KR101398023B1 - 식물체의 면역 증진용 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 식물체의 면역 증진용 조성물로서, 특히 병원체(pathogen)에 대한 저항성을 증진시키는 신규한 조성물에 관한 것이다. OsMEK2 유전자를 벼에 형질도입하여 과발현시킨 경우 벼 도열병에 대한 병변이 나타나지 않으며, 방어 반응 관련 유전자들의 발현이 유도된다. 따라서 OsMEK2를 과발현하는 유전자전달체를 포함하는 본 발명의 조성물은 식물 생장과 수확량에 전혀 영향을 주지 않으면서 병원균 침입 시 OsMEK2의 존재에 의해 효과적으로 식물 면역 시스템을 조절할 수 있다. 결론적으로 본 발명자들은 OsMEK2를 병원체 저항성 특이적 조절 단백질로서 제시하여, 식물 병 저항성 품종의 육종소재로서의 가능성을 제시한다.

Description

식물체의 면역 증진용 조성물 및 그의 용도{Compositions for Enhancing the Plant Innate Immunity and Use thereof}
본 발명은 신규한 식물체의 면역 증진용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
벼는 아시아 지역 사람들의 주식으로 이용되는 매우 중요한 농작물로서 생명공학 기술의 발달과 더불어 유전자의 기능 연구나 유전자의 단자엽 식물에서의 작용을 구명하는 모델식물로 이용되는 등 그 중요성이 점차 커지고 있다. 균류 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 또는 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea) 등에 의해 발생하는 벼 도열병은 전세계적으로 벼농사에 위협적이고, 이 질병은 감염 지역의 수확율을 10% 내지 30% 감소시킬 수 있어 문제가 되고 있다. 특히, 벼 잎 도열병(Pyricularia oryzae)은 생장 및 수량을 결정짓는 중요한 질병이고, 현재까지 보편적으로 화학적 살균제(농약) 및 방제방법이 개발되어 이용되어 왔으나, 화학제가 지닌 유독성, 안전성(잔류 문제) 및 방제효과 등의 극복해야 할 많은 결점을 지니고 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 재조합 유전자를 도입하여 식물체가 병충해에 대한 저항성을 갖도록 한 분자생물학적인 노력이 일부 식물군에서 시도되어 왔으며, 최적의 방어 능력을 지닌 유전자들이 계속적으로 연구되고 있다. 현재까지 유전자 분석을 통하여 다양한 저항성 유전자가 존재할 수 있음이 염색체 지도를 바탕으로 밝혀졌으며(Proteins, Nucleic Acids, Enzymes, 37(7), 1353(1992)), 수많은 저항성(또는 내성) 유전자가 벼 식물에 존재하는 것으로 추정된다.
벼에서 질병 저항성 유전자, 예컨대 키티나아제(Kim et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58(6), 1164(1894)), 리폭시제나아제(일본공개특허 제06-225774호), 피토알렉신 합성효소[Minami et al., Eur. J. Biochem., 185, 19(1989)), 과산화효소[Ito et al., Plant Cell Report, 13, 361(1994))에 대한 유전자가 분리되었지만, 이들 유전자와 내병성 사이의 어떤 연관성을 입증하는 보고는 없었다. 이와 관련한 선행특허문헌 대한민국 공개특허(제2001-0041277호)에서는 벼 도열병 병원균인 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea)로부터의 신규한 무독성 유전자 AVRI - CO39를 규명하였고 이를 이용한 벼 도열병 저항성 증진 방법을 제공하며, 대한민국 등록특허(제10-0839027호)에서는 식물(벼)의 질병에 대하여 직접적으로 방어 작용을 하는 벼 잎 도열병 저항성 유전자, OsGlu2를 포함하는 형질전환 식물체를 제공하며, 대한민국 등록특허(제10-0682129호)에서는 벼의 벼흰잎마름병 및 벼도열병에 대한 저항성이 높아지는, 벼 유래 OsCK1을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 유전자, 벼 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법을 제공하고, 미국등록특허(제7,345,219호)에서는 MAPK5 유전자를 과발현시킨 형질전환체에서 벼 도열병균에 대한 저항성을 나타내었다. 상기 선행특허발명은 본 발명과 비교하여 벼 도열병 병원균에 대한 저항 유전자 및 이를 이용한 형질전환 식물을 제공하는 것은 공통되나, 벼 도열병 저항성과 관련된 유전자와 저항성 유도반응 기작이 본 발명과 상이한 바, 본 발명과는 과제를 해결하고자 하는 방법 및 그의 구성이 상이할 것이다.
