KR20050086077A

KR20050086077A - 신규한 폴리갈락투로나제 저해제 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20050086077A
Application number: KR1020040012408A
Authority: KR
Inventors: 김신제; 김군보; 김종기; 황병호
Original assignee: 주식회사 에프앤피
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2005-08-30
Also published as: WO2005080421A1

Abstract

본 발명은 신규한 폴리갈락투로나제 저해제 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 배추로부터 분리된 폴리갈락투로나제 저해제 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 폴리갈락투로나제 저해제 단백질은 세균 감염에 대한 식물의 방어 기작에 관여한다. 따라서 본 발명의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 병 저항성 형질전환 식물체를 제조하거나 식물체에 세균 감염에 대한 저항성을 부여하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 폴리갈락투로나제 저해제 단백질 및 이의 용도{Novel polygalacturonase inhibitor protein and its use}

본 발명은 식물의 방어 기작과 관계된 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 배추로부터 분리된 폴리갈락투로나제 저해제 단백질과 이의 용도에 관한 것이다.

유해한 해충 및 병원성 곰팡이, 세균 등과 같은 병원균에 의한 식물 병해는 농가에 막대한 경제적 손실을 끼칠 뿐 아니라 대부분의 식량을 재배 식물에 의존하고 있는 인류에게 있어 생존까지도 위협하고 있는 심각한 문제이다. 곰팡이에 의해 매개되는 식물 병해는 가장 종류가 다양하여 수백여 종이 넘으며, 식물의 잎과 과실에서 주로 발병한다. 대표적인 곰팡이 병해로는 탄저병, 균핵병, 잿빛 곰팡이병, 노균병, 돌림병(역병), 시들음병(위조병, 위황병)을 들 수 있다. 또한 세균에 의해 매개되는 식물 병해는 식물 전체나 과실에서 주로 발병하며, 대표적인 세균 병해로는 무름병, 풋마름병, 세균성 점무늬병, 검은썩음병 등이 있다. 이러한 병해들은 병원균에 따라 차이가 있으나 대부분 식물을 물러 썩게 만든다.

따라서 병원균으로부터 식물체를 보호하기 위하여 다양한 방제 방법이 사용되고 있다. 그 중에서 가장 쉽고 간편한 식물병 방제법은 농약을 살포하는 것인데, 이는 맹독성이므로 병원균 뿐만 아니라 기타 주변 생태계의 생물까지도 대량 살상하여 생태계를 파괴시키고 토양 및 수질을 오염시키는 등의 폐해가 있다. 그러므로 농약 살포 등의 화학적 방제수단보다는 식물이 처해 있는 환경 및 조건을 고려한 물리적, 생물학적 방제법 등을 개발하는 것이 필요하다. 이에 다양한 작물-병원균의 상호작용을 대상으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 진행되어져 왔다.

병원성 곰팡이 또는 세균이 식물에 침입한 경우, 식물에서는 평상시에 미량으로 존재하거나 발현되지 않는 단백질들이 특이적으로 증가되거나 나타난다. 이를 병 생성관련 단백질(pathogenesis-related protein)이라 부른다. 그 예로 키틴가수분해효소(chitinase)와 글루칸가수분해효소(glucanase)의 발현 및 축적이 식물병에 대한 저항성 반응과 감수성 반응에서 차별적으로 관찰되었다. 또한 키틴가수분해효소 유전자를 과발현하는 담배 식물체에서 세르코스포라 니코티아나에(Cercospora nicotianae)에 의한 감염이 부분적으로 감소됨이 보고된 바 있다(Neuhaus et al., Plant Mol. Biol., 15:141, 1991). 병원성 곰팡이의 세포벽을 구성하는 주요 성분이 키틴이라는 사실과 이 키틴이 식물체 내에서는 발견되지 않는다는 사실은 키틴가수분해효소가 식물의 병원균에 대한 방어 반응에 중요한 역할을 하리라는 생각을 뒷받침하였다. 또한 식물 방어 경로(plant defense pathway), 예컨대 피토알렉신 생합성(phytoalexin biosynthesis)에서 유도되는 다른 효소들에 대한 유전자가 도입된 형질전환 담배 식물체에서 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)의 침입이 부분적으로 지연됨이 밝혀졌다(Hain et al., Nature, 361:153, 1993).

대부분 병원성 곰팡이는 식물의 세포벽 성분들을 분해하는 효소들을 분비하여 식물의 조직 내로 침투한다. 병원성 곰팡이에 의해 분비되는 주 효소는 펙틴 세포벽 성분을 분해하는 폴리갈락투로나제(polygalacturonases)이다. 따라서 식물이 병원성 곰팡이의 감염에 대항하는 하나의 방법은 폴리갈락투로나제 저해제 단백질(polygalacturonase inhibitor protein; 이하 'PGIP'라 함)을 생산하는 것이다(Albersheim & Anderson, Physiol. Plant Path., 2:339, 1972; Fielding, Gen. Micro., 123:377, 1981; Abu-Goukh et al., Physiol. Plant Path., 23:111, 1983; Hahn et al., in T. Kosuge & E. Nester, Plant Microbe Interactions, Vol. 3, 1989).

PGIP는 곰팡이가 분비하는 폴리갈락투로나제의 활성을 억제하여 병 발생을 억제한다. 병 저항성에 관계하는 많은 단백질(R 유전자)에는 LRR(lecine rich repeat) 구조가 보존적으로 존재하는데, PGIP도 약 10개의 LRR 구조를 가지고 있다(Jones D. A. et al., Adv. Bot. Res., 24:89-166, 1997). 완벽한 PGIP는 분비시그날, N 말단, LRR 모듈 및 C 말단으로 구성되어 있으며, LRR 묘듈 중 β-회전(β-turn) 부위가 세포벽 밖으로 도출되어 병원성 단백질을 인식한다(Jones D. A. et al., Adv. Bot. Res., 24:89-166, 1997). 애기장대에서 연구된 PGIP의 프로모터 부위에는 병원체 감염 반응(HSRE, LS4), 상처에 의한 유도(PINIIK), 냉해에 의한 유도(LTRE)에 반응하는 신호가 존재한다(Ferrari Simone et al., The Plant Cell, 15:93-106, 2003). PGIP는 배에서 최초로 분리되어 그 특성이 규명되었으며(Abu-Goukh A. A. et al., Physiol. Plant Pathol., 23:111-122, 1983), 현재 대부분의 식물이 PGIP를 보유하고 있는 것으로 추정되고 있다. 그러나 병원균에서 분비되는 폴리갈락투로나제에 따라 대응되는 유전자가 다른 것으로 밝혀지고 있다. 예컨대, 토마토의 PGIP는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 폴리갈락투로나제는 저해하나, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme), 플라센티세라스 플라센타(Placenticeras placenta) 등의 폴리갈락투로나제는 저해하지 않는다(Lorenzo G. D. et al., Ann. Rev. Phytopathol., 39:313-335, 2001). 또한 포도에서 분리된 PGIPA는 아스퍼질러스 니거와 보트리티스 시네레아의 폴리갈락투로나제를 둘 다 저해하는 반면, PGIPB는 보트리티스 시네리아의 폴리갈락투로나제만 저해하고 아스퍼질러스 니거의 폴리갈락투로나제는 저해하지 않는다(Lorenzo G. D. et al., Ann. Rev. Phytopathol., 39:313-335, 2001). 이와 같이 PGIP 패밀리 내 유전자에 따라서도 대응하는 병원균이 다르다.

