KR101126520B1 - 식물의 병 저항성과 생장에 관련된 담배 유전자 ＮｂＬｙｔＢ - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 병 저항성 또는 생장에 관련된 담배 유래의 NbLytB 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 식물체에 형질전환하여 NbLytB 유전자를 침묵시켜 식물의 세포 사멸과 활성산소 발생을 억제하는 방법 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어, 세포 사멸과 활성산소 발생이 억제된 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

담배, NbLytB, nonmevalonate 경로, VIGS, 세포사멸, 병 저항성

Description

식물의 병 저항성과 생장에 관련된 담배 유전자 ＮｂＬｙｔＢ{Tobacco NbLytB gene involved in disease resistance and growth of plant development}

본 발명은 식물의 병 저항성과 생장에 중요한 역할을 하는 담배유전자 NbLytB에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물의 병 저항성 또는 생장에 관련된 담배 유래의 NbLytB 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 식물체에 형질전환하여 NbLytB 유전자를 침묵시켜 식물의 세포 사멸과 활성산소 발생을 억제하는 방법 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어, 세포 사멸과 활성산소 발생이 억제된 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

전 세계적으로 담배, 고추, 감자, 토마토 등 많은 가지과 식물들이 재배되어 왔다. 우리나라에서도 오래전부터 가지과 작물을 재배하였으며 식생활에서 많은 비중을 차지하고 있다. 작물은 넓은 면적에 단일 품종을 경작하고 동일한 품종을 연작하는 특성으로 생물적 요인에 의한 피해를 많이 받게 된다. 그러므로 안정적으로 식량을 공급하기 위해서는 식물의 병 방제는 매우 중요한 문제이다.

지금까지는 이러한 식물 병들을 방제하기 위해 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어져 왔다. 하지만 그 독성으로 인하여 병원체뿐만 아니라 주변 다른 생물에게도 해를 끼쳐 자연 생태계의 파괴를 일으키는 폐해를 가져왔다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 식물이 처해 있는 환경 및 생태조건을 고려하여 물리적/생물학적 방제수단을 적절히 혼용하여 농약의 사용을 줄이는 방향으로 식물병 방제법이 바뀌어 왔으며, 이와 더불어 앞으로는 분자생물학적 방법 및 육종법 등을 이용하여 병에 대해 저항성을 가지고 있는 품종의 도입 및 개량 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법을 찾는 것이 좋다고 할 수 있다.

일단 식물이 병원균에 의해 감염되면, 기주식물은 여러 가지 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 시작하는데, 이러한 방어기작에 의해 병원균 감염 초기에 기주식물과 식물병원균간의 반응이 친화적 반응(병이 일어남, 감수성)과 불친화적 반응(병이 나지 않음, 저항성)으로 나뉘어 결정되고, 이에 따라 병의 진전을 제한시킬 수 있는지의 여부가 결정되는 것이다.

불친화적 반응에서, 감염된 식물은 자체의 인식작용에 의해 병원균의 침입을 인지하고, 이에 대하여 감염부위의 세포에 국부적 세포 죽음과 같은 과민성 반응(hypersensitive reaction), 켈러스(callose)의 축적, 리그닌 (lignin)화에 의한 세포벽의 후벽화 같은 반응을 나타내며, 파이토알렉신(phytoalexin) 등 여러 종류의 항균성 물질을 생성하고, 소위 병원성 관련 단백질[pathogenesis related (PR) protein]이라 불려지는 방어 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 그리고 이러 한 방어반응은 식물세포의 여러 기관에서 서로 다른 정교하고 복잡한 경로에 의해 이루어진다.

식물의 가장 큰 특징 중 하나는 광합성을 통해 스스로 양분을 만들어 낼 수 있다는 것이다. 광합성은 잎의 엽록체에서 이루어지며, 양분의 생산뿐 아니라 병 저항성과의 관련성도 연구되어져 왔다. 광합성을 제대로 하지 못하는 식물은 생육뿐만 아니라 병원체에 대한 저항성이 정상적인 식물에 비해 많이 약해진다. 이는 정상적인 대사 활동을 하지 못함으로서 오는 이차적인 원인일 수도 있지만, 엽록체의 다양한 경로 중에서 병 저항성과 관련되는 부분이 제대로 일을 하지 못함으로써 오는 결과일 수도 있다.

이소프레노이드(isoprenoid)는 살아있는 유기체에서 발견되는 가장 큰 그룹을 이루고 있는 자연적 산물로 포유동물의 스테로이드(steroid) 호르몬, 세균의 유비퀴논(ubiquinone) 또는 메나퀴논(menaquinone), 사람에게는 의학적으로 중요한 비타민, 호르몬, Taxol 같은 항암성분을 만드는데 중요한 화합물로 알려져 있다. 식물에서는 카로티노이드와 엽록소를 만드는 물질로 알려져 있으며 이소프레노이드의 합성은 세포질에서 이루어지는 mevalonate(MVA)와 plastid에서 이루어지는 nonmevalonate, 이 두 개의 독립적인 경로에 의해 합성된다. 식물은 Nonmevalonate 경로를 통해 엽록소뿐만 아니라 다양한 호르몬, 그리고 세포질에서 필요로 하는 물질을 합성 공급하므로 이 경로에 관여하는 유전자의 기능을 연구하면 본 발명에서와 같이 식물의 병 저항성 및 생장을 촉진하는데 효과적일 수 있다.

