KR101361296B1 - 무의 위황병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 무의 위황병 저항성 선발 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트는 위황병 저항성과 이병성에 있어 염기서열의 차이를 나타낼 수 있는바, 외부의 선발 조건에 영향을 받지 않고, 안정적으로 무의 위황병 저항성 품종을 검출, 선발 또는 육성하는데 유용할 뿐만 아니라, 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 위황병으로 인한 무 작물의 수율 손실 및 상품성이 저하되는 것을 방지할 수 있어 농가의 수입을 증가시키는데도 유용할 것으로 기대된다.

Description

무의 위황병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법{PRIMER SET FOR BINDING MARKER INVOLVING IN FUSARIUM WILT RESISTANCE AND SELECTION METHOD USING THEM}
본 발명은 무의 위황병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 위황병 저항성과 이병성에 있어 염기서열의 차이를 나타낼 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 외부의 선발 조건에 영향을 받지 않고, 안정적으로 무의 위황병 저항성 품종을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법에 관한 것이다.
십자화과(brassicaceae family)에 속하는 무(Radish, Raphanus sativus(2n=18))는 잎줄기 채소 및 뿌리 작물을 생산하기 위해 전 세계적으로 재배되고 있다. 하지만, 이렇게 경제적으로 중요한 작물임에도 불구하고, 이러한 작물에서 수율 및 품질 특성, 그리고 생물적 및 비생물적 스트레스의 유전학에 대한 연구는 잘 이루어지지 않고 있다. 단, R. sativus는 다수의 연구된 Brassica 종과 같은 과에 속하기 때문에, 이러한 작물의 게놈은 Brassica rapa, B. oleracea, 및 B. napus의 A와 C 게놈과 각각 밀접하게 관련이 있는 것으로 보고될 뿐이었다(Warwick SI, Black LD 1991 Molecular systematics of Brassica and allied genera (subtribe Brassicinae, Brassiceae) chloroplast genome and cytodeme congruence. Theor Appl Genet 82: 8192).
따라서, 최초의 유전자 지도는 Brassica의 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 마커를 기반으로 하여 R. sativus R. raphanistrum 간의 교배에 의해 얻은 분리 집단을 사용하여 개발되어 2003년에 보고되었으나, 무 작물에서 사용 가능한 마커가 개발되지는 않았다(Bett KE, Lydiate DJ 2003 Genetic analysis and genome mapping in Raphanus. Genome 46:423430). 하지만, 이어서, radish에서 AFLP(amplified fragment length polymorpshim) 및 Brassica-Simple sequence repeats (SSR) 마커들이 사용된 종내 유전자 지도의 개발이 이루어졌으며(Tsuro M, Suwabe K, Kubo N, Matsumoto S, Hirai M 2005 Construction of a linkage map of radish (Raphanus sativus L.), based on AFLP and Brassica-SSR markers. Breed Sci 55:107111), 이 후, 사탕무우 시스트 선충(Budahn H, Peterka H, Mousa MA, Ding Y, Zhang S, Li J 2009 Molecular mapping in oil radish (Raphanus sativus L.) and QTL analysis of resistance against beet cyst nematode (Heterodera schachtii). Theor Appl Genet 118:775782) 및 뿌리혹병(Kamei A, Tsuro M, Kubo N, Hayashi T, Wang N, Fujimura T, Hirai M 2010 QTL mapping of clubroot resistance in radish (Raphanus sativus L.). Theor Appl Genet 120:10211027)에 대한 저항성을 가지는 뿌리 형태 및 붉은 색소를 포함하는 많은 형질을 위해 많은 유전자 지도와 양적형질 유전자좌(QTL) 분석의 개발이 이루어졌다. 더욱이, 최근에는 EST-SSRs(Expressed Sequence Tag derived SSRs) 및 SNP(Single Nucleotide Polymphism) 마커들이 무에서 연관 지도 개발을 위해 사용되고, 동일한 과(family)에서 잘 알려진 게놈과 비교하여 무 게놈의 단편 보전 및 다양화를 보고하는데 모델 식물 A. thaliana 및 B. rapa를 사용한 게놈 와이드 비교 분석이 수행되고 있다.