결론적으로, 벼 도열병을 포함한 식물 질병에 대한 내성은 식물에서의 병원성 감염 기작 및 내성 발현 기작이 매우 복잡하고 실험실 수준의 내성과 야외 수준의 내성 사이에 어떤 연관도 얻을 수 없었기 때문에 유전자 수준에서 어떤 진척도 없이 벼에서 어렵게 연구되고 있다.
따라서 본 발명에서는 식물 면역반응과 관련된 유전자들을 스크리닝하여 벼 도열병 저항성 관련 유전자인 OsMEK2 (OsMAPKK2, Oryza sativa mitogen activated protein kinase kinase)를 선별하였다. 상기 유전자는 벼 도열병과의 상관성이 거의 알려지지 않은바, 본 발명자들은 벼에서 OsMEK2 (OsMAPKK2)를 과발현시킴으로써 벼 도열병균에 대한 다양한 방어 마커 유전자들의 발현을 유도하였고, 이로써 기존의 도열병 저항성 형질전환체 보다 우수한 저항성을 나타내는 벼의 신규한 면역 조절유전자 및 이를 이용한 형질전환체를 제공하고자 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 식물체의 면역 증진용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 담배, 애기장대 및 옥수수의 면역반응 조절단백질인 MAP 키나아제 키나아제(mitogen activated protein kinase kinase, MAPKK)의 아미노산 서열과 상동성 있는 OsMEK2를 새로운 식물 면역반응 조절자로 규명하였고, 이를 이용하여 벼 도열병균 저항성 증진 조성물을 개발하였다. 상기 OsMEK2 유전자를 벼에 형질도입하여 과발현시킨 경우 벼 도열병에 대한 병변이 나타나지 않으며, 방어 반응 관련 유전자들의 발현이 유도됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 식물체의 면역 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 면역 증진용 조성물로 형질전환된 식물세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 면역 증진용 조성물로 형질전환된 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 병원체(pathogen) 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 식물체의 면역 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 식물체의 면역 증진용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 담배, 애기장대 및 옥수수의 면역반응 조절단백질인 MAP 키나아제 키나아제(mitogen activated protein kinase kinase, MAPKK)의 아미노산 서열과 상동성 있는 OsMEK2를 새로운 식물 면역반응 조절자로 규명하였고, 이를 이용하여 벼 도열병균 저항성 증진 조성물을 개발하였다. 상기 OsMEK2 유전자를 벼에 형질도입하여 과발현시킨 경우 벼 도열병에 대한 병변이 나타나지 않으며, 방어 반응 관련 유전자들의 저항성을 보일 때와 동일한 패턴으로 발현이 유도됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
종래에는 벼 도열병으로 인한 피해를 막기 위한 방법으로서 보편적으로 화학적 살균제(농약) 및 방제방법이 개발되어 이용되어 왔으나, 화학제가 지닌 유독성, 안전성(잔류 문제) 및 방제효과 등의 극복해야 할 많은 결점을 지니고 있었으며, 특히 벼 도열병의 발병 후에는 화학제 살포에 의한 영향으로 벼의 생장과 생산량에 큰 영향을 주었다. 본 발명자들은 이러한 점에 착안하여, 식물 생장과 생산에 전혀 영향을 주지 않으면서 효과적으로 식물 병원균에 대한 면역반응을 조절하는 유전자를 선별하여 이를 이용한 식물체의 면역 증진용 조성물을 개발하였다.
본 발명자들은 본 발명의 식물체의 면역 증진용 조성물을 이용한 OsMEK2 과발현 돌연변이체의 경우 벼 도열병 및 벼 흰잎마름병에 저항성을 나타냄을 최초로 규명하였으며, 본 발명의 식물 면역 조절기술은 식물 면역 반응 조절 유전자로서 OsMEK2 유전자를 과발현 시켰을 때 벼 도열병균에 대한 방어 마커 유전자의 전사를 조기 유도함으로써 신속한 병원균의 인지 및 벼 도열병 방어 기작을 활성화시킨다는 특징이 있음을 밝혔다.
따라서 본 발명자들은 본 발명의 조성물을 이용하여 식물 생장과 수확량에 전혀 영향을 주지 않으면서, 병원균 침입 시 OsMEK2의 존재에 의해 효과적으로 식물 면역 시스템을 조절하는 조성물을 제공하고, 이로써 병원균에 의한 영향을 극소화하여 식물의 생장에 미치는 영향을 최소화 하는 방법을 제공하고자 하며, 특히 OsMEK2 유전자를 면역 조절, 특히 병원체 저항성 증진과 관련된 유전자로서 이를 이용한 식물체의 병원체 저항성 품종의 육종소재로서의 가능성을 제시하고자 한다.
