CN107893127A

CN107893127A - 水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及应用

Info

Publication number: CN107893127A
Application number: CN201711497959.0A
Authority: CN
Inventors: 李容柏; 施力军; 刘芳; 罗登杰; 覃宝祥
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107893127B

Abstract

本发明公开了一种水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记，以及扩增该分子标记的引物对。发明人通过群体构建，将广西野生稻抗源DY19(♂)与9311(♀)杂交及回交、自交获得的BC3F2后代，并进行抗性鉴定及分子遗传连锁分析，获得与抗细菌性条斑病基因紧密连锁的分子标记SL41。本发明所开发的分子标记检测的主效基因位点位置明确，鉴定方便，对于该虫病的长期防治意义重大。而且，用该标记检测育种材料的细菌性条斑病基因操作简单，准确率达95％以上，不仅节省生产成本而且大大提高抗细菌性条斑病水稻品种的筛选效率，极大地缩短抗病水稻品种的育种周期，提高育种效率。

Description

水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，尤其涉及一种水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及应用。

背景技术

水稻细菌性条斑病(病原为Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Fang，Ren，Chu，Faan，wu)Swings称稻生黄单胞菌条斑致病变种，属黄单胞杆菌属细菌)又称细条病、条斑病，主要为害叶片。水稻细菌性条斑病病斑初为暗绿色水浸状小斑，很快在叶脉间扩展为暗绿至黄褐色的细条斑，大小约1×50mm，病斑两端呈浸润型绿色。病斑上常溢出大量串珠状黄色菌脓，干后呈胶状小粒。发病严重时条斑融合成不规则黄褐至枯白大斑，与白叶枯类似，但对光看可见许多半透明条斑。病情严重时叶片卷曲，田间呈现一片黄白色。

水稻细菌性条斑病是一种重要的检疫性水稻病害，其发生具有流行性、暴发性和毁灭性等特点，在我国华南、华中和华东东南亚稻区及非洲稻区危害严重。水稻受水稻细条病菌侵染后，叶片变黄甚至枯死，空瘪粒增多，千粒重降低。一般年份，在感病品种上能引起15％～25％损失，在气候条件适宜时，该病容易发生流行，产量损失高达40％～60％，对水稻的高产稳产造成了严重威胁。目前，水稻细菌性条斑病防治主要依赖噻唑类杀菌剂，长期使用容易造成病原菌抗药性突变体的比例逐年上升，产生抗药性，并且其抗药性能够稳定遗传。在缺乏有效化学药剂和抗病品种的前提下，利用水稻本身携带抗病基因是一种值得探求的防治途径，而且抗性基因的利用被认为是一类具有发展潜力的生防因子。

国内外对水稻细条病抗性的研究工作并不多，研究方向多为病原菌鉴定、灾害防治、抗源鉴定筛选、抗源的遗传分析等方面，而对抗性基因的分子遗传机理则少有涉及。迄今为止，我国主要有吴为人等(2014)获得了抗细菌性条斑病基因qblsr3d(位于第3染色体)，qBlsr5a(位于第5染色体)，qBlsr5b(位于第5染色体)，同时均获得了相应的分子标记，并进行了精细定位。郑景生等(2005)等以感病品种明恢86和抗病品种佳辐占构建F2代分离群体，在2号染色体检测到一个抗性QTL，可解释13.7％的表型变异。黄小嫚(2006)利用感性品种IR24和抗病品种DV85检测到6个细条病抗性QTL，分别位于5、7号染色体。Chen(2006)利用Dular/IR24(DI)和Dular/Balila(DB)分别构建群体在11号染色体上检测到一个QTL，可解释表型变异21.7％和36.3％。贺文爱等(2010)以一份高抗性普通野生稻材料与测序品种9311构建了连续回交群体BC2F2，将一个抗性基因bls1定位在6号染色体上4cM的范围内。以上的研究大部分都获得相应的分子标记，与本研究所获得的抗细菌性条斑病主效基因位点均不同。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与主效基因紧密连锁的水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

水稻抗细菌性条斑病主效基因(暂命名为bls2(t))位点的分子标记(SL41)，位于水稻第2染色体24056656bp，且其扩增片段具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。

上述分子标记在选育抗细菌性条斑病水稻品种及抗性基因资源的筛选中的应用。

扩增上述分子标记的引物对，包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。

上述引物对在选育抗细菌性条斑病水稻品种及抗性基因资源的筛选中的应用。

针对现有抗水稻细菌性条斑病分子标记与主效基因距离较远的问题，发明人通过群体构建，将广西野生稻抗源DY19(♂)与9311(早)杂交及回交、自交获得的BC3F2后代，并进行抗性鉴定及分子遗传连锁分析，获得到与广西普通野生稻DY19的抗细菌性条斑病基因紧密连锁的分子标记SL41，其位于水稻第2染色体24056656bp，且其扩增片段具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。与现有技术相比，本发明具有以下突出优势：