한편, 토양전염성 병원균인 Fusarium oxysporum에 의한 위황병(FW; Fusarium wilt)은 무 등을 포함하는 십자화과 식물에서 심각한 질병이다. 이 병원균은 적절한 숙주 식물의 부재에도 오랜 기간 동안 살아남을 수 있는바, 무(radish)의 생산은 이러한 Fusarium oxysporum f. sp . raphani에 의한 위황병에 부정적인 영향을 받는다. 위황병에 걸린 식물은 잎이 시들고, 떨어질 뿐만 아니라 짙은 갈색 및 관 변색이 심해지고, 심각한 발육 저해로 인해 결국 식물이 죽게되어, 결과적으로 심각한 작물 수율 손실 및 상품성이 저하되는 결과를 초래한다. 따라서, 위황병(FW)에 강한 무 품종을 육종하는 것은 이러한 질병으로 의해 수백만 달러의 손실을 줄여, 결과적으로 농가의 수입을 증가시키는데 큰 이점을 가질 수 있다.
위황병의 유전 및 유전자는 A. thaliana(Diener AC, Ausubel FM 2005 RESISTANCE TO FUSARIUM OXYSPORUM 1, a dominant Arabidopsis disease-resistance gene, is not race specific. Genetics 171:305321) 및 B. oleracea(Pu ZJ, Shimizu M, Zhang YJ , Nagaoka T, Hayashi T, Hori H, Matsumoto S, Fujimoto R and Okazaki K 2011 Genetic mapping of a fusarium wilt resistance gene in Brassica oleracea. Molecular Breeding 1 - 10)에서 연구되었다. QTL맵핑은, Brassica oleracea(PU 등 2011)의 연관군 7(O7)에서 우성 저항성 QTL/유전자, Foc -Bol을 확인하였고, Arabidopsis의 1번 염색체에서 fusarium oxysporum에 대한 우성 저항성 유전자인 RFO1을 확인하였는데, 이러한 RFO1은 저항성 계통에서 과민 반응을 유도한다(Diener 및 Ausubel 2005). 하지만, 현재까지 무(radish)에서 위황병(FW) 양적형질 유전자좌(QTL)의 세부 유전적 연구 또는 분자 지도에 대해 보고된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 무(radish)의 유전자 지도에서 위황병(FW) 저항성 형질 연관 양적형질 유전자좌(QTL)에 위치하는 유전체 단편을 분리한 후, 상기 유전체 단편들의 염기서열을 분석하여, 위황병 저항성과 이병성에 차이를 나타낼 수 있는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 무의 위황병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 마커 R3-indel1을 탐지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 마커 R3-indel2을 탐지하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 무 위황병 저항성 품종을 선발 또는 육성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트는 위황병 저항성과 이병성에 있어 염기서열의 차이를 나타낼 수 있는바, 외부의 선발 조건에 영향을 받지 않고, 안정적으로 무의 위황병 저항성 품종을 검출, 선발 또는 육성하는데 유용할 뿐만 아니라, 저항성 품종을 분리하여 새로운 품종을 개발하는데도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 위황병으로 인한 무 작물의 수율 손실 및 상품성이 저하되는 것을 방지할 수 있어 농가의 수입을 증가시키는데도 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 위황병 병원균 접종 후 무의 병징 정도를 등급별로 관찰한 결과를 보여주는 도면이다.
도 2는 제작된 무의 유전자 지도를 보여주는 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 무의 위황병 접종방법으로 보편적으로 사용하고 있는 두 가지 방법인 dropping method, root-cut dipping method을 사용하여 2011년에 실시한 실험에서 나타난 QTL 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 B. rapa 및 A. thaliana 게놈을 가지고 raphanus 게놈에 대한 신터니 분석을 한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5a 및 5b는 위황병 저항성 형질분석 실험에서 주동유전자좌로 나타난 qFW4에 위치하는 마커를 이용하여 저항성 무와 이병성 무의 유전체 단편의 염기서열을 분석하여 저항성 및 이병성 간의 염기서열 차이를 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6a 및 6b은 무의 위황병 저항성 여부를 검출하기 위해 본 발명의 프라이머 세트를 적용한 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명자들은 무의 위황병 저항성 유전자형을 탐색하여 저항성 무 품종을 외부의 선발 조건에 영향을 받지 않고, 안정적으로 선발하고 육성할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 프라이머 세트는 무의 위황병 저항성 계통과 이병성 배추 계통을 이용하여 만든 분리집단을 육성 및 병 검정하여 양적형질 유전자좌(QTL; quantitiative trait loci)를 탐색하고, 상기 유전자좌(QTL)에 위치하는 위황병 저항성과 연관된 유전체 단편을 분리한 후, 상기 유전체 단편들의 염기서열을 분석함으로써, 위황병 저항성과 이병성에 차이를 나타낼 수 있는 프라이머 쌍을 조합하여 제작하였다.
