KR100703566B1

KR100703566B1 - 벼에서 분리된 병저항성 유전자, 이 유전자를 포함하는발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이형질전환체의 제조방법

Info

Publication number: KR100703566B1
Application number: KR1020050088306A
Authority: KR
Inventors: 변명옥; 박상렬; 박수철; 정미정; 송혜숙; 이진옥; 한성숙; 이은진; 문경미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2005-09-22
Publication date: 2007-05-21
Also published as: KR20070033781A

Abstract

본 발명은 벼에서 분리된 벼의 병저항성 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 서열번호1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 벼의 병저항성 유전자인 OsDRP를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체 및 벼, 애기장대, 담배 형질전환체, 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.

OsDRP, 벼, 벼흰잎마름병, 벼도열병, 병저항성 유전자

Description

벼에서 분리된 병저항성 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법{DISEASE RESISTANCE GENE ISOLATED FROM Oryza sativa, EXPRESSION VECTOR CONTAINING THE GENE, TRANSFORMANT TRANSFORMED BY THE VECTOR AND METHOD FOR PREPARATION OF THE TRANSFORMANT}

도1a는 벼에서 분리한 병저항성 유전자인 OsDRP 유전자의 염기서열, 및 상기 OsDRP 유전자의 프로모터 및 C-말단의 서열을 나타낸다.

도1b는 벼에서 분리한 병저항성 유전자인 OsDRP 유전자의 인트론 영역의 염기서열을 나타낸다.

도1c는 벼에서 분리한 병저항성 유전자인 OsDRP 유전자의 추정 도메인을 나타낸다.

도2a는 화합성과 불화합성 도열병균 처리에 의한 OsDRP 유전자의 시간별 노던(Northern)발현 분석결과를 나타낸다.

도2b는 OsDRP 유전자의 신호처리별 노던발현 분석결과를 나타낸다.

도3a는 OsDRP유전자의 이스트-투 하이브리드(yeast-two hybrid) 스크린용 벡터를 나타낸다.

도3b는 OsDRP유전자의 이스트-투 하이브리드 스크린에 의한 상호작용 결과를 나타낸다.

도4a는 도열병균의 CYP유전자의 제한효소지도와 OsDRP 유전자의 추정 아미노산 서열을 나타낸다.

도4b는 OsDRP유전자와 벼도열병균 사이클로필린 유전자의 상호작용 분석을 위한 도면이다.

도5a는 OsDRP 유전자를 식물체내에 도입하여 발현을 증폭시키기 위하여 발현벡터를 제조한 도면이다.

도5b는 OsDRP 유전자 발현증폭을 위해 발현벡터를 도입한 담배 형질전환체를 나타낸 도면이다.

도5c는 OsDRP 유전자 발현증폭을 위한 형질전환 담배의 유전자 삽입 여부를 PCR방법으로 검정한 도면이다.

도6a는 OsDRP유전자의 프로모터를 절단하여 GUS 유전자와 결합하여 프로모터 분석벡터를 제조한 도면이다.

도6b는 OsDRP유전자의 promoter분석 벡터를 담배에 주입(infiltration) 하고 병원균을 처리하여 GUS 발현양을 측정함으로써 OsDRP 프로모터 부위별로 발현여부를 검정(transient assay)한 도면이다.

본 발명은 벼에서 분리된 병저항성 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.

농작물은 고착생활을 하기 때문에, 끊임없이 수많은 병원균(곰팡이, 세균, 바이러스 등)들의 공격을 받게되어, 그로인한 다양한 질병에 따른 생산량의 감소는 일찍이 기록되어져 왔다. 이러한 병원균에 의한 농작물의 피해를 줄이고 생산성을 향상시키기 위하여 일반적으로 농약이 사용되어오고 있으나, 농약의 사용은 환경오염이라는 심각한 문제를 새로이 야기시킴으로써 돌이킬 수 없는 자연환경의 파괴와 회복불능의 환경을 만들어 내고 있다(Sherman JD et al., Arch. Environ. Health., 52, 332-333, 1997). 뿐만 아니라, 농약을 살포하는 농민들의 경우 맹독성의 농약을 인체에 흡입하므로써 인체내의 축적과 불치의 유전병이 생성되게 되고, 잔류농약의 흡수에 의해 소비자들에게도 치명적인 건강상의 손실을 유발시키게 된다(London et al., Scan. J., Work. Environ. Health., 24, 18-29, 1998).