(1)本发明所开发的分子标记检测的主效基因位点位置明确，鉴定方便。利用该分子标记扩增水稻抗源DY19的后代材料或水稻抗细菌性条斑病基因系的后代材料的基因组DNA，如能扩增出104bp的扩增片段，则表明该杂交后代材料含有抗细菌性条斑病主效基因位点。因此，本发明水稻细菌性条斑病紧密连锁分子标记对于该虫病的长期防治意义重大。

(2)水稻抗细菌性条斑病辅助育种选择目标明确，节约成本。传统育种技术往往直接根据表型进行品种的选择和培育。由于水稻抗细菌性条斑病育种研究过程中涉及2种生物的互作，抗病表型的鉴定极易受鉴定方法和环境条件的影响，同时在接种病菌前要求培养并获得高质量的病源，而且接种病源与水稻秧苗苗龄较同步，处理好病源、秧苗以及环境之间的关系，操作复杂。而且不同的研究人员在进行抗病的接种方法及鉴定均存较大个人差异。因此，采用传统育种技术费时、费力、成本高、误判率高。通过利用本发明分子标记检测抗细菌性条斑病主效基因位点，在水稻育种材料的分蘖期就鉴定出高抗细菌性条斑病的单株，所得抗病品系抗性强，应用前景好。而且，用该标记检测育种材料的细菌性条斑病基因操作简单，准确率达95％以上，不仅节省生产成本而且大大提高抗细菌性条斑病水稻品种的筛选效率，极大地缩短抗病水稻品种的育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1是本发明分子标记SL41在亲本和抗感池、单株检测的多态性试验结果图，图中：1感性亲本(9311)，2抗性亲本(DY19)，3～4是感性基因池，5～6是抗性基因池，7～12是后代感性单株，13～18是后代抗性单株，19～24是后代杂合性单株。

图2是亲本9311(P1)和DY19(P2)的抗病性比较图(接种后10天)。

具体实施方式

一、分子标记的筛选

1、材料与方法

1.1供试材料

感病材料9311是公知的水稻恢复系，抗病材料DY19经过多次接种复筛和验证获得的普通野生稻抗源。

1.2方法

1.2.1抗性基因的遗传分析

DY19与9311杂交，接菌观察F1植株表型并自交收获F2单株上的种子，种植F2群体，接菌后分别统计其病斑分离情况，用于细菌性条斑病的遗传分析。

1.2.2分子标记群体的构建

将感病母本9311与抗病父本DY19杂交获得F1，自交获得F2群体。通过基因检测选取杂合基因型植株，以9311为轮回亲本连续进行三次回交，再进行一次自交获得BC3F2作为定位群体。

1.2.3接种用菌液的配制

将筛选所用的菌株分别在NA培养基斜面上28℃活化48h。挑取形态正常的单菌落接种到200ml的NB培养基中，28℃下200r/min的摇床中培养至对数期后6000r/min离心10min，去上清，用无菌水将菌体配成悬浊液后稀释至3×10⁸CFU/mL后用于接种，接种菌液需现配现用。

1.2.4接种与调查

接种时期选择在水稻分蘖期。采用针刺法：把2根针距为0.8cm的大头针固定在橡皮上灭菌备用；用直径为9cm、厚度为2cm的无菌海绵碟吸足菌液后置于培养皿内，将水稻叶片的中部平置于海绵碟上，用带大头针的橡皮刺一下稻叶后(注意让水稻叶片中脉将2个针孔隔开)，再用橡皮挤压海绵至挤出菌液；接种过程注意给海绵补充菌液；每株材料接种2张叶片，每叶接种四孔。接种后20d进行病情调查，选取除细菌性条斑病以外的无虫害及其它病害和机械损伤的叶测量其病斑长度。以病斑长度1.5cm作为抗、感分界线，抗病鉴定标准为：免疫(I)，伤口无症状或仅有褐点；高抗(HR)，病斑长0.1～0.5om；抗(R)，病斑长0.6～1.0cm；中抗(MR)，病斑长1.1～1.5cm；感病(S)，病斑长1.6～2.5cm；高感(HS)，病斑长度大于2.5cm。

