解析JA信号的重大突破是作为COI1的底物之一的JAZ1的分离。

发明内容

本发明的目的是提供一个植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因以及它们在调控茉莉酸信号传导、以及提高植物抗病性和/或抗虫性中的应用

本发明所提供的植物茉莉酸信号传导调控蛋白，名称为JAH1，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列3的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物茉莉酸信号传导功能的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列3由523个氨基酸残基组成。

上述植物茉莉酸信号传导调控蛋白的编码基因(JAH1)也属于本发明的保护范围。

上述植物茉莉酸信号传导调控蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中序列1是由1572个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5＇端第1-1572位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质。

上述植物茉莉酸信号传导调控蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列2的DNA序列；

2)编码序列表中序列3所示蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

其中，序列表中序列2是由5123个核苷酸组成，自序列2的5＇端第2627-3098位核苷酸为该基因组基因的第一个外显子，自序列2的5＇端第3099-3197位核苷酸为该基因组基因的第一个内含子，自序列2的5＇端第3198-3670位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自序列2的5＇端第3671-3950位核苷酸为该基因组基因的第二个内含子，自序列2的5＇端第3951-4577位核苷酸为该基因组基因的第三个外显子。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有上述植物茉莉酸信号传导调控蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增与植物茉莉酸信号传导调控蛋白的编码基因中任一片段的引物均属于本发明的保护范围。

利用植物表达载体，将本发明的植物茉莉酸信号传导调控蛋白的编码基因导入植物细胞或组织，可得到对茉莉酸敏感性减弱，对病害耐受力增强的植株。

使用JAH1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明JAH1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、番茄、烟草、棉花等双子叶植物。

本发明的植物茉莉酸信号传导调控蛋白可调节植物对茉莉酸敏感性，对植物中抗病虫基因的分离和功能研究提供了重要手段。

本发明的植物茉莉酸信号传导调控蛋白对植物茉莉酸信号传导起正调控作用，通过对植物茉莉酸信号传导的调控，增强植物的抗病性和抗虫性，对提高植物产量，在植物(特别是农作物)品种的改良中发挥巨大作用。实验证明，将植物茉莉酸信号传导调控蛋白的编码基因导入植物中过表达，可提高植物对腐生菌，如软腐病真菌(Botrytis cinerea)的抗性。

附图说明

图1为野生型植物与jah1突变体主根的生长情况

图2为转JAH1基因的jah1突变体(转pCAMBIA1300-JAH1的突变株)主根的生长情况

图3为过量表达JAH1转基因植株中JAH1基因的表达情况

图4为过量表达JAH1转基因植株主根的生长情况

图5为野生型植物、jah1突变体与过量表达JAH1转基因植株(OE37)中抗性基因PDF1.2与Thi2.1的表达情况

图6为过量表达JAH1的转基因植株(OE37)的抗病(Botrytis cinerea)试验结果

图7为过量表达JAH1的转基因植株(OE37)的抗病(Botrytis cinerea)病斑大小试验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、拟南芥茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因(JAH1)的获得

一、拟南芥jah1突变体的获得

通过对一个拟南芥T-DNA突变体库(由遗传发育所左建儒研究院提供)的筛选，得到一个对茉莉酸(JA)在根长生长抑制方面表现超敏感的突变体，命名为jah1-1。如图1所示，该突变体在不含JA的空白培养基上主根的长度与野生型(Col-0生态型)根长相比没有差异，但是在含不同浓度JA的培养基上，突变体jah1-1根长均比野生型短，具体来说，在不含JA的空白培养基(MS)上，生长8天的野生型植物(Col-0)的根长是30.6±2.6mm，而在含10μM JA的MS培养基上，其根长为16.9±0.9mm，缩短了45％；而突变体的根长在不含JA的空白培养基上为29.8±2.8mm，与野生型植物的根长没有差异，但是，在含10μM JA的培养基上，突变体的根长缩短为9.0±1.9mm，减少了70％。图1中WT为野生型拟南芥(Col-0生态型)；jah1-1为上述筛选得到的jah1-1突变体；control为不含JA的空白培养基(MS)上生长8天的处理；10μM JA为含10μM JA的MS培养基上生长8天的处理。

