KR20110082973A - 벼 도열병 저항성 유전자의 고밀도 양적형질 유전자지도 작성 및 동정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼의 두 가지 자포니카(Japonica) 재배종간의 여교잡으로 생산된 이입계통(introgression line population)을 이용하여 작성된, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌(QTL)가 포함된 고밀도 유전자 지도 및 상기 유전자 지도를 이용하여 벼의 도열병 저항성 관련 QTL을 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)을 포함하는 이입계통에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자 지도에 포함된 SSR 마커를 이용하여 Pi45(t)를 동정하는 방법, 벼 도열병 저항성에 대한 QTL을 검출하는 방법, 및 벼 도열병 저항성 벼 식물을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

벼 도열병 저항성 유전자의 고밀도 양적형질 유전자지도 작성 및 동정{Fine QTL mapping and identification of rice blast resistance gene}
본 발명은 벼의 두 가지 자포니카 재배종간의 여교잡으로 생산된 이입계통을 이용하여 작성된, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌(QTL)가 포함된 고밀도 유전자 지도, 상기 유전자 지도를 이용하여 벼의 도열병 저항성 관련 QTL을 분석하는 방법, 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)을 포함하는 이입계통, 및 상기 유전자 지도에 포함된 SSR 마커를 이용하여 Pi45(t)를 동정하는 방법, 벼 도열병 저항성에 대한 QTL을 검출하는 방법과 벼 도열병 저항성 벼 식물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea)에 의해 유발되는 도열병은 벼에 있어 전세계적으로 가장 파괴적인 질병 중의 하나이다. 이에 대해 질병 저항성(R) 유전자를 사용하는 것이 상기 질병의 통제를 위한 가장 효과적이며 환경친화적인 방식이다. 벼 도열병 저항성은 일반적으로 하기의 2 가지 유형으로 분류된다; 질적 (완전 또는 주요) 및 양적 (부분 또는 QTL) (Bonman 및 Mackill 1988, Oryza 25: 103-110). 현재까지 벼 도열병에 대한 50 개를 초과하는 많은 수의 주요 저항성 유전자가 맵핑되었으며 (Jeung 등 2007, Theor . Appl . Genet . 115: 1163-1177), 저항성 유전자에 밀접하게 연관된 DNA 마커가 개발되었다.
마그나포르테 그리세아에 대해 완전 저항성(complete resistance)을 가진 벼 재배종이 최근에 개발되었으나, 많은 경우에 보다 더 강력한 악성 균주의 출현으로 상기 저항성은 해당 계통의 초기 재배 수년 내에 소실되었다 (Bonman 및 Mackill 1988, Oryza 25: 103-110). 저항성은 질병 발생에 유리한 환경조건하에서 광범위한 재배에도 불구하고 재배종 내에 유효하게 남아있을 때 내구성이 있는(durable) 것으로 간주되며, 도열병 저항성의 내구성에 대한 가장 강력한 검정은 재배종이 질병 발생에 유리한 환경조건하에서 장기간에 걸쳐 광범위한 영역에 걸쳐 자랄 때 가능하다. 도열병 밭못자리 검정(nursery screening test) 및 악성 균 접종이 도열병 저항성 평가에 일상적으로 사용되어 왔다. 그러나, 도열병 저항성의 내구성에 대한 효과적인 검정법은 아직 확립된 바 없다. SPM(sequential planting method)이 한국 벼 재배종에서 도열병 내구저항성을 동정하기 위해 개발되었다 (Kim 등 2004, Korean J. Breed. 36: 350-356). 가계도분석에서 대부분의 한국 자포니카 재배종은 품종(race) 특이적이며 내구성이 없는 도열병 저항성 유전자, Pia, Pib, Pii, Pik, 및 Pita를 가진 것으로 나타났다 (Cho 등 2007, J. Crop Sci . & Biotech. 10: 265-276). 따라서, 마그나포르테 그리세아의 동적인 도열병 분리균주에 대한 효과적인 대처를 위해 광범위 항균성의 도열병 저항성 유전자를 동정하는 일이 불가피하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 일품벼와 모로베레칸간의 교잡으로 생성된 이입계통을 이용하여 벼 도열병에 대한 저항성 QTL을 동정 및 분석하기 위해 수행되었다. 본 발명으로 벼 개량을 위한 도열병 내구저항성 재배종 개발에 유용한 저항성 유전자 Pi45(t)가 동정되었으며, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌가 포함된 고밀도 유전자지도를 작성함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 일품벼와 모로베레칸간의 여교잡으로 생산된 이입계통을 이용하여 작성된, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌가 포함된 고밀도 유전자 지도를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)를 포함하는 이입계통을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 