1.2.5水稻基因组DNA提取

a、取植株幼嫩叶面约100mg，剪碎后置于2ml的EP管中，加入一颗直径5mm的研磨珠，使用高通量组织研磨仪充分研磨。

b、加入800μl的已预热至65℃的2％的CTAB抽提缓冲液。略微混匀后将整管置于65℃水浴30min。期间每10min充分摇匀一次。

c、加入等体积(800μl)的氯仿-异戊醇混合液(混合比例为24∶1)，剧烈摇匀2～3min。静置几分钟，待重新分层后12000rpm离心10min。

d、小心吸取离心后的上清400μl置于新的1.5mlEP管中，加入等体积(400μl)的异丙醇及1/10体积(40μl)的3M的醋酸钠溶液，室温下静置20min。

e、再次12000rpm离心10min。去上清。加入600μl的75％乙醇溶液，轻轻旋起底部沉淀。数分钟后再次12000rpm离心10min，去上清。自然干燥。

f、加入300μl的1×TE溶液充分溶解干燥的DNA后，置于4℃保存或置于-20℃保存，备用。

g、通过超微量紫外可见分光光度计对所提取的基因组DNA进行浓度及质量检测。当0D260/280在1.8～2.0之间时，认为DNA质量较好。对于质量不高的样品可重复c～f步骤进一步纯化。

1.2.6 PCR扩增反应体系与程序

参照Panaud et al的方法(1996)，反应总体系为10μl，按照表1配置相应的PCR反应体系。

表1 PCR反应体系

PCR反应程序：

1.2.7 PCR产物检测

扩增产物取出后加入5×Loading Buffer 5μl载样缓冲液，充分混匀后于4℃冰箱保存待电泳使用。由于SSR引物扩增片段不大，一般为200bp以内，所以本实验使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。具体步骤如下：

a配胶

将制胶用玻璃板洗净风干，以一块胶的药品量为例，需要ddH₂O 12ml、5×TBE缓冲液4ml、浓度为40％的丙烯酰胺溶液4ml，混匀，加入促凝剂10％的APS(过硫酸铵)150μl、TEMED(四甲基乙二胺)10μl。最终得到浓度为8％的丙烯酰胺混合溶液。

b灌胶

加了促凝剂的胶溶液迅速平稳地倒入已经组装好的玻璃板之间，灌好胶后插入40孔大小的梳子，静置(约30min)等待胶凝固。

c点样

胶凝固后将玻璃板装入电泳槽中，加1×TBE电泳缓冲液，拔去梳子，将加好Loading Buffer的扩增产物按顺序小心点入梳孔，注意不能漂移到隔壁梳孔中，这将影响检验的准确度。

d电泳

点好样的电泳槽接上电泳仪，设置电压600V，时间20min。电泳时间可以根据片段大小和胶浓度进行调整。一般来说，固定电压下，片段小、胶浓度低的电泳速度快。

e染色

采用银染法着色。先将胶剥离至蒸馏水中漂洗2次，然后用10％硝酸银溶液振荡染色10min。染色完毕用蒸馏水振荡2～3次冲洗干净。最后用显影液振荡显影至能清晰看到条带时停止，用蒸馏水洗去残留显影液即可观察统计条带。

f分析

SSR为共显性标记，分离后代来自母本“9311”的带型记作“A”，来自父本“DY19”的带型记作“B”，杂合带型记作“H”。连续两次扩增电泳仍无带的记为“0”。

1.2.8标记与抗病基因的连锁分析

应用分子标记技术，对分子标记和抗病基因进行连锁分析。具体方法如下：

(1)根据表型，从F2群体中分别挑选出10株极抗病单株和10株极感病单株。提取各单株的DNA后测定浓度，将抗病和感病单株DNA分别等量混合，建立抗病池(R-pool)和感病池(S-pool)。

(2)用分子标记对抗、感池进行多态性分析，筛选出在抗感池之间有多态的标记。提取F2分离群体中所有单株的DNA。然后，利用在抗感池间筛选到的多态标记对F2分离群体中所有单株进行分子检测，分析抗病基因位点与标记间的重组情况，建立遗传连锁图。继续在连锁标记间的目标区域中设计引物并筛选更多与目的基因连锁的标记，对单株进行扩增，分析抗病基因与多态标记间的连锁关系，最终确定其在染色体上的位置。根据连锁交换规律，利用软件JoinMap 3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F2群体各个单株的基因型和表型值，利用MapQTL 5.0软件复合区间作图法，LOD≥3.0，对目标染色体进行QTL位点扫描。

2、结果与分析

2.1水稻细菌性条斑病抗性鉴定及遗传分析

以抗病DY19作为父本与感病籼稻品种9311杂交和回交，所获得的F₁和BC₁对广西强致病力细菌性条斑病菌株JZ28的抗性鉴定结果如表2所示，所有F₁和BC₁植株对细菌性条斑病的病情指数均为7-9级，表现为感至高感，没有发现抗病植株。F2出现病斑分离，如表3所示经卡平方测验，抗感分离比符合1∶3分离(X²＝1.24＜X² _0.05＝3.84)，表明该抗源对JZ28的抗性受隐性单基因控制。