보다 구체적으로, 본 발명에서는 위황병에 대하여 저항성을 보이는 계통과 이병성을 보이는 근교계통간의 교배를 통하여 얻은 잡종 세대 F1을 자가 수정하여 분리집단 F2를 육성하고, 상기 F2를 자가 수정하여 분리집단 F3을 육성하여 총 F2 222개체 및 F3 5개체를 이용하였다. 그리고 나서, 이들 양친계통과 F1, F2 및 F3에 위황병 병원균(F. oxysporum f. sp. raphani)을 접종하여 위황병을 발생시켜 발병 정도를 7 등급으로 나누어 검정하였다. 그 결과, 양친계통은 위황병에 대한 저항성에 대해 상반된 형질을 나타낸 반면, F1은 이병성 표현형을 나타냈고, 분리집단 F2 및 F3은 상당한 유전자형 변이(P<0.01)를 나타내어, 위황병에 대한 저항성 형질은 열성 유전자에 의해 이루어지는 것으로 추정할 수 있다.
분리집단 F2 및 F3으로부터 DNA를 추출한 후, B. rapa에서 이전에 맵핑된 SSRs, BAC end sequence에서 개발된 SSRs, A genome-specific B. juncea IP 마커, B. rapa의 ACMP EST-SSR 마커, Radish EST-SSR 및 B. oleracea의 "Foc-bol" QTL에 인접한 마커 10종류를 이용하여 양친계통(835 및 B2)간의 다형성 조사를 하였고, Ramchiary 등 2011(Ramchiary N, Nguyen DV, Li XN, Hong CP, Dhandapani V, Choi SR, Ge Y, Piao ZY, Lim YP (2011) Genic microsatellite markers in Brassica rapa: development, characterisation, mapping, and their utility in other cultivated and wild Brassica relatives. DNA Res18: 305-320)에 개시된 방법에 따라 SSR 다형성 조사, 표현형 및 점수화(scoring)를 수행하였다. 그 결과 총 220개의 다형성 마커 좌위를 얻었고, 9개 연관군과 맵핑된 무의 유전자 지도를 작성하였다.
작성된 무의 유전자 지도를 이용하여 양적형질 유전자좌(QTL) 분석을 실시하였고, 그 결과, 무의 위황병 저항성 형질에 관여하는 총 8개의 양적형질 유전자위(QTL)를 검출하였다. 이 중, 2년에 걸친 실험을 통해 모두 검출된 3개의 양적형질 유전자위(QTL), 즉 qFW3, qFW4 및 qFW8를 확인하였다. 이중, 가장 높은 LOD 값과 표현형 변이율을 가지며, 지속적으로 반복하여 유의성 있는 QTL이 검출된 qFW4부위를(마커 ACMP0609에서 Rss2974 에 걸쳐 위치하는) 저항성 형질에 관여하는 주동유전자좌로 판단하여 Fo-Rs1로 명명하였다. 그리고, qFW4(Fo-Rs1)에 위치하는 위황병 저항성과 연관된 유전체 단편(분자표지)을 분리하여, 이들의 염기서열을 분석하였고, 그 결과 위황병 저항성과 이병성에서의 염기서열 차이를 확인하였으며, 이러한 차이를 나타낼 수 있는 2개의 프라이머 쌍을 조합하여 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트를 제작하였다.
이에, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 마커 R3-indel1을 탐지하여 약 100bp 크기의 PCR 산물을 생성할 수 있으며, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 마커 R3-indel2를 탐지하여 약 200bp 크기의 PCR 산물을 생성할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 한 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명의 또 다른 한 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 무의 위황병 저항성 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 위황병 저항성 형질에 관여하는 양적형질 유전자위(QTL)에 위치하는 유전체 단편(분자 표지)을 표지하여 위황병 저항성과 이병성에서의 염기서열 차이를 나타낼 수 있는바, 안정적이고 정확하게 무의 위황병 저항성 품종을 선발 및 육성할 수 있다.
이에, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 무 위황병 저항성 계통을 선발 또는 육성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 제작된 무의 유전자 지도와 B. rapa와 A. thaliana와의 비교 맵핑을 통해 검출된 qFW3, qFW4 및 qFW8이 위황병 저항성 형질에 관여하는 중요한 좌위라는 것을 확인하였고(실시예 3 참조), 해당 좌위에 위치하는 유전체 단편을 분석하여 저항성과 이병성 간의 염기서열의 차이가 있음을 확인하였다(실시예 6 참조).