따라서, 식물의 병 방제와 농약사용으로 인한 환경오염이나 인체 축적에 의한 치명적인 질병 발생 등을 방지할 수 있는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 그 예로서 생물체내에 존재하는 병원균 살균 단백질의 탐색과 분리 및 이들을 코딩하는 유전자의 클로닝과 이들을 이용한 내병성 형질전환 식물체에 대한 개발이 이루어지고 있다.

이러한 노력의 일환으로 병저항성 작물의 육성 프로그램들이 다양한 작물-병원균의 상호작용을 대상으로 진행되어져 왔으며, 병저항성에 대한 이해 및 이의 실 제적 응용을 위해 병저항성 식물에서의 저항성 기작의 연구가 여러 가지 작물 및 모델식물을 대상으로 실시되어져 왔다. 집중적으로 연구가 되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다.

식물의 병발생에 대한 방어반응으로 건전한 식물에서는 미량으로 존재하거나 발견되지 않는 유전자 또는 단백질들이 병감염시 특이적으로 증가되거나 나타난다. 이를 병저항성유전자 또는 병생성관련단백질(pathogenesis-related protein)이라 한다.

식물들은 특이한 병 방어유전자를 다양하게 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특이한 병 방어 유전자를 식물체로부터 분리하여, 유전공학적으로 적용하고자 하는 연구가 진행되어 왔다.

본 발명은 병원균에 대하여 특이적인 병저항성을 나타내는 벼 유래의 OsDRP(Oryza sativa Disease Resistance Protein) 유전자 및 그 염기서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 특히 벼도열병균에 대하여 특이적인 병저항성을 나타내는 벼 유래의 OsDRP 유전자 및 그 염기서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 OsDRP 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, 벼 유래의 OsDRP 유전자 및 그 염기서열이 제공된다.

본 발명에서 OsDRP 유전자를 선발하기 위하여, 병처리한 벼에서 cDNA 유전자 은행을 작성하여 역노던법(reverse northern)으로 특정 유전자를 추출한 다음, 유전자 염기서열분석 및 상동성 분석을 통하여 병저항성유전자로 추정되는 유전자를 선발하고, 이를 발현분석하고, 이스트-투 하이브리드 스크리닝(yeast-two hybrid screening)에 의해 병원균의 병원성 인자(virulence factor)와의 단백질 상호작용을 확인하였다.

상기와 같이 선발된 유전자는 식물이 병원균이나 병방어 유도물질로 처리될때 발현이 증폭되는 유전자로서, "OsDRP 유전자"로 명명하였다.

본 발명의 상기 OsDRP 유전자는 서열번호1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 896개의 아미노산을 코드하는 2,691bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 도1a에는 본 발명의 벼유래 OsDRP유전자의 염기서열을 나타내었으 며, 특히 프로모터 및 C-말단의 서열을 나타내었고, 도1b에는 인트론 영역의 염기서열을 나타내었으며, 도1c는 OsDRP 유전자의 추정 도메인을 나타내었다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 벼 유래의 OsDRP 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 상기 OsDRP 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 OsDRP 유전자를 삽입하기 위한 발현벡터는 pB7WG2D 벡터가 바람직하다.

본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 "pB7WG2D-OsDRP" 라고 명명하였고 도5a에 나타내었다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 벼 유래의 OsDRP 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(transformants)가 제공된다.

본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 식물체내로의 형질전환, 세포배양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 아그로박테리움(Agrobacterium)이 바람직하다.

여기서, '형질전환체'란 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.

본 발명자들은 본 발명의 상기 OsDRP 유전자를 포함하는 발현벡터를 제작한 후, 이 발현벡터를 아그로박테리움에 형질전환시켜 안정적인 아그로박테리움 형질전환체를 확립하였으며, 이를 형질전환체 "LBA4404:pB7WG2D-OsDRP"로 명명하였다. 이 아그로박테리움 형질전환체를 농촌진흥청 부설 농업생명공학연구원 한국농용미생물보존센터에 2005년 6월 29일에 수탁번호 KACC 95036으로 기탁하였다.

