KR101365927B1 - 프로모터를 이용한 친환경 바이오소재 모니터링 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터 및 이를 이용한 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 스트레스 저항성 반응 시 발현되는 유전자의 프로모터를 이용하여 스트레스 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물의 생장 촉진 시 발현되는 유전자의 프로모터를 이용하여 식물 생장 촉진물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

프로모터를 이용한 친환경 바이오소재 모니터링 시스템 및 이의 용도{Environment-friendly biomaterial monitoring system using promoter and uses thereof}
본 발명은 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터 및 이를 이용한 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 스트레스 저항성 반응 시 발현되는 유전자의 프로모터를 이용하여 스트레스 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물의 생장 촉진 시 발현되는 유전자의 프로모터를 이용하여 식물 생장 촉진물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
식물이 한 세대를 마치는 동안 필요한 모든 유전자들은 프로모터에 의해 조절된다. 진핵생물에서의 프로모터는 전사를 조절할 대상이 되는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA 염기서열 앞 부분에 위치하며 전사인자들이 결합하는 모든 DNA 염기서열 부위를 지칭하기도 한다.
기존의 유기 합성농약을 이용한 병 방제는 강한 독성과 함께 환경오염을 야기시키는 문제점이 있으며, 이에 대한 해결책으로 바이오 생물농약이 개발되고 있다. 그 중에서 유도저항성을 이용한 생물학적 방제는 식물체 자체의 방어 시스템을 이용하여, 식물 병을 방제할 수 있는 기술로서 식물체에 저항성이 유도되면 곰팡이, 세균, 바이러스 등 여러 가지 병해에 대한 복합적인 방제가 가능하다. 따라서, 유기 합성농약의 과다 사용으로 인한 제반 문제점을 안고 있는 현 농업 생태계의 개선뿐 아니라 농업 생산성 증진의 효과도 기대할 수 있다. 그러나, 이들의 처리와 효능의 검증이 어렵기 때문에 이를 진단할 수 있는 모니터링 시스템의 개발이 필요한 실정이다.
기존의 유기 합성농약을 이용한 병 방제는 강한 독성과 함께 환경오염을 야기 시키는 문제점이 있어, 이에 대한 해결책으로 바이오 생물농약의 개발이 필요하다. 유도저항성을 이용한 생물학적 방제는 식물체 자체의 방어 시스템을 이용한 것으로, 식물체에 저항성이 유도되면 곰팡이, 세균, 바이러스 등 여러 가지 병해에 대한 복합적인 방제가 가능하므로, 유도저항성을 이용한 생물학적 방제 물질의 처리 및 효능 검증을 위한 진단 시스템을 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물의 병 저항성 반응 시 특이적으로 발현이 증가하는 유전자의 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물을 이용한 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물을 이용한 식물 저항성 유도물질의 상대적 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물 저항성 유도물질 검출용 키트 및 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 특정 스트레스 저항성 반응 시 발현되는 유전자의 프로모터를 이용하여 스트레스 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 식물의 생장 촉진 시 발현되는 유전자의 프로모터를 이용하여 식물 생장 촉진물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법을 이용하면 다양한 외부 자극에 대한 식물체의 저항성 반응을 증진시키기 위하여 개발된 물질에 대한 식물의 반응을 진단-모니터링할 수 있다. 또한, 다양한 스트레스뿐만 아니라 생장 조건에서 발현되는 유전자를 선발하여 본 발명의 시스템에 적용 시, 식물의 생장에 영향을 주는 물질에 대한 진단-모니터링 시스템으로 이용할 수 있다.
본 발명의 방법의 활용은 바이오 생물농약 중에서 식물의 자체 병 저항성을 유도하여 다양한 병원균에 대한 저항성을 부여하는 작물보호제의 산업화를 위한 객관성 있는 효과검정 자료 및 품질관리 시스템을 제공함으로써 친환경 생물농약의 활용 증대 및 규격화로 이끌 수 있다.