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 저항성과 이병성 간의 염기서열 차이를 나타낼 수 있어 무의 위황병 저항성 품종을 검출하는데 유용하다는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 저항성 계통과 이병성 계통을 이용한 분리집단 F 2 와 F 3 육성 및 위황병 검정
양친으로, 위황병에 대해 심한 증상을 나타내는 이병성 계통 835 및 강한 저항성 표현형을 나타내는 저항성 계통 B2를 교배하여 얻은 잡종 1세대 F1을 자가 수정하여 분리집단 F2를 육성하여 222개체를 선택하였고, 상기 F2를 자가 수정하여 분리집단 F3을 육성하였다.
위황병 병원균(F. oxysporum f. sp. raphani)은 다른 두 지역(Syngenta Co., Korea)에서 수집된 증상을 보이는 뿌리 조직으로부터 얻었다. 접종원을 제조하기 위해, 감자한천배지에 2주간 배양한 배양물을 플로딩(flooding)하여 포자 현탁액을 제조하였고, 제조된 fusarium 포자 현탁액의 농도는 hemocytometer를 사용하여 106/mm 농도로 조절되었다. 위황병 검정을 위해, 2011년 9월 및 2012년 7월에 온실에서의 각 F2 계통으로부터 얻은 F3 계통에 접종하였으며, 각 F2 계통으로부터 얻은 5개의 F3 종자는 5개의 포트에서, 즉, 한 포트당 하나의 종자가 육종되었다. 위황병 검정은 2년에 걸쳐 진행되었고, 2011년, 병원균 포자는 두 개의 상이한 방법, 즉 root-cut dipping 방법(Smith SN, Ebbels DL, Garber RH, Kappelman AJ 1981 Fusarium wilt of cotton. In: Nelson PE, Toussoun TA, Cook RJ (eds) Fusarium: diseases, biology, and taxonomy. Pennsylvania State University, University Park pp 2938) 및 dropping 방법을 사용하여 유묘(seedling)에 접종되었다.
보다 구체적으로, root-cut dipping 방법을 위해, 2주된 유묘의 뿌리를 수돗물로 씻고, 이들의 곁뿌리(이차근)를 2-3 길이로 커팅했다. 그리고 나서, 이를 즉시 Fusarium 포자를 포함하는 현탁액 수용액에 1분 동안 담근 후, 고압멸균된(autoclaved) 토양을 포함하는 50-cell 플러그 트레이로 유묘(seedling)를 옮겨 심었다. 온실의 온도는 25 내지 29 사이로 유지되었고, 접종 16일 후, 병징(disease symptom) 정도를 1-7등급(등급 1, 건강 및 증상이 없음; 등급 2, 떡잎의 시들음 및 약간의 왜소화; 등급 3, 식물의 25% 이하가 병징을 나타냄; 등급 4, 식물의 25-50% 이하가 병징을 나타냄; 등급 5, 식물의 51-90% 이하가 병징을 나타냄; 등급 6, 식물이 시들고 고사됨; 등급 7, 완전히 죽음)으로 나누어 검정하였고, 발병지수(Disease Index)를 산출하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
한편, dropping 방법은 50-cell 플러그 트레이에 2주된 묘에 뿌리 방향을 따라 병원균 현탁액을 주입함으로써 접종시키는 방법으로, 접종 31일 후, DI를 산출하였다. 한편, 2012년에 수행한 실험은 25 챔버에서 수행되었고, root-cut dipping 방법을 반복하였다.