또한, 상기 아그로박테리움 형질전환체인 LBA4404:pB7WG2D-OsDRP를 벼, 애기장대 , 담배식물에 형질전환시켜 안정적인 식물형질전환체를 확립하였다.

본 발명의 상기 형질전환체의 제조방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:

1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열 또는 그것의 일부로 이루어지는 OsDRP DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.

상기 발현벡터를 제조하는 단계 1)에 있어서, 벼에서 특이적으로 발현되는 유전자 풀을 얻기 위하여, cDNA 라이브러리(cDNA library)를 제작한 후, ESTs 분석을 실시하고, 이를 통하여 벼 유래 OsDRP 유전자의 부분 단편을 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 이 클론의 유전자 단편을 3'-연장 및 5'-연장하므로써 전장(full length) DNA를 획득하고, 얻어진 전장 DNA를 게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용하여 식물 발현벡터인 pB7WG2D에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pB7WG2D-OsDRP을 제작할 수 있다.

상기 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 2)에 있어서, 얻어진 발현벡터(예컨대, pB7WG2D-OsDRP)를 식물, 예컨대 벼 또는 애기장대에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 진공을 이용한 형질전환법(Vacuum infiltration method), 화아 침지법(Floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method) 등이 있으며, 벼에 상기 유전자를 도입하는 방법은 캘러스(callus)를 유도하여 아그로박테리움과 공동배양하는 방법을 이용하는 것이 가장 바람직한 방법이다. 이때, 상기 발현벡터(예컨대, pB7WG2D-OsDRP)를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 등이 있으며, 일렉트로포레이션법(electroporation)이 가장 바람직하다.

이와 같은 형질전환 기술은 조직배양을 거치지 않고 식물이 생장하는 상태 그대로 생장점 부위에 위치하는 세포들을 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포로부터 재분화하는 줄기에서 형질전환된 종자를 획득하여, 유전적으로 안정된 형질전환 식물체를 획득할 수 있는 기술이다.

상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계 3)에 있어서, 선별방법은 숙주세포의 제초제 저항성을 이용하여 선별할 수 있는 데, 즉 선별마커로서 제초제 저항성 유전자 Bar를 포함하는 상기 발현벡터 pB7WG2D-OsDRP가 도입된 숙주를 확인하기 위하여 종자를 획득 후 파종하여 제초제(basta)를 처리한 후 저항성을 나타내는 식물을 선별할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 벼의 병원균 특이 발현 cDNA 라이브러리에서 병저항성 관련 클론 선발을 위한 유전자 분리 및 염기서열분석

종자를 파종하여 3주간 키운 벼에 흰잎마름병균을 처리한 후, 22℃, 95%의 항습장치속에서 6시간 처리하고 나서, 벼의 지상부를 회수하여 액체질소로 마쇄하고, BRL의 트리졸(Trizol)시약으로 추출하였다. cDNA 유전자은행 작성은 Stratagene사의 "Lambda ZAP II cDNA 합성키트(synthesis kit)"와 "Gigapack II gold packaging extract"를 사용하여, 제조회사가 제시한 방법에 따라 제작하였다. 트리졸(Trizol)로 분리된 전장 RNA를 Qiagen사의 "Oligotex"로 poly A⁺ RNA를 분리하고, poly A⁺ RNA를 주형으로 하α고, RNase H^- 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 첫번째 가닥(first strand) cDNA를 합성한 후, RNase H를 사용하여 RNA를 제거하 고, DNA 중합효소를 사용하여 두번째 가닥(second strand) cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 EcoRI 어댑터(adaptor)를 리게이션(ligation)시키고 XhoI을 처리하여 EcoRI과 XhoI 부위를 만들고, EcoRI과 XhoI이 처리된 Uni-zap XR 벡터에 리게이션시켰다. 리게이션한 용액을α 실험실내 패키징 키트(in vitro packaging kit, Stratagene사)를 사용하여 패키징한 후 E.coli에 감염시켜 파아지 티터(Phage titer)를 측정한 후 엠플리파이시켜 보존 저장액(stock)으로 만든 후 사용하였는데, 플레이크(plaque) 수는 약 70만개였다.