또한 패밀리 내 각 유전자는 다른 신호전달 경로를 받는다. 애기장대에는 2개의 PGIP 유전자(AtPGIP1과 AtPGIP2)가 패밀리를 이루고 있다. 두 유전자 모두 썩음병을 일으키는 보트리티스 시네레아에 반응하여 감염을 저해하는 활성을 가지고 있으나, AtPGIP1은 병원균이 식물세포벽을 분해하여 생기는 중간물질에 의해 활성이 유도되는 반면, AtPGIP2는 자스몬산(jasmonate)의 매개에 의하여 활성이 유도된다(Ferrari Simone, et al., The Plant Cell, 15:93-106, 2003). 목화의 PGIP는 살리신산에 의해 활성이 유도되기도 한다(James, T. T. et al., Phytochemistry, 57:149-156, 2001).

그러나, PGIP가 배추로부터는 아직 분리된 바 없다. 또한 종래에는 PGIP가 곰팡이 감염에 대해서만 반응한다고 알려져 있을 뿐, 세균 감염에 대해서도 반응하는지에 대해서는 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 배추로부터 PGIP를 분리하고 이의 특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 배추로 분리된 폴리갈락투로나제 저해제 단백질 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리갈락투로나제 저해제 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 식물체 내로 도입하는 것을 포함하는 병 저항성 형질전환 식물체를 제조하는 방법 및 세균 감염에 대한 저항성을 식물체에 부여하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다.

나아가 본 발명은 상기 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이들의 절편 또는 이들의 유도체를 이용하여 병원균에 대한 식물의 방어 기작에 관여하는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 배추로부터 분리된 폴리갈락투로나제 저해제 단백질(이하, 'BcPGIP'라 함)을 제공한다. 본 발명의 BcPGIP는 종래 PGIP들에 보존되어 있는 LRR 모듈을 포함한다. 구체적으로는 시그널 펩타이드, N-말단, 10개의 LRR 모듈 및 C-말단을 포함한다. 또한 본 발명에서 제공되는 BcPGIP는 세균 감염에 의해 그 발현이 유도되며, 세균 감염을 저해하여 식물을 보호하는 활성이 있다. 배추의 PGIP가 세균 감염에 대한 식물의 방어 기작에 관여한다는 사실은 본 발명에 의해 처음으로 규명된 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 배추로부터 PGIP 유전자를 클로닝하기 위하여 무름병 병원균을 접종한 배추로부터 RNA를 분리하고 이를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 또한 종래 알려진 유채와 애기장대의 PGIP들의 서열을 정렬(alignment)하여 상동성을 조사하고, 보존된 서열을 찾아내어 배추의 PGIP 유전자를 클로닝하기 위한 3개의 프라이머 세트를 디자인하였다(표 1 참조). 이후, 무름병 병원균을 접종한 배추로부터 얻은 cDNA를 주형으로 하고, 제작된 프라이머를 이용하여 2-스텝 PCR을 수행한 결과, 약 900bp 크기의 PCR 산물이 증폭됨을 확인하였다(도 1 참조). 상기 PCR 산물의 서열을 분석한 결과, 종래 알려진 PGIP들에 보존된 서열들, 예컨대 시그널 펩타이드, N-말단, LRR 묘듈이 존재하는 것으로 확인되었다. 이로부터 상기 PCR 산물이 배추의 PGIP(BcPGIP; Brassica campestris Polygalaturonase Inhibitor Protein)임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 배추 PGIP의 전장 cDNA를 클로닝하기 위하여, 상기 PCR 산물을 탐침으로 하여 cDNA 라이브러리 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 총 63개의 양성 클론을 얻었으며, 이들 중 약 900bp 이상의 삽입물(insert)을 함유하고 있는 클론만을 선발하였다. 선발된 클론들의 서열을 분석하고, ORF 서열이 동일한 클론끼리 클러스터링을 하였다. 그 결과, 최소 5개의 ORF가 존재하며, 각각은 다수의 UTR 염기서열을 갖고 있어 복수 카피인 것으로 추정된다. 또한 배추에는 적어도 5개 이상의 PGIP 패밀리가 존재하는 것으로 사료된다. 본 발명자들은 5개의 ORF를 각각'BcPGIP1', 'BcPGIP2', 'BcPGIP3', 'BcPGIP4' 및 ' BcPGIP5'라 명명하였다. 상기에서 BcPGIP2는 탐침으로 사용한 PCR 산물과 동일한 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. BcPGIP1 내지 BcPGIP5의 염기서열을 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 기재하였다. 또한 각 염기서열로부터 유추되는 아미노산 서열을 서열번호 14 내지 서열번호 18로 기재하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 무름병 병원균에 의한 BcPGIP 유전자의 발현양상을 시간별로 조사하였다. 그 결과, BcPGIP 유전자의 발현은 접종 후 12시간에 가장 높은 수준으로 유도되었으며, 그 이후로는 점차 감소하는 것으로 나타났다(도 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 BcPGIP 유전자를 담배에 도입하여 형질전환 담배에 BcPGIP 유전자가 안정하게 도입 및 발현됨을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 또한 형질전환 담배가 무름병에 대하여 저항성을 나타내는지 조사한 결과, 야생형 담배에 비하여 병증의 발현이 더 늦게 나타났으며, 그 병증 정도 또한 야생형에 비해 현저히 미비한 것으로 나타났다(도 6 참조). 이는 BcPGIP가 세균 감염에 대한 식물의 방어 기작에 관여함을 나타내는 결과이다. 또한 BcPGIP 유전자를 식물체 내로 도입하는 경우 식물체에 세균 감염에 대한 저항성을 부여할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 BcPGIP는 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 14 내지 서열번호 18로 기재되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 생리활성"이란 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)의 폴리갈락투로나제에 대한 저해 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 BcPGIP의 생리 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명에 따른 단백질은 자연(예컨대, 식물 세포)으로부터 추출되거나 또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는 배추(Brassica camperstris)로부터 분리될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 BcPGIP 및 이의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 갖거나 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 여기서, '벡터'라 함은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 식물 세포 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드, 뿌리 유도성(Ri) 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 pCAMBIA 2300 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 상기에서 세포는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세포 또는 대장균과 같은 원핵세포일 수 있다. 바람직하게는 대장균 세포 또는 아그로박테리움 속 미생물 세포이다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 세포로는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세포 및 대장균 세포와 같은 원핵세포가 포함된다. 그리고 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 식물 조직, 이로부터 재분화된 식물체 및 상기 식물체로부터 파종된 종자를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다. 상기 프라이머는 본 발명의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머를 포함한다. 또한 상기 프라이머는 그 서열 내에 증폭된 유전자의 용이한 클로닝을 위하여 적절한 제한효소 인식 서열을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 본 발명의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하는 것을 포함하는 병 저항성 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것이 바람직하다:

(a) 본 발명의 BcPGIP를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및

(b) 상기 발현 벡터를 식물체로 도입하는 단계.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한 상기 방법에 사용될 수 있는 발현 벡터로는 폴리뉴클레오티드(유전자)의 과발현을 유도하는 프로모터(예: CaMV 35S 프로모터)가 포함되어 있는 벡터가 바람직하다. 그 예로는 pCAMBIA 2300 벡터가 있다. 상기에서 '과발현'이란, 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 식물체로의 도입 방법은 전술한 바와 같으며, 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 방법에 따라 BcPGIP 유전자가 도입된 식물체는 병 저항성을 나타낸다. 본 발명에서 제공되는 형질전환 식물체는 식물의 세포벽 성분을 분해하는 폴리갈락투로나제를 분비하는 병원균에 의해 매개되는 병에 대하여 저항성을 나타낸다. 보다 구체적으로는 무름병에 대하여 저항성을 나타낸다. 본 발명에 따른 형질전환 식물체는 조직 배양으로 무성번식될 수 있다. 조직 배양의 예는 다음과 같다: 본 발명에 따른 형질전환 식물체의 조직을 캘러스 유도 배지에서 배양하여 캘러스를 유도한 후, 이를 뿌리 유도 배지에서 배양하여 발근을 유도한다. 이 때 뿌리 유도용 배지에는 소량의 NAA(naphthalenacetic acid)를 첨가하는 것이 바람직하다. 이외에도 겜보그 비타민 액(Gamborg's vitamin solution), IAA(indole-3-acetic acid) 등의 식물 생장 촉진제를 첨가할 수 있다. 이후, 뿌리 유도 배지에서 배양된 유식물체(plantlet)로부터 세근(부정근)이 나면, 배지를 깨끗이 제거하여 멸균 배합토에 이식한다. 이 때 비닐로 화분을 덮어 약 3주간 밀봉하는 것이 바람직하다. 그리고 나서, 큰 화분으로 옮겨 완전한 식물체로 재분화시킨다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하는 것을 포함하는 식물체에 세균 감염(bacterial infection)에 대한 저항성을 부여하는 방법을 제공한다. 상기에서 세균 감염은 폴리갈락투로나제를 분비하는 세균에 의한 감염을 말하는 것으로, 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)에 의해 매개되는 감염을 말한다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것이 바람직하다:

(b) 상기 발현 벡터를 식물체로 도입하는 단계.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 발현 벡터와 식물체로의 도입 방법은 상기 병 저항성 형질전환 식물체의 제조방법에서 전술한 바와 같다. 바람직하게는 pCAMBIA 2300 벡터를 사용할 수 있으며, 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법들이 적용될 수 있는 식물은 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 단자엽 식물(monocotyledonous plant)일 수 있다. 상기에서 쌍자엽 식물은 대두, 애기장대, 담배, 가지, 고추, 페튜니아, 감자, 토마토, 배추, 유채, 양배추, 목화, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리를 포함한다. 또한 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파를 포함한다.

본 발명에 따른 BcPGIP는 폴리갈락투로나제를 저해하는 활성을 나타내는 단백질로서, 병원균 감염에 대한 식물의 방어 기작에 관여한다. 따라서 본 발명에 따른 BcPGIP 또는 이의 변이형, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이들의 절편 또는 유도체를 이용하여 곰팡이 또는 세균 감염에 대한 식물의 방어 기작에 관여하는 물질을 탐색할 수 있다. 예컨대, BcPGIP 유전자 또는 이의 일부분을 탐침으로 하여 배추 내에서 BcPGIP 패밀리에 속하는 다른 유전자를 탐색하거나 다른 식물체에서 동일 또는 유사 유전자를 탐색할 수 있다. 또한, BcPGIP 단백질 또는 이의 변이형, 즉 BcPGIP의 절편 또는 유도체를 탐침으로 하여 BcPGIP와 상호 결합 하는 단백질을 탐색할 수 있다. 탐색은 당업계에서 일반적으로 사용되는 cDNA 라이브러리 스크리닝, BAC(bacterial artificial chromosome) 스크리닝, DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 면역 침전법, 방사능 면역 측정법(RIA), 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석, 효모 이중 혼성화 반응(yeast two hybrid system) 및 시험관 내 결합 어세이(in vitro binding assay)를 포함하는 다양한 방법으로 수행할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

배추 PGIP 유전자의 클로닝을 위한 RNA 및 cDNA의 준비

#734 배추(Hiratsuka, 중앙종묘, 한국)의 잎자루에 무름병 병원균(Erwinia carotovara subsp. carotovara)을 5.0×10⁶cfu의 농도의 접종하였다. 접종 후, 6, 12, 24, 48 및 72시간에 배추로부터 시료(잎)를 각각 채취하였다. RNA 분리 키트(QIAGEN RNAeasy Kit, #74904)를 이용하여 배추 시료로부터 RNA를 분리하였다. 전기영동을 수행하여 분리된 RNA를 확인하였으며, 상기 RNA를 주형으로 하고 인비트로겐(Invitrogen) 사의 수퍼스크립트(superscript, catalog No.:12371-019)를 이용하여 1차-스트랜드 cDNA(firtst-strand cDNA)를 합성하였다.

<실시예 2>

배추 PGIP 유전자의 부분 유전자의 클로닝

배추로부터 PGIP 유전자를 클로닝하기 위하여, 먼저 유채의 BnPGIP1(GenBank accession No.: AAM94868), BnPGIP2(GenBank accession No.: AAM94869) 및 BnPGIP3(GenBank accession No.: AAM95647)과 애기장대의 AtPGIP1(GenBank accession No.: AAF69827) 및 AtPGIP2(GenBank accession No.: AAF69828)의 유전자 서열을 정렬하여 이들의 상동성을 조사하였다. 상동성 결과를 바탕으로 단백질의 보존된 서열을 찾아낸 후, PGIP 유전자 증폭용 프라이머들을 디자인하였다(하기 표 1 참조). 제작된 프라이머들의 서열을 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 각각 기재하였다.

	프라이머명	서열	서열번호
1	BcPGIP L1	TCg Tgg gAC CCT CgA ACA gAC TgY TgY WVR Tgg	1
2	BcPGIP L2	ggT CAg ATC CCg CCA gAg gTI ggN gAY YT	2
3	BcPGIP L3	AgC Tgg ACg AAT CTg ACC ggT CCIgTI CCN ggN	3
4	BcPGIP R1	T gAg CTC ACT gAg AAA ACC Agg NAY Ngg ACC	4
5	BcPGIP R2	Tgg TAT ATA ACC ggA gAg CTg gTT IAC ISW ITY YAT	5
6	BcPGIP R3	TCC ACA CAA TCT gTT ATA gCT AAC ATT YTT YTT RAC ITY	6

상기 표 1에 기재된 프라이머 중 BcPGIP L1/BcPGIP R1 프라이머 조합을 이용하고 상기 실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여 투-스텝 PCR을 실시하였다. PCR은 첫 번째 스텝에서는 94℃에서 3분 동안 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 1분; 46℃에서 1분; 및 72℃에서 2분의 조건으로 3 사이클을 반복 수행하였고, 두 번째 스텝에서는 94℃에서 3분 동안 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 1분; 52℃에서 1분; 및 72℃에서 2분의 조건으로 30 사이클을 반복 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 7분 30초 동안 반응시켰다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 PGIP 유전자의 증폭여부를 조사하였다. 그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 약 900bp 크기의 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 도 1의 결과는 무름병 병원균 접종 후 12시간에 채취한 샘플의 결과이다.

이후, 상기 증폭된 유전자가 PGIP 유전자인지 확인하기 위하여, BcPGIP L2/BcPGIP R2 또는 BcPGIP L3/BcPGIP R3 프라이머 조합을 이용하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하였다. 그 결과, 모든 프라이머 조합에서 밴드가 검출되었다. 이로부터 상기 BcPGIP L1/BcPGIP R1 프라이머 조합으로 증폭된 DNA가 PGIP유전자임을 간접적으로 확인할 수 있었다(결과 미도시).