한국특허등록 제0871591호에는 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 유전자가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0210514호에는 야생종 담배의 병발생관련단백질-1 및 글루칸 가수분해효소 유전자 및 이를 이용한 식물병 저항성 유도물질의 탐색방법이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 nonmevalonate 경로에 관여하는 유전자의 기능을 연구한 결과, 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 LytB 유전자인 NbLytB가 식물의 생장과 병 저항성에 중요한 역할을 한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물의 병 저항성 또는 생장에 관련된 담배 유래의 NbLytB 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 식물체에 형질전환하여 NbLytB 유전자를 침묵시켜 식물의 세포 사멸과 활성산소 발생을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어, 세포 사멸과 활성산소 발생이 억제된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 담배 유래 NbLytB는 nonmevalonate 경로에 관 여하는 유전자로서, 이 유전자를 VIGS 방법을 위한 벡터에 조합하여 식물체를 감염시킴으로써, NbLytB 유전자가 식물의 생장은 물론, 식물의 방어기작인 세포사멸과 병원균에 대한 저항성에 관련되어 있다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명을 통해 생장이 촉진되고 병 저항성이 강한 식물체를 얻음으로써, 경제 작물 등의 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 이용된 VIGS 방법은 식물의 생장, 병 저항성 및 환경 스트레스 등에 관여하는 새로운 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 병 저항성 또는 생장에 관련된 담배 유래의 NbLytB 단백질을 제공한다. NbLytB에서, Nb는 Nicotiana benthamiana를 의미하며, LytB는 IspH, 또는 HDR이라고도 하며, 1-히드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase)를 의미한다. 상기 NbLytB는 침묵시, Bax에 의해 유도되는 세포사멸과 활성산소 발생을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 NbLytB 단백질의 범위는 담배로부터 분리된 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 병 저항성 또는 생장을 나타내는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 NbLytB 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 NbLytB 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 서열이며, 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 서열이다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 NbLytB 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가 닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(아그로박테리움 tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 식물체에 형질전환하여 NbLytB 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물의 세포 사멸과 활성산소 발생을 억제하는 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테 리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어, 세포 사멸과 활성산소 발생이 억제된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 담배이다.

야생종 담배(Nicotiana benthamiana)에서 HRT/CP 또는 Bax에 의해 세포사멸이 유도되는 조건에서 발현이 달라지는 유전자 44개를 고추 cDNA microarray 분석방법을 이용하여 선발하였다. 이렇게 선발된 유전자의 세포사멸 및 병 저항성 관련 기능을 알아보기 위해 유전자 침묵(silencing)을 시킬 수 있는 virus-induced gene silencing (VIGS) 방법을 사용하였다. 그 결과, nonmevalonate 경로의 마지막 단계에 관여하는 유전자인 NbLytB가 세포사멸과 관련되어 있음을 확인할 수 있었다. NbLytB 유전자가 침묵된 식물은 생장이 위축되고 알비노 표현형(albino phenotype) 을 보였다. 그리고 Bax에 의해 유도되는 세포사멸이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. NbLytB 유전자가 침묵된 식물에서의 세포사멸이 활성산소(Reactive oxygen species)의 변화에 의한 결과인지를 확인해 보기 위해, 3,3'-diaminobenzidine (DAB)으로 과산화수소(hydrogen peroxide)를 검출해본 결과 NbLytB가 침묵된 식물의 잎에서 활성산소가 검출되지 않았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. NbLytB 유전자의 클로닝

야생종 담배(Nicotiana benthamiana)에서 HRT/CP 또는 Bax에 의해 세포사멸이 유도되는 조건에서 발현이 달라지는 유전자 44개를 고추 cDNA microarray 분석방법을 이용하여 선발하였다. 그 중에서 하나가 LytB 이다.

유전자 기능을 알아보기 위해 처음에는 고추 EST 클론을 분양받아 염기서열을 확인하고 VIGS용 벡터인 TRV2에 클로닝 하였다. 이렇게 확보한 구축물을 이용하여 담배에 VIGS를 수행하여 표현형을 관찰하고 세포사멸을 비교하였다. 이러한 과정에서 Bax에 의해 유도되는 세포사멸이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 실질적으로 담배의 LytB 유전자를 클로닝하여 VIGS를 수행하였을 때, 동일한 결과를 보이는가를 확인하기 위하여 담배의 LytB 유전자를 클로닝하게 되었다.

클로닝 방법은 NCBI 확인 결과, 담배(Nicotiana benthamiana)의 LytB 유전자 일부 염기서열이 등록되어 있어 이를 참고하여 프라이머를 제작하고 담배의 cDNA로 부터 PCR을 수행하여 증폭하였다. 그 결과, 담배의 LytB 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있었고 증폭된 산물을 T-vector에 클로닝하고 염기서열을 분석하여 담배 LytB 유전자의 일부 염기서열을 확보하였다. 확보한 염기서열에서 담배 LytB 유전자의 특이적인 프라이머를 양방향으로 제작하고 담배 LytB 유전자의 전체서열을 확보하기 위해 담배의 cDNA 라이브러리에서 PCR을 수행하였다. 그 결과, C-말단 쪽은 코딩 영역뿐만 아니라 3'UTR 영역까지 확보할 수 있었고 N-말단 쪽은 일부 코딩 영역만을 확보할 수 있었다. 이상의 결과로 담배 라이브러리에서는 5'쪽 서열이 전체적으로 완전하지 않다는 것을 확인하고 5'쪽 서열을 확보하기 위해, 5'RLM-RACE 방법(Ambion 사)을 이용하였다. 그 결과, 담배 LytB 5'쪽 모든 코딩 서열을 확보할 수 있었다.

