CN117305506B - 一种精准的水稻稻曲病抗性基因鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻基因定位和抗病育种技术领域，具体为一种精准的水稻稻曲病抗性基因鉴定方法。该方法包括以下步骤：(1)亲本筛选；(2)群体构建；(3)抗性鉴定；(4)构建抗感基因混池；(5)遗传图谱定位水稻稻曲病抗性QTL；(6)BSA‑seq关联分析定位水稻稻曲病抗性QTL；(7)候选基因分析。在该方法中，通过对传统QTL定位和BSA‑seq方法进行改进，并结合传统QTL定位和BSA‑seq方法的优点，避开缺点，大大的提高了抗性基因鉴定的准确性和效率。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因定位和抗病育种技术领域，具体为一种精准的水稻稻曲病抗性基因鉴定方法。
背景技术
水稻稻曲病(Rice false smut)是水稻穗部重要的真菌病害，是由子囊菌麦角菌属真菌Ustilaginoidea virens(Cooke)Tanaka侵染穗子引起的真菌病害，受害的穗粒形成大于谷粒数倍的稻曲球。稻曲球不但影响水稻的产量和品质，而且产生对人和牲畜有剧毒作用的毒素。稻曲病是一种世界性的病害，在我国，由于受栽培条件、品种以及气候等因素的影响，稻曲病发生面积和程度日趋加大。生产实践证明，选育和种植抗病品种是稻曲病最经济、最环保和最有效的措施，而抗病基因的鉴定和挖掘则是提高水稻品种抗性的有效途径。
水稻对稻曲病的抗性属于数量性状(QTL)控制的抗性。近些来年，研究者们已对稻曲病抗性基因进行了研究，采用的方法大多是传统QTL作图法定位抗性基因(李余生等，2008；韩彦卿，2015；何焕然，2018)。但传统QTL定位法需要构建高世代群体，群体样本大，耗时、耗力，且田间稻曲病抗性评价易受环境条件的影响常常导致抗性品种鉴定不准确，因此容易鉴定到假阳性抗性位点。随着测序技术的发展，高通量测序技术已应用到基因定位中，BSA-seq是一种快速、高效的基因定位法，鉴定与目标性状关联的QTLs(陈子强等，2021；蒋家焕等2022)。其方法的具体步骤是：首先是构建F2代分离群体，其次是在F2群体中挑选极高/低单株，构建极高/低单株DNA混池；三是利用群体分离分析法(Bulked segregantanalysis，BSA)定位关联分析。但BSA-seq用于抗性基因定位仍然存在一些问题：一是F2群体抗性表型鉴定时容易出现假阳性，极端混池中出现抗感DNA混合，最终导致抗性基因关联分析不准确；二是关联分析的亲本单一，导致关联分析产生一些假阳性信号。
发明内容
本发明的目的是根据现有技术存在的问题，提供一种精准的水稻稻曲病抗性基因鉴定方法。在该方法中，通过对传统QTL定位和BSA-seq方法进行改进，并结合传统QTL定位和BSA-seq方法的优点，避开缺点，大大的提高了抗性基因鉴定的准确性和效率。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：
一种精准的水稻稻曲病抗性基因鉴定方法，包括以下步骤：
(1)亲本筛选：IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为抗病品种，桂朝2号和9311为感病品种。
(2)群体构建：以IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为父本，以桂朝2号为母本，将父本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1与母本桂朝2号杂交获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体；
(3)抗性鉴定：在水稻孕穗的第7-8期，采用人工注射接种体的方法接种步骤(1)中亲本和步骤(2)中F2分离群体中的各个单株进行抗性表型性状鉴定。(4)构建抗感基因混池：从步骤(3)中F2群体选取20个高抗单株和20个高感单株，采用CTAB法提取高抗单株和高感单株的DNA，将20个高抗单株DNA和20个高感单株DNA分别等量混合构成抗病基因池和感病基因池。
(5)遗传图谱定位水稻稻曲病抗性QTL
a.采用常规CTAB法分别提取步骤(2)中父本DNA、母本DNA和F2群体各个单株基因组DNA。
b.抗性连锁标记筛选：利用选出的SSR引物对步骤(5)a中父本DNA和母本DNA，以及步骤(4)中抗病基因池中的DNA和感病基因池中的DNA进行PCR扩增，筛出在亲本间与抗感池中表现为多态性的SSR分子标记RM5341和RM28196。
c.在步骤(5)b中获得的多态性分子标记附近设计SSR分子标记，筛选到在亲本间具有多态性的4个标记RM1158、RM1103、RM28472和RM1047，用这6对SSR多态性引物分析F2群体各个单株的基因型。
d.将步骤(5)c中F2群体分析的基因型用QTL ICiMapping4.0软件计算出分子标记间的连锁遗传距离并绘制连锁图谱，再根据步骤(3)中F2群体鉴定的表型进行复合区间作图定位QTL。
e.从步骤(5)d中定位的QTL位于第12号染色体18,152,114bp