지도를 이용하여 벼의 도열병 저항성 관련 QTL을 분석하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 지도에 포함된 SSR 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)를 동정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 지도에 포함된 SSR 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성에 대한 QTL을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 지도에 포함된 SSR 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성 벼 식물을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 고밀도 양적형질 유전자 지도는, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 특정 양적형질 유전자좌를 확인함으로써, 벼 도열병 저항성의 유전적 배경에 대한 직접적인 정보를 제공할 수 있는 고밀도 양적형질 유전자 지도이다. 벼 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌를 포함하는 본 발명에 따른 이입계통은 벼 도열병 저항성 관련 QTL을 확인하고 관련 유전자지도를 작성하는데 뿐만 아니라 도열병 저항성 벼 생산을 위한 육종재료로서도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1의 (A)는 도열병 밭못자리 검정(nursery screening test)에서 도열병 저항성에 대한 2 개 QTL의 위치를 보여준다. (B)는 QTL의 고밀도 유전자지도에서 bn4가 4번 염색체상에 위치함을 보여준다. bn4의 위치를 더욱 세밀하게 나타내기 위해, F2 및 F3 집단을 이용하여 추가적으로 7 개의 SSR 마커가 맵핑되었다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼의 두 가지 자포니카 재배종간의 여교잡으로 생산된 이입계통을 이용하여 작성된, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌(QTL)가 포함된 유전자 지도를 제공한다. 본 발명에 사용되는 벼 도열병-저항성 공여 벼 식물은 바람직하게는 야생 벼 수집종일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 모로베레칸일 수 있다. 본 발명에 사용되는 마그나포르테 그리세아-감염 수용 벼 식물은 바람직하게는 상업적으로 바람직한 특징을 갖는 벼 식물, 더욱 바람직하게는 일품벼일 수 있다.
상기 유전자 지도는 구체적으로는 자성친 및 반복친으로서 일품벼 (Ilpumbyeo)와 공여친으로서 모로베레칸 (Moroberekan)간의 여교잡으로 생산된 이입계통을 대상으로 양적형질 유전자 분석을 실시하여 작성된, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌(QTL)를 포함하는 도 1에 도시된 벼의 고밀도 양적형질 유전자 지도이다. 더욱 구체적으로는, 일품벼와 모로베레칸간에 여교잡 2 세대 후, 생성된 BC3F1 집단 1,105 식물체 중 일품벼에 유사한 표현형을 보이는 279 식물체로 구성된 이입계통을 대상으로 SSR 마커를 이용한 유전형분석(genotyping)을 수행하여 작성된 유전자 지도일 수 있다.
상기 양적형질 유전자좌는 4번 염색체상 또는 7번 염색체상에 위치할 수 있으며, 구체적으로는 4번 염색체상의 SSR 마커인 RM3276 및 RM5709 사이에 위치하는 QTL bn4 또는 7번 염색체상의 SSR 마커인 RM234 및 RM134 사이에 위치하는 QTL bn7에 위치할 수 있다.
본 발명의 QTL은 상기 QTL을 포함하는 단리된, 바람직하게는 이중 가닥 핵산서열 또는 그것의 저항성-제공부위의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 적합한 공여 식물의 염색체로부터 단리될 수 있는 핵산 서열의 크기는 상기 염색체에서 1~100cM, 더욱 바람직하게는 10~50 cM의 유전자 거리를 나타낼 것이다. 상기 핵산은 적어도 50, 바람직하게는 적어도 500, 더욱 바람직하게는 적어도 1000, 더 더욱 바람직하게는 적어도 5000개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 QTL 또는 그것의 저항성-제공부위를 포함하는 하나 이상의 핵산 서열은 차례로 핵산 구성물에 포함될 수 있고, 상기 구성물은 추가로 상기 하나 이상의 핵산 서열의 측면에 위치하는 영역을 포함할 수 있고, 상기 영역은 상기 하나 이상의 핵산 서열을 적합한 마그나포르테 그리세아-감염 수용 벼 식물로 전달하기에 적합한 벡터에 병합될 수 있다. 벡터는 추가로 적합한 프로모터 영역 또는 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. QTL은 또한 벼 식물의 게놈 내에 존재하는 형태일 수 있다. 본 발명의 QTL은 바람직하게는 상기 QTL에 연결된 도 1의 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 마커, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개, 더욱 바람직하게는 4개, 더욱 바람직하게는 4개보다 많은 벼 도열병-저항성과 연관된 마커를 포함한다.