담배에서 LytB 유전자를 확보한 결과 서열에서 조금 차이를 보이는 두 개가 존재하는 것을 확인할 수 있었다: NbLytB1.1(서열번호 1)과 NbLytB1.2(서열번호 3).

실시예 2. NbLytB 유전자의 침묵에 의한 식물의 표현형

NbLytB 유전자의 기능을 알아보기 위해 유전자를 침묵(Silencing) 시킬 수 있는 Virus Induced Gene Silencing (VIGS)를 수행하였다. Tobacco Rattle Virus로 만들어진 TRV2 벡터에 NbLytB의 일부 유전자를 클로닝(cloning)하고, 아그로박테리움(Agrobacterium) GV2260에 형질전환하여 VIGS용 구축물을 만들었다. 이렇게 만들어진 구축물을 TRV1 벡터가 들어있는 아그로박테리움과 같이 infiltration buffer (10 mM MgCl₂, 10 mM MES, 200uM Acetosyringone)에 1:1로 섞어서 본엽이 6장 나온 담배에 처리하였다. 본 실험을 할 때, NbLytB 유전자가 관여하는 신호전달 체계에서 아래쪽에 있는 NbPDS 유전자, 엽록체에 위치하고 있는 NbRbcS 유전자, 그리고 저항성 관련 유전자인 NbICS1과 NbPAL을 함께 침묵시켜 실험을 수행함에 있어 대조구로 사용하였다. 처리한 담배를 23℃ 배양실에서 키우면서 표현형을 관찰한 결과, NbLytB가 침묵된 담배의 잎이 하얗게 변화되고 생장이 위축되는 것을 관찰할 수 있었다(도 1A). 이러한 유전자 침묵의 결과로 NbLytB 유전자가 식물의 생장에 있어 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있다.

21일이 지난 후 잎에서 샘플을 채취하여 total RNA를 추출하여 RT-PCR 방법으로 NbLytB 유전자 산물이 실제로 침묵 되었는지를 확인하였다. NbLytB 유전자의 발현양을 5'-TAACGTGCGCACTCTCCTTC-3'(서열번호 5)와 5'-AAGCAATCTGAACTGCACGC-3'(서열번호 6) 프라이머를 사용하여 분석한 결과 유전자 침묵이 잘 이루어졌음을 확인하였다. 대조구로 사용한 유전자들의 발현을 분석하기 위해 사용한 프라이머 정보; NbPDS: 5'-CACGCCCAACTAAACCATTG-3'(서열번호 7)과 5'-AAGATTGCCCTCCAAGCATT-3'(서열번호 8), NbRbcS: 5'-AAAATGGATGGGTTCCTTGC-3'(서열번호 9)와 5'-ATTTCAAACAAGCTGCCCCT-3'(서열번호 10), NbICS1: 5'-GACCAAGCTGTTAAGCGTGC-3'(서열번호 11)과 5'-TTCAGTCTGGAGTCTCCCCC-3'(서열번호 12), NbPAL: 5'-CCAATTCTCCGAGCTTGTCA-3'(서열번호 13)과 5'-TCGTCAGCATAGGCGAAGAC-3'(서열번호 14). 분석에 사용한 cDNA의 양이 동일함을 확인 하기 위해 NbActin 프라이머 5'-TGGACTCTGGTGATGGTGTC-3'(서열번호 15)와 5'-CCTCCAATCCAAACACTGTA-3'(서열번호 16)을 사용하여 분석하였다(도 1B).

실시예 3. 담배에서 NbLytB 를 VIGS 후 Bax 에 대한 반응

도 2는 NbLytB 유전자가 Bax에 의해 유도되는 세포사멸에 있어 어떤 역할을 하는지 알아보기 위한 실험이다. 동물세포에서 apoptosis를 유도하는 Bax를 이용하여 유전자를 침묵시킨 담배에서 세포사멸을 비교하였다. 유전자 침묵은 실시예 2에서 설명한 방법과 동일하게 수행하였으며 유전자 침묵을 확인하였다. Bax를 pBTex 벡터에 클로닝한 후, 아그로박테리움 GV2260에 도입한 구축물을 28℃에서 16시간 배양하고 원심분리하여 세포를 모은 후 infiltration 버퍼에 다시 현탁하여 25℃에서 3시간을 배양하여 virulence를 유도한 후, 세포 농도를 O.D₆₀₀: 0.5로 맞추고 유전자 침묵을 시킨 담배 잎에 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 잎의 왼쪽에 처리하였다. 잎의 오른쪽에는 특정 유전자를 넣지 않은 pBTex 벡터가 들어있는 아그로박테리움을 대조구로 사용하기 위해 함께 처리하였다. Bax를 처리한 잎에서 NbLytB가 침묵된 식물체를 제외하고 46시간 후에 세포사멸 반응을 육안으로 관찰할 수 있었다. 50시간 뒤에는 확실한 세포사멸을 관찰할 수 있었으나, NbLytB가 침묵된 식물체에서는 72시간까지도 세포사멸이 관찰되지 않았다(도 2A). 세포사멸 반응을 육안으로 관찰할 수 없는 시간인 36시간에 세포수준에서의 차이를 알아보기 위해 트리판블루염색(Trypan blue staining)을 실시하였다. Bax를 처리한 잎에서 3반복으로 샘플링하여 트리판블루 용액에 넣고 용액이 잘 흡수될 수 있도록 5분간 진공(vacuum) 처리하고, 끓는 물에서 5분 동안 중탕으로 가열한 후 16시간 동안 염색 반응을 하였다. 트리판블루 용액을 버리고, 죽은 조직에 특이적으로 염색된 것을 제외한 염색약을 제거하기 위해 Chloral hydrate solution에 2일 동안 처리하였다. 현미경을 사용하여 염색한 잎 조직을 관찰한 결과, 육안으로 관찰한 것과 동일하게 NbLytB가 침묵된 식물체에서 세포사멸이 나타나지 않았다(도 2B).