이렇게 확인된 PCR 산물을 퀴아젠 겔 일루션 키트(QIAGEN gel elution kit)를 이용하여 겔로부터 분리하였다. 분리된 DNA를 pGEMT-easy 벡터에 클로닝하였다. 제조된 재조합 벡터를 주형으로 하고 T7 프로모터 프라이머(서열번호 7)와 SP6 프로모터 프라이머(서열번호 8)를 이용하여 서열분석을 하였다. 그 결과, 상기 PCR 산물에는 종래 PGIP들에 보존되어 있는 서열이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 PCR 산물의 염기서열은 시그널 펩타이드, N-말단, LRR 모듈 및 C-말단으로 구성되어 있었다. 이로부터 본 발명자들은 상기 PCR 산물이 배추의 PGIP임을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

BcPGIP 유전자의 전장 cDNA의 클로닝

상기 실시예 2에서 얻은 유전자를 키트(Rediprime^TM Ⅱ random prime labelling kit, Amersham Biosciences, RPN1633)를 이용하여 탐침으로 만들고, 이를 이용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 배추의 cDNA 라이브러리를 함유하고 있는 나일론 멤브레인을 상기 탐침과 65℃에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 0.1×SSC, 1% SDS 용액으로 65℃에서 30분간 최종 세척하였다. 세척된 나일론 막을 X-ray 필름에 감광시킨 후, 디벨로핑(developing)하였다. 그 결과, 총 63개의 양성 클론을 얻을 수 있었다(결과 미도시).

이후, 각 양성 클론을 LB 브로쓰에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액으로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 EcoRⅠ과 XhoⅠ으로 절단한 후, 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 전기영동 결과에서 900bp 이상 크기의 DNA 삽입물(insert)을 보유한 클론을 선발하여 이들의 서열분석을 수행하였다. 이후, 분석된 서열을 CAP(contig assembly program, Xiaoqiu, 1991)을 이용하여 동일한 ORF끼리 클러스터링하였다. 그 결과, 총 5개의 ORF를 얻을 수 있었으며, 각각은 다수의 UTR 염기서열을 갖고 있어 복수 카피인 것으로 추정되었다. 5개의 ORF를 각각 'BcPGIP1', 'BcPGIP2', 'BcPGIP3', 'BcPGIP4' 및 'BcPGIP5'로 각각 명명하였다. 그 중에서 BcPGIP1 내지 BcPGIP5의 염기서열을 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 기재하였다. 또한, 각 염기서열로부터 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 14 내지 서열번호 18로 각각 기재하였다. 상기 BcPGIP2는 상기 실시예 2에서 얻은 PCR 산물과 동일한 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다.

<실시예 4>

BcPGIP 유전자의 발현 양상 분석

병원균의 접종시 BcPGIP 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 1차-스트랜드 cDNA를 합성하였다. 접종 후 각 시간별로 준비된 1차-스트랜드 cDNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 기재되는 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 3분 동안 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 1분; 58℃에서 1분; 72℃에서 2분의 조건으로 30 사이클 반복수행하였으며, 최종적으로 72℃에서 7분 30초 동안 반응시켰다. 이 때 대조군으로는 배추의 액틴(actin) 유전자를 증폭할 수 Actin-F 프라이머(서열번호 21)/Actin-R 프라이머(서열번호 22)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 2의 A에서 보는 바와 같이, BcPGIP 유전자의 발현은 병원균 접종 후 12시간에서 가장 높은 수준이었으며, 그 이후로는 점차 감소하였다.

상기 도 2의 A에서 검출된 밴드가 BcPGIP 유전자인지 확인하기 위하여 상기 실시예 3에서 제조한 탐침을 이용하여 상기 실시예 3과 동일한 방법에 따라 서던 블럿을 실시하였다. 그 결과, 도 2의 B에서 보는 바와 같이, PCR 산물이 BcPGIP 유전자임을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>

BcPGIP 유전자의 담배 도입

배추 유래의 PGIP의 기능을 알아보기 위하여 BcPGIP 유전자를 모델 식물체로 많이 활용하고 있는 담배(Nicotiana tabaccum var. Xanti nc)에 도입하고, 형질전환 담배의 병 저항성 여부를 조사하였다.

먼저, BcPGIP 유전자를 식물 형질전환용 벡터인 pCAMBIA 2300에 삽입하기 위하여 BamHⅠ 및 KpnⅠ 인식 서열이 각각 포함하는 프라이머 세트(서열번호 23 및 서열번호 24)를 제작하였다. 제작된 프라이머를 이용하여 상기 실시예 4와 동일한 방법에 따라 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 키트(Qia quick PCR purification Kit, QIAGEN, 28104)를 이용하여 분리하였다. 정제된 PCR 산물을 pCAMBIA 2300 벡터에 삽입하였다(도 3 참조). 제조된 재조합 벡터를 'pFnP1002'라 명명하였다. 이후, pFnP1002 벡터를 일렉트로포레이션(electroporation)으로 DH10B 세포에 도입하였다. 세포를 50 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하고 있는 LB 고체배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 형질전환체를 선발하였다.

선발된 콜로니들을 대상으로 PCR 분석과 DNA 제한효소 절단 분석을 수행하여 BcPGIP 유전자의 삽입을 확인하였다(결과 미도시). BcPGIP 유전자가 도입된 콜로니로부터 재조합 벡터를 분리하고, 이를 다시 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404에 도입하였다. PCR 분석과 DNA 제한효소 절단 분석을 수행하여 형질전환된 아그로박테리움을 선발 및 확인하였다. 이후, BcPGIP 유전자가 도입된 형질전환 아그로박테리움을 이용하여 담배를 형질전환시켰다.

담배의 형질전환은 종래의 방법(Horsch et al., Science, 227:1229-1231, 1985)을 약간 변형하여 수행하였다. 먼저, 담배의 잎 절편을 BcPGIP 유전자가 도입된 형질전환 아그로박테리움과 2일 동안 공동 배양하였다. 담배의 잎 절편을 여러 번 세척한 후, 0.5 ㎎/ℓ BA 및 100 ㎎/ℓ 카나마이신이 함유된 MS 선발 배지에 치상하였다. 약 한 달 후 신초가 형성되었을 때, 신초를 뿌리 유도 배지(50 ㎎/ℓ 카나마이신을 함유하는 MS 배지)에 이식하여 발근을 유도하였으며, 완전한 유식물체로의 분화시켰다.

<실시예 6>

형질전환 담배의 BcPGIP 유전자의 삽입 및 발현 여부 확인

<6-1> 서던 블럿 분석을 통한 BcPGIP 의 삽입 여부 확인

상기 실시예 5에서 제조된 형질전환 담배 유식물체의 잎으로부터 키트(DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, 69104)를 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하고 상기 실시예 4와 동일한 방법에 따라 PCR을 수행하여 BcPGIP 유전자의 삽입여부를 확인하였다. BcPGIP 유전자가 삽입되어 있음이 확인된 형질전환 담배 유식물체는 순화 과정을 거쳐 온실에서 생육하였다. 온실 중에서 생육 중인 형질전환 담배를 대상으로 서던 블럿을 실시하여 BcPGIP 유전자의 삽입을 재확인하였다. 게놈 DNA를 HindⅢ로 절단한 후, 1.0% 아가로스 겔에 전기영동하였다. 이후, 겔 상의 DNA를 나일론 막으로 옮기고, 상기 실시예 3에서 제조된 BcPGIP 탐침을 첨가하여 65℃에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 0.1×SSC, 1% SDS 용액으로 65℃에서 30분간 최종 세척하였다. 세척된 나일론 막을 X-ray 필름에 감광시킨 후, 디벨로핑(developing)하였다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 약 16개의 형질전환 담배 중 3개체에서 밴드를 검출되었다. 그 중 2개체(#1-17 및 #18-2-4)는 기대한 바와 같이 약 2kb 크기에서 밴드가 검출되었다. 나머지 하나(#1-3)는 유전자 삽입시 재조합으로 인해 다른 크기에서 밴드가 검출되었다.