表2 9311与DY19杂交F₁和BC₁植株对细菌性条斑病菌株JZ28的抗性反应

表3 F2后代抗性遗传X²分析

2.2目的基因的分子定位

2.2.1亲本多态性标记的筛选

表4亲本多态性引物筛选

据经典图位克隆的方法，为确定主效抗性QTL的位置，从已公布的水稻全基因组SSR标记中以每2cM的间距共挑选680对均匀分布于全基因组共12条染色体上的SSR标记。以两亲本的基因组DNA为模板，通过PCR反应及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛在这680对标记引物中选出PCR产物在亲本间具有共显性的多态性的标记。如表4，各染体组SSR标记多态率较高均在40％左右，共获得261对在亲本间具有共显性多态的标记，平均多态率达到38.38％。

2.2.2抗感池间多态性标记的筛选

在F2代群体中随机抽取10株极抗(1级)单株，10株极感(9级)单株，分别提取基因组DNA后等量混合，构建成抗病基因混池(R)和感病基因混池(S)。以抗感池DNA为PCR模板，用筛选出的261对在亲本间具有共显性多态的标记进行PCR扩增反应，对产物进行聚丙烯酰氨胶电泳，筛选出在混池间依然表现出多态性的标记。通过对这261对引物的筛选，获得1个在抗感池具多态性引物RM13630，推测这两个标记附近极可能存在细条病抗性主效QTL。

2.2.3分子标记遗传连锁图的构建及主效QTL的定位

在标记RM13630附近进行标记加密，获得在抗感池间具有多态标记5个。用这6个引物进一步对DY19/9311的409株F2群体重组单株筛选。结合各单株的抗性值进行QTL扫描，结果表明第2染色体基因位点分子标记SL04与RM13630之间有一个LOD值为33.2的最大峰值的存在，贡献率为59.7％。

为了缩小定位基因标记距离，构建了276株BC3F2群体，在SL04与RM13630两标记间进一步设计了8对SSR引物，其中SL41(24056656bp)在两亲本及抗感池间表现出多态性，通过对BC3F2群体进行单株基因检测，获得6个交换株。经过对DY19后代群体检测的结果表明，分子标记SL41与水稻细菌性条斑病抗性基因紧密连锁(表5、图2)。

表5第2染色体上的连锁标记及物理位置

二、分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料

感病品种：感病品种9311、日本晴、DY19×9311杂交后代的感病材料18份，共20份。

抗病品种：DY19×9311杂交后代的抗病材料19份。

分子标记SL41引物对。

1.2方法

水稻基因组DNA提取和用SL41引物对基因组DNA进行PCR扩增的方法同实施例1。

2、结果

分别对水稻材料9311等39份不同样本的DNA进行PCR扩增。结果表明，在抗性样本中均能扩增出相应的104bp片段，而在感性样本中均不能扩增出相同大小的片段。依据分子标记检测的结果，对水稻DY19杂交的后代进行抗病鉴定，分子标记的检测结果达准确率达95％以上(表6、表7)。结果说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗细菌性条斑病的主效基因，能够预测水稻植株对细菌性条斑病的抗性与否，可大大加快抗细菌性条斑病水稻材料的筛选进度。

表6分子标记SL41对感性品种检测结果

表6中，基因型A为分子标记感病纯合基因型，L1～L18为DY19×9311杂交后代育种品系18份。

表7分子标记SL41对阳性品种检测结果

表7中，基因型B为分子标记抗病纯合基因型，L19～L36为DY19×9311杂交后代育种品系18份。

序列表

<110> 广西大学

<120> 水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及应用

<141> 2017-12-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaattgaatt agacggttgc atgtgcttta gtggggaatg catggctggt cttcgacaca 60

aacaaccgga tcccctttta attatttggt agagccaatt cttt 104

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaagaattgg ctctaccaaa 20

Claims

1.一种水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记，其特征在于位于水稻第2染色体24056656bp，且其扩增片段具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

2.权利要求1所述分子标记在选育抗细菌性条斑病水稻品种及抗性基因资源的筛选中的应用。

3.扩增权利要求2所述分子标记的引物，其特征在于包括具有序列表SEQ.ID.No.2和SEQ.ID.No.3的碱基序列。

4.权利要求3所述引物对在选育抗细菌性条斑病水稻品种及抗性基因资源的筛选中的应用。