세포사멸이 유도될 때 관찰되는 현상인 활성산소(Reactive Oxygen Species)의 발생을 알아보기 위해서, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 염색[세포 내 과산화수소(H₂O₂)를 관찰하는 방법]을 실시하였다. 잎을 도 2C에 표시된 시간 간격으로 샘플링하여 DAB 용액에 담그고 5분 동안 진공(vacuum)을 걸어서 용액이 잎 속으로 잘 흡수되도록 하였다. 그 뒤 8시간 동안 형광등 밑에서 배양한 후에 DAB 용액을 제거하고 알코올:락토페놀(2:1) 용액을 넣고 전자레인지를 이용하여 엽록소가 제거될 정도로 가열한 후, 용액을 제거하고 50% EtOH로 2~3회 씻어준다. DAB 염색법을 이용한 활성산소의 관찰에서도 다른 대조구와 달리 NbLytB 유전자 침묵이 일어난 잎에서는 활성산소 발생이 거의 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 2C).

NbLytB 유전자를 침묵시킨 담배 잎에서의 저항성 관련 유전자 발현을 알아보기 위해 Bax를 처리하고 도 2D에 표시된 시간별로 샘플링을 하여 RNA를 확보하였다. 확보된 RNA를 이용하여 RT-PCR 방법으로 저항성 관련 유전자의 발현을 비교해 보았다. 그 결과, NbLytB에서 산성 PR1 [5'-AATATCCCACTCTTGCC-3'(서열번호 17)과 5'-CCTGGAGGATCATAGTT-3'(서열번호 18)]과 PR2 [5'-ACCATCAGACCAAGATG-3'(서열번호 19)와 5'-TGGCTAAGAGTGGAAGGT-3'(서열번호 20)]의 발현이 감소하였고 염기성 PR2[5'-CAGCCCTGTCACTGGCACA-3'(서열번호 21)과 5'-CCCTACAGATGCCCCTCCTG-3'(서열번호 22)]와 PR5[5'-ATGAGAAAGACCCACGT-3'(서열번호 23)과 5'-ATGCCTTCTTTGCAGCAG-3'(서열번호 24)]의 발현은 차이가 없었다(도 2D). 따라서 NbLytB는 식물의 세포사멸과 그와 관련된 활성산소 및 유전자 발현에 있어서 중요한 역할을 하는 유전자임을 알 수 있다.

실시예 4. NbLytB 의 침묵은 감수성을 증가시킨다

식물의 기본저항성(Basal defense)과 NbLytB 유전자와의 관계를 알아보기 위해 담배에 NbLytB의 침묵을 유도하고 담배에 병을 일으키는 세균성 병원균 Peudomona syringae pv. tabaci (Pst)를 접종하여 병의 정도를 대조구와 비교해 보았다. Pst를 King's B 액체배지에 접종하여 28℃에서 16시간 동안 배양 후, 원심분리하여 세포를 다시 10mM MgCl₂에 현탁하였다. 접종농도는 OD₆₀₀= 0.0001로 맞추어 유전자를 침묵시킨 식물을 3주씩 사용하였으며 식물 한 주당 2장의 잎에 전체적으로 병원균을 처리하였다. Pst의 생장은 0, 2, 4, 6일째 처리한 잎에서 무작위적으로 3 반복 샘플링한 잎 조각을 10mM MgCl₂에 넣고 마쇄기로 곱게 갈고 여러 희석배수로 King's B 고체배지에 도말하였다. 이렇게 Pst의 생장을 측정한 결과 NbLytB 의 침묵을 유도한 식물체에서 대조구와 비교해 2~5배 정도 생장이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 3). 이상의 결과로부터 NbLytB가 병원성 세균에 대한 기본저항성(Basal defense)에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