<6-2> RT-PCR 분석을 통한 BcPGIP 유전자의 발현 여부 확인

상기 실시예 5에서 제조된 형질전환 담배 유식물체의 잎으로부터 키트(RNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, 69104)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 전기영동을 실시하여 분리된 RNA를 확인하였다. 분리된 RNA를 주형으로 하고 인비트로겐(Invitrogen) 사의 수퍼스크립트(superscript, catalog No.:12371-019)를 이용하여 1차-스트랜드 cDNA(firtst-strand cDNA)를 합성하였다. 이후, 합성된 1차-스트랜드 cDNA를 주형으로 하여 상기 실시예 4와 동일한 방법에 따라 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 <6-1>에서 PCR 산물이 검출된 #1-17 및 #18-2-4 개체에서는 BcPGIP 유전자가 안정하게 발현됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

형질전환 담배의 무름병 저항성 테스트

상기 실시예 6에서 BcPGIP 유전자의 삽입과 발현이 확인된 형질전환 담배(#18-2-4)의 잎을 채취하여 무름병에 대한 저항성을 조사하였다. 병 저항성 조사는 유묘엽 기부 접종 방법(대산 농촌 문화 재단 논문집, 1999)으로 실시하였다.

습기가 충분한 실험 상자에 형질전환 담배 및 야생형 담배(대조군)의 잎을 나란히 펴 놓은 후, 5.0×10⁶ cfu의 농도의 무름병 병원균을 주사기를 이용하여 잎자루에 접종하였다. 접종 후 2시간 마다 병증의 크기를 측정하여 비교 분석하였다.

그 결과, 도 6의 A에서 보는 바와 같이, 야생형 담배의 경우에는 접종 후 12시간에 병증이 나타나 16시간 이후부터는 높은 수준으로 나타나는 반면, 형질전환 담배의 경우에는 18시간에서 병증이 나타남을 확인할 수 있었다. 특히, 20시간이 경과한 후 야생형 담배의 경우에는 병증이 잎 전체에 전이되었으나, 형질전환 담배에서는 미비한 병증만을 나타내었다(도 6의 B 참조). 이로부터 배추의 PGIP 유전자가 도입된 식물이 무름병에 대하여 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 배추로부터 PGIP 유전자를 분리하였으며, 상기 BcPGIP 유전자가 무름병에 대한 식물의 방어 기작에 관여함을 확인하였다. 본 발명에 따른 BcPGIP 유전자는 무름병을 일으키는 세균의 활성을 저해한다. 따라서, 본 발명의 BcPGIP 유전자, 이를 함유하는 재조합 벡터 및 형질전환 아그로박테리움은 병 저항성 식물체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 배추의 PGIP 유전자를 클로닝하기 위하여 유채 및 애기장대의 PGIP에 보존되어 있는 서열을 참고로 하여 제작된 프라이머로 PCR을 수행한 결과이다.

레인 1: 분자량 마커(1kb ladder marker)

레인 2: PCR 산물

도 2는 배추에 무름병 병원균을 접종한 후, 시간에 따른 BcPGIP 유전자의 시간별 발현 양상을 RT-PCR(A) 및 서던 블럿(B)으로 분석한 결과이다.

레인 1: 분자량 마커 레인 2: 접종 전

레인 3: 접종 후 6시간 레인 4: 접종 후 12시간

레인 5: 접종 후 24시간 레인 6: 접종 후 48시간

레인 7: 접종 후 72시간 레인 8: 분자량 마커

도 3은 본 발명의 BcPGIP 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터의 개략적인 모식도이다.

도 4는 형질전환 담배에서 BcPGIP 유전자의 도입 여부를 서던 블럿으로 확인한 결과이다.

레인 1: 야생형 담배 레인 2: 형질전환 식물체 #1-2

레인 3: 형질전환 식물체 #1-3 레인 4: 형질전환 식물체 #1-4

레인 5: 형질전환 식물체 #1-13 레인 6: 형질전환 식물체 #1-16

레인 7: 형질전환 식물체 #1-17 레인 8: 형질전환 식물체 #18-1

레인 9: 형질전환 식물체 #18-2-1 레인 10: 형질전환 식물체 #18-2-2

레인 11: 형질전환 식물체 #18-2-4 레인 12: 형질전환 식물체 #18-2-5

레인 13: 형질전환 식물체 #18-5-1 레인 14: 형질전환 식물체 #18-5-3

레인 15: 형질전환 식물체 #18-7 레인 16: 형질전환 식물체 #18-8

도 5는 형질전환 담배에서 BcPGIP 유전자의 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 결과이다.

레인 1: 분자량 마커 레인 2: 형질전환 식물체 #1-3

레인 3: 형질전환 식물체 #1-4 레인 4: 형질전환 식물체 #1-13

레인 5: 형질전환 식물체 #1-17 레인 6: 형질전환 식물체 #18-2-4

레인 7: 형질전환 식물체 #18-5-3 레인 8: 야생형 담배

레인 9: 형질전환 식물체 #1-3 레인 10: 분자량 마커

도 6은 BcPGIP 유전자가 도입된 형질전환 담배에 무름병 병원균을 접종한 후 나타나는 병변의 길이(lesion length)를 시간별로 나타낸 그래프(A)와 잎에서 나타난 병증을 야생형 담배와 비교하여 도시한 사진(B)이다.