～19,155,838bp之间。
(6)BSA-seq关联分析定位水稻稻曲病抗性QTL
a.测序：检测亲本与步骤(4)中两个混池的基因组DNA质量，样品DNA合格后用于构建测序文库，对测序文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，将合格的文库通过IlluminaNovaSeq测序仪进行高通量测序；
b.基因型分析：将步骤(6)a中获得的高质量数据reads对比到水稻参考基因组，统计样品的测序深度、基因组覆盖等信息，采用GATA软件筛选SNP多态性标记。
c.ED值分析：将步骤(6)b中的获得的SNP做进一步的过滤，然后利用ED方法计算关联值。
d.候选区域：将步骤(6)c中的ED值4次方，并对ED4进行Loess Fit拟合，选取中位数+3*标准差为阈值，高于阈值的区域作为候选区间；获得位于6号染色体上1个区间0bp～805,366bp，12号染色体上3个区间：
10,575,821bp～12,234,025bp、15,758,178bp～19,055,436bp和21,494,927bp～23,703,456bp，推测这4个区间为稻曲病抗性关联区域。
(7)候选基因分析
将步骤(5)e中定位的结果与步骤(6)d中定位的结果进行对比，发现在12号染色体上存在1个重叠区间，其物理距离为18,152,114bp～19,055,436bp区间，区间大小为0.903Mb，这个区域作为稻曲病抗性基因的候选区域；利用GO(Gene Ontology)、KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)、NR(Non-Red undant Protein Sequence)数据库以及水稻基因注释数据库对候选区域内的基因进行注释，预测功能与抗病相关的基因作为候选基因。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤(3)中的接种体为3个以上强致病力且不同来源地的稻曲病菌混合菌，具体可以为4个、5个、6个等等。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤(3)中的接种体要通过过滤，过滤掉稻曲病菌在液体培养基中产生的毒素次生代谢产物。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤(5)c中设计的SSR分子标记数≥30个。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤(6)a中的亲本为3个：其中1个抗病品种、2个感病品种。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤(6)c中的过滤条件为：一是保留亲本基因型纯化且不一致的SNP位点，二是去除亲本深度低于15x的点，三是去除子代混池深度低于15x的点。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤(7)中的候选区域为两种定位方法定位区间的交集区域。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(一)、抗性表型鉴定更为准确：本发明采用强致病力且不同来源地的混菌作为接种体，稻曲病菌混菌的致病性强于单个菌株；同时排除了稻曲病菌毒素等代谢产物对水稻穗子的毒害作用。
(二)、本发明在遗传图谱定位水稻稻曲病抗性QTL时构建了极端混池进行SSR引物多态性筛洗，而无需用所有的SSR引物对F2分离群体单株进行基因型鉴定(传统筛选方法)，极大地降低了试验成本，提高了SSR分子标记筛选效率。
(三)BSA关联分析更准确：本发明用一个抗病品种和两个感病品种作为亲本进行BSA性状关联分析(常规只用一个抗病材料和一个感病材料作为亲本进行性状关联分系)，极大的提高了目标性状关联分析的准确性。
(四)基因鉴定更精准：本发明的候选区域是在遗传图谱QTL定位的基础上再采用BSA-seq关联分析定位，可快速锁定候选区间，缩小目标基因的候选区域，提高了基因鉴定的精确性。
(五)本发明提供的精准水稻稻曲病抗性基因鉴定方法应用于水稻抗性基因定位和分子育种中，将会加快水稻抗性基因定位的效率和精准率，为水稻抗性基因定位领域提供了精准、快速、廉价的新方法，对于水稻重要抗性基因定位和克隆具有重要意义。
附图说明
图1为12号染色体的水稻稻曲病抗性QTL定位图谱；
图2为SNP在染色体上的分布图；
图3为候选区间在染色体上实际物理位置的示意图。
图4为利用qRT-PCR方法检测19个候选基因在抗病品种IR27与感病品种GC2、9311穗子中的表达模式。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在以下试验中，未提及的步骤为现有技术。
在本申请中，抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为现有技术，如伏荣桃,陈诚,王剑等.抗稻曲病水稻种质资源筛选与评价[J].南方农业学报,2022,53(01):78-87.