실시예 5. NbLytB 의 침묵은 저항성 유전자에 의해 조절되는 병 저항성을 약화시킨다

저항성 유전자(R gene)에 의해 유도되는 반응에 있어서 NbLytB 유전자의 역할을 알아보기 위하여, N 유전자(Tobacco mosaic virus, TMV에 대한 저항성 유전자)가 포함된 형질전환 담배에 유전자 침묵을 유도하였다. 이때, TMV에 대한 저항성에 중요한 유전자로 밝혀진 NbSGT1을 병에 대한 양성대조구로 함께 침묵시켰다. 유전자 침묵을 유도한 식물에 TMV::GFP [TMV에 녹색형광단백질을 넣어준 형질전환 바이러스로 자외선(UV)으로 관찰하면 녹색의 형광을 관찰할 수 있어 간접적으로 바이러스의 증식을 확인할 수 있음]를 처리하여 상호관계를 확인하였다. 바이러스 접종은 TMV::GFP에 감염된 식물조직을 곱게 마쇄하여 연마제(식물잎 표면에 상처를 낼 수 있는 물질)와 함께 1x PBS 버퍼에 희석하여 면봉을 사용해 잎의 위쪽에 가벼운 상처가 날 정도로 문질렀다. 바이러스를 처리하고 N 유전자에 의해 유도되는 전형적인 세포사멸과 접종한 잎에서의 TMV 증식을 GFP 형광을 이용하여 확인한 결과, 세포사멸이 시작되기 전에는 약하게 형광이 관찰되었지만, 세포사멸이 일어나고 난 이후에는 벡터 대조구(:00), NbPDS , NbRbcS , NbICS1 , NbPAL를 침묵시킨 담배에서는 TMV의 형광이 관찰되지 않았다. 반면, NbSGT1에서는 형광이 강하게 관찰되었으며 NbLytB에서도 NbSGT1보다는 약한 형광이 관찰 되었다(도 4A). 트리판 블루염색법을 이용하여 접종 후 2일에 세포사멸을 관찰하였다. NbPAL은 벡터 대조구와 비슷한 경향성을 보였으며 NbSGT1 , NbPDS , NbRbcS , NbICS1 에서는 세포사멸이 크기가 벡터 대조구보다 크게 관찰되었고 NbLytB에서는 N 유전자에 의한 세포사멸이 거의 관찰되지 않았다(도 4B).

NbLytB 유전자 침묵과 N 유전자에 의한 세포사멸과 TMV::GFP 발현의 상관관계를 확인하기 위해, 노던 블럿(Northern blot)을 수행하여 TMV 증식을 확인하였다(도 4C). 노던 블럿으로 TMV::GFP의 증식을 확인하기 위해 TMV:GFP를 접종한 잎을 10일 후에 샘플링하여 전체 RNA를 추출하고 각 샘플간 동량의 RNA를 전기영동한 후, 핵산용 membrane으로 transfer하고 TMV의 movement protein (MP) 부위를 이용하여 프로브를 제작 [TMVmp: 5'-TGCTATAACCACCCAGGACG-3'(서열번호 25)와 5'-CGACAGTAGCCTCCGAATCA-3'(서열번호 26)]하고, 65℃에서 혼성화하여 TMV를 검출한 결과 NbLytB 유전자 침묵이 일어난 담배에서 TMV 증식이 많이 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 NbLytB 유전자 발현이 저항성 유전자에 의해 유도되는 방어 기작에 있어서 중요한 것으로 생각된다.

실시예 6. NbLytB 침묵에 의한 세포사멸을 억제제를 사용하여 확인

NbLytB 유전자 침묵에 따른 nonmevalonate 경로의 억제효과 이외의 다른 영향을 배제하기 위해서 nonmevalonate 경로의 억제제(inhibitor)인 fosmidomycin을 처리하여 세포사멸에 대한 반응을 관찰하기로 하였다. 이때, mevalonate 경로의 억 제제(Mevinolin)와 NbLytB의 유전자 침묵 표현형과 비슷한 NbPDS가 위치한 신호전달 체계를 억제할 수 있는 fluridon을 함께 처리하여 비교하였다. 그 결과 NbLytB 유전자가 위치한 신호전달 체계를 억제시키는 fosmidomycin을 처리한 잎에서만 특이적으로 Bax에 의한 세포사멸이 억제됨을 관찰할 수 있었다(도 5A).

이러한 세포사멸의 차이를 트리판블루 염색을 하여 세포수준에서 확인한 결과에서도 동일하게 fosmidomycin을 처리한 잎에서 세포사멸이 관찰되지 않았다(도 5A). 또한, Ion leakage 측정으로 세포사멸을 비교하였다. Ion leakage 측정은 그래프에 표시된 시간별로 잎 조각을 3 반복으로 채취하여 증류수에 담근 후, 빛 조건에서 12시간 배양하고 1시간 동안 진탕 후, 값을 측정하였다. 비교한 세포사멸의 결과에서도 동일한 결과를 확인할 수 있었다(도 5B). 이것으로 NbLytB 유전자가 세포사멸에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7. NbLytB 와 다양한 식물들의 LytB 의 단백질 서열비교

다른 식물에 존재하는 NbLytB의 homolog를 조사하고 그 homolog 들 사이의 유사정도를 알아보기 위하여 NCBI로부터 서열을 확보하였다. 방법은 NblytB 단백질 서열을 Query로 하여 단백질 데이터베이스로부터 유사한 서열을 찾도록 BlastP를 실행하였으며 그로부터 2개의 담배 종(Nicotiana langsdorffii, Nicotiana tabacum), 감자(Solanum tuberosum), 금잔화(Catharanthus roseus), 미나리 아재비과의 호황련(Picrorhiza kurrooa), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 벼(Oryza sativa), 옥수수(Zea mays)로부터 단백질 서열을 선별하였으며, 고추(Capsicum annuum)는 가지과 식물 데이터베이스(http://sol.pdrc.re.kr/)에서 서열을 확보하여 유사도를 조사하였다.