<110> FNP, Inc. <120> Novel polygalacturonase inhibitor protein and its use <130> NP04-0017 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BcPGIP L1 primer <400> 1 tcgtgggacc ctcgaacaga ctgytgywvr tgg 33 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BcPGIP L2 primer <220> <221> modified_base <222> (21) <223> i <400> 2 ggtcagatcc cgccagaggt nggngayyt 29 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BcPGIP L3 primer <220> <221> modified_base <222> (24) <223> i <220> <221> modified_base <222> (27) <223> i <400> 3 agctggacga atctgaccgg tccngtnccn ggn 33 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BcPGIP R1 primer <400> 4 tgagctcact gagaaaacca ggnaynggac c 31 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BcPGIP R2 primer <220> <221> modified_base <222> (19) <223> i <220> <221> modified_base <222> (22) <223> i <220> <221> modified_base <222> (25) <223> i <400> 5 tggtatataa ccggagagct ggttnacnsw ntyyat 36 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BcPGIP R3 primer <220> <221> modified_base <222> (37) <223> i <400> 6 tccacacaat ctgttatagc taacattytt yttracnty 39 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter primer <400> 7 taatacgact cactataggg 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP6 promoter primer <400> 8 atttaggtga cactatag 18 <210> 9 <211> 1026 <212> DNA <213> Brassica campestris <400> 9 atgggtaaga caacgatact gctcttgctc ttgttcgctc tcctcctcac cacatcttta 60 tccaaagacc tctgtcacaa agatgacaaa aacaccctcc tcaagatcaa gaaagccatg 120 aacgaccctt acaccatcat ctcctgggac cccaaggacg actgctgcac ctggtactcc 180 gttgagtgcg gcaacgcaaa ccgcgtcacc tctctagact tatcagacga cgacgtctcc 240 gctcagatcc ctcctgaagt cggcgacttg ccttatctac aatacctcac gttccgcaaa 300 ctccctaacc tcaccggtga aatcccaccc accatcgcca agctcaagta tctcaaatct 360 ctctggctca gctggaacag cctgaccggc ccggttcctg aatttctgag ccagctcaag 420 aacctagagt acattaacct ttctttcaat aaactctctg gctccatacc cggttctctc 480 tctttgttac ctaaactaga ttttcttgaa ctaagcagga acaagcttac aggtcccata 540 ccagagtcat ttggatcatt taaaagagca gtatatggga tttacctatc gcacaaccag 600 ctgtccggtt ctataccaaa atcactaggc aacatcgact ttaacaccat tgatctttcc 660 cggaacaagc ttgaaggtga tgcgtccatg ttgtttggag taaaaaagac gacatggcac 720 attgacttat ctagaaacat gttccagttc gatatctcca aggttaaggt cgctaagaca 780 gttaatttct tggacttgaa tcacaacggg ctcacaggga gtatcccgga tcaatggacc 840 caacttgatc ttcagacttt caacgttagc tataacagac tgtgtggacg catccctcag 900 ggaggtgacc ttcagagttt tgatgcttat gcctatttac acaacaagtg cttgtgtggt 960 gcacctcttc cgagttgcaa cgtgaagatt caggcaaccg atctttatnt aaacttacca 1020 tcagaa 1026 <210> 10 <211> 993 <212> DNA <213> Brassica campestris <400> 10 atggataaga caacgacact gcttttgttc ttcttcttgt tcacattcct cacgacttct 60 ttctctaaaa acctatgtaa ccaagatgac aaaaccaccc tcctcaagat caagaaagcc 120 ctaaacaacc cttaccacct cgcctcgtgg gaccctcgaa cagactgttg ctcctggtac 180 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campestris <400> 11 atggagggta agacaacgac actgctcttg ctcttgttca ctctcctcct cacgacatct 60 ttatccaaag atctctgtca caaagatgac aaaaacaccc tcctcaagat caagaaagcc 120 atgaacgacc cttacaccat catctcctgg gaccccaagg acgattgctg cacctggtac 180 gccgttgagt gcggcaacgc atctattaac caccgcgtca cttctctaga catatcaaac 240 gacgacgtct ccgctcagat cccacccgaa gtcggcgact tgccttatct agaatatctc 300 atattccaca aactccctaa cctcaccggt gaaatcccac ccaccatcac caagctcaag 360 tatctccgtt atctctggct cagctggaac aacctgagcg gcccggttcc tgaattactg 420 agtcagctca agaatctaga gtacattaac ctttccttca ataagctctc cggttcgata 480 cccggttcac tctctttgtt acctaaactc gagtttcttg aactcagcag gaacaagctt 540 acaggttcga taccagagtc atttggatcg tttaaaggag tggtatatgc tctttaccta 600 tcgcacaacc agctgtccgg ttctataccg aaatcattag gcaacctgga cattaaccag 660 attgatcttt cccggaacaa gctcgaaggt gatgcgtcga tgttgtttgg agccaaaaag 720 acaacacagc acattgacct atcaagaaac atgttccagt tcaatatctc caaggttaag 780 gtagctaaaa cagttaattt cttggacttg aaccacaaca gcctcacagg gagtatcccg 840 gttcaatgga cccaacttga tcttcagact ttcaatgtaa gctataatag actgtgtgga 900 cgcatccccc agggagggga ccttcagaga tttgatgctt atgcgtattt acacaacaag 960 tgtttgtgtg atgcacctct tcagagttgc aag 993 <210> 12 <211> 1002 <212> DNA <213> Brassica campestris <400> 12 atggatcata agacaaatac gacactgctt ttctcgctct tgtttttcat tacacacctc 60 agcaacgcgt tatcaaaaga tctatgtaac gaaaacgaca aaaacaccct cctcaagatc 120 aagaagtccc taaacaaccc ttaccacctc gcctcgtggc accccgaaac cgactgctgc 180 tcctggaaca gcctcgagtg cgacgacgcc accgttaacc gccgcgtcat ctccctaacc 240 atattctccg ctcagatctc cggtcagatc cctcctgaag tcggtgactt accgtatctt 300 cagaagcttg tcttccgcaa aatcactaac ctcaccggtc agataccaca caccatcacc 360 aagctcaagt atctccgttt tctcaggctt agctggacga accttaccgg cccggttcct 420 gagtttttga gtcagctcat ggatcttgcc tacttaaacc tttccttcaa ttatttttct 480 ggttccatac ctagctctct ctccttgtta cctaaacttt cgtacgttga tcttagtcgg 540 aataagctta caggtacaat accagagtca tttggatcgt tttcaggaga agtccctgac 600 cttttcctat cacataacca gctctccggt tctataccta aatcactagg caacctggat 660 tttaaccgga tcgatttttc aaggaacagg ttcataggcg atgcttcgat gttgtttgga 720 gccaataaaa cgacattttc tattgattta tcaagaaaca tgttccagtt cgatctctcc 780 cgtgttgaga tccctaagac atttggtatc ttagacttga atcacaatgg gatcacaggg 840 agtatcccgg ttcagtggac tgaaactcct ttccaaatct tcaatgttag ctacaacaga 900 ttgtgtggac gcatccccac tggagggaaa ctgcagatgt ttgattctta tgcatatttt 960 cacaataagt gtttatgtgg tgcaccactt gatagttgca ag 1002 <210> 13 <211> 1008 <212> DNA <213> Brassica campestris <400> 13 atggatcata agacaaacac gacactgctt ttctcgctct tgtttttcat cacgtacctc 60 atcaccatcg cgacatcgaa agatctatgt aaccaaaacg acaaaaacac cctccttaaa 120 atcaagaagt ccctaaacaa cccttaccac ctcgcctcgt ggcaccccga aaccgactgc 180 tgctcctggt actgcctcga atgcggcgac gccacagtta accaccgcgt catctcccta 240 accatattcg ccggtcagat atccggtcag atcccgcctg aagtcggtga cttaccgtat 300 cttcagagtc ttatgttcca caggatcact aacatcaccg gtcagatccc atccaccatc 360 accaagctta agtatctccg ttctctcagg cttagctggt tgaacctcac cggcccggtt 420 cctgagtttt tgagtcagct catgaatctt gaatacttaa gcctttcctt caatcagctc 480 tctggttcca tacctagctc tctcgctttg ttacctaaac tttcttacgt tgatcttagt 540 aggaataagc ttacaggtac aataccagag tcatttggat cgtttccagc agaacttgct 600 taccttatct tatcacacaa ccagctctcc ggttcgatac ccaaatcact aggcaacctt 660 gattttaacc ggatagattt ctcaaggaac aagttcacag gcgatgcttc gatgttgttt 720 ggtgccaaca aaacgacgtt ttccattgac ttatcaagaa acatattcca gtttgatctg 780 tccagagttg tgctccatga gtcacttggt gtactggact tgaaccacaa tgggatcaca 840 gggagtattc cggttcagtg gactgaatat tctctccaaa tcttaaacgt tagctataac 900 agactgtgtg gacccatccc cactggagga agtcttcaga gatttgattc ttatacatat 960 tttcataaca agtgtttatg tggtgcacct cttgatagta gttgcaag 1008 <210> 14 <211> 342 <212> PRT <213> Brassica campestris <400> 14 Met Gly Lys Thr Thr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Thr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Cys His Lys Asp Asp Lys Asn Thr 20 25 30 Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ala Met Asn Asp Pro Tyr Thr Ile Ile Ser 35 40 45 Trp Asp Pro Lys Asp Asp Cys Cys Thr Trp Tyr Ser Val Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Ala Asn Arg Val Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asp Asp Val Ser 65 70 75 80 Ala Gln Ile Pro Pro Glu Val Gly Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Tyr Leu 85 90 95 Thr Phe Arg Lys Leu Pro Asn Leu Thr Gly Glu Ile Pro Pro Thr Ile 100 105 110 Ala Lys Leu Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Trp Leu Ser Trp Asn Ser Leu 115 120 125 Thr Gly Pro Val Pro Glu Phe Leu Ser Gln Leu Lys Asn Leu Glu Tyr 130 135 140 Ile Asn Leu Ser Phe Asn Lys Leu Ser Gly Ser Ile Pro Gly Ser Leu 145 150 155 160 Ser Leu Leu Pro Lys Leu Asp Phe Leu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Leu 165 170 175 Thr Gly Pro Ile Pro Glu Ser Phe Gly Ser Phe Lys Arg Ala Val Tyr 180 185 190 Gly Ile Tyr Leu Ser His Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ile Pro Lys Ser 195 200 205 Leu Gly Asn Ile Asp Phe Asn Thr Ile Asp Leu Ser Arg Asn Lys Leu 210 215 220 Glu Gly Asp Ala Ser Met Leu Phe Gly Val Lys Lys Thr Thr Trp His 225 230 235 240 Ile Asp Leu Ser Arg Asn Met Phe Gln