父本抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1也可以采用抗病品种IR28替代，抗病品种IR28为现有技术，如余功新,张端品,谢岳峰等发表的水稻品种IR28对我国白叶枯病菌系抗病基因定位研究[J]作物学报,1990(02):139-152。
感病品种9311为现有技术，如张月雄,梁海福,秦钢等发表的籼稻品种9311抗白叶枯基因鉴定和定位[J].分子植物育种,2018,16(02):460-465.
实施例1
一种精准的水稻品种稻曲病抗性基因鉴定方法，该方法包括以下步骤：
1、亲本筛选
2015-2020年连续6年对多个水稻品种(市售或国际水稻研究所赠送)进行稻曲病抗性鉴定(表1)，其中筛选出IR77298-14-1-2::IRGC117374-1(IR27，来自国际水稻研究所，该研究所简称IRRI)对稻曲病抗病持续表现为高抗，桂朝2号(GC2，市售，现有技术)、9311(来自长沙德农正成水稻研究所)对稻曲病表现为高感；从鉴定结果，再综合考虑各品种的农艺性状和生育期等因素。最后以IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为抗病亲本、桂朝2号和9311为感病亲本。
表1水稻品种稻曲病抗性鉴定结果
2、群体构建
2021年将IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1(IR27，父本)与桂朝2号(GC2，母本)杂交获得杂种F1，于2021年冬在海南陵水将F1自交获得F2，于2022年在农科院试验基地种植F2分离群体。
3、接种体培养
稻曲病菌致病力测定：2018-2020年，采用人工注射接种的方法，连续3年对水稻稻曲病菌菌株进行致病力测定(表2)，将连续3年对水稻穗子致病穗率≥60％的菌株鉴定为强致病力菌株，水稻稻曲病菌菌株致病力测定为现有技术，致病力菌株的鉴定可参考文献
Fu RT,Chen C,Wang J,Zhao LY,Lu DH.Diversity analysis of the ricefalse smut pathogen Ustilaginoidea vire ns in Southwest China[J].J.Fungi,2022,8,1204。
表2稻曲病菌致病力测定结果
病原菌培养：筛选在田间鉴定为强致病力、不同来源地的稻曲病菌菌株5个(如：Fy399、PX·D25、GH·BL、PJ1、QL·SQD12)分别接种于马铃薯蔗糖固体培养基上27℃培养7d，取稻曲病菌边缘菌丝块接种于马铃薯蔗糖液体培养基中，27℃摇床中培养12d，过滤离心收集菌丝和分生孢子，当接种时，将5个稻曲病菌的菌丝和分生孢子进行混合，重新悬浮在无菌的PS液体培养基中，制成混合菌的菌丝片段-孢子悬浮液，作为接种体。
4、稻曲病抗性鉴定
在亲本、F2群体水稻孕穗的第7-8期，采用人工注射接种体的方法接种幼穗，接种后盖上遮阳网和保湿，以保证相对湿度在85％以上，温度为28～30℃，保湿7d。接种3周后，调查稻曲病的病穗数、每穗病粒数等并统计其发病情况，按照农业行业标准《稻曲病抗性鉴定技术规程》(NY/T 3625-2020)进行评价抗病和感病。
评价标准：免疫(I)：病情指数DI＝0；高抗(HR)：0.0＜DI≤5.0；抗病(R)：5.0＜DI≤10.0；中抗(MR)：10.0＜DI≤20.0；中感(MS)：20.0＜DI≤40.0；感病(S)：40.0＜DI≤60.0；高感(HS)：60.0＜DI≤100.0。感病亲本GC2、9311的抗性表现级别为感病以上，抗性亲本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1表现为抗病以上；F2群体穗期的病情指数(DI)呈连续分布，说明材料抗性是由多基因控制的数量性状。
5、构建抗感基因混池
根据稻曲病抗性表型分别选择高抗单株20株和高感单株20株，对高抗单株和高感单株提取DNA，每株DNA等量混合，获得抗病基因池DNA和感病基因池DNA。
6、遗传图谱定位水稻稻曲病抗性QTL
a.采用常规CTAB法分别提取IR27(父本)、GC2(母本)、9311以及F2群体各个单株的基因组DNA；
b.抗性连锁标记筛选：利用选出的SSR引物对IR27(父本)、GC2(母本)、9311以及抗病基因池DNA和感病基因池DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：总体积20μL，DNA模板1μL，SuperPCR Mix 17μL，正反引物各1μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸6min。筛出在亲本间以及抗感池中表现为多态性的SSR分子标记RM5341和RM28196。
c.在多态性分子标记RM5341和RM28196附近设计30个SSR分子引物，筛选到在亲本间具有多态性的4个标记RM1158、RM1103、RM28472和RM1047，用这6对SSR多态性引物分析F2群体各个单株的基因型。
其中分子标记RM28196：
正向引物序列为：5’-CCTAGTTCAGCTCCTGCTTACC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物序列为：5’-CTCAGATGTAGGGAATGTTTGC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