상기 QTL bn4는 벼 도열병 저항성 유전자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)를 포함할 수 있다.
상기 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)는 4번 염색체상에 위치할 수 있으며, 구체적으로는 4번 염색체상의 SSR 마커 RM3687 및 RM5709 사이에 근접하여 위치할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 Nipponbare 게놈 서열 (http://rgp.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/statusdb/stattable.pl?chr=4)에 근거한 약 577 kb 구간인, RM3687-RM5709 사이에 근접하여 위치할 수 있으며, 더 더욱 구체적으로는 4번 염색체상의 SSR 마커 RM3687 및 RM17511 사이에 위치할 수 있다.
상기 유전자 Pi45(t)는 모로베레칸으로부터 이입된 것일 수 있으며, 바람직하게는 모로베레칸으로부터 이입된 유전자 단편에 포함된 것일 수 있다. 상기 이입된 유전자 단편은 농업적 형질의 저하에 관여하는 열악유전자들과 연관되지 않은 것이다. 상기 농업적 형질은 바람직하게는 출수까지 일수(days to heading), 간장(culm length), 수장(panicle length), 수수(panicle number), 천립중(1,000 grain weight) 또는 아밀로즈 함량일 수 있다.
상기 유전자 Pi45(t)는 벼 도열병에 대해 저항성을 부여할 수 있으며, 바람직하게는 내구저항성 및 안정적인 저항성을 부여할 수 있다.
상기 "저항성"은 식물이 물질 투여, 병원체 감염, 또는 스트레스에 노출의 결과로서 실질적으로 표현형 변화를 보이지 않는 것을 의미할 수 있으며, 바람직하게는 병원체 감염 시 실질적으로 표현형 변화를 보이지 않는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용된 벼의 도열병 저항성은 마그나포르테 그리세아에 감염 시 유발되는 도열병에 대한 식물의 증가된 저항성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 상기 마그나포르테 그리세아는 1984년부터 2002년까지 한국의 논 및 도열병 실험포장에서 수집된 대표적인 균주이다 (Kim 등 2004, Korean J. Breed. 36: 350-356). 상기 증가된 저항성은 바람직하게는, 상기 균주의 혼합체 또는 개별 균주에 대한 증가된 저항성일 수 있다.
또한, 본 발명은 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)을 포함하는, 자성친 및 반복친으로서 일품벼와 공여친으로서 모로베레칸 간의 여교잡으로 생산된 이입계통을 제공한다. 바람직하게는, 상기 이입계통은 CR5, CR9, CR31 또는 CR59일 수 있다.
상기 이입계통 CR5, CR9, CR31 또는 CR59은 벼 도열병에 대한 저항성을 가질 수 있으며, 바람직하게는 내구저항성 및 안정적인 저항성을 가질 수 있다.
상기 이입계통 CR5, CR9, CR31 또는 CR59은 벼 도열병에 대해 40% 이하의 DLA(Diseased Leaf Area)를 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 0~20%의 DLA를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 도 1에 제시된 SSR 마커를 사용하여, 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45 (t)를 동정하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 SSR 마커는 RM3687, RM3843, RM3836, RM17509, M17511 또는 RM5709일 수 있다.
또한, 본 발명은 도 1에 도식된 SSR 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성에 대한 QTL을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 의심된 벼 도열병-저항성 벼 식물의 염색체 4번 또는 7번의 벼 도열병-저항성에 대한 QTL에 연결된 적어도 하나의 마커를 검출하는 것을 포함하고, 상기 식물의 7번 염색체에서 상기 QTL의 위치는 도 1에 도시된 벼의 7번 염색체의 SSR 마커를 포함하는 게놈 영역에 의해 표시된다. 상기 SSR 마커는 바람직하게는 RM234, RM5426, RM1330, RM5455 또는 RM134일 수 있다. 본 발명의 QTL을 검출하는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 식물의 4번 염색체에서 상기 QTL의 위치는 도 1에 도시된 벼의 4번 염색체의 SSR 마커를 포함하는 게놈 영역에 의해 표시된다. 상기 SSR 마커는 바람직하게는 RM3276, RM17481, RM17488, RM3687, RM3843, RM3836, RM17509, M17511 또는 RM5709일 수 있다.