확보한 10개의 단백질 서열은 Dicotyledoneae 서열 7개와 Monocotyledonae 3개의 서열이 포함되어 있다. 이 10개의 단백질 서열을 N. benthamiana의 NblytB1.1 과 NblytB1.2의 서열과 함께 clustal W를 통해 multiple alignment를 수행하였다. 모두 12개의 단백질 서열 중 NbLytB와 가장 유사한 서열을 알아보기 위해 multiple alignment 결과물을 Mega4 프로그램으로 분석하였다. Mega4 프로그램은 균주 간 16sr RNA의 계통수를 나타낼 때 사용가능한 프로그램으로 상동성이 매우 높은 서열 내에서 보다 유사한 서열을 알아보기에 유용하다.

NblytB homolog의 계통수는 Bootstrap test의 Neighbor-joining method를 사용하였고 10000 replication 한 조건에서 작성하였다. 유사한 서열 간의 그룹은 가로선의 길이로 표시하며 가로선의 길이가 짧을수록 가까운 것을 나타낸다. 세로선은 10000번의 반복을 했을 때 같은 그룹으로 묶일 수 있는 빈도로 100에 가까울수록 같이 그룹화할 수 있는 의미를 갖는다.

그 결과 NbLytB는 가지과 식물과 가장 높은 유사성을 나타냈으며 외떡잎식물과는 어느 정도 차이를 보였다.

이것으로 추측할 수 있는 것은 식물 간 유사성이 매우 높고 중요한 신호전달 경로에 위치해 있는 유전자인 만큼 다른 식물에서도 그 기능이 매우 보존되어 있을 것이다. 따라서 이 특징을 이용한다면 작물의 생장 및 병 저항성에 유용하게 이용할 수 있을 것이라 생각된다.

도 1은 NbLytB 유전자가 담배의 생장과 표현형에 미치는 영향을 알아보기 위한 VIGS 결과이다. 유묘를 표시된 TRV 구축물을 갖는 아그로박테리움으로 접종하였다. 접종 2주 후, 사진을 촬영하였다. (A) 대조구 및 NbLytB-침묵된 식물 유래의 잎의 형태. (B) 대조구 및 NbLytB-침묵된 식물 유래의 잎으로부터 분리한 RNA를 이용한 RT-PCR 결과.

도 2는 NbLytB 유전자가 Bax에 의해 유도되는 세포사멸과 활성산소의 발생, 그리고 저항성 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다. (A) 표시된 침묵된 식물 유래의 잎을 Bax 및 GFP를 전달하는 아그로박테리움으로 침윤시켰다. 침윤 후 3일에 사진을 촬영하였다. (B) 락토페놀 트리판블루 염색에 의해 HR 세포사멸의 검출. 잎을 Bax를 전달하는 아그로박테리움으로 침윤 후 2일에 트리판블루로 염색하고, 괴사 식물 세포를 관찰하기 위해 광학현미경을 이용하였다. (C) 과산화수소 생산의 측정. 과산화수소 수준을 침묵된 식물의 잎에서 DAB 염색으로 관찰하였다. (D) 침묵된 N. benthamiana의 RT-PCR 분석을 이용한 방어 관련 유전자의 발현 양상.

도 3은 NbLytB 유전자가 병원성 세균에 대한 기본저항성에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 유전자 침묵된 TRV-00, TRV-NbPDS, TRV-NbLytB, TRV-RbcS, TRV-ICS1, 및 TRV-PAL 식물 유래의 잎을 P. s pv. tabaci (1x10⁵)를 이용하여 침윤시켰다. 세균수(식물 추출물 cm² 당 cfu로 나타냄)를 접종 후 6일 동안 측정하였다.

도 4는 NbLytB 유전자가 저항성 유전자에 의해 조절되는 병 저항성 반응에 미치는 영향을 확인한 결과이다. (A) N 유전자에 의해 매개되는 저항성 반응을 알아보기 위해 NbLytB 침묵된 식물을 TMV-GFP 바이러스로 감염시켰다. TMV-GFP 감염 후 10일에 정상 조건 및 UV 조사 조건하에 사진을 촬영하였다. (B) 락토페놀 트리판블루 염색에 의해 HR 세포 사멸의 검출. TMV-GFP 감염 후 2일에 잎을 염색하였다. (C) TMV의 MP 유전자 프로브를 이용한 유전자침묵된 N. benthamiana 의 감염된 잎에서 TMV RNA 축적의 노던 블롯 분석. TMV RNA 축적을 접종된 잎에서 감염 후 10일에 측정하였다.

도 5는 MVA(mevalonate)와 Non-MVA 경로의 억제제(inhibitor)를 처리하고 Bax에 의해 유도되는 세포사멸을 관찰한 그림이다. (A) MVA의 억제제인 mevinolin, non-MVA의 억제제인 fosmidomycin, NbPDS 유전자가 위치한 곳의 억제제인 fluridon을 처리하고 16시간 후에 Bax를 OD₆₀₀=0.5로 맞추고 처리한 결과이다. (상단) Bax 처리 후, 58시간에 일반 광원과 UV 광원에서 찍은 사진. (하단) Bax 처리 후, 36시간에 트리판블루 염색을 하여 세포사멸을 관찰하고 현미경으로 찍은 사진(x150). (B) Ion leakage 측정 방법을 이용하여 세포사멸을 비교한 그래프이다. 그래프에 표시된 시간대별로 샘플링하여 측정.