본 명세서에서 용어 “면역(immunity)"은 생물적 또는 비생물적 환경스트레스에 대한 내성 또는 저항성을 나타내는 것을 의미하며, 방어 반응(defense response)과 동일한 의미로 사용된다. 상기 생물적 스트레스란 해충, 박테리아 또는 병원체(pathogen) 등에 대한 스트레스이고, 상기 비생물적 스트레스란 염, 저온, 건조 또는 광(빛) 등에 대한 스트레스를 포함한다. 본 발명에서 상기 면역은 바람직하게는 생물적 스트레스에 대한 면역을 의미하고, 보다 바람직하게는 병원체에 대한 면역을 의미한다.
본 발명의 방법은 공지된 다양한 식물체에 적용될 수 있으며, 예컨대 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류에 적용될 수 있다.
본 발명의 식물체의 면역 증진용 조성물은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 서열목록 제 1 서열은 벼(Oryza sativa)의 MEK2(Mitogen-activated protein kinase kinase 2, MAPKK2)의 아미노산 서열을 의미하며, 상기 핵산 분자가 코딩하는 아미노산 서열과 상기 담배 애기장대 및 옥수수의 MAP 키나아제 키나아제 아미노산 서열은 적어도 약 50%, 60% 또는 70%의 상동성이 있고, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80% 또는 82%의 상동성이 있으며, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97%의 상동성이 있으며, 보다 더욱 더 바람직하게는 적어도 98%, 99% 또는 그 이상의 상동성이 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 아미노산 서열은 담배(tobacco), 애기장대(Arabidopsis) 및 옥수수의 MAP(Mitogen-activated protein) 키나아제 키나아제 단백질의 아미노산 서열과 각각 67%, 65% 및 82%의 상동성이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록 제 2 서열의 1115째 뉴클레오타이드로부터 4680째 뉴클레오타이드 까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 서열 목록 제 2서열은 OsMEK2 유전자의 프로모터, 5’UTR (untranslated region) 및 3’UTR의 서열을 모두 포함하며, 상기 서열목록 제 3 서열은 상기 서열목록 제 2 서열 중 오픈 리딩 프레임(ORF)의 서열을 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 ‘오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)’은 유전자의 코딩(coding) 서열 중 번역 개시 코돈 및 번역 종료 코돈 사이에 있는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 개시 코돈 및 종료 코돈은 단백질 합성의 개시 및 종료를 특정화하는 코딩 서열에서 3개의 근접한 뉴클레오타이드로 구성된 하나의 유닛을 의미한다.
본 발명에서 상기 오픈 리딩 프레임 서열을 운반하는 상기 유전자 전달체(gene carrier)는 당업계에 공지된 다양한 유전자 전달체(벡터)를 이용할 수 있으며, 예컨대, 플라스미드, 파아지 등을 포함하며, 바람직하게는 상기 유전자 전달체는 플라스미드이다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 유전자 전달체는 (i) 상기 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자; (ii) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (iii) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 식물세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 형질전환을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 옥수수의 유비퀴틴 프로모터를 포함하며, 바람직하게는 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터이다.
본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열(3’-비-해독화 부위)은 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3‘ 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함하며, 바람직하게는 CaMV 35S 터미네이터이다.
선택적으로, 상기 재조합 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 병원체에 대한 면역을 증진시켜 상기 식물체에 병원체(pathogen) 저항성을 부여하며, 상기 병원체는 박테리아(bacteria), 균류(fungi), 효모(yeast), 오어마이시트(oomycete) 및 바이러스(virus)를 포함하며, 보다 바람직하게는 박테리아 또는 균류이다.
상기 박테리아는 슈도모나스 아베나(Pseudomonas avenae subsp. avenae), 슈도모나스 안드로포고니스(Pseudomonas andropogonis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 헤르니파라시틱 박테리아(Herniparasitic bacteria) 또는 코리네박테리움 미치가넨스(Corynebacterium michiganense pv. nebraskense)를 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 균류는 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea), 글로메렐라 그라미니콜라 폴리티스(Glomerella graminicola Politis), 글로멜라 루쿠마넨시스(Glomerella lucumanensis), 아스페르질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 컬버라리아 클라바타(Curvularia clavata , C. maculans), 컬버라리아 이나카스(Curvularia inaequahs) 또는 컬버라리아 루나타(Curvularia lunata)를 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 균류는 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 또는 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea)이다.