실시예 2. 무( Raphanus sativus )의 유전자 지도 제작 및 B. rapa 와 A. thaliana 와의 비교 맵핑
실시예 1을 통해 얻은 분리집단 F2 및 F3으로부터 DNA를 추출한 후, B. rapa에서 이전에 맵핑된 SSRs 189종류(Kim H, Choi SR, Bae J, Hong CP, Lee SY, Hossain MJ, Van Nguyen D, Jin M, Park BS, Bang JW, Bancroft I, Lim YP 2009 Sequenced BAC anchored reference genetic map that reconciles the ten individual chromosomes of Brassica rapa. BMC Genomics 10:432; prefixed cnu and nia), BAC end sequence에서 개발된 SSRs 528 종류(Li XN, Ramchiary N, Choi SR, Nguyen DV, Hossain MJ, Yang HK, Lim YP 2010 Development of a high density integrated reference genetic linkage map for the multinational Brassica rapa genome sequencing project. Genome 53:939947; prefixed BRPGM), Panjabi 등(Panjabi P, Jagannath A, Bisht NC, Padmaja KL, Sharma S, Gupta V, Pradhan AK, Pental D 2008 Comparative mapping of Brassica juncea and Arabidopsis thaliana using intron polymorphism (IP) markers: homoeologous relationships, diversification and evolution of the A, B and C Brassica genomes. BMC Genomics 9:113)에 의해 개발된 A genome-specific B. juncea IP 마커 272 종류, B. rapa의 ACMP EST-SSR 마커 707 종류(Ramchiary N, Nguyen DV, Li XN, Hong CP, Dhandapani V, Choi SR, Ge Y, Piao ZY, Lim YP 2011 Genic microsatellite markers in Brassica rapa: development, characterisation, mapping, and their utility in other cultivated and wild Brassica relatives. DNA Res18: 305-320), Radish EST-SSR 245 종류(Shirasawa K, Oyama M, Hirakawa H, Sato S, Tabata S, Fujioka T, Kimizuka-Takagi C, Sasamoto S, Watanabe A, Kato M, Kishida Y, Kohara M, Takahashi C, Tsuruoka H, Wada T, Sakai T, Isobe S 2011 An EST-SSR linkage map of Raphanus sativus and comparative genomics of the Brassicaceae. DNA Res 18:221232), 및 B. oleracea의 "Foc-bol" QTL에 인접한 마커 10종류를 이용하여 양친계통(cnu-10022 및 cnu-10023)간의 다형성 조사를 하였고, Ramchiary 등 2011에 개시된 방법에 따라 SSR 다형성 조사, 표현형 및 점수화(scoring)를 수행하였다.
JoinMap 버전 4.0 (Van Ooijen 2006)을 사용하여 무의 유전자 지도를 제작하였다. LOD(Logarithms of odds) 스코어 4.0-7.0은 마커를 연관군에 할당하기 위해 사용하였고, Kosambi의 사상 함수(mapping function)는 재조합 값(recombination value)을 유전자 거리(map distance)로 변환시키기 위해 사용하였다. 0.25보다 작은 재조합 빈도 및 2.0보다 큰 LOD는 마커를 순서대로 배열하기 위해 설정되었다. 실시예 2에서 사용된 마커의 게놈 위치(genomic location)는 이미 B. rapa(http://brassicadb.org/brad/) 및 A. thaliana(http://www.arabidopsis.org/) 게놈에서 잘 알려져 있기 때문에, 작성된 무의 유전자 지도를 상기 종들과 비교하였으며, 작성된 무의 유전자 지도 및 이에 대한 특성은 도 2 및 표 1에 나타내었다.
Linkage Length Number of markers
Group cM cnu/nia BRPGM ACMP IP EST-SSR BRMS KBRS Total
1 113.8 0 10 9 2 3 0 0 24
2 135.0 0 25 8 2 8 1 0 44
3 140.9 2 13 9 2 15 1 0 42
4 166.9 0 10 12 6 3 1 2 34
5 70.6 0 5 4 0 2 0 0 11
6 125.6 1 10 4 2 5 0 0 22
7 96.2 1 8 2 1 0 0 0 12
8 85.4 2 5 2 3 1 1 0 14
9 107.1 0 10 5 0 2 0 17
Total 1041.5 6 96 55 18 39 4 2 220
표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 무(radish)의 유전자 지도를 제작하기 위해 양친 계통 사이의 다형성에 대한 많은 마커들을 확인했음에도 불구하고, Brassica 마커와 상대적인 전달성(transferability)을 보여주는 많은 다형성 마커를 얻지는 못하였다. 즉, 717 종류의 cnu/nia 및 B. rapa의 BRPGM SSRs 중, 오직 112(15.62%)만이 양친 계통 사이의 다형성을 나타내었고, 이와 유사하게, 272 중 18 종류(6.61%)의 A genome-specific B. juncea IP 마커, 707 중 55 종류의(7.78%)의 ACMP EST-SSR 마커 및 245 중 39 종류의(15.91%)의 Radish EST-SSRs이 다형성을 나타내어, 양친 계통 사이에서 총 237개의 다형성 마커 좌위를 얻었다. 또한, B. oleracea의 위황병 저항성 QTL "Foc-bol"에 인접한 2종류의 마커는 양친 계통 사이에서 다형성이었다. 더욱이, 이상분리(distorted segregation), 유전자형 정보 손실(missing genotype information) 및 부족한 클리어 밴드(insufficiently clear band)를 나타내는 15개 마커를 제거하여, 결과적으로 최종 유전자 지도는 9개 연관군에 맵핑된 220(12.66%)개의 좌위로 이루어짐을 확인했다. 유전자 지도의 총 거리는 1041.5cM이며, 두 개 마커 좌위 간의 평균 거리는 4.7cM였고, 9개 연관군은 각 염색체 상에 위치된 공지된 마커에 기반한 Shirasawa's map(2011)에 따라 LG1-LG9으로 명명되었다.