RM5341：
正向引物序列为：5’-CATCCGGAGGAAGTTTGAAAGAAGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
反向引物序列为：5’-CAAGGGCAACCTCTTCCACTACGC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
分子标记RM1158：
正向引物序列为：5’-GTCCATAATCCGGTTGCTATTAGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
反向引物序列为：5’-ACAGGATCATGTCGCAATCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
RM1103：
正向引物序列为：5’-GTCGGTGTGTACTCCGTGTTTGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；
反向引物序列为：5’-CATATGCAGTGGTCAGTGGAGTGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
RM28472：
正向引物序列为：5’-GCTATGAACCTGTACACATGTAGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
反向引物序列为：5’-GAGCACCATAACAATCAGTTGC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
RM1047：
正向引物序列为：5’-CACCTGGCTCCTCATCAAGTACC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；
反向引物序列：5’-TGGCTTAGTCTTGTGGAGACACG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
d.根据F2群体各个单株的基因型，应用QTL ICiMapping4.0软件计算出分子标记间的连锁遗传距离并绘制连锁图谱；在根据F2群体田间表型，利用QTL ICiMapping4.0软件进行复合区间作图定位QTL(图1)。
e.根据SSR分子标记在染色体上的物理位置，将QTL定位于第12号染色体18,152,114bp～19,155,838bp区间。
7、BSA-seq关联分析定位
a.测序：通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测亲本IR27、GC2、9311以及两个抗感混池的基因组DNA质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量检测；样品DNA合格后用于构建测序文库，对测序文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，将合格的测序文库通过IlluminaNovaSeq测序仪进行2×150bp的双端测序；
b.基因型分析：采用bwa(0.7.12-r1039)mem程序对获得的亲本、抗感混池5个样本的高质量reads对比到水稻参考基因组上，分别统计每个样品的测序深度、基因组覆盖等信息；采用GATA软件来进行SNP检测，为了保证SNP位点的可靠性，进一步对获得的SNP位点进行过滤。为了定位目标性状，每组性状相关样本一起call群体SNP，经过过滤后对最终得到的群体SNP在每个样本中的数目如表3。以滑窗统计SNP的数目，每条染色体上SNP的分布情况如图2。
表3群体SNP在每个样本中的统计结果
c.ED值分析：将获得的SNP做进一步的过滤，过滤条件为：一是保留3个亲本基因纯合且不一致的SNP位点，二是去除亲本深度低于15x的点，三是去除子代混池深度低于15x的点；然后利用ED方法计算关联值，计算公式如下：
其中(ATCG)mut为感混池碱基的频率，(ATCG)wt为抗池碱基的频率。
d.候选区域：将ED值4次方，并对ED4进行Loess Fit拟合，选取中位数+3*标准差为阈值，高于阈值的区域作为候选区间，在NC_029261.1上获得位于6号染色体上1个区间0bp～805,366bp，在NC_029267.1上获得12号染色体上3个区间：10,575,821bp～12,234,025bp、15,758,178bp～19,055,436bp和21,494,927bp～23,703,456bp，据此推测6号染色体和12号染色体上的这4个区间为稻曲病抗性关联区域。
8、候选基因分析
由上可知，由遗传图谱定位的QTL区间位于第12号染色体的18,152,114bp～19,155,838bp区间和由BSA-seq定位出的第12号染色体上的15,758,178bp～19,055,436bp区间这两个物理位置有重叠，因此，取它们的交集区间作为最终的抗性候选区间，即最终的候选区间为第12号染色体上18,152,114bp～19,055,436bp区间，区间大小为0.903Mb(图3)，因此，这个区域作为稻曲病抗性基因的候选区域，利用GO、KEGG、NR数据库和水稻基因注释数据库(http://rice.uga.edu/index.shtml)对候选区域内的基因进行注释，预测功能与抗病相关的基因作为候选基因，共得到19个候选基因。
