JP2013502210A - 病害耐性トマト植物 - Google Patents

Abstract

本発明は、病原菌である灰色かび病菌への耐性に寄与する少なくとも１つのＱＴＬによって、具体的には、２つおよび３つのＱＴＬによって制御される、前記耐性を示す栽培トマト植物に関し、このＱＴＬは、連鎖群６、および／または連鎖群１ｂ、および／または連鎖群９ｂにマッピングしている。本発明はさらに、前記植物を産生するための方法、およびその使用に関する。

Description

本発明は、トマト植物、具体的には、病原菌である灰色かび病菌に耐性を示す栽培トマト植物、該植物を産生するための方法、およびその使用に関する。

灰色かび病（ｇｒａｙ ｍｏｌｄ）として一般に知られている灰色かび病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｂｌｉｇｈｔ）は、多くの植物および観賞植物の花、果実、茎、ならびに葉の立ち枯れ病および胴枯れ病を含む様々な植物病害を引き起こす。収穫時および保存中のトマトを含む腐敗しやすい植物農産物の収穫後の腐敗の主な原因である。病害は、温室と田畑の両方で発生し得る。

灰色かび病は、真菌灰色かび病菌によって引き起こされる。単細胞胞子は、胞子がそこから遊離して風媒される分岐した分生子柄上に生み出される。真菌は、それ自体が傷害組織上に定着することが多く、腐生菌として長期間存続し得る。トマト苗上の茎傷害は、地面で、または地面のすぐ下で発生し得る。茎は、葉痕、枯れ葉、または茎損傷の任意の形態を介して感染し得る。茎傷害は、茎を部分的に取り囲むことが多いが、茎全体が感染し、植物が死滅する場合もある。温室内では、ボトリチス感染はとりわけ重要である。実際、世話が必要な不確定のトマトに関して、植物の生育に付随して起こる外側の葉の除去は、常に茎上の傷害につながり、そのような傷害は、病原体における複数の侵入点を構成する。葉柄傷害は、茎上の傷害と非常に類似しているように見え、小葉の感染および定着に起因することが多い。小葉傷害は、老化組織または任意の身体的もしくは化学的損傷から始まることが多い。植物上に存在する傷害が多いほど、植物が灰色かび病菌に感染する危険性も大きい。

田畑では、真菌は、死にかけの花および果実の萼上に、胞子の灰色でビロードのような被膜として現れる。未熟な緑色の果実は、それらが他の感染した植物部分に触れた時点で薄茶色または白色に変わる。軟腐病は果皮を無傷のままに保って進行し得るが、内部組織は、柔らかく水っぽくなる。後に、灰色の綿毛状カビが成長し、菌核粒子が現れ得る。熟していない果実は、他の感染との接触の代わりに、風媒された胞子によって直接感染する場合もある。

トマト栽培品種における灰色かび病菌への耐性は知られていない。

Ｎｉｃｏｔら（「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｕｎｉｎｇ ｗｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ａｍｏｎｇ ｗｉｌｄ ｔｏｍａｔｏ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ」（Ｎｉｃｏｔ，Ｐ．Ｃ．，２ Ｍｏｒｅｔｔｉ Ａ．，１ Ｒｏｍｉｔｉ，Ｃ．，１ Ｂａｒｄｉｎ，Ｍ．，２ Ｃａｒａｎｔａ Ｃ．，１ Ｆｅｒｒｉeｒｅ Ｈ．ＩＮＲＡ−Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｎｕｍｂｅｒ ５２−Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００２））において、約２０件の野生トマトの受入が、灰色かび病菌耐性について、具体的には、茎および葉の傷害上で評価された。これらの２０件の受入をソラヌム・リコペルシクムと比較した時、特に、Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ７３１０８９およびＬ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ ＬＡ７９６９の受入について、症状の軽減が観察された。しかしながら、Ｎｉｃｏｔらは、この耐性に関連した任意の遺伝的決定因子の同定または遺伝子移入を報告していない。

温室作業において、効果的な制御を、素因的状態（高相対湿度および冷温度）を阻止することにより、通気を促進するための適切な間隔および剪定により、創傷を阻止するための注意深い取り扱いにより、および適正な植物衛生を介して接種菌源を除去することにより、達成することができる。