도 1은 PIG 유전자의 발현패턴을 고추의 조직별로 병 저항성 반응에서 확인 한 결과를 보여준다. 고추의 각 조직에서 추출한 RNA와 Xag 8ra를 접종한 조직의 잎에서 추출한 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하고 각 PIG의 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다 (Buf: 버퍼; Immature: 미성숙 과실; Mature green: 성숙한 녹색 과실; Breaker: 라이코펜이 축적되기 시작한 과실; Mature red ripe: 성숙한 붉은과실).
도 2는 세균성 비병원균에 대한 PIG 발현을 확인한 결과를 보여준다. (a)는 고추에서 분리한 각 PIG 프로모터에 GUS 보고자를 융합시킨 구축물을 아그로박테리움을 이용하여 담배에 넣어 일시적 발현이 되도록 한 것으로, 24시간 후에 담배에 과민성 세포사멸(HR) 반응을 유도하는 슈도모나스 시린개 pv. 시린개(Pseudomonas syringae pv. syringae ) 61 [Pss 61 (HR+)] 세균성 비병원균을 접종하고 34시간 뒤에 PIG의 반응을 확인한 결과이다. HR이 유도되지 않도록 hrp h- 유전자를 돌연변이시킨 Pss 61 (HR-)을 대조구로 사용하였다. (b)는 PIG 프로모터 형질전환 애기장대의 로제트 잎에 HR 반응을 유도하는 슈도모나스 시린개 pv. 토마토(Pseudomonas syringae pv . tomato ) DC3000 avrRpm1 (P. s. DC3000 avrRpm1) 세균성 병원균을 OD600 = 0.1로 접종하고 12시간 후에 GUS 염색법을 이용하여 PIG의 발현을 확인한 것이다. 10 mM MgCl2 (Mock)를 병원균에 대한 대조구로 사용하였다.
도 3은 PIG 프로모터 형질전환체를 이용하여 식물의 병 저항성 반응을 진단한 결과를 보여준다. (a)는 PIG 프로모터 형질전환체의 호르몬에 대한 반응을 알아보기 위하여 형질전환 애기장대가 있는 24 웰 플에이트에 1 mM SA, 100 μM MeJA, 100 μM ET, 50 μM ABA를 1 ㎖ 씩 처리하고 12시간 상온에서 반응시킨 후, GUS 염색법으로 PIG의 발현을 확인한 것이다. 대조구로 증류수(DW)를 처리하였다. (b)는 각 미생물 소재 처리에 따른 PIG 프로모터 형질전환체의 반응을 GUS 발현으로 확인한 결과이다. 과정은 오른쪽 모식도와 같으며 미생물 소재는 24시간 동안 처리하였다. 무처리구는 미생물 소재 현탁에 사용한 증류수를 처리한 것이며, GUS 발현의 양성 대조구로 35S 프로모터 형질전환체를, 음성 대조구로 애기장대 Col-0 생태형을 사용하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터를 제공한다.
"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. 본 발명에 따른 프로모터는 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터이며, 예를 들면 PIG(Pathogen Induced Gene) 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 PIG1 프로모터(서열번호 1), PIG5 프로모터(서열번호 2), PIG6 프로모터(서열번호 3), PIG14 프로모터(서열번호 4) 또는 PIG15 프로모터(서열번호 5)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 5의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1 내지 5의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 식물 발현 벡터에서, 보고자 유전자는 프로모터에 의해 발현되어 유전자의 발현을 용이하게 검출 가능하게 하는 유전자로서, 예를 들면 GUS 유전자, GFP 유전자, 루시퍼라아제 유전자, YFP(yellow flourescent protein) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 따라서, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주세포, 식물 및 이의 종자를 제공한다. 