또한, 본 발명은 도 1에 도식된 SSR 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성 벼 식물을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 SSR 마커는 바람직하게는 RM234, RM5426, RM1330, RM5455, RM134, RM3276, RM17481, RM17488, RM3687, RM3843, RM3836, RM17509, M17511 또는 RM5709일 수 있다.
또한, 본 발명은 목적으로 하는 양적 형질과 이들 DNA 마커들과의 연관성 분석으로 멘델식 유전자좌가 복합적으로 관여하는 양적형질에 대한 유전적 특성을 파악할 수 있는 양적형질 유전자좌 분석방법에 있어서, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 QTL이 4번 또는 7번 염색체에 위치하는 도 1에 도시된 유전자 연관 지도를 이용하는 것을 특징으로 하는 벼의 도열병 저항성 관련 QTL 분석방법을 제공한다. 상기 DNA 마커는 바람직하게는 SSR 마커인 RM234, RM5426, RM1330, RM5455, RM134, RM3276, RM17481, RM17488, RM3687, RM3843, RM3836, RM17509, M17511 또는 RM5709일 수 있다.
본 발명에서 빈번히 사용된 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
이전 연구(Ju 등 2004, Korean J. Breed . 36: 338-344)에서, 279 개의 BC3F2 계통이 일품벼(Ilpumbyeo)와 모로베레칸(Moroberekan)간의 교잡으로 개발되었다. 개발 과정은 하기와 같다. 일품벼와 모로베레칸간의 교잡으로 생성된 F1 식물체는 10 개의 BC1F1를 만들기 위해 일품벼에 여교잡되었다. 한국 우량 재배종인 일품벼가 자성친 및 반복친으로 사용되었다. 서아프리카 열대성 자포니카인 모로베레칸이 공여친으로 사용되었다. 여교잡 2 세대 후, BC3F1 1,105 식물체가 생성되었으며, 일품벼와 유사한 표현형을 보이는 BC3F1 279 식물체를 선발하였다. 상기 BC3F2 279 계통을 SSR 마커를 이용하여 유전형분석(genotyping)을 수행하였으며, 3 세대 자식(selfing) 및 선발을 거쳤다. SSR 유전형에 근거하여, 117 개의 BC3F5 계통을 본 발명에 사용하였다 (Ju 등 2008, Korean J. Breed . 40: 414-421). 117 개의 BC3F5 계통을 2005년 및 2006년 수원 (SW), 제천 (JC) 및 이천 (IC)의, 2006년 및 2007년 대전 (DJ)의 도열병 밭못자리 검정포장에 파종하였다. 시험 계통별 50 개 내지 100 개의 유묘(seedling)를 CRBD(completely randomized block design)로 1 열 (SW, JC, 및 IC) 또는 2 열 (DJ)로 줄뿌림하였다. 가장자리 열과 각 열 주변에는 다양한 병원균 집단을 유지하기 위해 이병성 판별품종을 줄뿌림하였다. 발병정도는 IRRI의 표준평가법 (1996, standard evaluation system for rice, 4th ed.)에 따라 0 (저항성)에서 9 (이병성)까지 점수화하였다. 하나의 BC3F5 계통인 CR5와 일품벼간의 교잡으로 생성된 F2 집단과 F3 계통의 도열병 밭못자리 저항성은 상기 기술된 바와 동일한 과정으로 2007년 및 2008년 각각 대전에서 평가되었다.
수량검정시험은 반복친인 일품벼와 5 개의 선발된 ILs에 대해 수행되었다. 6 개 유전형에 대한 Plots은 3열 CRBD로 두어 하기 6 개 형질에 대해 평가되었다: 출수까지 일수(days to heading), 간장(culm length), 수장(panicle length), 수수(panicle number), 천립중(1,000 grain weight), 및 아밀로즈 함량. 형질 평가 과정은 Xie 등 (2006, Theor . Appl . Genet . 113, 885-894)을 따랐다.
2. DNA 추출 및 분석
DNA를 BC3F5 117 계통 및 두 양친에서 벌크(bulk)로 신선한 잎에서 추출하였다. DNA 추출은 Causse 등 (1994, Genetics 138:1251-1274)의 과정을 따랐다. PCR 및 은염색 과정은 Panaud 등 (1996, Mol . Gen . Genet. 252: 597-607)의 과정을 따랐다. SSR 프라이머 쌍 및 은염색 키트는 Bioneer Co., 한국 (www.bioneer.co.kr)에서 구입하였다.