상기 바이러스는 미국 밀조흔 모자이크 바이러스(AWSMV), 대맥줄무늬 모자이크 바이러스(BSMV), 맥류황화위축 바이러스(BYDV), 대맥황반 모자이크 바이러스(BYMV), 동부퇴록얼룩 바이러스(CCMV), 벼줄무늬 바이러스(RSV), 벼 검은줄오갈병 바이러스(RBSDV), 또는 옥수수모자이크 바이러스(MMV)을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 식물체의 면역 증진용 조성물은 다양한 형태로 제형화 될 수 있으며, 예컨대 현탁제(suspension), 용제(solution), 유화액제(emulsion), 분제(dusting powder), 분산성입제(dispersible granule), 수화제(wettable powder), 유제(emulsifiable concentrate), 연무제(aerosol), 미립제(microgranule) 또는 도포제(paste)로 제형화 될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 식물체의 면역 증진용 조성물은 추가적으로 계면활성제, 불활성 담체(inert carrier), 방부제, 습윤제, 캡슐화제, 바인더(binder), 유화제, 염색제, UV 보호제, 유도제(flow agent) 또는 비료를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 면역 증진용 조성물로 형질전환된 식물세포 및 식물체를 제공한다. 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물세포 및 식물체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 벼 도열병 또는 벼 흰잎마름병에 저항성을 가지는 형질전환 식물세포 및 식물체를 구축하였다.
본 발명의 형질전환된 식물세포 및 식물체는 상술한 본 발명의 면역 증진용 조성물을 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다. 일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).
아그로박테이룸 튜머페이션스에 의한 식물세포 또는 식물체의 형질전환은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 형질전환 과정은 아그로박테이룸 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테이룸 튜머페이션스는 식물내로 감염된다. 아그로박테이룸 튜머페이션스에 의해 형질전환된 식물세포 또는 식물체는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 당업자는 상기 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다. 최종적으로, 발근 배지에서 재분화된 신초의 발근에 의해 형질전환 식물이 생산된다.
형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 벼에 적용된다. 본 발명에 있어서, 유전자 도입에 적합한 잎은 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 병원체(pathogen) 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및
(b) 상기 식물세포로부터 병원체 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
상기 병원체(pathogen) 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법은 식물체에서의 병원체(pathogen) 저항성 증진방법으로도 이해될 수 있으며, 본 발명에서는 이를 동일한 의미로 사용한다. 본 발명의 병원체(pathogen) 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법은 상술한 본 발명의 면역 증진용 조성물을 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 병원체(pathogen) 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법에 대하여 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 식물세포의 형질전환
우선, 본 발명의 식물체 면역 증진용 조성물을 식물 세포에 도입시킨다. 형질전환은 상술한 식물의 형질전환 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류가 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직, 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
단계 (b): 형질전환 식물체의 수득
이어, 상기 식물세포로부터 병원체 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득한다.
본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인될 수 있다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989).)
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 식물체는 벼이고, 상기 병원체는 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균이다. 본 발명의 실시예에서는 상기 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균을 상기 본 발명의 형질전환 식물체에 접종하였을 때 병원균에 대해 저항성 또는 내성이 나타남을 알 수 있었다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 벼 도열병균은 마그나포르테 속(Magnaporthe)이고, 보다 바람직하게는 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea), 마그나포르테 포아(Magnaporthe poae), 마그나포르테 리조필라(Magnaporthe rhizophila) 및 마그나포르테 살비니(Magnaporthe salvinii)를 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 벼 도열병균은 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 또는 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 벼 흰잎마름병균은 산토모나스 속(Xanthomonas)이고 보다 바람직하게는 산토모나스 오리자(Xanthomonas oryzae)이며, 보다 더 바람직하게는 산토모나스 오리자 오리자(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) 또는 산토모나스 오리자 오리지콜라(Xanthomonas oryzae pv . oryzicola)이고, 보다 더욱 더 바람직하게는 산토모나스 오리자 오리자(Xanthomonas oryzae pv . oryzae)다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 병원체 저항성이 증진된 형질전환 식물체는 방어 마커 유전자의 발현을 유도하며, 바람직하게는 OsPR1b , OsPBZ , OsPAL1, OsAPX1 또는 OsAPX2의 발현을 상향 조절한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 식물체 면역 증진 조성물에 관한 것으로, 특히 병원체(pathogen)에 대한 저항성을 증진시키는 신규한 조성물에 관한 것이다.