Hybond-N+ membrane(Amersham, USA)에 분리한 EST DNA를 2개의 레플리카로 스포팅한 뒤 UV 크로스링커(Spectrolinker XL-1000, USA)로 고정시켰다. 전사량을 비교할 프로브로는 동진벼와 흰잎마름병을 처리 6시간 후의 동진벼에서 추출한 RNA 10㎍과 oligo dT 프라이머를 바인딩 시킨 후 α-[³²P]dCTP와 역전사효소(reverse transcriptase)를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 라벨링된 cDNA를 합성하였다. 준비된 2장의 멤브레인을 혼성화 용액(1% BSA, 1mM EDTA, 7% SDS, 0.5M NaHPO₄ 버퍼, pH 7.2)에 담그고 라벨링된 프로브를 넣어 65℃에서 12시간 동안 혼성화 하였다. 동일한 2장의 멤브레인을 각각 10mM MgCl₂(Mock)로 처리한 동진벼와 흰잎마름병균으로 처리하고 6시간 후의 동진벼를 RNA 프로브로 혼성화하여 유전자 발현을 비교 분석하여 발현이 증가된 유전자를 선별하였다. 선발된 유전자의 염기서열결정은 ABI회사의 "Big dye terminator"를 이용하였고, 상동성 분석은 미국 NCBI 데이터 베이스를 이용하였고, 애기장대의 CC-NBS LRR계열의 병저항성 단백질과 유 사함을 확인하였다.

3' 부분의 단편이므로 완전한 전체 유전자를 분리하기 위하여, 게놈 워커(Genome walker)를 사용하여 5' 부분을 찾았고, 프로모터도 게놈 워커를 사용하여 분리하였다. 염기서열을 분석하여 ORF를 추정한 결과 도1a와 같았으며, 인트론 부위는 도1b와 같이 3개가 존재하였다.

실시예 2: OsDRP유전자의 노던발현

[식물 재료 및 병원성 균주]

암 상태로 28℃ 그로스 챔버에서 동진벼 종자를 3일 동안 발아시킨 후, 수도용 상토에 파종하여 온실에서 2주간 자란 어린잎을 사용하였다. 사용된 균주는 벼흰잎마름병균(Xoo 10331과 K3, PSA 배지; 펩톤 10g, Na-글루타메이트 1g, 수크로즈 20g/ℓ, 30℃에서 3일간 배양 후 108/㎖로 희석)과 벼도열병균(Pyricularia grisea KJ-301 및 101(쌀겨 20g, 수크로즈 20g, 한천 24g/ℓ, 30℃에서 4일 간 배양 후 5x10⁵ spore/㎖로 0.01% Triton X-100에 희석))을 분무법에 의해 처리하였다. 처리 후 듀 챔버(25℃, dark)에서 24시간 인큐베이션 후 온실로 옮겨 배양하면서 시간대별로 샘플링하였다.

[전장 RNA 분리]

액체질소를 이용하여 샘플을 곱게 간 후, 2㎖ E-튜브에 100㎎ 넣고, 800㎕ TRI-시약(MRC사제, USA)을 넣어 샘플과 잘 혼합하였다. 200㎕ 클로로포름을 첨가하 고 잘 섞은 후 12,000g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상등액을 새 튜브에 옮겼다. 여기에 500㎕ 이소프로판올을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하고, 펠렛에 75% 에탄올 1㎖를 넣고 세정한 후 공기 중에서 말렸다. 말린 펠렛은 RNase-무함유 물에 녹인 후 농도를 측정하고, 분주하여 -70℃에 보관하면서 필요시 사용하였다.

[노던 혼성화]

1) 포름알데히드 RNA 젤 전기영동과 모세관 블롯팅

20㎍의 전장 RNA 샘플에 EtBr을 함유한 로딩 염료(loading dye)를 넣고 65℃에서 15분 동안 변성(denaturation)시켜 1% 변성 포름알데히드 겔(denaturing formaldehyde gel)에서 70V로 3 시간 동안 전기영동하였다. 이 겔을 증류수에 20분 동안 진탕 하면서 세정하고, 10×SSC 버퍼로 옮겨 포화(saturation)시킨 후 hybond-N+ 멤브레인(Amersham사제, USA)으로 전이하였다. 전이된 멤브레인을 2×SSC로 세정한 후, 65℃에서 10분간 말린 후 UV 크로스링커로 오토크로스링크하였다.