3. 도열병 접종
두 양친, 팔공벼 및 7 개의 ILs는 개별 균주 29 개뿐 아니라 상기 균주의 혼합체 (표 2)에 대해 분무 접종으로 Jeung 등 (2007, Theor . Appl . Genet . 115: 1163-1177)의 과정에 따라 스크리닝되었다. 접종 평가 및 SPM에 사용된 29 개의 도열병 분리균주는 1984년부터 2002년까지 한국의 논 및 도열병 실험포장에서 수집된 대표적인 균주이다 (Kim 등 2004, Korean J. Breed. 36: 350-356). 모든 접종 및 질병평가는 Jeung 등 (2007, Theor . Appl . Genet . 115: 1163-1177)의 과정을 따랐다.
4. 연계재배법( Sequential planting method )
도열병 저항성 유전자의 내구성을 평가하기 위해 SPM (Kim 등 2004, Korean J. Breed. 36: 350-356)이 사용되었다. 상기 방법에서, 도열병 저항성 정도는 2주 간격으로 일련의 7 회까지 평가되었으며, 첫 회에 4~5 엽 단계에서 식물체에 도열병 분리균주 29 개의 혼합물을 분무하여 인공 접종하였다. 각 재배종 및 라인당 종자 10g을 40x30x10cm 플라스틱 트레이에 7 회차에 대해 7 번 파종하였다. 접종에 이어, 유묘를 습실상(dew growth chamber)에 25℃, 암소에서 24시간 정치한 후, 90% 상대 습도의 온실로 옮겨 7일간 두었다. 2 회부터 7 회까지의 연속 재배 과정에서, 시험 유묘는 충분한 발병 징후를 나타내는 이전 회의 상자에 인접하게 두어 온도가 조절된 온실에서 자연적으로 감염되게 하였다. 유묘를 저녁에는 폴리비닐 시트로 덮어 두었으며, 고습도 유지를 위해 주간 중에는 매일 3 내지 4 회 분무 급수하였다. 발병된 엽면적 (DLA: Diseased Leaf Area)은 벼에 대한 표준 평가 시스템인 IRRI의 표준평가법 (1996, standard evaluation system for rice, 4th ed.)에 따라 가시적으로 평가되었으며, 매 회에 자연 감염 후 14일째 기록하였다. 3 회 반복 조사하였다. 도열병의 내구저항성을 결정하기 위한 기준은 적합한 분리균주의 존재 및 DLA 40% 이하의 발병정도였다 (Kim 등 2004, Korean J. Breed. 36: 350-356).
5. 통계 분석
연관지도는 134 개의 SSR 마커로 작성되었으며, 마커 간의 순서 및 거리는 이전에 작성된 SSR 지도에 근거하였다 (McCouch 등 2002, DNA Res. 9: 199-207). QTLs의 염색체상의 위치는 SPA (single-point analysis) 및 CIM (composite interval mapping)에 의해 결정되었다. SPA 또는 CIM에 의해 검출된 QTLs은 서로 일치하였다.
실시예 1. 도열병 실험포장에서 유전자이입 계통( introgression line )의 발병
양친 및 117 개의 유전자이입 계통 (ILs: BC3F5 계통)이 2005년, 2006년 및 2007년, 각각 4 개의 도열병 밭못자리에서 도열병 발병정도에 대해 스크리닝되었다. 3년간 일품벼는 평균 7.1점을 보였으며, 한편 모로베레칸은 모든 도열병 실험포장에서 포장 분리균주에 대해 완전 저항성(complete resistance)을 나타내었다. 대부분의 ILs은 지역 및 연도에 걸쳐 도열병 밭못자리 검정에서 유사한 반응을 보였다 (자료 미제시).