도 6은 NbLytB 단백질과, 담배 종(Nicotiana langsdorffii, Nicotiana tabacum), 감자(Solanum tuberosum), 고추(Capsicum annuum), 금잔화(Catharanthus roseus), 애기장대(Arabidopsis thaliana), 미나리 아재비과의 호황련(Picrorhiza kurrooa), 옥수수(Zea mays) 및 벼(Oryza sativa) 유래의 단백질의 아미노산 서열의 계통수 관계를 보여준다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Tobacco NbLytB gene involved in disease resistance and growth of plant development <130> PN09240 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1386 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 1 atggctatcc ctctccagtt ctctagtatc tccactcgta cagaactctc cttgccggag 60 actagaactt tccgactgcc gaagttctcc gtcgttagat gctccgccgg cgaagctgct 120 ccttcctcct cggctactgc ggattcagaa ttcgatgcta aggcttttcg gaagaacttg 180 accagaagtg ctaattacaa tcgtaaaggt tttggacata aagaagctac tcttgagcta 240 ttgaatcagg agtatcaatc tagtgatatc ataaagaaat tgaaggagaa tggatatgag 300 tacacttggg gaaatgttac cgtaaaactt gcagaggcct atggtttctg ttggggggtt 360 gagcgtgcag ttcagattgc ttatgaagcg aggaaacagt ttccaacaga gaggctttgg 420 ataaccaatg aaattattca caaccccact gtgaataaga gactcgagga gatggacgtt 480 aagaacatcc ctattgagga agggaagaaa aattttgatg ttgttgacaa ggatgatgtt 540 gtggttttgc ctgcttttgg ggctgctgtt gatgaaatgc ttgttttgag tgataaaaat 600 gtacaaatcg ttgatacaac ctgcccctgg 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Thr 420 425 430 Ser Gly Ala Ser Thr Pro Asp Lys Val Val Glu Asp Val Leu Ile Lys 435 440 445 Val Phe Asn Ile Lys Arg Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala 450 455 460 <210> 3 <211> 1386 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 3 atggctattc ctctccagtt ctctagtatc tccacccgta cagaactctc cttgccggag 60 actagaactt tccgattgcc gaagttctcc gtcgttagat gctctgccgg cgaagctgct 120 ccttcctcct cggctactgc ggattcagac ttcgatgcta aggtttttcg gaagaacttg 180 accagaagtg ctaattacaa tcgtaaaggt tttggacata aagaagctac tcttgagctg 240 ttgaatcagg agtatcaatc tagtgatatc ataaagaaat tgaaggagaa tggatatgag 300 tacacttggg gaaatgttac cgtaaaactt gcagaggcct atggtttctg ttggggggtt 360 gagcgtgcag ttcagattgc ttatgaagcg aggaaacagt ttccaacaga gaggctttgg 420 ataaccaatg aaattattca caaccccact gtgaataaga gactcgagga gatggaagtt 480 aagaacatcc ctattgagga agggaagaaa aattttgatg ttgttgacaa ggatgatgtt 540 gtggttttgc ctgcttttgg ggccgctgtt gatgaaatgc ttgttttgag tgataaaaac 600 gtacaaatcg ttgatacaac ctgcccctgg gtaacaaagg tctggaacac cgttgaaaag 660 cacaagaagg gagactatac ctccattatc catggtaaat attctcatga ggagactgta 720 gcgactgcat cctttgctgg gaaatacatc attgtgaaga acatggcaga ggcaacttat 780 gtctgtgatt atattcttgg aggtaaactt gacggttcta gctcaaccaa agaggcattt 840 atgcagaaat tcaaaaatgc agtttctaaa gggttcgatc cggatgttga tcttgtaaaa 900 actggtattg caaaccaaac tacaatgttg aagggagaaa cagaagaaat tgggaagttg 960 gttgagagga caatgatgca aagatatggg gtggaaaata ttaacaacca cttcataagt 1020 ttcaacacta tatgtgatgc aactcaagag cggcaagatg caatgtataa gctggttgat 1080 gaaaagcttg atcttatgtt agtggttggt ggttggaact caagcaacac ttcacatctt 1140 caggagattg cggaggagcg tggaattccc tcatattgga ttgacagtga gcagagaata 1200 ggtcctggaa acagaataag ttacaagttg ctgcatggtg agttggtcga gaaagagaac 1260 ttcttacccg agggtcctat tacagttggg gtgacatctg gtgcatccac ccccgataag 1320 gctgttgaag atgtccttat taaggtgttt aatatcaagc gggaagaagc cttacaattg 1380 gcctaa 1386 <210> 4 <211> 461 <212> PRT <213> Nicotiana benthamiana <400> 4 Met Ala Ile Pro Leu Gln Phe Ser Ser Ile Ser Thr Arg Thr Glu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Pro Glu Thr Arg Thr Phe Arg Leu Pro Lys Phe Ser Val Val 20 25 30 Arg Cys Ser Ala Gly Glu Ala Ala Pro Ser Ser Ser Ala Thr Ala Asp 35 40 45 Ser Asp Phe Asp Ala Lys Val Phe Arg Lys Asn Leu Thr Arg Ser Ala 50 55 60 Asn Tyr Asn Arg Lys Gly Phe Gly His Lys Glu Ala Thr Leu Glu Leu 65 70 75 80 Leu Asn Gln Glu Tyr Gln Ser Ser Asp Ile Ile Lys Lys Leu Lys Glu 85 90 95 Asn Gly Tyr Glu Tyr Thr Trp Gly Asn Val Thr Val Lys Leu Ala Glu 100 105 110 Ala Tyr Gly Phe Cys Trp Gly Val Glu Arg Ala Val Gln Ile Ala Tyr 115 120 125 Glu Ala Arg Lys Gln Phe Pro Thr Glu Arg Leu Trp Ile Thr Asn Glu 130 135 140 Ile Ile His Asn Pro Thr Val Asn Lys Arg Leu Glu Glu Met Glu Val 145 150 155 160 Lys Asn Ile Pro Ile Glu Glu Gly Lys