본 발명의 형질전환 식물은 식물 전체, 식물조직 또는 식물세포일 수 있으며, 상기 식물 조직 및 식물세포로부터 재생된 식물도 이에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 식물은 벼, 보리, 옥수수, 밀, 호밀, 귀리, 잔디, 마초, 기장, 사탕수수, 라이그래스, 오차드그래스 등의 단자엽식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 바람직하게는 애기장대이다. 본 발명의 종자는, 형질전환 식물로부터 종자를 채취함으로써 얻을 수 있으며, 본 발명의 형질전환 식물에 포함된다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 식물 전체, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대이다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 형질전환 식물에 식물 저항성 유도 후보 물질을 처리하는 단계; 및
상기 후보 물질이 처리된 식물에서 보고자 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
구체적으로는, 식물의 종자를 소독하고, 3~5일간 저온처리를 한 후, 4~6일간 배양한 본 발명의 형질전환 식물에 식물 저항성 유도 후보 물질을 6~24시간 처리하는 단계; 및
상기 후보 물질이 처리된 식물에서 1~2일 동안 보고자 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법일 수 있다. 상기 유전자 발현의 확인은 스크리닝을 간편하고 신속하게 수행하기 위해 웰 플레이트(well plate)에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 웰 플레이트는 6웰, 12웰, 24웰트, 48웰, 96웰, 386웰, 960웰 플레이트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 형질전환 식물에 식물 저항성 유도 후보 물질을 처리하는 단계;
상기 후보 물질이 처리된 식물에서 보고자 유전자의 발현 양을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 유전자의 발현 양과 기준 물질이 처리된 식물의 보고자 유전자의 발현 양을 비교하는 단계를 포함하는 식물 저항성 유도물질의 상대적 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 기준 물질은 기존에 알려진 식물 저항성 유도물질로서, 예를 들면 BTH(benzothiadiazole), 식물 저항성 유도 미생물 균주 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 식물 저항성 유도물질 후보군으로 가능한 모든 물질을 사용하여 스크리닝할 수 있고, 합성화합물, 천연물을 포함한 순수화합물, 식물추출물 및 미생물 배양액을 포함하는 추출물 또는 분획으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다. 형질전환 식물에 식물 저항성 유도물질 후보군의 처리는 각각의 다른 물질을 동시에 처리할 수도 있고, 하나의 물질을 각각 다른 농도로 처리할 수도 있으며, 각각의 다른 물질을 여러 가지 농도로 동시에 처리할 수도 있다. 이는 하나의 웰 플레이트 내에서 단 한 번의 스크리닝을 통하여 여러 가지 물질 및 여러 가지 농도로 스트레스 저항성 유도물질 후보군이 식물에 미치는 영향을 측정함으로써, 개별적으로 스크리닝하거나 각각의 실험에서 생길 수 있는 오차를 없앨 수 있어 정확한 스크리닝이 가능하다. 가능한 식물 저항성 유도물질 후보로는 살리실산, 자스몬산, 에틸렌 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 식물 발현 벡터를 포함하는 식물 저항성 유도물질 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 웰 플레이트(well plate)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 보고자의 검출용 기질을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 웰 플레이트는 일반적으로 세포의 배양에 사용되는 모든 웰 플레이트를 사용할 수 있고, 24 웰 플레이트, 96 웰 플레이트, 386 웰 플레이트, 960 웰 플레이트 및 9600 웰 플레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 소독한 종자를 웰 플레이트를 사용하여 웰 당 1 ㎖의 저항성 유도물질을 첨가한 배양규모에서 종자를 효율적으로 배양할 수 있었다.