2) 랜덤 헥사멀 라벨링(Random hexamer labelling)에 의한 프로브 조제

랜덤 프라이머(Amresham사제, USA) 5㎕와 프로브 DNA(25ng 이상)를 혼합하여 95℃에서 5분간 끓인 후 실온에 방치하였다. 라벨링 혼합물(10×라벨링 버퍼, dNTP 혼합물 2.5㎕, 표지된 dCTP 5㎕, 클레노브 단편 1㎕)을 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 5M EDTA 1㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 반응혼합물을 가이거 카운터로 모니터하여 방사능(radioactivity)을 확인하여 프로브로 사용하였다.

3) 노던 혼성화

혼성화 버퍼(0.5M NaHPO₄, 1% 결정성 BSA, 1mM EDTA, 7% SDS/1ℓ)에 전장 RNA가 전이된 멤브레인을 넣어 65℃에서 15분 이상 예비 혼성화한 후 프로브를 3분간 끓인 후 식혀서 넣고, 65℃에서 12시간 이상 진탕시켰다. 2×SSC/0.1% SDS 용액으로 65℃에서 10분간 세정한 후, 가이거 카운터로 모니터하여 신호가 강하면 좀 더 엄격한 조건의 용액(1×SSC/0.1% SDS 또는 0.1×SSC/0.1% SDS)으로 65℃에서 세정한 후, BAS 카세트(후지필름사제)에서 12시간 이상 노출시켰다. 이에 따른 OsDRP 유전자의 시간별 노던 발현 분석결과는 도2a에 나타내었다.

4) 노던 혼성화 결과

벼에 병을 일으키는 화합성(Compatible) 도열병 병원균을 처리하였을 때에 비해, 벼가 병저항성을 나타내는 불화합성(Incompatible) 도열병 병원균을 처리하였을 때 병처리 후 1시간부터 OsDRP 유전자의 발현이 증폭됨을 도2a로부터 확인할 수 있었다. 따라서 상기 OsDRP 유전자가 병저항성에 관련된 유전자임을 확인할 수 있었다. 또한 도2b로부터 본 발명의 상기 OsDRP 유전자는 도열병균 뿐아니라 흰잎마름병균, BTH, SA, 에틸렌 등을 처리하였을 때에도 그 발현이 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : OsDRP 유전자의 단백질-단백질 상호작용 연구

가. BD MATCHMARKER Two-Hybrid 라이브러리 제작

도열병과 흰잎마름병에 의해 발현이 증가된 OsDRP 유전자와 상호작용하는 유전자를 탐색하기 위하여 동진벼 잎에 벼흰잎마름병균인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae를 처리하고 나서 3시간 후, 잎에서 전장 RNA를 분리하여 "mRNA 분리 시스템"(Promega사 제품)을 이용하여 mRNA를 분리하였다. 분리된 mRNA는 "BD SMART cDNA 합성 키트(Clontech사 제품)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, "BD MATCHMARKER 라이브러리 구축 키트"(Clontech사 제품)를 이용하여 이스트-투 하이브리드용 라이브러리를 제작하였다.

나. 베이트 벡터제작

병 저항성 유전자들 간의 상호작용을 분석하기 위하여 이스트-투 하이브리드 시스템을 이용하였다. 베이트 벡터 합성을 위하여, 병방어 유전자로 추정되는 OsDRP 유전자를 pGBKT7 벡터에 삽입하였다. 합성된 베이트 벡터를 이용하여, AH109 이스트에 형질전환 하여, SD trp w/o배지에서 선택되어 콜로니가 얻어졌으며, 이들에 대하여 OsDRP 유전자의 센스 프라이머와 안티센스 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 및 염기서열을 분석하여 OsDRP 유전자의 베이트 벡터가 완성되었음을 확인하였다.