Lys Asn Phe Asp Val Val Asp 165 170 175 Lys Asp Asp Val Val Val Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Val Asp Glu 180 185 190 Met Leu Val Leu Ser Asp Lys Asn Val Gln Ile Val Asp Thr Thr Cys 195 200 205 Pro Trp Val Thr Lys Val Trp Asn Thr Val Glu Lys His Lys Lys Gly 210 215 220 Asp Tyr Thr Ser Ile Ile His Gly Lys Tyr Ser His Glu Glu Thr Val 225 230 235 240 Ala Thr Ala Ser Phe Ala Gly Lys Tyr Ile Ile Val Lys Asn Met Ala 245 250 255 Glu Ala Thr Tyr Val Cys Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Lys Leu Asp Gly 260 265 270 Ser Ser Ser Thr Lys Glu Ala Phe Met Gln Lys Phe Lys Asn Ala Val 275 280 285 Ser Lys Gly Phe Asp Pro Asp Val Asp Leu Val Lys Thr Gly Ile Ala 290 295 300 Asn Gln Thr Thr Met Leu Lys Gly Glu Thr Glu Glu Ile Gly Lys Leu 305 310 315 320 Val Glu Arg Thr Met Met Gln Arg Tyr Gly Val Glu Asn Ile Asn Asn 325 330 335 His Phe Ile Ser Phe Asn Thr Ile Cys Asp Ala Thr Gln Glu Arg Gln 340 345 350 Asp Ala Met Tyr Lys Leu Val Asp Glu Lys Leu Asp Leu Met Leu Val 355 360 365 Val Gly Gly Trp Asn Ser Ser Asn Thr Ser His Leu Gln Glu Ile Ala 370 375 380 Glu Glu Arg Gly Ile Pro Ser Tyr Trp Ile Asp Ser Glu Gln Arg Ile 385 390 395 400 Gly Pro Gly Asn Arg Ile Ser Tyr Lys Leu Leu His Gly Glu Leu Val 405 410 415 Glu Lys Glu Asn Phe Leu Pro Glu Gly Pro Ile Thr Val Gly Val Thr 420 425 430 Ser Gly Ala Ser Thr Pro Asp Lys Ala Val Glu Asp Val Leu Ile Lys 435 440 445 Val Phe Asn Ile Lys Arg Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala 450 455 460 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 taacgtgcgc actctccttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aagcaatctg aactgcacgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbPDS primer <400> 7 cacgcccaac taaaccattg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbPDS primer <400> 8 aagattgccc tccaagcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbRbcS primer <400> 9 aaaatggatg ggttccttgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbRbcS primer <400> 10 atttcaaaca agctgcccct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbICS1 primer <400> 11 gaccaagctg ttaagcgtgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbICS1 primer <400> 12 ttcagtctgg agtctccccc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbPAL primer <400> 13 ccaattctcc gagcttgtca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbPAL primer <400> 14 tcgtcagcat aggcgaagac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbActin primer <400> 15 tggactctgg tgatggtgtc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NbActin primer <400> 16 cctccaatcc aaacactgta 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR1 primer <400> 17 aatatcccac tcttgcc 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PR1 primer <400> 18 cctggaggat catagtt 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acidic PR2 primer <400> 19 accatcagac caagatg 17 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acidic PR2 primer <400> 20 tggctaagag tggaaggt 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> basic PR2 primer <400> 21 cagccctgtc actggcaca 19 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> basic PR2 primer <400> 22 ccctacagat gcccctcctg 20 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> basic PR5 primer <400> 23 atgagaaaga cccacgt 17 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> basic PR5 primer <400> 24 atgccttctt tgcagcag 18 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMVmp probe <400> 25 tgctataacc acccaggacg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMVmp probe <400> 26 cgacagtagc ctccgaatca 20

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 병 저항성 또는 생장에 관련된 담배 유래의 NbLytB 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터를 식물체에 형질전환하여 NbLytB 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 식물의 세포 사멸과 활성산소 발생을 억제하는 방법.
8. 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 병 저항성 또는 생장에 관련된 담배 유래의 NbLytB 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터로 형질전환되어, 세포 사멸과 활성산소 발생이 억제된 식물체.
9. 제8항에 따른 식물체의 종자.

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