二、拟南芥茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因的获得

由于jah1-1突变体为T-DNA插入突变体，所以我们通过TAIL-PCR的方法分离得到T-DNA插入的区域，对比已经公布的拟南芥全基因组序列，最终确定T-DNA插入所在的基因。该基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，将其命名为JAH1。其cDNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列，自序列表中序列1的5＇端第1-1572位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质(JAH1)。

根据获得的JAH1的基因组序列设计扩增JAH1序列的引物，为了方便其连入植物表达载体pCAMBIA1300，进行转基因实验，将上下游引物加入下述酶识别位点，引物序列如下所示：

引物1(上游引物)：5’-ATAGGTACCCACACACAGTTTATTACTCATC-3’(划线部分核苷酸为KpnI识别位点)；

引物2(下游引物)：5’-ATATCTAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3’(划线部分核苷酸为Xba I识别位点)。

提取拟南芥品种Col-0(ABRC，Arabidopsis Biological Resources Center)的基因组DNA作为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化4000bp的DNA片段，即JAH1基因组基因片段，经测序表明该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。序列表中序列2是由5123个核苷酸组成，自5＇端第2627-3098位核苷酸为该基因组基因的第一个外显子，自5＇端第3099-3197位核苷酸为该基因组基因的第一个内含子，自5＇端第3198-3670位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5＇端第3671-3950位核苷酸为该基因组基因的第二个内含子，自5＇端第3951-4577位核苷酸为该基因组基因的第三个外显子。该JAH1基因组基因片段编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质(JAH1)。

三、JAH1的转基因功能验证

将步骤二PCR获得的JAH1基因组基因片段用限制性内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切后与经相同酶酶切的载体pCAMBIA1300(CAMBIA公司)连接，将连接产物进行测序，将经测序表明正确的含有JAH1基因组基因的重组载体命名为pCAMBIA1300-JAH1。

将pCAMBIA1300-JAH1在根癌农杆菌的介导下转化jah1突变体(SALK_128974，ABRC，该突变体与jah1-1突变体具有相同的表型，并且该表型是由于T-DNA插入JAH1基因中引起的)，然后用选择性标记基因潮霉素(在含50mg/L潮霉素的MS培养基)进行抗性筛选，将筛选得到阳性植株再用上述引物1和引物2对抗性筛选得到的转pCAMBIA1300-JAH1突变株进行PCR分子鉴定，得到PCR鉴定表明正确的转入JAH1基因片段的植株即为转pCAMBIA1300-JAH1的突变株。

对转基因植株进行表型分析，即将野生型与PCR验证正确的转pCAMBIA1300-JAH1的突变株的种子分别同时播种在MS空白培养基或含10uM的茉莉酸(JA)的MS培养基上，4℃黑暗培养3天后，转移到22摄氏度光照培养8天。

观察上述培养的植株的根部，如图2所示，结果表明，在含JA的培养基上，该转pCAMBIA1300-JAH1的突变株根长与野生型根长并无差异，jah1突变体根长比野生型根长短，该结果表明，JAH1基因的导入使jah1突变体恢复了对JA的野生型表型，表明正是JAH1基因的突变影响植物了jah1突变体主根对JA在主根生长抑制方面的反应。图2中WT为野生型拟南芥(Col-0生态型)；jah1为jah1突变体；jah1-comp为转pCAMBIA1300-JAH1的突变株；control为不含JA的空白培养基(MS)上生长8天的处理；10μM JA为含10μM JA的MS培养基上生长8天的处理。