(b) OsMEK2 유전자를 벼에 형질도입하여 과발현시킨 경우 벼 도열병에 대한 병변이 나타나지 않으며, 방어 반응 관련 유전자들의 발현이 유도된다. 따라서 본 발명의 조성물은 식물 생장과 수확량에 전혀 영향을 주지 않으면서 병원균 침입 시 OsMEK2의 존재에 의해 효과적으로 식물 면역 시스템을 조절할 수 있다.
(d) 따라서 본 발명은 OsMEK2를 병원체 저항성 특이적 조절 단백질로서 제시하여, 식물 병 저항성 품종의 육종소재로서의 가능성을 제시한다.
도 1은 OsMEK2(벼의 MAP 키나아제 키나아제)와 이종간 유사단백질(orthologue) 간의 아미노산 서열 얼라인먼트(alignment) 결과를 나타낸 것이다.
아미노산 서열은 ClustalW2 프로그램을 이용하여 얼라인하였다. OsMEK2, (Accession No. NP_001056806.1); ZmMEK2, 옥수수(Accession No. ACN31610.1); NbMEK2, 니코티아나 토바쿰(Accession No. AAF67262.1) and AtMEK2, 아라비돕시스 탈리아니아(Accession No. NP_194710.1).
도 2는 OsMEK2 과발현 변이체(OsMEK2 OX)의 전사체를 모식적으로 나타낸 것이다. 도 2A의 왼쪽 패널은 OsMEK2 OX 형질전환 식물이 하이그로마이신 선택 마커를 포함하는 CaMV 35S 프로모터 하의 재조합 벡터로 구축되었음을 나타낸다. LB, T-DNA 왼쪽 경계; RB, T-DNA 오른쪽 경계; HPT, 하이그로마이신; NT, 터미네이터; MCS, 다중 클로닝부위. 도 2A의 오른쪽 패널은 야생형 벼(니폰바레 품종) 및 네 가지 OsMEK2 OX 라인의 전사체(transcript)로 실시간(Real-time) PCR 분석을 실시한 결과이다. 야생형 및 OsMEK2 OX로부터 전체 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하여 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 도 2B는 병원균 접종이후 각각 다른 시간대에서 OsMEK2 OX 라인의 전사체를 분석한 결과이다. OsMEK2 OX 전사체는 병원체 접종 1 시간이내에 유도되었다.
도 3은 병원균이 접종된 4 개의 독립적인 OsMEK2 OX 형질전환 라인에서의 병원성(Pathogenicity) 시험을 나타낸 결과이다. 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) 감염이후 형질전환 라인에서의 질병의 심각도를 측정하였다. KJ201 종으로 감염된 이후 5 dpi (days post inoculation)에 사진을 촬영하였다. WT (NB)는 야생형 니폰바레 품종을 나타내고, OX1, OX2, OX3 및 OX4는 4개의 독립적인 형질전환 라인(OsMEK2 OX)을 나타낸다.
도 4는 2 개의 독립적인 OsMEK2 OX 라인(OsMEK2 OX1 및 OsMEK2 OX2) 및 야생형 벼(니폰바레 품종)에 병원체 접종한 후, 5개의 방어마커 유전자의 시간에 따른 발현정도를 정량적으로 나타낸 것이다. 도 4a 내지 도 4e의 위쪽 패널은 OsMEK2 OX1에 대한 결과이고, 아래쪽 패널은 OsMEK2 OX2에 대한 결과이다. 도 4a 내지 도 4e는 각각 (4a) OsPR1B, (4b) OsPBZ, (4c) OsPAL1, (4d) OsAPX1, 및 (4e) OsAPX2 유전자의 발현 정도를 나타낸 것이다. 측정값은 18s rRNA의 발현정도로 정규화하였으며, 상기 시험을 3번 반복하여 오차선(Error bar)을 나타내었다.
도 5는 병원균 접종 후 OsMEK2 OX 라인(OsMEK2 OX1 및 OsMEK2 OX2)에서의 OsMPK1 및 OsMPK6 발현이 증가되었음을 나타낸 것이다. 도 5a 내지 도 5b의 위쪽 패널은 OsMEK2 OX1에 대한 결과이고, 아래쪽 패널은 OsMEK2 OX2에 대한 결과이다. 도 5a에서 OsMEK2 OX 개체에 병원균 접종 후 1 시간이내에 OsMPK1 발현이 유도되었고, 도 5b에서 OsMEK2 OX 개체에 병원균 접종 후 1 시간이내에 OsMPK6 발현이 유도되었다. 전체 RNA 추출, cDNA 합성 및 실시간 PCR은 하기 실시예의 ‘실험재료 및 실험방법’에 따라 실시하였다.