Phe Asp Ile Ser Lys Val Lys 245 250 255 Val Ala Lys Thr Val Asn Phe Leu Asp Leu Asn His Asn Gly Leu Thr 260 265 270 Gly Ser Ile Pro Asp Gln Trp Thr Gln Leu Asp Leu Gln Thr Phe Asn 275 280 285 Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly Arg Ile Pro Gln Gly Gly Asp Leu 290 295 300 Gln Ser Phe Asp Ala Tyr Ala Tyr Leu His Asn Lys Cys Leu Cys Gly 305 310 315 320 Ala Pro Leu Pro Ser Cys Asn Val Lys Ile Gln Ala Thr Asp Leu Tyr 325 330 335 Xaa Asn Leu Pro Ser Glu 340 <210> 15 <211> 331 <212> PRT <213> Brassica campestris <400> 15 Met Asp Lys Thr Thr Thr Leu Leu Leu Phe Phe Phe Leu Phe Thr Phe 1 5 10 15 Leu Thr Thr Ser Phe Ser Lys Asn Leu Cys Asn Gln Asp Asp Lys Thr 20 25 30 Thr Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ala Leu Asn Asn Pro Tyr His Leu Ala 35 40 45 Ser Trp Asp Pro Arg Thr Asp Cys Cys Ser Trp Tyr Cys Leu Glu Cys 50 55 60 Gly Asp Ala Thr Val Asn His Arg Val Thr Ala Leu Thr Ile Phe Ser 65 70 75 80 Gly Gln Ile Ser Gly Gln Ile Pro Pro Glu Val Gly Asp Leu Ser Tyr 85 90 95 Leu Gln Thr Leu Val Phe Arg Lys Leu Thr Asn Leu Thr Gly Gln Ile 100 105 110 Pro Arg Thr Ile Ala Lys Leu Lys Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Leu Ser 115 120 125 Trp Thr Asn Leu Thr Gly Pro Val Pro Gly Phe Leu Ser Glu Leu Lys 130 135 140 Asn Leu Gln Trp Val Asp Leu Ser Phe Asn Asp Leu Ser Gly Ser Ile 145 150 155 160 Pro Ser Ser Leu Ser Leu Leu Pro Asn Leu Val Ser Leu Asp Leu Ser 165 170 175 Arg Asn Lys Leu Thr Gly Ser Ile Pro Glu Ser Phe Gly Ser Phe Pro 180 185 190 Ala Lys Val Pro Asp Leu Tyr Leu Ser His Asn Gln Leu Ser Gly Tyr 195 200 205 Ile Pro Lys Thr Leu Gly Asn Leu Asp Phe Ser Lys Ile Asp Phe Ser 210 215 220 Arg Asn Lys Leu Gly Gly Glu Ala Ser Met Leu Phe Gly Ala Asn Lys 225 230 235 240 Thr Thr Trp Tyr Ile Asp Leu Ser Arg Asn Met Leu Gln Phe Asp Leu 245 250 255 Ser Arg Val Val Ile Pro Lys Thr Leu Gly Ile Leu Asp Leu Asn His 260 265 270 Asn Gly Ile Thr Gly Asn Ile Pro Val Gln Trp Thr Glu Ala Pro Leu 275 280 285 Gln Phe Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly His Ile Pro Thr 290 295 300 Gly Gly Thr Leu Gln Glu Phe Asp Thr Tyr Ser Tyr Phe His Asn Lys 305 310 315 320 Cys Leu Cys Gly Ala Pro Leu Asp Ser Cys Lys 325 330 <210> 16 <211> 331 <212> PRT <213> Brassica campestris <400> 16 Met Glu Gly Lys Thr Thr Thr Leu Leu Leu Leu Leu Phe Thr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Thr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Cys His Lys Asp Asp Lys Asn 20 25 30 Thr Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ala Met Asn Asp Pro Tyr Thr Ile Ile 35 40 45 Ser Trp Asp Pro Lys Asp Asp Cys Cys Thr Trp Tyr Ala Val Glu Cys 50 55 60 Gly Asn Ala Ser Ile Asn His Arg Val Thr Ser Leu Asp Ile Ser Asn 65 70 75 80 Asp Asp Val Ser Ala Gln Ile Pro Pro Glu Val Gly Asp Leu Pro Tyr 85 90 95 Leu Glu Tyr Leu Ile Phe His Lys Leu Pro Asn Leu Thr Gly Glu Ile 100 105 110 Pro Pro Thr Ile Thr Lys Leu Lys Tyr Leu Arg Tyr Leu Trp Leu Ser 115 120 125 Trp Asn Asn Leu Ser Gly Pro Val Pro Glu Leu Leu Ser Gln Leu Lys 130 135 140 Asn Leu Glu Tyr Ile Asn Leu Ser Phe Asn Lys Leu Ser Gly Ser Ile 145 150 155 160 Pro Gly Ser Leu Ser Leu Leu Pro Lys Leu Glu Phe Leu Glu Leu Ser 165 170 175 Arg Asn Lys Leu Thr Gly Ser Ile Pro Glu Ser Phe Gly Ser Phe Lys 180 185 190 Gly Val Val Tyr Ala Leu Tyr Leu Ser His Asn Gln Leu Ser Gly Ser 195 200 205 Ile Pro Lys Ser Leu Gly Asn Leu Asp Ile Asn Gln Ile Asp Leu Ser 210 215 220 Arg Asn Lys Leu Glu Gly Asp Ala Ser Met Leu Phe Gly Ala Lys Lys 225 230 235 240 Thr Thr Gln His Ile Asp Leu Ser Arg Asn Met Phe Gln Phe Asn Ile 245 250 255 Ser Lys Val Lys Val Ala Lys Thr Val Asn Phe Leu Asp Leu Asn His 260 265 270 Asn Ser Leu Thr Gly Ser Ile Pro Val Gln Trp Thr Gln Leu Asp Leu 275 280 285 Gln Thr Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly Arg Ile Pro Gln 290 295 300 Gly Gly Asp Leu Gln Arg Phe Asp Ala Tyr Ala Tyr Leu His Asn Lys 305 310 315 320 Cys Leu Cys Asp Ala Pro Leu Gln Ser Cys Lys 325 330 <210> 17 <211> 334 <212> PRT <213> Brassica campestris <400> 17 Met Asp His Lys Thr Asn Thr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Phe 1 5 10 15 Ile Thr His Leu Ser Asn Ala Leu Ser Lys Asp Leu Cys Asn Glu Asn 20 25 30 Asp Lys Asn Thr Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asn Pro Tyr 35 40 45 His Leu Ala Ser Trp His Pro Glu Thr Asp Cys Cys Ser Trp Asn Ser 50 55 60 Leu Glu Cys Asp Asp Ala Thr Val Asn Arg Arg Val Ile Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ile Phe Ser Ala Gln Ile Ser Gly Gln Ile Pro Pro Glu Val Gly Asp 85 90 95 Leu Pro Tyr Leu Gln Lys Leu Val Phe Arg Lys Ile Thr Asn Leu Thr 100 105 110 Gly Gln Ile Pro His Thr Ile Thr Lys Leu Lys Tyr Leu Arg Phe Leu 115 120 125 Arg Leu Ser Trp Thr Asn Leu Thr Gly Pro Val Pro Glu Phe Leu Ser 130 135 140 Gln Leu Met Asp Leu Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Phe Asn Tyr Phe Ser 145 150 155 160 Gly Ser Ile Pro Ser Ser Leu Ser Leu Leu Pro Lys Leu Ser Tyr Val 165 170 175 Asp Leu Ser Arg Asn Lys Leu Thr Gly Thr Ile Pro Glu Ser Phe Gly 180 185 190 Ser Phe Ser Gly Glu Val Pro Asp Leu Phe Leu Ser His Asn Gln Leu 195 200 205 Ser Gly Ser Ile Pro Lys Ser Leu Gly Asn Leu Asp Phe Asn Arg Ile 210 215 220 Asp Phe Ser Arg Asn Arg Phe Ile Gly Asp Ala Ser Met Leu Phe Gly 225 230 235 240 Ala Asn Lys Thr Thr Phe Ser Ile Asp Leu Ser Arg Asn Met Phe Gln 245 250 255 Phe Asp Leu Ser Arg Val Glu Ile Pro Lys Thr Phe Gly Ile Leu Asp 260 265 270 Leu Asn His Asn Gly Ile Thr Gly Ser Ile Pro Val Gln Trp Thr Glu 275 280 285 Thr Pro Phe Gln Ile Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly Arg 290 295 300 Ile Pro Thr Gly Gly Lys Leu Gln Met Phe Asp Ser Tyr Ala Tyr Phe 305 310 315 320 His Asn Lys Cys Leu Cys Gly Ala Pro Leu Asp Ser Cys Lys 325 330 <210> 18 <211> 336 <212> PRT <213> Brassica campestris <400> 18 Met Asp His Lys Thr Asn Thr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Phe 1 5 10 15 Ile Thr Tyr Leu Ile Thr Ile Ala Thr Ser Lys Asp Leu Cys Asn Gln 20 25 30 Asn Asp Lys Asn Thr Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asn Pro 35 40 45 Tyr His Leu Ala Ser Trp His Pro Glu Thr Asp Cys Cys Ser Trp Tyr 50 55 60 Cys Leu Glu Cys Gly Asp Ala Thr Val Asn His Arg Val Ile Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ile Phe Ala Gly Gln Ile Ser Gly Gln Ile Pro Pro Glu Val Gly 85 90 95 Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ser Leu Met Phe His Arg Ile Thr Asn Ile 100 105 110 Thr Gly Gln Ile Pro Ser Thr Ile Thr Lys Leu Lys Tyr Leu Arg Ser 115 120 125 Leu Arg Leu Ser Trp Leu Asn Leu Thr Gly Pro Val Pro Glu Phe Leu 130 135 140 Ser Gln Leu Met Asn Leu Glu Tyr Leu Ser Leu Ser Phe Asn Gln Leu 145 150 155 160 Ser Gly Ser Ile Pro Ser Ser Leu Ala Leu Leu Pro Lys Leu Ser Tyr 165 170 175 Val Asp Leu Ser Arg Asn Lys Leu Thr Gly Thr Ile Pro Glu Ser Phe 180 185 190 Gly Ser Phe Pro Ala Glu Leu Ala Tyr Leu Ile Leu Ser His Asn Gln 195 200 205 Leu Ser Gly Ser Ile Pro Lys Ser Leu Gly Asn Leu Asp Phe Asn Arg 210 215 220 Ile Asp Phe Ser Arg Asn Lys Phe Thr Gly Asp Ala Ser Met Leu Phe 225 230 235 240 Gly Ala Asn Lys Thr Thr Phe Ser Ile Asp Leu Ser Arg Asn Ile Phe 245 250 255 Gln Phe Asp Leu Ser Arg Val Val Leu His Glu Ser Leu Gly Val Leu 260 265 270 Asp Leu Asn His Asn Gly Ile Thr Gly Ser Ile Pro Val Gln Trp Thr 275 280 285 Glu Tyr Ser Leu Gln Ile Leu Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly 290 295 300 Pro Ile Pro Thr Gly Gly Ser Leu Gln Arg Phe Asp Ser Tyr Thr Tyr 305 310 315 320 Phe His Asn Lys Cys Leu Cys Gly Ala Pro Leu Asp Ser Ser Cys Lys 325 330 335 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 19 atgggtaaga caacgacact gcttttg 27 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 20 ctttacttgc aactatcaag ac 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin F primer <400> 21 tggactctgg tgatggtgtc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin R primer <400> 22 cctccaatcc aaacactgta 20 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR <400> 23 agtcggatcc atgggtaaga caacgacact gcttttg 37 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR <400> 24 ggctgcggta ccctttactt gcaactatca agac 34