실시예 2. 도열병 실험포장에서 도열병 반응의 QTL 분석
4번 및 7번 염색체상에 2 개의 QTLs이 도열병 밭못자리 검정에 대한 저항성에 대해 동정되었다 (표 1). 2 개의 SSR 마커 RM3276 및 RM5709 사이에 위치하는 QTL bn4는 3년간 모든 도열병 실험포장에서 탐지되었으며, 상기 QTL이 표현형 변이의 16.8 내지 35.9%를 설명한다. QTL, bn7은 SSR 마커, RM234-RM134 부근에 위치하며, 2005년에는 2 지역 (JC 및 IC)에서, 2006년에는 4 지역 (JC, IC, SW 및 DJ)에서 탐지되었다. 상기 QTL에 의해 설명되는 표현형 변이의 백분율은 4.0% 내지 14.8%이다 (표 1). 양 좌위에서 모로베레칸 대립인자는 도열병 밭못자리 검정에서 저항성을 나타낸다. 각 QTL에 의해 설명되는 표현형 변이에 있어 또는 QTL의 탐지능에 있어 년간 변이는 주로 집단 및 환경 영향에 있어서의 도열병 저항성에 대한 분리에 기인하는 것으로, 데이터 분석을 와해시킨다.
일품벼/모로베레칸 집단에서 탐지된 도열병 저항성 QTLs

QTL
염색체
SSR 마커
 2005 2006 2007
제천 인천 수원 대전 제천 수원 인천 대전
R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2
bn4 4 RM3276-RM5709 35.9 31.1 18.5 21.4 16.8 20.6 24.8 28.2
bn7 7 RM234-RM134 10.4 13.4 - 9.3 4 14.8 4.6 -
실시예 3. Pi45 (t)의 연관분석
BC3F5 117 계통 중, 한 라인인 CR5가 QTL, bn4의 유전분석을 위해 선발되었다. 상기 라인에는 표적 구간 (도열병 밭못자리 검정에서 저항성과 연관된, 4번 염색체상의 마커 RM3276 및 RM3306에 의해 동정된)에 모로베레칸의 유전자가 이입(introgression)되었으며, 3 개의 비표적 모로베레칸 염색체 단편이 게놈상의 다른 곳에 있다. CR5 라인에는 bn7을 포함하는 모로베레칸 단편이 없다. 목표 구간에서 이형접합체인 CR5의 한 식물체를 자식(selfing)하여, 4번 염색체상의 목표 구간에 대해 분리하는 F2 집단 및 F3 계통을 만들었다. F2 252 식물체 중 176 개체가 2 점 미만의 저항성을 보였으며, 한편 76 개체는 6점을 초과하는 높은 이병성을 보였다 (3:1 ratio;χ 2 = 3.51, 0.05 < P < 0.1). F3 계통은 2 회 반복으로 실시하였는데 17 계통은 3 점 미만의 평균 저항성을 나타내었다. 45 계통의 평균은 3.5 내지 6.0점이었으며, 한편 20 계통은 6.5 내지 9점이었다 (1:2:1 ratio;χ 2 = 2.11, 0.1 < P < 0.5). 상기와 같은 유전 양상은 Pi45(t)로 표시된 주요 우성 유전자가 도열병 밭못자리 검정에 대한 저항성을 조절한다는 것을 나타낸다. 양친간에 이형성(polymorphism)을 보이는 7 개의 SSR 마커가 82 개의 F3 계통에서 도열병 저항성에 대해 분리되는 것이 확인되었다 (도 1). 연관 분석은 도열병 밭못자리 검정에 대한 저항성 유전자가 Nipponbare 게놈 서열 (http://rgp.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/statusdb/stattable.pl?chr=4)에 근거한 약 577 kb 구간인, RM3687-RM5709 사이에 근접하여 맵핑되었음을 보여준다.
실시예 4. 저항성 유전자 상동체 추정
SSR 마커 RM17511 및 RM3687 사이에 위치하는 Pi45 (t)를 포함하는 염색체의 표적 구간에 저항성 유전자 상동체의 존재를 탐지하기 위해 BAC의 annotation 데이터가 사용되었다. SSR 마커, RM17511 및 RM3687의 프라이머 서열은 B1356F10 및 OSJNBa0041J17 (http://www.tigr.org) 각각의 BAC 클론에 매치하였다. 2 개의 SSR 마커 사이에 위치하는 구간은 질병 저항성에 관여되는 다양한 상동체인 5 개의 추정 유전자를 포함하고 있었다.