다. 이스트 공변형(Yeast cotransformation)

OsDRP 유전자와 상호작용하는 유전자들을 분리하기 위하여 베이트 벡터인 OsDRP 유전자와 MATCHMARKER 이스트 투 하이브리드법용 라이브러리를 이스트 공변형하여 SD Trp, Leu, His w/o의 선택배지에서 배양한 결과, 다수의 콜로니를 확인하였다. 얻어진 콜로니들 중에서 베이트 유전자인 OsDRP 유전자와의 상호작용을 확 인하기 위하여 X-gal처리에 의한 스크리닝을 수행하고, 플라스미드 DNA를 분리하여 염기서열을 분석하여 블라스트 서치에 의해 상동성을 조사하였다. 또한 이들 중 병관련 유전자로 추정되는 클론들의 유전자 발현을 보기 위해 노던 혼성화(northern hybridization)를 실시하였다.

라. OsDRP와 상호작용하는 단백질.

이스트 공변형한 후 β-갈락토시다제 분석을 통해 도3b에 도시된 바와 같이 OsDRP 유전자와 상호작용하는 타겟유전자를 선별하여 25개의 클론을 얻었다. 그중 20개의 클론은 발현이 매우 강하고, 3개의 클론은 중간 정도이며, 2개의 클론은 매우 약하게 상호작용 하였다.

상기 OsDRP 유전자의 이스트-투 하이브리드 분석 결과를 표1에 나타내었다. 하기 표1로부터 OsDRP와 상호작용하는 것으로 추정되는 19개 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 이들은 메탈로티오네인-유사 단백질(metallothionein-like protein), 이뮤노필린(immunophilin), GTP-결합 단백질 등과 상동성을 보였다.

[표1:OsDRP 유전자의 이스트-투 하이브리드 분석 결과]

서열 상동성(sequence homology)	GenBank 등록번호 (accession number)
Fructose-bisphosphate aldolase	S65073
Metallothionein-like protein type 2	P93433
F1-ATPase	AAP80663
cysteine synthase	CAC09469
Ribosomal protein L7Ae family	NP-850856
hypothetical protein	BAC20675
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	CAD79700
Prolamin precursor	BAA36699
Kinesin-like protein	AAK70904
Myo-inositol phosphate synthase	AAP85531
UDP-galactose-4-epimerase-like protein	BAC53786
Metallothionein-like protein	AAP80616
enolase	AAP94211
Adenosylhomocysteinase-like protein	AAO72664
immunophilin	AAM65589
expressed protein	BAA90797
GTP-binding protein	NP-196119

실시예4. OsDRP와 CYP1의 상호작용 실험

도4a에 도시한 바와 같이 벼 도열병에 있어서 병원성 결정인자로서 작용하는 것으로 알려져 있는 도열병원균(Pyricularia grisea)으로부터 사이클로필린(Cyclophilin)을 코딩하는 유전자 CYP1을 분리하여 OsDRP와의 상호작용 여부를 "MATCHMARKER GAL4 Two-Hybrid 시스템3"(Clontech사 제품)을 사용하여 조사하였다. BD 벡터는 pGBKT7를, AD 벡터는 pGADT7을 사용하였으며, OsDRP 유전자와 CYP1 유전자를 이용하여 베이트(bait)와 프레이(prey)를 서로 바꾸어 가면서 시험한 결과, 도4b에 도시한 바와 같이 두 경우 모두 상호작용을 하는 것으로 확인되었다.