또한, 매핑된 220 마커 중, A. thaliana 게놈 과의 상동 유전자(homologous gene)임을 확인하기 위해 BLASTN을 사용하였고, 그 결과 143개가 A. thaliana 게놈에서 상응하는 좌위를 가짐을 확인할 수 있었다. A. thaliana의 5개 염색체는 무(radish) 게놈을 통해 짧은 단편(segment)으로 비균일하게 분포되었고, 무 게놈 구조는 Schranz 등(Schranz ME, Lysak MA, Mitchell-Olds T 2006 The ABCs of comparative genomics in the Brassicaceae: building blocks of crucifer genomes. Trends Plant Sci 11:5355426)에 의해 제안된 조상 핵형 게놈 블록(ancestral karyotype genomic blocks) 내의 24 게놈 블록에 의해 확인할 수 있었다. 즉, D, G, P 블록을 제외한 모든 블록이 R. sativus의 게놈에서 확인되었는데, 작성된 지도에서 3개 블록의 부재는, 아마도 (길이가) 짧거나 조상 핵형의 동원체에 가깝기 때문인 것으로 사료된다. 대부분의 블록은, B. rapa에서 보고된 바와 같이, 2배 및 3배 되었으며, R. sativus에서의 일부 인접 블록(예컨대, A/B 및 V/W)은 조상 핵형의 게놈에서의 연속 분포와 동일하게 검출됨을 확인할 수 있었다. 더욱이, 9개 연관군 중에서, LG1은 각각 R, E 및 N블록인 A. thaliana 염색체 1(At C1), 3(At C3) 및 5(At C5)를 포함하며, LG5 및 LG6은 At C1, At C3, At C4 및 At C5에 상응하는 어떠한 좌위도 없음을 확인하였는데, 이는 매우 작은 수의 마커를 사용했기 때문인 것으로 사료된다. 뿐만 아니라, LG4는 10개의 게놈 블록으로 구성된 가장 긴 군으로 발견되었고, 이어서 LG2 및 LG3군이었으며, 이들은 각각 8개의 게놈 블록으로 구성되었고, LG8 및 LG9는 A, B 및 C 블록으로 구성되었고, 대부분 At C1으로 이루어짐을 확인할 수 있었다.
한편, radish EST-RSS 및 IP 마커를 제외한 모든 마커들은 B. rapa에서 파생되었고, 적어도 3개의 마커를 포함하며 B. rapa 게놈과 공선성(collinearity)을 가진 22 신터니 영역이 있음을 확인할 수 있었다. B. rapa의 열 개 염색체는 무의 유전자 지도에서 많은 단편으로 분할되었으며, 가장 큰 연관군인 연관군 2는 A01, A02, A05, A07, A09 및 A10과 상응함을 확인할 수 있었다. 또한, 연관군 7은 오직 하나의 큰 A01의 영역을 가진 가장 작은 연관군이었으며, 이어서 A01 및 A02의 두 영역를 가진 LG5 순이었다. 이어서, B. rapa의 게놈 영역은 연관군 LG1(A07 및 A10으로 구성), LG3(A03, A05, A06 및 A09), LG4(A03, A04 및 A06) 및 LG9(A06, A08 및 A10)에서 관찰되었다.