117 개의 계통 중에서 Pi45 (t) 유전자를 보유하는 4 개 그리고 보유하지 않는 3 개의 ILs을 선정하여 SPM을 사용하여 도열병의 내구저항성을 평가하였다. Pi45(t) 공여 라인, 모로베레칸은 한국 도열병 분리균주에 대해 강한 저항성을 보였다. 양친 및 check 재배종, 27 개의 ILs의 연계재배의 각 회차별 식물체의 DLA를 조사하였다 (표 2). 재배종 팔공벼는 도열병에 대해 내구저항성을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 30%의 DLA를 넘지 않는 소수의 이병성 병반을 유지하였으며, 일품벼는 연계재배의 모든 회에 연속적으로 높은 율의 DLA (> 60%)를 보였다. Pi45(t) 유전자를 가진 4 개의 ILs인 CR5, CR9, CR31 및 CR59는 ILs 연속 재배 회차 중에 0-20%의 DLA를 보였으며, 한편 상기 유전자를 가지지 않은 3 개의 ILs (CR43, CR93 및 CR94)는 7 회까지 45%였다. 모로베레칸은 전혀 도열병 병반을 보이지 않았다. 따라서, 질병 역치 지수로서 DLA 40%를 고려할 때, 상기 재배종이 도열병 감염증에 대해 연속적인 저항성 스펙트럼을 보여주는 것과 같이, 팔공벼 및 Pi45(t)를 가진 4 개의 ILs가 한국 도열병 분리균주에 대해 고도의 내구저항성을 나타내었다. 상기 결과는 Pi45(t)가 한국 벼 도열병에 대해 내구저항성 및 비교적 안정적인 저항성을 가진다는 것을 나타낸다.
7 개의 ILs 및 양친 계통에 있어 연계재배법에 의한 해당 분리균주의 발병정도 및 친화성 균주의 수

계통		 발병된 엽면적 (%) 친화성 균주의 수**
1회 2회 3회 4회 5회 6회 7회 평균*
CR5 0.6 0.3 0.1 0.8 0.6 0.5 0.8 0.6d 3
CR9 11.5 12.8 5.8 9.3 12.5 6.3 5.3 9.0d 8
CR31 3 0.5 0.5 0.6 0.5 2.5 2.1 1.3d 5
CR59 3.5 1.3 1.4 4.5 3.5 1.9 3.3 2.7d 8
CR43 18.8 27.5 25 40 55 42.5 45 26.3c 9
CR93 27.5 37.5 40 42.5 55 46.3 50 42.7b 12
CR94 55 62.5 67.5 67.5 70 60 50 61.8a 12
일품벼 50 60 67.5 65 72.5 70 60 65.0a 15
모로베레칸 2.7 2.5 2.5 7.5 5 1.5 2.5 3.5d 1
팔공벼 30 5 1.3 2 4 0.2 0.1 6.1d 15
* 동일 문자가 딸린 숫자는 Duncan's multiple range test에 따라 5% 수준에서 유의하게 다르지 않다.
**해당 계통과 친화성 균주의 수
Pi45(t)를 포함하는 유전자이입 단편이 주요 농업 형질에 영향을 미치는 유전자를 포함하고 있는지의 여부를 알아보기 위해 5 개의 ILs (목표 유전자 전영역에 걸쳐 모로베레칸 동형접합체) 및 일품벼의 종자를 사용하여 수량검정시험을 수행하였다. 모두 6 개의 유전형에 대한 Plots이 3줄 CRBD로 배치되었다. 2 개의 ILs인 CR11 및 CR31은 출수까지 일수(days to heading), 간장(culm length) 및 수수(panicle number)에 있어 일품벼와는 유의한 차이를 보였다. 출수까지 일수, 간장 및 수장(panicle length)에 있어 일품벼 및 두 ILs간의 상기 차이는 4번, 6번 및 7번 염색체상의 비표적 모로베레칸 단편에 의한 것이다 (Ju 등 2008, Korean J. Breed. 40: 414-421). 수수, 천립중(1,000 grain weight) 및 아밀로즈 함량의 3 개 형질에 대해 5 개의 ILs 및 일품벼간에 유의한 차이가 검출되지 않았다. 상기 결과는 Pi45(t) 유전자 인근의 모로베레칸 염색체 구간이 다른 농업적 형질에 미치는 유전자들을 포함하지 않음을 나타내는 것이다 (표 3).