实施例2、拟南芥茉莉酸信号传导调控基因JAH1cDNA的功能验证

1、转JAH1cDNA拟南芥(转pCAMBIA2300-JAH1植株)的获得

根据实施例1获得的JAH1cDNA序列及载体pCAMBIA2300(CAMBIA公司)适宜的酶切位点设计引物扩增JAH1，引物序列如下：

引物3：5＇-ATTGGATCCATGGATACTTCCCTCTTTTCT-3＇(上游引物，划线部分碱基为BamHI识别位点)；

引物4：5＇-AATTCTAGATCACACATAAAGCCCTTCCT-3＇(下游引物，划线部分碱基为XbaI识别位点)。

提取拟南芥Col-0的总RNA，以其反转录产物为模板，在引物3和引物4的引导下，进行PCR扩增，反应结束后对PCR产物进行纯化表明，扩增得到1572bp左右的片段，经测序表明该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。该片段编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的蛋白质(JAH1)。

将上述扩增得到的片段用限制性内切酶BamHI和XbaI进行双酶切后与经相同酶酶切后的pCAMBIA2300载体片段连接，将连接产物进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明含有JAH1cDNA序列的正确的重组载体命名为pCAMBIA2300-JAH1。

将pCAMBIA2300-JAH1或空质粒pCAMBIA2300在根癌农杆菌的介导下转化野生型植株(Col-0)，然后分别播在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行抗性筛选，将筛选得到阳性植株再用上述引物3和引物4对抗性筛选得到的转pCAMBIA2300-JAH1基因植株或转pCAMBIA2300植株进行PCR分子鉴定，得到PCR鉴定表明正确的转入JAH1基因片段的植株即转pCAMBIA2300-JAH1植株。经PCR鉴定，没有扩增到片段的抗性筛选阳性植株为转pCAMBIA2300植株。

我们进一步提取转pCAMBIA2300-JAH1植株几个株系RNA，电泳、转膜后Northern杂交检测了这几个株系中JAH1基因的表达情况，其中检测JAH1表达的探针的获得方法为：提取拟南芥Col-0的总RNA，以其反转录产物为模板，以5’-GTTATCCCCTGAAGATGCCGAA-3’与5’-CTTGTGCCGCGACGAACG-3’为引物进行PCR扩增，并回收612bp的片段即为JAH1探针。以转pCAMBIA2300植株作为对照(WT)。结果如图3所示，转pCAMBIA2300植株对照JAH1基因表达量很弱，所检测转pCAMBIA2300-JAH1基因植株株系(OE17、OE18、OE20、OE37)中JAH1基因的表达显著增强，其中株系OE37植株中JAH1基因的表达最强，所以选取该株系作深入研究。

对转pCAMBIA2300-JAH1基因植株进行表型分析，即将转pCAMBIA2300植株(WT)、jah1突变体(SALK_128974，ABRC)和一个PCR验证正确的转pCAMBIA2300-JAH1基因株系(OE37)的各20粒种子分别播种在MS空白培养基与含10uM茉莉酸(JA)的MS培养基上培养8天。然后查看根长情况。结果如图4所示，结果表明在含茉莉酸(JA)的培养基上培养8天后，OE37株系主根与转pCAMBIA2300植株相比明显增长，即该转基因植株对茉莉酸在抑制主根伸长方面表现为不敏感，这与jah1突变体表型恰恰相反。

我们进一步分析了三种基因型(转pCAMBIA2300植株对照(WT)、转pCAMBIA2300-JAH1基因OE37株系或jah1突变体)中受JA诱导的抗病基因PDF1.2与Thi2.1基因的表达情况。具体方法如下所示：在1/2MS培养基上生长两周的幼苗(转pCAMBIA2300植株对照(WT)幼苗、转pCAMBIA2300-JAH1基因OE37株系幼苗或jah1突变体幼苗)喷施50μM茉莉酸甲酯(MeJA)处理6h，取样提取RNA，并设无菌水处理作空白对照。电泳、转膜后Northern杂交检测结果表明，其中，检测PDF1.2表达的探针的获得方法为：以拟南芥品种Col-0的基因组DNA为模板以5’-CGCACCGGCAATGGTGGAAG-3’与5’-CACACGATTTAGCACCAAAG-3’为引物进行PCR扩增，电泳回收210bp的片段即为PDF1.2探针。检测Thi2.1表达的探针的获得方法为以拟南芥品种Col-0的基因组DNA为模板，以5’-GTGATCAAACAAGTAAACCAT-3’与5’-AACAAACCTTCTACGACACAT-3’为引物进行PCR扩增，电泳回收670bp的片段即为Thi2.1探针。结果如图5所示，结果表明，jah1突变体中受JA诱导的PDF1.2、Thi2.1基因的表达水平与转pCAMBIA2300植株对照(WT)相比有显著下降，OE37株系中受JA诱导的PDF1.2与Thi2.1基因表达与转pCAMBIA2300植株对照(WT)相比明显增强(如图5所示)。