田畑では、この真菌は、田畑において休眠した状態のままである感染を引き起こし、収穫後の保存中に果実腐敗に発展するため、制御するのが困難である。最大５０％の作物損失は珍しくない。ボトリチス属を制御するための化学的戦略は、殺菌剤のうちの１つまたはいくつかの群に耐性を示す菌株の出現につながる真菌の高い遺伝的変動により限定されている。トマトにおける使用に登録されているほとんどの殺菌剤は、それらの作用において保護的であり、殺菌剤の収穫前の適用に対して効果的な制御を制限する確立した感染を抑圧しない。

したがって、灰色かび病菌寄生に対してトマト植物を保護するための便利で効率的かつ経済的に持続可能な戦略における、長年にわたる切実な満たされていない必要性が存在する。

本発明は、灰色かび病菌に耐性を示し、したがってこの病原体によって引き起こされる損傷から保護される、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物を提供することにより、この必要性に対処する。ボトリチス耐性トマト植物の提供は、殺虫剤使用における環境に優しい代替案であり、生物学的制御選択の効率を高め、功を奏する統合された害虫管理プログラムに寄与し得る。

したがって、本発明の根底にある技術的問題は、この病原体への耐性を示すボトリチス耐性トマト植物の提供である。

技術的問題は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態の提供により解決される。具体的には、技術的問題は、灰色かび病菌への耐性を示すトマト植物を提供することにより解決され、該植物は、トマト植物における該灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御する少なくとも１つの遺伝的決定因子を含み、該遺伝的決定因子は、野生トマト供給源、具体的には、ソラヌム・ハブロカイテス、具体的には、ソラヌム・ハブロカイテス０４ＴＥＰ９９０３１２から入手可能であり、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で寄託されている。さらに、今般意外にも、本発明の範囲内で、植物における望ましくない形態学的変化に関与する遺伝子と、野生型供給源物質、例えば、ソラヌム・ハブロカイテス等に存在するような灰色かび病菌への耐性に関与する遺伝子との間の結合を破壊することが可能であり、したがって、本発明に記載のトマト植物中にもはや存在しないことが見出された。

（１） 第１の実施形態において、本発明は、トマト植物、具体的には、灰色かび病菌への耐性を示す栽培トマト植物に関し、該植物は、トマト植物における該灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御する少なくとも１つの遺伝的決定因子を含み、１つまたは複数の遺伝的決定因子は、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群にマッピングする。

（２） 具体的には、特定の実施形態において、該遺伝的決定因子は、該灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御することができる少なくとも１つのＱＴＬまたはその機能部分で表される。

（３） 本発明のさらに特定の実施形態において、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群にマッピングする。

（４） 一実施形態において、実施形態（２）に記載のトマト植物、具体的には、栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、ボトリチス耐性形質を共分離し、かつＰＣＲ反応において、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、少なくとも１対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより同定することができる、少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合される。

（５） 一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、該ＱＴＬまたはその機能部分に隣接する少なくとも２つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合され、その隣接マーカー遺伝子座を、ＰＣＲ反応において、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーにより、ならびに／または
ｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーにより、ならびに／または
ｉｉｉ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーにより、かつ／あるいは
ボトリチス耐性形質に統計的に相関し、意外にも遺伝的に結合される、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーにより同定することができる。

（６） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群６にマッピングし、かつ配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表されるＤＮＡマーカーにより隣接される。

（７） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群１ｂにマッピングし、かつ配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表されるＤＮＡマーカーにより隣接される。

（８） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群９ｂにマッピングし、かつ配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表されるＤＮＡマーカーにより隣接される。

（９） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群９ｂにマッピングし、かつＰＣＲ反応において、配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーで表されるＤＮＡマーカーにより同定することができる。

（１０） 一実施形態において、本発明は、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物に関し、灰色かび病菌への耐性に寄与するトマトゲノム中の量的形質遺伝子座に少なくとも１つの対立遺伝子を含み、これは、灰色かび病菌耐性形質と共分離し、かつＰＣＲ反応において、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
ｖｉ．配列番号１２の順方向プライマーおよび配列番号１１の逆方向プライマーを含む、少なくとも１対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより同定することができる、少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合される。