도 6은 OsMEK2, OsMPK1 및 OsMPK6의 상호 관련성에 대한 개략적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 OsMEK2 KO 형질전환 개체의 잎에 벼 흰잎마름병균인 PXO099를 접종한 후 10일째의 표현형을 관찰한 결과이다. 도 7a는 OsMEK2 KO5, 도 7b는 OsMEK2 KO 1에 대한 결과를 나타낸다. 상기 두 개의 OsMEK2 KO 라인은 대조군과 비교하여 PXO099에 대한 내성 또는 저항성이 있는 것으로 나타났다.
도 8은 OsMEK2 OX 형질전환 개체의 잎에 벼 흰잎마름병균인 PXO099를 접종한 후 10일째의 표현형을 관찰한 결과이다. 도 7a 내지 도 7d는 각각 OsMEK2 OX1, OsMEK2 OX1, OsMEK2 OX2 및 OsMEK2 OX5에 대한 결과를 나타낸다.
도 9는 OsMEK2 OX 형질전환 개체의 잎에 벼 흰잎마름병균인 PXO099를 접종한 후 10일째에 벼 흰잎마름병의 병변 부위를 정량적으로 나타낸 결과이다. OsMEK2 OX (2-8-6-2) 5 라인만을 제외한 3개의 OsMEK2 OX 라인은 PXO099 균에 대해 내성 또는 저항성을 가짐을 알 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
벡터 구축
OsMEK2 유전자의 과발현 벡터를 구축하기 위하여, pBluescript SK-벡터내에 존재하는 OsMEK2 cDNA 클론(1173bp)의 완전 오픈 리딩 프레임(ORF, 서열목록 제 3 서열) 및 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터의 다운스트림 부분(서열목록 제 4 서열)을 pCambia 1300 이원벡터의 다중클로닝부위(multicloning site)에 삽입하였다(pCambia 벡터http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html).
트렌스제닉-OsMEK2 과발현 개체의 구축
야생형 벼(cv. Nipponbare, 자포니카형)를 OsMEK2-과발현 이원벡터(35S:OsMEK2)를 포함하고 있는 아그로박테리움 투메파시언스 균주 LBA4404로 형질전환시킨 후, 약간의 변형된 표준 절차를 수행하였다(Hiei et al., 1994). 형질전환된 캘리(calli)는 히그로마이신 농도를 점차 증가시킨 배지(30 mg - 60 mg 히그로마이신/ℓ)에서 배양하면서 선별과정을 거쳤다. 형질전환 및 선별과정을 거친 캘러스에서 신초형성(shooting) 및 발근(rooting)이 일어난 후, 묘(seedling)를 물에 침지하여 3-4일 동안 순응시켰으며, 이후 온실의 토양에서 재배하였다. T1 라인 종자의 히그로마이신 저항성을 분석하였으며, 히그로마이신-저항성 묘를 기능성 분석 및 T2 동형접합체(homozygote) 선별에 사용하였다.
병원성 시험(Pathogenicity Test)
병원성 시험을 위해, 자포니카형 야생형 벼 및 OsMEK2 과발현 벼(OsMEK2 OX)의 종자를 증류수가 담긴 페트리디쉬 상에서 28℃, 3일 동안 발아시켰다. 이후, 토양으로 이식시켜, 조직배양기에서 2주 동안 배양하였다. 조직배양기 조건은 다음과 같다: 12시간의 광주기, 28℃, 70% 상대습도. 2주간 배양한 배양체에 벼도열병균 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)(친화성 레이스 KJ201) 포자(5 x 105 분생포자/㎖)를 공기압축기를 사용하여 분사함으로써 접종시켰다. 분생포자(conidial spore) 현탁액은 지속적인 광 조건하의 25℃ 오트밀 아가 상에서 0.05%(w/v) 트윈-20을 처리하여 14일간 배양한 균주로 준비하였다. 접종된 식물체는 25℃에서 24시간 동안 암조건에서 배양한 후, 종전의 28℃ 정상 성장 조건에서 배양하였다. 벼도열병은 접종 후 4일-6일내에 발병하였다. 접종 후 일정한 시간 간격으로 잎을 채취하였으며, 접종 전에 채취한 잎을 대조군(0 시간)으로 하였다. 모든 샘플들은 액화질소 하에 즉시 냉동시켜 -80℃에 보관하였다. 벼도열병의 심각성은 6 단계의 질병 인덱스 스케일에 따라 접종 후 5일 째(dpi, days post inoculation)에 측정하였다.