본 발명은 또한, 본 발명의 식물 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물 저항성 유도물질 검출용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 발명의 식물 발현 벡터를 단독으로 포함할 수도 있으며, 허용가능한 담체를 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한, 특정 스트레스 저항성 반응 시 발현되는 유전자를 선발하는 단계;
상기 선발된 유전자의 프로모터를 수득하는 단계;
상기 수득한 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터를 제작하는 단계;
상기 제작된 벡터로 식물을 형질전환하는 단계;
상기 형질전환 식물에 스트레스 저항성 유도 후보 물질을 처리하는 단계; 및
상기 후보 물질이 처리된 식물에서 보고자 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 스트레스 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 스트레스 저항성 유도물질 후보군으로 가능한 모든 물질을 사용하여 스크리닝할 수 있고, 합성화합물, 천연물을 포함한 순수화합물, 식물추출물 및 미생물 배양액을 포함하는 추출물 또는 분획으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다. 형질전환 식물에 스트레스 저항성 유도물질 후보군의 처리는 각각의 다른 물질을 동시에 처리할 수도 있고, 하나의 물질을 각각 다른 농도로 처리할 수도 있으며, 각각의 다른 물질을 여러 가지 농도로 동시에 처리할 수도 있다. 이는 하나의 웰 플레이트 내에서 단 한 번의 스크리닝을 통하여 여러 가지 물질 및 여러 가지 농도로 스트레스 저항성 유도물질 후보군이 식물에 미치는 영향을 측정함으로써, 개별적으로 스크리닝하거나 각각의 실험에서 생길 수 있는 오차를 없앨 수 있어 정확한 스크리닝이 가능하다. 가능한 스트레스 저항성 유도물질 후보로는 엡시스산을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 식물의 생장 촉진 시 발현되는 유전자를 선발하는 단계;
상기 선발된 유전자의 프로모터를 수득하는 단계;
상기 수득한 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터를 제작하는 단계;
상기 제작된 벡터로 식물을 형질전환하는 단계;
상기 형질전환 식물에 식물 생장 촉진 후보 물질을 처리하는 단계; 및
상기 후보 물질이 처리된 식물에서 보고자 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물 생장 촉진물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 보고자 유전자(reporter gene)는 바람직하게는 GUS(β-glucuronidase) 유전자 또는 GFP(green fluorescent protein) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 식물 생장 촉진물질 후보군으로 가능한 모든 물질을 사용하여 스크리닝할 수 있고, 합성화합물, 천연물을 포함한 순수화합물, 식물추출물 및 미생물 배양액을 포함하는 추출물 또는 분획으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다. 형질전환 식물에 식물 생장 촉진물질 후보군의 처리는 각각의 다른 물질을 동시에 처리할 수도 있고, 하나의 물질을 각각 다른 농도로 처리할 수도 있으며, 각각의 다른 물질을 여러 가지 농도로 동시에 처리할 수도 있다. 이는 하나의 웰 플레이트 내에서 단 한 번의 스크리닝을 통하여 여러 가지 물질 및 여러 가지 농도로 식물 생장 촉진물질 후보군이 식물생장촉진에 미치는 영향을 측정함으로써, 개별적으로 스크리닝하거나 각각의 실험에서 생길 수 있는 오차를 없앨 수 있어 정확한 스크리닝이 가능하다. 가능한 식물 생장 촉진물질 후보는 옥신, 지베렐린 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다,
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1. 비병원성균 에 대한 방어반응에서 PIG 유전자들의 특이적 발현 증가>
선발된 PIG 유전자들을 고추 조직별 또는 비기주 저항성 반응에서의 발현을 알아보기 위하여 고추 식물체를 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 열매 (미성숙, 성숙)로 나누어 분리한 RNA와 고추에 비병원성 균인 콩불마름병을 일으키는 세균성 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines 8ra, Xag 8ra)을 처리한 고추 식물체로부터 분리한 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후 각 PIG들의 특이 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 모든 PIG들이 콩불마름병을 일으키는 세균성 병원균이 접종된 고추에서 발현이 증가하였다 (도 1). 이것으로 PIG들이 비병원성 균에 대한 저항성 반응에서 특이적으로 발현이 증가한다는 것을 알 수 있다.
조직 특이적인 발현에서는 PIG1은 꽃에서 약하게 발현이 되고, PIG6는 잎과 뿌리에서 발현이 확인되었다 (도 1). 하지만 다른 PIG들은 어떤 조직에서도 특이적인 발현이 확인되지 않아 선발된 PIG들이 조직의 발달이나 생장 단계보다는 식물의 저항성 반응에서 특이적으로 발현되는 유전자임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 2. PIG 유전자들의 프로모터 분리 및 GUS 발현용 형질전환 벡터 제작 >
병 저항성 반응 시 특이적으로 발현이 증가하는 PIG 유전자들의 프로모터 부분을 분리하고 병 저항성 반응에서의 반응을 확인하기 위하여 5'-말단의 상부 서열을 Genome walker kit을 이용하여 확보하였다. 실험 방법은 고추의 게놈 DNA를 제한효소로 자르고 genome walker 어댑터를 붙인 다음, PIG의 특이 프라이머를 이용하여 얻은 PCR 산물을 TOPO 벡터에 서브클로닝하고 염기서열을 확인하였다 .