（１１） 一実施形態において、本発明は、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物に関し、灰色かび病菌への耐性に寄与するトマトゲノム中の量的形質遺伝子座に少なくとも１つの対立遺伝子を含み、これは、ソラヌム・ハブロカイテス系統０４ＴＥＰ９９０３１２中に存在する対応する対立遺伝子に相補的であり、この種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で、またはその子孫もしくは祖先において寄託され、ソラヌム・ハブロカイテス、系統０４ＴＥＰ９９０３１２、ＮＣＩＭＢ４１６２３のゲノムまたはその子孫もしくは祖先における少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合され、そのマーカー遺伝子座は、灰色かび病菌耐性形質と共分離し、かつソラヌム・ハブロカイテス、系統０４ＴＥＰ９９０３１２、ＮＣＩＭＢ４１６２３のゲノムまたはその子孫もしくは祖先において、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、少なくとも１対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより、ＰＣＲ反応において同定することができる。

（１２） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群６にマッピングし、かつ配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマー表されるＤＮＡマーカーにより隣接され、灰色かび病菌耐性に寄与する第２のＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分をさらに含み、該第２のＱＴＬ（２）は、連鎖群１ｂにマッピングし、かつ配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される隣接ＤＮＡマーカーにより定義される。

（１３） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群６にマッピングし、かつ配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表されるＤＮＡマーカーにより隣接され、灰色かび病菌耐性に寄与する第２のＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分をさらに含み、該第２のＱＴＬ（２）は、連鎖群１ｂにマッピングし、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される隣接ＤＮＡマーカーにより定義され、灰色かび病菌耐性に寄与する第３のＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分をさらに含み、該第３のＱＴＬ（３）は、連鎖群９ｂにマッピングし、かつ配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーで表されるＤＮＡマーカー、ならびに／または配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される隣接マーカーにより定義される。

（１４） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該少なくとも１つのＱＴＬは、ソラヌム・ハブロカイテス ０４ＴＥＰ９９０３１２の遺伝的背景を有するドナー植物から入手可能であり、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で、またはその子孫もしくは祖先において寄託され、該少なくとも１つのＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分を含む。

（１５） 一実施形態において、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物が提供され、該遺伝的決定因子は、ソラヌム・ハブロカイテス ０４ＴＥＰ９９０３１２から入手可能であり、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で寄託されている。

（１６） 本発明の一実施形態において、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物は、実施形態（１５）に記載の植物であり、該耐性ＱＴＬは、灰色かび病菌への単一遺伝子耐性および優性耐性を提供する。

（１７） 本発明の一実施形態において、トマト植物は、前述の実施形態のいずれかに記載の植物であり、その植物は、ソラヌム・リコペルシクムのトマト植物、とりわけ、（１８）栽培トマト植物、具体的には、（１９）半数体、二ゲノム性半数体、近交、または雑種である。

（２０） 一実施形態において、本発明は、雑種トマト植物、具体的には、栽培トマト植物である、前述の実施形態のいずれかに記載の植物を提供し、少なくとも１つのＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分を含み、これは、ボトリチス耐性形質と共分離する少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合され、該少なくとも１つのＱＴＬは、ソラヌム・ハブロカイテス０４ＴＥＰ９９０３１２の遺伝的背景を有するドナー植物から入手可能であり、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で、またはその子孫もしくは祖先において寄託され、該少なくとも１つのＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分を含む。

（２１） 一実施形態において、本発明のトマト植物、具体的には、栽培トマト植物は、スライシングまたはグローブトマト、チェリートマト、ビーフステーキトマト、およびプラムトマトから成る群より選択される果実を生育する、前述の実施形態のいずれかに記載の植物である。

（２２） 本発明はさらに、本発明に記載の灰色かび病菌耐性トマト植物を生育することができる、トマト植物、具体的には、前述の実施形態のいずれかに記載の栽培トマト植物の種子に関する。

（２３） 別の実施形態では、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物中の灰色かび病菌耐性遺伝子座の検出のためのキットが本明細書で提供され、該キットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から成る群より選択されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、または
ａ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーで表されるプライマー対１、
ｂ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーで表されるプライマー対２、
ｃ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーで表されるプライマー対３、
ｄ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーで表されるプライマー対４、
ｅ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーで表されるプライマー対５、ならびに
ｆ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーで表されるプライマー対６、から選択される一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、または
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーを表す別のプライマーを含む。

（２４） 一実施形態において、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物において灰色かび病菌耐性遺伝子座に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から成る群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
ａ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーで表されるプライマー対１、
ｂ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーで表されるプライマー対２、
ｃ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーで表されるプライマー対３、
ｄ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーで表されるプライマー対４、
ｅ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーで表されるプライマー対５、ならびに
ｆ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーで表されるプライマー対６から選択される一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーを表す別のプライマーにより増幅することができるＤＮＡマーカーが提供される。