5 개의 유망한 ILs와 일품벼간의 농업적 수행의 비교
재배품종
/계통		 DTH*
(일)		 CL
(cm)		 PL
(cm)		 PN
(no.)		 GW
(g)		 AC
(%)		 비표적 모로베레칸 단편
수 염색체 백분율(%)
CR5 115b 84.0b 24.3a 15a 19.8a 18.6a 6 4,5,6,8,9 12.4
CR9 117b 85.4a 21.7b 15a 19.9a 19.2a 2 3,4 3.5
CR11 119a 89.7a 24.5a 14a 21.4a 19.8a 5 4,7,9 11.7
CR31 119a 84.4a 19.6c 14a 20.7a 18.5a 8 3,4,5,6,9,10,11,12 8.8
CR59 117b 81.4b 23.6a 16a 20.5a 18.7a 6 1,2,4,6 5.4
일품 116b 83.1b 21.8b 14a 20.9a 18.8a - - 0
* DTH: 출수까지 일수(days to heading), CL: 간장(culm length), PL: 수장(panicle length), PN: 수수(panicle number), GW: 천립중(1,000 grain weight), AC: 아밀로즈 함량. 각 열에서 동일 문자가 딸린 숫자는 5% 수준에서 유의하게 다르지 않다.
없음.

Claims (17)

  1. 자성친 및 반복친으로서 일품벼 (Ilpumbyeo)와 공여친으로서 모로베레칸 (Moroberekan)간의 여교잡으로 생산된 이입계통(introgression line population)을 대상으로 양적형질 유전자 분석을 실시하여 작성된 벼의 도열병 저항성에 관여하는 양적형질 유전자좌(QTL)를 포함하는 것을 특징으로 하는 도 1에 도시된 벼의 고밀도 양적형질 유전자 지도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양적형질 유전자좌는 4번 염색체상의 SSR 마커인 RM3276 및 RM5709 사이에 위치하는 QTL bn4인 것을 특징으로 하는 양적형질 유전자 지도.
  3. 제1항에 있어서, 상기 양적형질 유전자좌는 7번 염색체상의 SSR 마커인 RM234 및 RM134 사이에 위치하는 QTL bn7인 것을 특징으로 하는 양적형질 유전자 지도.
  4. 제2항에 있어서, 상기 QTL bn4는 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)를 포함하는 것을 특징으로 하는 양적형질 유전자 지도.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)는 4번 염색체상의 SSR 마커 RM3687 및 RM5709 사이에 근접하여 위치한 것을 특징으로 하는 유전자 지도.
  6. 제4항에 있어서, 상기 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)는 4번 염색체상의 SSR 마커 RM3687 및 RM17511 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 유전자 지도.
  7. 제4항에 있어서, 상기 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)는 모로베레칸으로부터 이입된 유전자 단편에 포함된 것임을 특징으로 하는 유전자 지도.
  8. 제4항에 있어서, 상기 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)는 벼 도열병에 대해 내구저항성 및 안정적인 저항성을 부여하는 것을 특징으로 하는 유전자 지도.
  9. 제7항에 있어서, 상기 이입된 유전자 단편은 다른 농업적 형질의 저하에 관여하는 열악유전자들과 연관되지 않은 것임을 특징으로 하는 유전자 지도.
  10. 제4항의 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)을 포함하는, 자성친 및 반복친으로서 일품벼 및 공여친으로서 모로베레칸 간의 여교잡으로 생산된 이입계통(introgression lines).
  11. 제10항에 있어서, 상기 이입계통은 CR5, CR9, CR31 또는 CR59인 것을 특징으로 하는 이입계통.
  12. 제10항에 있어서, 상기 이입계통은 벼 도열병에 대한 내구저항성 및 안정적인 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는 이입계통.
  13. 제10항에 있어서, 상기 이입계통은 벼 도열병에 대해 0~20%의 DLA(Diseased Leaf Area)를 나타내는 것을 특징으로 하는 이입계통.
  14. SSR 마커인 RM3687, RM3843, RM3836, RM17509, M17511 및 RM5709 중에서 선택된 유전자 마커를 이용하여, 벼 도열병 저항성 유전자 Pi45(t)를 동정하는 방법.
  15. 도 1에 도식된 SSR 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성에 대한 QTL을 검출하는 방법.
  16. 도 1에 도식된 SSR 마커로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 마커를 이용하여 벼 도열병 저항성 벼 식물을 검출하는 방법.
  17. 목적으로 하는 양적 형질과 이들 DNA 마커들과의 연관성 분석으로 멘델식 유전자좌가 복합적으로 관여하는 양적형질에 대한 유전적 특성을 파악할 수 있는 양적형질 유전자좌 분석방법에 있어서, 벼의 도열병 저항성에 관여하는 QTL이 4번 또는 7번 염색체에 위치하는 도 1에 도시된 유전자 연관 지도를 이용하는 것을 특징으로 하는 벼의 도열병 저항성 관련 QTL 분석방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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