정량적 실시간 중합효소연쇄반응을 통한 전사 분석
병원성 테스트로서, 저항성 마커 유전자의 발현 유도를 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(Stratagene, Mx3000P)을 수행하였다. 인비트로젠(Invitrogen) 프로토콜에 따라 트라이졸을 사용하여 벼 조직으로부터 전체 RNA를 분리한 후, 흡광분광분석 방법으로 정량하였다. 실시간 중합효소연쇄반응 전, 전체 RNA 샘플을 RNA 분해효소가 없는 DNA 가수분해효소(DNase)로 처리하였다. cDNA 첫 번째 가닥은 cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 20 ㎕ 반응 혼합물에서 합성되었다. 상기 합성 반응에는 벼도열병균 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea) KJ201로 접종시킨 벼에서 일정 기간 후 채취한 벼 잎으로부터 분리한 RNA 2 ㎍을 사용하였다. cDNA 1 ㎕를 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였으며, 상기 반응에는 반응시약으로서 스트라타진 마스터 믹스를 사용하였다(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix, Stratagene). 18S rRNA를 대조군으로 사용하였다.
실험결과
계통 분석(Phylogenetic analysis)을 통한 OsMEK2의 방어 반응 양성 조절자로서의 발견
본 발명자들은 OsMEK2에 대한 기능적 실마리를 제공하는 다른 식물 종으로부터 OsMEK2와 가장 가까운 이종간 유사단백질(orthologue)을 찾기 위하여 계통 분석을 실시하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 토바코(tobacco), 애기장대(Arabidopsis) 및 옥수수의 MAP(Mitogen-activated protein) 키나아제 키나아제 단백질과 OsMEK2 단백질간의 아미노산 서열 분석을 실시하였다(도 1). 그 결과, OsMEK2가 토바코, 애기장대 및 옥수수 MAP 키나아제 키나아제 단백질과 각각 67%, 65% 및 82%의 상동성을 나타내었다. OsMEK2와 가장 근접한 상동유전자로서 토바코 MAP 키나아제 키나아제(NbMEK), 애기장대 MAP 키나아제 키나아제(AtMEK2)에 대한 선행연구에서는, 방어 반응에 있어서 이들 MAP 키나아제 키나아제가 적극적으로 관여하고 있음이 확인되었다(Jin et al., 2003, Brader et al., 2007). 이러한 연구들은 OsMEK2가 벼(rice)의 질병 저항성 경로에서 양성 조절자로서 기능할 수 있음을 증명한다.
병원균 접종에 의해 유도되는 OsMEK2 발현
방어 기작에 있어서 OsMEK2의 기능을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 벼에서 과발현 형질전환 시험을 실시하였다. 이를 위해 CaMV35S:OsMEK2 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 식물을 구축하였으며, OsMEK2 OX로 명명하였다(도 2A). 일반적으로 OsMEK2 OX의 표현형은 야생형 개체와 매우 유사하였다. 본 발명자들은 기능적 분석을 위해 OsMEK2 전사 패턴을 기준으로 4개의 독립적인 OsMEK2 OX 라인(OX1, OX2, OX3 및 OX4)을 선별하였다(도 2A). 맹독성의 균주(KJ201)을 접종한 후, OsMEK2 OX 라인들은 야생형 및 MOCK-처리된 대조군과 비교하여 신속하고(1시간 이내) 강하게 OsMEK2 전사를 유도하였다(도 2B). 이러한 결과들은 OsMEK2가 방어기작에서 양성 조절에 관여하는 병원균-유도된 MAP 키나아제 키나아제임을 증명한다.
OsMEK2 의 과발현으로 인한 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae, KJ201)에 대한 저항성 증가
방어 기작에서의 OsMEK2 기능을 분석하기 위해, 4개의 독립적인 OsMEK2 OX 라인(OX1, OX2, OX3 및 OX4) 및 야생형(니폰바레 품종) 벼에 벼도열병균인 KJ201종을 접종하였다. 질병의 표현형은 5 dpi (days post inoculation)일 때, 관찰하였다(도 3). 야생형 개체는 3 dpi부터 병변을 보이며 심각한 질병 증후를 나타내었으나, OsMEK2 과발현 개체들은 5 dpi 이내에 어떠한 증후도 나타나지 않았으며(도 3), 5 dpi 이후에는 거의 질병 증후를 보이지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 OsMEK2 OX 라인이 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae)에 대한 저항성을 조기 향상시킴을 증명하였다.