확보한 프로모터 부분을 프로모터의 특이 프라이머와 게이트웨이 클로닝 시스템을 이용하여 GUS와 GFP 보고자 유전자가 있는 pkGWFS7 벡터에 도입하여 각 PIG 프로모터의 병 저항성 특이 발현을 확인할 수 있는 벡터를 제작하였다.
< 실시예 3. GUS 발현 형질전환 식물체 개발>
실시예 2에서 제작한 GUS와 GFP 보고자 유전자가 포함된 식물 발현 벡터(pkGWFS7::GUS::GFP)에 각 PIG 프로모터를 융합시켜서 만든 구축물을 아그로박테리움을 이용하여 애기장대를 형질전환시켰다. 형질전환 식물체에서 받은 종자를 50 mg/L 카나마이신을 첨가한 1/2 MS 배지 (1% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.8% agar, pH 5.7)에서 발아시켜, 각 구축물별로 5개 이상의 형질전환 식물체(T1 세대)를 선발하였다.
< 실시예 4. PIG 프로모터와 보고자 유전자 융합 구축물의 특이적 반응>
PIG 프로모터와 보고자를 융합시킨 구축물이 병 저항성 반응에서 특이적으로 반응하는지를 확인하기 위하여 PIG 구축물을 아그로박테리움을 이용하여 담배 잎에서 일시적으로 발현이 되도록 유도하였다.
24시간 후, 담배에 과민성 세포사멸 (hypersensitive response; HR) 반응을 유도하는 세균성 병원균 슈도모나스 시린개 pv. 시린개(P. syringae pv. syringae) 61 [Pss61 HR(+)])과 대조구로 hrp h - 유전자를 돌연변이시켜 HR이 유도되지 않는 슈도모나스 시린개 pv. 시린개 61 hrp h - [Pss61 HR(-)]을 10mM MgCl2에 현탁하여 농도 OD600 = 0.1로 처리하고 34시간 뒤에 GUS 염색법을 이용하여 반응을 확인하였다. 그 결과, 모든 PIG 구축물들이 저항성 반응에서 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다 (도 2a).
실시예 3에서 만든 PIG 프로모터 형질전환 애기장대를 이용하여 병 저항성 반응을 GUS 염색법으로 관찰하였다. 형질전환 애기장대는 저항성 유전자(RPM1)를 갖고 있어 이에 상응하는 비병원성 유전자 (avrRpm1)를 갖고 있는 슈도모나스 시린개 pv. 토마토 DC3000 avrRpm1 (P. s. DC3000 avrRpm1)을 접종하게 되면 저항성 반응이 유도된다. P. s. DC3000 (avrRpm1)을 King's B 배지(50 mg/L 리팜피신, 25 mg/L 카나마이신)에 접종 후, 28℃, 200 rpm으로 14~16시간 배양하고 세포를 모아 10 mM MgCl2에 재현탁하여 OD600을 0.1로 맞추어 로제트 잎에 접종하였으며, 병원균 처리에 대한 대조구로 10 mM MgCl2 (Mock)를 함께 처리하였다.
본 실험의 결과 PIG1, 14, 15 프로모터 형질전환 애기장대에서 저항성 유전자에 의해 유도되는 저항성 반응 조건에서 GUS 발현이 강하게 관찰되었으며 PIG5, 6 프로모터 형질전환 애기장대에서는 엽맥에서만 약하게 GUS 발현이 관찰되었다. 이것으로 PIG 프로모터가 식물의 저항성 기작에서 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다 (도 2b).
< 실시예 5. PIG 형질전환체를 이용한 식물의 병 저항성 반응 진단시스템 구축>
다양한 외부 자극에 대한 식물체의 저항성 반응을 증진시키기 위하여 개발된 물질을 PIG 프로모터 형질전환체를 이용하여 액체배양으로 단기간에 유의성 있게 진단-모니터링 할 수 있는 시스템을 구축하기 위하여 식물의 저항성 반응에 중요한 역할을 하는 호르몬과 미생물 농약 후보 물질을 처리하고 각 PIG 프로모터 형질전환체의 반응을 관찰하였다.