실시예 3. 위황병 저항성 형질 관여 양적형질 유전자좌 ( QTL ) 검출
실시예 2에서 제작된 무의 유전자 지도에서 위황병 저항성 형질에 관여하는 양적형질 유전자좌(QTL)을 검출하기 위해, WinQTL cartographer 버전 2.5를 이용하여 비교간격 맵핑(composite interval mapping)을 수행하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Trait linkage
group		 Marker interval 2011 dropping method 2011 root-cut dipping method 2012 root-cut dipping method
start end LOD R2
(%)		 Additive
effects		 LOD R2
(%)		 additive
effects 		LOD R2
(%)		 additive effects
qFW1 LG2 cnu_mBRPGM1376 cnu_mBRPGM1211 3.72 3.80 0.01 3.29 1.01 0.02
qFW2 LG2 ACMP0590 cnu_mBRPGM0674 5.62 1.40 -0.03
qFW3 LG3 cnu_mBRPGM0674 RSS3562 3.76 10.91 0.20 4.84 12.50 0.20 4.23 6.72 0.24
qFW4 LG3 RSS2831 cnu_mBRPGM0085 7.94 13.32 0.47 8.84 14.63 0.52 4.34 9.11 0.41
qFW5 LG4 cnu_mBRPGM0356 At3g36 8.57 6.42 -0.16
qFW6 LG4 cnu_mBRPGM1208 At4g31 9.42 3.60 0.14
qFW7 LG6 ACMP0357 cnu_mBRPGM0701 3.2 1.79 0.03 10.08 1.57 0.14
qFW8 LG7 nia_m032 cnu_mBRPGM1542 2.5 2.21 -0.28 3.31 0.49 -0.37 3.03 4.49 -0.35
표 2에 나타낸 바와 같이, 양적형질 유전자좌(QTL) 분석을 통해 5개 연관군에서 분포된 총 8개의 양적형질 유전자좌(QTL)가 검출되었으며, 보다 구체적으로는, LG2, LG3 및 LG4에서 각각 2개의 양적형질 유전자좌(QTL)가 검출되었고, LG6 및 LG7에서 각각 1개의 양적형질 유전자좌(QTL)가 검출됨을 확인할 수 있었다. 또한, 8개의 양적형질 유전자좌(QTL)에 대한 LOD 값을 산출한 결과, 8개의 양적형질 유전자좌(QTL)에 대한 LOD 값은 2.50 내지 10.08의 범위를 나타냈으며, R2는 0.32 내지 14.63% 범위를 나타냄을 확인할 수 있었다.
한편, 양적형질 유전자좌(QTL) 분석 역시 2년에 걸쳐 진행되었으며, 8개의 양적형질 유전자좌(QTL) 중 3개의 양적형질 유전자좌(QTL) 즉, qFW3, qFW4 및 qFW8은 2년 동안 수행된 실험에서 모두 검출되었고, qFW1은 2011년 연관군 2(root-cut dipping 방법 및 dropping 방법을 모두 포함)에서는 검출되었으나 2012년에는 검출되지 않았으며, qFW2, qFW5 및 qFW6은 오직 2012년에서만 검출되었다. 더욱이, 실험을 통하여 qFW3, qFW4 및 qFW8 중에서, qFW4는 LG3에서 ACMP0609에서 Rss2974까지 플랭크되고(flanked), qFW4에 대한 LOD 값을 산출한 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 5.93-8.75 범위의 비교적 높은 LOD 값을 나타내며, 9.11-14.63%의 표현형 변이율을 나타냄을 확인하였다. 또한, qFW4(Fo - Rs1로 명명함)의 상가치(additive value)는 B2(P2) 대립 유전자(allele)로부터 위황병에 대한 주요 유전자 저항성이 생긴다는 것을 나타냈다. 더욱이, LOD의 2년 실험결과에서는 2011년이 2012년보다 높았는데, 이는 위황병(FW) 질환의 발병률이 온도가 상승할 때 증가하기 때문인 것으로 사료된다.
상기 결과들을 통하여 검출된 양적형질 유전자좌(QTL), 특히 qFW3, qFW4 및 qFW8은 위황병 저항성 형질에 관여하는 중요한 좌위라는 것을 확인할 수 있었다. 또한, qFW4은 가장 높은 LOD 수치를 나타내고 저항성 표현형값에 관여하는 비중이 크면서, 실험횟수 및 다른 방법으로 병 저항성을 검정하였을 때 반복적으로 나타나므로 8개의 QTL 중에 저항성 형질에 주도적으로 관여하는 QTL(대표QTL)임을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 위황병 저항성 유전자좌(QTL)을 포함하는 crucifer block 확인
실시예 3에서 검출된 위황병 저항성 형질 관여 양적형질 유전자좌(QTL)가 위치된 crucifer block를 Ramchiary 등(N, Nguyen DV, Li XN, Hong CP, Dhandapani V, Choi SR, Ge Y, Piao ZY, Lim YP 2011 Genic microsatellite markers in Brassica rapa: development, characterisation, mapping, and their utility in other cultivated and wild Brassica relatives. DNA Res18: 305-320)에 개시된 방법에 따라 확인하였다. 즉, 주(major) 및 부(minor) 위황병 저항성 양적형질 유전자좌(QRL)가 있는(harboring) crucifer blocks을 확인하였으며, 그 결과, 위황병 저항성 양적형질 유전자좌(QRL)에 관하여 더 중요할 4개의 주요 crucifer blocks를 검출하였다. 보다 구체적으로, 검출된 4개의 주요 crucifer blocks들은 각각 LG3(QTL qFW3을 포함함)에서의 F 블록, LG3(qFW4, 주 QTL) 및 LG4(qFW5)의 N 블록, LG4(qFW6) 및 LG7(qFW8, constitutive QTL)의 U 블록 및 LG6(qFW7)의 S 블록임을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 신터니 ( synteny ) 분석