（２５） さらなる実施形態において、本発明は、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物中の灰色かび病菌耐性遺伝子座、具体的には、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群、具体的には、本発明に記載のトマト植物中の灰色かび病菌耐性遺伝子座の診断的選択における、本発明に記載のこれらのＤＮＡマーカーのいくつか、または全ての使用にも関する。

（２６） 別の実施形態において、本発明はさらに、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物、具体的には、本発明に記載のトマト植物中の灰色かび病菌耐性遺伝子座の存在を特定するため、および／またはトマト植物、具体的には、栽培ソラヌム・リコペルシクム植物、具体的には、トマト植物、具体的には、本発明に記載され、かつ本明細書に記載されるトマト植物中の灰色かび病菌耐性遺伝子座の遺伝子移入を監視するために、これらのＤＮＡマーカーのいくつかもしくは全ての使用を企図する。

（２７） 一実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から成る群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、または
ａ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーで表されるプライマー対１、
ｂ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーで表されるプライマー対２、
ｃ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーで表されるプライマー対３、
ｄ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーで表されるプライマー対４、
ｅ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーで表されるプライマー対５、ならびに
ｆ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーで表されるプライマー対６から選択される一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、または
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーを表す別のプライマーを含む、ＰＣＲ反応において入手可能であるポリヌクレオチド（増幅産物）に関し、同一のプライマーもしくはプライマー対とのＰＣＲ反応において、それぞれのマーカー遺伝子座は、該トマト植物中になお存在し、および／またはその対立遺伝子と見なすことができるという条件で、その増幅産物は、ソラヌム・ハブロカイテス０４ＴＥＰ９９０３１２から入手可能である増幅産物に相当し、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で寄託されている。

（２８） 特定の実施形態において、本発明は、
ｉ．増幅産物につながり、２０５ｂｐ〜２３５ｂｐ、具体的には、２１０ｂｐ〜２３０ｂｐ、具体的には、２１５ｂｐ〜２２５ｂｐの範囲であり、および／または罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも１０％〜２０％、具体的には、１２％〜１８％、具体的には、約１４％短い、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｉｉ．増幅産物につながり、２２４ｂｐ〜２２６ｂｐの範囲であり、および／または罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも０．４％〜１，８％、具体的には、０．８％〜１．５％長い、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｉｉｉ．増幅産物につながり、１６０ｂｐ〜１７０ｂｐ、具体的には、１６２ｂｐ〜１６８ｂｐ、具体的には、１６４ｂｐ〜１６６ｂｐの範囲であり、および／または罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも３％〜１０％、具体的には、５％〜９％、具体的には、約６％短い、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｉｖ．増幅産物につながり、８５ｂｐ〜９５ｂｐ、具体的には、８８ｂｐ〜９２ｂｐの範囲であり、および／または罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも５％〜１５％、具体的には、８％〜１２％、具体的には、約１１％短い、配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｖ．増幅産物につながり、２９０ｂｐ〜３２０ｂｐ、具体的には、２８０ｂｐ〜３１０ｂｐの範囲であり、および／または罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも５％〜１５％、具体的には、８％〜１２％、具体的には、約１０％短い、配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｖｉ．増幅産物につながり、１４０ｂｐ〜１６０ｂｐ、具体的には、１４５ｂｐ〜１５５ｂｐの範囲であり、および／または罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも１０％〜３０％、具体的には、１５％〜２５％、具体的には、約２０％短い、配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含むプライマー対を用いて、ＰＣＲ反応において得られる実施形態（２７）に記載の増幅産物に関する。

（２９） 該増幅産物および／または上述のＰＣＲ反応において入手可能である該増幅産物のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を示すポリヌクレオチドと、少なくとも９０％、具体的には、少なくとも９５％、具体的には、少なくとも９６％、具体的には、少なくとも９７％、具体的には、少なくとも９８％、具体的には、少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドも本明細書で企図される。

次に、本発明に記載され、かつ上述の本明細書に記載される増幅産物を用いて、灰色かび病菌耐性遺伝子座を同定するために用いることができる新規のプライマーおよび／もしくはプローブを生成または作成することができる。

（３０） したがって、本発明はさらに、一実施形態において、生成されたマーカー、具体的には、当分野で既知の方法によって、本発明に記載され、かつ上述の本明細書に記載される増幅産物から作成される生成されたプライマーまたはプローブに関し、その生成されたマーカーは、灰色かび病菌耐性遺伝子座、具体的には、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における灰色かび病菌耐性遺伝子座に遺伝的に結合される。