실험방법은 각 PIG 프로모터의 형질전환체로부터 확보한 종자를 소독 (70% 에탄올, 12% 락스 사용)하고 4℃에서 4일 동안 저온처리 후, 항생제를 첨가하지 않은 1 ㎖의 1/2 MS 배지가 들어있는 24 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 넣고 배양실 (23℃, 광조건 16/암조건 8시간)에서 5일 동안 진탕(shaking) 배양하였다.
식물의 방어반응과 관련된 호르몬 [1 mM Salicylic acid (SA), 100 μM Methyl Jasmonic acid (MeJA), 100 μM Ethephon (ET; Ethylene releasing agent), 50 μM Abscisic acid (ABA)]에 대한 반응을 알아보기 위하여 플레이트의 배양액을 제거 후, 증류수로 각 형질전환체에 묻어있는 배양액을 씻어주고, 각 식물 호르몬을 서로 다른 24 웰 플레이트에 1 ㎖씩 넣어주고 23℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 호르몬 처리 시 음성 대조구는 증류수를 사용하였으며, 각 호르몬에 대한 반응을 GUS 염색법으로 관찰한 결과, PIG1 프로모터 형질전환체는 MeJA, PIG5 프로모터 형질전환체는 ET과 SA, PIG14 프로모터 형질전환체는 MeJA와 SA, PIG15 프로모터 형질전환체는 ET와 SA에 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다 (도 3a).
미생물 농약 후보 물질을 처리하기 위한 형질전환체의 준비는 호르몬 처리를 위한 준비과정과 동일하며 미생물 소재 처리방법은 배양 원액(약 108-9)을 1/100 희석하여 준비한 것을 1㎖씩 넣어주고 24시간 상온에서 진탕 배양하였다. 처리한 미생물 소재에 대한 반응을 확인하기 위하여 GUS 염색을 수행한 결과 미생물 소재 #1을 처리한 플레이트에서는 대조구(증류수)에 비하여 PIG5, PIG14, PIG15 프로모터 형질전환체에서 특이적인 GUS 발현을 확인할 수 있었다 (도 3b).
PIG 프로모터 형질전환체는 식물의 병 저항성과 관련된 호르몬뿐만 아니라 식물의 병 저항성을 증진시키기 위해 선발한 미생물 농약 후보 물질에 대해서도 특이적인 반응을 하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, 이 시스템을 이용하면 다양한 외부 자극에 대한 식물체의 저항성 반응을 증진시키기 위하여 개발된 물질에 대한 식물의 반응을 진단-모니터링할 수 있을 것이다.
본 진단 시스템의 개발은 PIG 프로모터 형질전환체를 이용하는 것으로만 국한되는 것이 아니라, 다양한 스트레스뿐만 아니라 식물의 생장 조건에서 발현되는 유전자를 선발하고 본 시스템에 적용하면 병 저항성과 더불어 식물의 생장에 영향을 주는 물질에 대한 진단-모니터링 시스템으로도 이용할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물에 식물 저항성 유도 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보 물질이 처리된 식물에서 보고자 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법.
  2. 삭제
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  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    식물의 종자를 소독하고, 3~5일간 저온처리를 한 후, 4~6일간 배양한 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물에 식물 저항성 유도 후보 물질을 6~24시간 처리하는 단계; 및
    상기 후보 물질이 처리된 식물에서 1~2일 동안 보고자 유전자의 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물 저항성 유도물질을 스크리닝하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유전자 발현의 확인은 웰 플레이트(well plate)에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물에 식물 저항성 유도 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보 물질이 처리된 식물에서 보고자 유전자의 발현 양을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 유전자의 발현 양과 기준 물질이 처리된 식물의 보고자 유전자의 발현 양을 비교하는 단계를 포함하는 식물 저항성 유도물질의 상대적 활성을 측정하는 방법.
  11. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터를 포함하는 식물 저항성 유도물질 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 웰 플레이트(well plate)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물 병 저항성 특이 발현 프로모터 및 보고자 유전자(reporter gene)를 포함하는 식물 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 식물 저항성 유도물질 검출용 조성물.
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  15. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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이연 등. 제2차 KRIBB Poster Festival. 2008.11.12. 접수번호 C-7. In silico screening and promoter analysis of pathogen-induced genes in pepper. *

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