신터니 분석은 실시예 4의 Ramchiary 등 2011에 개시된 방법에 따라 B. rapa 및 A. thaliana 게놈을 가지고 raphanus 게놈에 대한 신터니 분석을 하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, raphanus 게놈의 연관군 3 에 위치하고 있는 qFW4에 해당하는 분자마커의 염기서열 정보를 이용하여 A. thaliana의 유전체와 신터니(상동성 있는 부분 찾기) 분석을 해 본 결과 A. thaliana의 3번 염색체에서 사이에서 신터니를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이전의 연구(Pu ZJ, Shimizu M, Zhang YJ , Nagaoka T, Hayashi T, Hori H, Matsumoto S, Fujimoto R and Okazaki K 2011 Genetic mapping of a fusarium wilt resistance gene in Brassica oleracea. Molecular Breeding 1 10)에서, B. oleracea의 Foc - Bol 영역을 포함하는 연관그룹은 A. thaliana의 3번 및 4번 염색체 간의 상응하는 영역과 나란하게 정렬됨을 확인할 수 있었고, Foc - Bol 영역 주변의 마커 KBrB089H07N1과 KBrB084F01N1은, 무(radish)에서 ACMP0606의 신터니 영역에 가까이 있는 A. thaliana 3번 염색체와 신터닉 관계임을 알 수 있었다. B. oleracea(양배추)에서 위황병 저항성 인자로 보고된 Foc-Bo1은 A. thaliana 와의 신터니 분석에서 A. thaliana의 4번 염색체에 위치한 유전자군들과 상동성을 나타내어 본 발명의 일실시예에서 발굴한 분자 표지인자와는 다른 것임을 확인할 수 있었다. 이는 저항성 기작에 관여하는 유전인자가 하나 이상일 수도 있거나 무에서 저항성 기작이 양배추와는 다를 수도 있다는 가능성을 제기한다.
상기 결과들로부터, 확인된 신터니는 R. sativus 연구에서 A. thaliana의 게놈 정보를 활용하고, 지도 기반의 클로닝을 가속화하는데 도움이 될 것임을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트 제작
(1) 위황병 저항성과 연관된 유전체 단편 분석
835와 B2의 genomic DNA를 사용하여 RSS0769 PCR 산물 시퀀싱(sequencing)으로부터 디자인된 R3-indel1 마커(서열번호 5) 및 ACMP0606 PCR 산물 시퀀싱(sequencing)으로부터 디자인된 R3-indel2 마커(서열번호 6)를 이용하여, 각각 이병성 및 저항성을 나타내는 양친계통(835와 B2)에서의 염기서열 차이를 확인하였으며, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, R3-indel1 마커(서열번호 5)의 경우, 132bp 위치에서 염기서열 차이가 존재함을 확인할 수 있었고, R3-indel2 마커(서열번호 6)의 경우 190bp 위치에서 염기서열의 차이가 존재함을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해 이러한 염기서열의 차이를 나타낼 수 있는 프라이머를 조합하면, 무의 위황병 저항성 검출에 효과적임을 알 수 있었다.
(2) 프라이머 세트 제작
실시예 6.1을 통해 확인한 염기서열의 차이를 나타낼 수 있는 프라이머 쌍을 조합하여 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트 제작하였고, 이에 대한 염기서열은 표 3과 같다. 또한, 무의 위황병 저항성 여부를 검출하기 위해 제작된 프라이머 세트를 양친계통(835와 B2)에 적용하였으며, 그 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.
Marker name Forward primer (5'→ 3') Reverse primer (5'→3')
R3-indel1 서열
번호 1		 ACC TCG AAA TCC GAC GAT A 서열
번호 2		 CAC TCC ATC TTC GCT TCC TC
R3-indel2 서열
번호 3		 AAC TGT GGG ACC AGG ATG AG 서열
번호 4		 GCA CGA GTG AAT CAG TCC AA
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 무의 위황병 저항성 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1및 2의 프라이머 쌍은 마커 R3-indel1을 탐지하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 마커 R3-indel2를 탐지하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 무의 위황병 저항성 검출용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는, 무의 위황병 저항성 검출용 키트.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 무 위황병 저항성 품종을 선발 또는 육성하는 방법.
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