以前的研究结果表明JA作为一种基础信号在调控植物对腐生菌的抗性反应中起着非常重要的作用，所以我们推测jah1突变体及OE37植株中受JA诱导的抗性基因的表达变化有可能造成对腐生菌抗性的变化。为了检验这个假设，我们比较了转pCAMBIA2300植株、jah1突变体(SALK_128974，ABRC)及转pCAMBIA2300-JAH1基因株系(OE37)对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的软腐病的感病性。

将转pCAMBIA2300植株、jah1突变体(SALK_128974，ABRC)和Northern杂交验证JAH1基因表达增强的转pCAMBIA2300-JAH1基因株系(OE37)的20粒种子分别播种于土中，对生长约4周且尚未抽苔的拟南芥植株进行接种病原菌实验。用无菌水冲洗灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Persoon)(购自广东微生物研究所微生物菌种保藏中心，编号为GIM3.47)孢子并用纱布过滤，之后800rpm8min离心两次，最后用MEA液体培养基(麦芽糖提取物20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，PH5.0-5.5)重悬，并计算孢子浓度，调整至1×10⁵conidia ml^-1。选择生长状态一致的植物叶片接种Botrytis cinerea，在叶片上扎一小孔，用枪点上5μL孢子悬浮液，盖上透明盖继续培养。并设MEA液体培养基处理作对照。5天后测量病斑大小。

结果如图6和图7所示，结果表明，生长4周的植物用B.cinerea的孢子悬浮液侵染5天后，当转pCAMBIA2300植株(图6和图7的WT)叶片接菌部位以外的叶面出现坏死斑时(病斑直径为1.7±0.12mm)，jah1叶片上的病斑开始蔓延进而导致叶片黄化(病斑直径为2.5±0.12mm)，而转pCAMBIA2300-JAH1基因株系(OE37)叶片病斑仍局限于接菌部位(病斑直径为0.94±0.04mm)。概括的说，与转pCAMBIA2300植株相比，jah1突变体对B.cinerea更感病，而转pCAMBIA2300-JAH1基因株系(OE37)对B.cinerea更抗病。以上结果表明JAH1在对B.cinerea侵染的抗性反应中起着重要作用。将JAH1导入植物中过表达可提高植物对B.cinerea侵染的抗性。

序列表

<160>3

<210>1

<211>1572

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

<210>2

<211>5123

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

<210>3

<211>523

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

Claims (10)

1、一种植物茉莉酸信号传导调控蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸残基序列；

2)将序列表中的SEQ ID №.3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物茉莉酸信号传导调控蛋白活性的蛋白质。

2、权利要求1所述的植物茉莉酸信号传导调控蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述植物JA信号传导相关蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述植物JA信号传导调控蛋白的基因组基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、含有权利要求2-4中任意一项所述的植物茉莉酸信号传导调控蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

6、权利要求1所述的植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因在提高植物中由茉莉酸诱导的抗病性基因或者抗虫性基因表达中的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。

8、权利要求1所述的植物茉莉酸信号传导调控蛋白及其编码基因在提高植物对病害和/或虫害的抗性中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。

10、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述病害为腐生菌所引起的植物病害。

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