Claims

서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리갈락투로나제 저해제 단백질(polygalacturonase inhibitor protein; PGIP).
제1항에 있어서, 배추(Brassica camperstris)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 단백질.
(a) 제1항의 단백질을 암호화하는 염기서열; 또는

(b) 상기 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물.
(a) 제3항의 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및

(b) 상기 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 병 저항성 형질전환 식물체를 제조하는 방법.
(a) 제3항의 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및

(b) 상기 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 단계를 포함하는 식물체에 세균 감염(bacterial infection)에 대한 저항성을 부여하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 대두, 애기장대, 담배, 가지, 고추, 페튜니아, 감자, 토마토, 배추, 유채, 양배추, 목화, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 병은 무름병인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 세균 감염은 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora subsp. carotovora)에 의해 매개되는 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항의 방법으로 제조되고, 조직배양을 통해 재분화시킨 병 저항성 형질전환 식물체.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머.
제17항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 4, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항의 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이들의 절편 또는 유도체를 탐침으로 이용하여 병원균에 대한 식물의 방어 기작에 관여하는 물질을 탐색하는 방법.
제19항에 있어서, cDNA 라이브러리 스크리닝, BAC(bacterial artificial chromosome) 스크리닝, DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 면역 침전법, 방사능 면역 측정법(RIA), 효소 면역 반응(ELISA), 2-D 겔 분석, 효모 이중 혼성화 반응(yeast two hybrid system) 및 시험관 내 결합 어세이(in vitro binding assay)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.