9、候选基因表达模式分析
19个候选基因在3个亲本IR27(抗病)、GC2(感病)和9311(感病)中qRT-PCR分析结果可看出，LOC_Os12g30570、LOC_Os12g30590、LOC_Os12g31160、LOC_Os12g30760、LOC_Os12g31200和LOC_Os12g31748在抗病亲本IR27中的表达量显著高于两个感病亲本GC2和9311(图4)，表明这6个基因与稻曲病抗性密切相关。
综上，采用本发明的方法，成功定位出1个与水稻稻曲病抗性相关的基因组区域；采用本发明方法，能鉴定出与目标性状关联的多个基因，提高了基因定位效率；采用不同的定位方法取物理位置相同的候选区间交集，可以缩小目标基因的候选区域，使定位基因更精准。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种精准的水稻稻曲病抗性基因鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）亲本筛选：以IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为抗病品种，桂朝2号和9311为感病品种；
（2）群体构建：以IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为父本，以桂朝2号为母本，将父本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1与母本桂朝2号杂交获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体；
（3）抗性鉴定：在水稻孕穗的第7-8期，采用人工注射接种体的方法接种步骤（1）中亲本和步骤（2）中F2分离群体中的各个单株进行抗性表型性状鉴定；所述接种体为3个以上强致病力且不同来源地的稻曲病菌混合菌；接种体要通过过滤，过滤掉稻曲病菌在液体培养基中产生的毒素次生代谢产物；
（4）构建抗感基因混池：从步骤（3）中F2群体选取20个高抗单株和20个高感单株，采用CTAB法提取高抗单株和高感单株的DNA，将20个高抗单株DNA和20个高感单株DNA分别等量混合构成抗病基因池和感病基因池；
（5）遗传图谱定位水稻稻曲病抗性QTL
a. 采用常规CTAB法分别提取步骤（2）中父本、母本、F2群体各个单株基因组DNA；
b.抗性连锁标记筛选：利用选出的SSR引物对步骤（5）a中父本DNA和母本DNA，以及步骤（4）中抗病基因池DNA和感病基因池DNA进行PCR扩增，筛出在亲本间与抗感池中表现为多态性的SSR分子标记RM5341和RM28196；
c. 在步骤（5）b中获得多态性分子标记附近设计SSR分子标记，筛选到在亲本间具有多态性的4个标记RM1158、RM1103、RM28472和RM1047，用这6对SSR多态性引物分析F2群体各个单株的基因型；设计的SSR分子标记数≥30个；
d. 将步骤（5）c中F2群体分析的基因型用QTL ICiMapping4.0软件计算出分子标记间的连锁遗传距离并绘制遗传图谱，再根据步骤（3）中F2群体鉴定的表型进行复合区间作图定位QTL；
e. 从步骤（5）d中定位的QTL位于第12号染色体18,152,114bp ~19,155,838bp之间；
（6）BSA-seq关联分析定位水稻稻曲病抗性QTL
a. 测序：检测亲本与步骤（4）中两个混池的基因组DNA质量，样品DNA合格后用于构建测序文库，对测序文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，将合格的文库通过IlluminaNovaSeq测序仪进行高通量测序；所述的亲本为3个，1个抗病品种、2个感病品种；
b. 基因型分析：将步骤（6）a中获得的高质量数据reads对比到水稻参考基因组，统计样品的测序深度、基因组覆盖信息，采用GATA软件筛选SNP多态性标记；
c. ED值分析：将步骤（6）b中的获得的SNP做进一步的过滤，然后利用ED方法计算关联值；过滤条件为，一是保留亲本基因型纯化且不一致的SNP位点，二是去除亲本深度低于15x的点，三是去除子代混池深度低于15x的点；
d. 候选区域：将步骤（6）c中的ED值4次方，并对ED4进行Loess Fit拟合，选取中位数+3*标准差为阈值，高于阈值的区域作为候选区间；获得位于6号染色体上1个区间0bp~805,366bp，12号染色体上3个区间：10,575,821bp~12,234,025bp、15,758,178bp~19,055,436bp和21,494,927bp~23,703,456bp，推测这4个区间为稻曲病抗性关联区域；
（7）候选基因分析
将步骤（5）e中定位的结果与步骤（6）d中定位的结果进行对比，发现在12号染色体上存在1个重叠区间，其物理距离为18,152,114bp~19,055,436bp区间，区间大小为0.903Mb，这个区域作为稻曲病抗性基因的候选区域；利用GO、KEGG、NR数据库以及水稻基因注释数据库对候选区域内的基因进行注释，预测功能与抗病相关的基因作为候选基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（7）中的候选区域为两种定位方法定位区间的交集区域。
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