병원균-접종된 OsMEK2 OX 개체에서 방어 마커 유전자들의 상향 조절
병원균-접종된 야생형 및 OsMEK2 OX 개체에서 5가지 다른 방어 마커 유전자(OsPR1b , OsPBZ , OsPAL1, OsAPX1 및 OsAPX2)의 시간-기반 정량적 발현 분석을 실시한 결과, 리드미컬한 패턴이 관찰되었다. OsPR1b 전사는 매우 이른 시간대인 접종 후 1-3 시간 내에 유도되었으며, 반면 OsPBZ 및 OsPAL1의 전사는 접종 후 1-24 시간 내에 유도되었다(도 4a, 4b 및 4c). 다른 방어 마커 유전자인 OsAPX1 및 OsAPX2는 비교적 늦게 즉, 접종 후 48 시간 내에 유도되었다(도 4d 및 4e). 이러한 결과들은, OsMEK2가 실제로 다양한 방어 마커 유전자의 활성을 유도함으로써 방어기작에서의 양성 조절자로서 기능함을 보여주며, 이로써 OsMEK2의 존재가 신속한 병원균의 인지 및 식물질병 방어작용에 중요함을 알 수 있다.
OsMEK2 OX 개체의 병원균 접종에 의한 OsMPK1 및 OsMPK6 유도 증가
본 발명자들은 선행연구에서 효모 이중 중합법(yeast two hybrid assay)에 의해 OsMPK1 및 OsMPK6가 OsMEK2의 상호작용자(interactor) 역할을 함을 규명하였다(Singh et al., 2012). 본 발명에서는 감염 1시간 내에 OsMPK1 및 OsMPK6가 유도됨을 확인함으로써 병원균에 높은 저항성을 보이는 OsMEK2 OX 라인을 구축하였다(도 5a 및 5b). 이러한 결과들은 OsMPK1 및 OsMPK6가 방어 시그널링에 관여함을 보여주며, 추후 연구에서 확인되어야 할 것이다.
벼 흰잎마름병균 접종에 의한 표현형 변화
벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae) 균주인 PXO099의 현탁액(OD600=0.4)을 이용하여, OsMEK2을 과발현 또는 넉-아웃(knock-out) 시킨 형질전환 개체의 발아(booting) 단계에서 Scissors-dip 방법(Song 외, 1995)으로 상기 PXO099를 접종시켰다. PXO099 균주는 야생형 벼(cv. Nipponbare, 자포니카형)에서 강한 병원성을 나타내는 균주이며, OsMEK2 KO는 유전자 결실 변이체, OsMEK2 OX는 유전자 넉-아웃(knock-out) 변이체이다. 대조군(OsMEK2 과발현 개체)은 물만 접종하였고, 병변 부위의 길이는 당업계에 공지된 방법(Chern 외. 2005)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에서와 같이 대조군에서는 벼 흰잎마름병균의 병변이 거의 나타나지 않았으나, OsMEK2 KO(도 7) 및 OsMEK2 OX(도 8) 변이체에서는 벼 잎의 백화 현상이 나타났음을 확인하였다.
도 9는 상기 OsMEK2 KO 및 OsMEK2 OX 변이체의 병변 부위 길이를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. KO 1 및 KO 2 라인은 대조군과 비교하여 병변 부위가 크게 나타났으며, OX 1, OX 2 및 OX 4 라인 또한 대조군과 비교하여 병변 부위가 크게 나타났음을 확인하였다. OX 3 라인은 대조군 보다 병변 부위가 적게 나타났는데, 이는 상기 OX 3 라인이 특이적으로 벼 흰잎마름병균인 PXO099에 대하여 저항성을 가지고 있기 때문이라 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체를 포함하는 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균에 대한 벼의 면역 증진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균에 대한 면역을 증진시켜 상기 벼에 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균에 대한 저항성을 부여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제 2 서열의 1115째 뉴클레오타이드로부터 4680째 뉴클레오타이드 까지의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 (i) 상기 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자; (ii) 상기 핵산 분자에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (iii) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 벼 세포.
  8. 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 벼.
  9. 다음의 단계를 포함하는 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균 저항성이 증진된 형질전환 벼를 제조하는 방법:
    (a) 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 벼의 식물 세포에 도입시키는 단계; 및
    (b) 상기 식물세포로부터 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균 저항성이 증진된 형질전환 벼를 수득하는 단계.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 벼 도열병균은 마그나포르테(Magnaporthe) 속인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 벼 도열병균 또는 벼 흰잎마름병균 저항성이 증진된 형질전환 벼는 방어 마커 유전자인 OsPR1b, OsPBZ, OsPAL1, OsAPX1 또는 OsAPX2의 발현을 상향 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 벼 흰잎마름병균은 산토모나스(Xanthomonas) 속인 것을 특징으로 하는 방법.
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Plant Physiology, 160권, 477-487쪽(2012년 6월) *

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