실시예 5 : 담배형질전환체 작성

도5a와 같이 제작된 형질전환용 벡터를 일렉트로포레이션법(electroporation)을 이용하여 Agrobacterium tumefaciens(LBA4404)에 도입하였다. 배양실에서 무균상태로 자란 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)에 리프 디스크(leaf disc)법으로 형질전환하였다. 담배잎을 대략 5 x 5 mm 크기로 잘라서 200㎕의 아그로박테리움(Agrobacterium)이 포함된 MSO 액체배지(MS염 4.3g, 수크로스 30 g/l, pH 5.6∼5.8)에 넣었다가 암조건에서 2∼3일 동안 배양하고, 배양된 잎 절편을 500 ㎍/㎕의 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 증류수로 2∼3회 세척한 후 캘러스-슈트(callus-shoot) 유도배지(MSO배지에 100㎍ NAA, 1mg BA, 500㎍ 세포탁심, 1 mg 포스피노트리신(phospinothricin), 0.7% 피토 한천(phyto agar), pH 5.6)으로 옮기고, 2주마다 새로운 배지로 옮겨 주었다. 유도된 발아는 1.5∼2cm 정도 자라면 루트-인덕션 배지(MSO배지에 250㎍ 세포탁심, 10mg 포스피노트리신, 0.7% 피토 한천, pH 5.6)로 옮겨 주었다. 담배의 형질전환 여부는 형질전환 담배의 게놈 DNA를 추출한 후 bar 유전자(제초제 저항성 유전자) 특이 프라이머를 이용하여 PCR(중합효소연쇄반응) 방법으로 확인하였다.

실시예 6: OsDRP유전자의 기능분석

프로모터의 기능분석을 위해 담배(Xanthi)에 Transient assay를 실시하였다. 프로모터를 절단하여 pBI 101 벡터에 크로닝하고, 포지티브 컨트롤로 35S 프로모터를 지닌 pBI121과 GUS 분석기로 비교하였다. OsDRP의 전체 프로모터를 함유한 2,471 bp(2F)와 앞부분에서부터 일부가 절단된 1,381 bp(3F), 981 bp(4F), 525 bp(5F)크기의 프로모터를 각각 클로닝하여 4개의 클론을 제작하였다. 각 딜리션된 프로모터를 식물 형질전환용 바이너리 벡터인 pBI 101에 크로닝한 후 아그로박테리움 EHA105균에 형질전환하였다. 프로모터가 도입된 아그로박테리움균을 YEP 액체배지에 배양한 후 주입(infiltration) 배지(0.1X MS염, 0.1X 비타민B5, 1%(w/v)글루코스, 2 %(w/v)수크로즈, 20mM MOPS pH5.4, 200ㅅM 아세토시린곤)에 OD₆₀₀에서 0.8로 현탁하였다. 아그로박테리움 현탁액을 주사바늘이 없는 주사기로 담배잎에 주입시켰다. 24℃에서 16시간동안 광조건에서 2일간 습실처리 후 병원균(Pseudomonas syringae pv. tabacci), Mock(10mM MgCl₂)를 처리하고 6시간 후 시료를 채취하여 Gus 분석을 실시하였다.

약 2.5 kb의 프로모터(-2471)는 병원균에 의해 발현 증폭되지 못하나 1381bp 프로모터는 병원균에 의해 발현이 증폭됨을 확인하였다. 1000부터 1500bp 부위에 존재하는 WRKY box, W box, MYB box 부위가 제외된 더 작아진 프로모터(981과 525)는 병원균에 의해 발현이 증폭되지 않았으므로 OsDRP의 프로모터는 1381bp가 병원균에 의해 발현이 증폭되는 조절부위로 확인되었다.

본 발명의 OsDRP 유전자는 벼 유래의 병저항성관련 유전자로서, 벼에 병원균이나 병방어 유도물질 처리시 발현이 증폭되기 때문에, 이 OsDRP 유전자를 식물에 도입하여 발현시키면 병저항성 작물 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 벼 유래의 병저항성 OsDRP(Oryza sativa Disease Resistance Protein) 유전자.
제1항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
제2항의 발현벡터로 형질전환된 수탁번호 KACC 95036인 LBA4404:pB7WG2D-OsDRP 아그로박테리움 형질전환체.
제3항의 아그로박테리움 형질전환체로 형질전환된 식물세포 형질전환체.
다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 OsDRP(Oryza sativa Disease Resistance Protein) 유전자로 형질전환된 형질전환체의 제조방법:

1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 벼 유래의 OsDRP DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 식물세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 OsDRP(Oryza sativa Disease Resistance Protein) 유전자로 형질전환된 형질전환체의 제조방법:

1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 벼 유래의 병저항성 OsDRP DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 아그로박테리움에 상기 발현벡터를 도입하는 단계;

3) 식물세포에 상기 아그로박테리움을 도입하는 단계; 및

4) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.