（３１） 次に、これらの生成されたマーカーを、灰色かび病菌耐性植物を同定するために用いることができ、本明細書に具体的に開示されるマーカーは、耐性に対して組換えられ、意外にも耐性植物ゲノム中にもはや存在しない。

（３２） さらなる実施形態において、本発明の範囲内で、灰色かび病菌への耐性に寄与する量的形質遺伝子座で、灰色かび病菌への耐性と関連する少なくとも１つの対立遺伝子を、トマト植物、具体的には、ａ）前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載の第１のトマト植物を得ることと、ｂ）該第１のトマト植物を、第２のトマト植物と交配させることであり、該第２のトマト植物は、該対立遺伝子を欠如し、ｃ）増加した灰色かび病菌への耐性を示し、該灰色かび病菌耐性と共分離する少なくとも１つのマーカー対立遺伝子を含む、交配に起因する植物を同定することと、ｄ）任意で、該植物を単離することと、ｅ）任意で、該植物を、第１または第２のトマト植物と戻し交配させることを含む、該対立遺伝子を欠如する栽培トマト植物の中に導入するための方法が提供される。

（３３） さらなる実施形態において、本発明は、灰色かび病菌への耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物を産生するための方法に関し、
ａ．灰色かび病菌耐性を示すソラヌム属の植物を選択するステップであり、該耐性は、該灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御することができる少なくとも１つのＱＴＬまたはその機能部分と関連しており、該ＱＴＬまたはその機能部分は、ボトリチス耐性形質と共分離し、かつＰＣＲ反応において、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、少なくとも１対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより同定することができる、少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合される、ステップと、
ｂ．灰色かび病菌耐性を示すステップａ）の該植物を、灰色かび病菌に感染しやすいか、あるいは灰色かび病菌に対して中間レベルの耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物と交配させるステップと、
ｃ．ボトリチス耐性を示し、ステップａ）の該少なくとも１つのマーカー遺伝子座との関連性を実証する該交配由来の子孫を選択するステップを含む。

（３４） 一実施形態において、本発明は、灰色かび病菌への耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物を産生するための方法に関し、
ａ．灰色かび病菌耐性を示すソラヌム属の植物を選択するステップであり、該耐性は、該灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御することができる少なくとも１つのＱＴＬまたはその機能部分と関連し、該ＱＴＬまたはその機能部分は、該ＱＴＬまたはその機能部分に隣接する少なくとも２つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合され、その隣接マーカー遺伝子座を、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーとのＰＣＲ反応、ならびに／または
ｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーとのＰＣＲ反応、ならびに／または
ｉｉｉ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーとのＰＣＲ反応において、あるいは
ボトリチス耐性形質に統計的に相関し、意外にも遺伝的に結合される、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーにより同定することができる、ステップと、
ｂ．灰色かび病菌耐性を示すステップａ）の該植物を、灰色かび病菌に感染しやすいか、あるいは灰色かび病菌に対して中間レベルの耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物と交配させるステップと、
ｃ．ボトリチス耐性を示し、ステップａ）の該少なくとも２つのマーカー遺伝子座との関連性を実証する、該交配由来の子孫を選択するステップを含む。

（３５） 本発明の一実施形態において、実施形態３３に記載の方法は、灰色かび病菌に耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物を得るために提供され、ステップ（ａ）のドナー植物は、灰色かび病菌への耐性に寄与するＱＴＬを含み、該ＱＴＬまたはその機能部分は、連鎖群６にマッピングし、かつ配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表されるＤＮＡマーカーにより隣接される。具体的には、ステップ（ａ）の該ソラヌムドナー植物は、ソラヌム・ハブロカイテス（３６）である。

（３７） 一実施形態において、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法は、灰色かび病菌に耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物を得るために提供され、ステップ（ａ）のドナーソラヌム植物は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載のトマト植物であり、（３８）の方法はさらに、ステップｃ）で得られるボトリチス耐性トマト植物を、ステップｂ）の罹病性トマト植物と戻し交配させるステップを含む。

（３９） 一実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の方法のステップｃ）における少なくとも１つのマーカー遺伝子座または少なくとも２つのマーカー遺伝子座との間のボトリチス耐性と関連の決定は、ステップａ）で同定されるプライマーとのＰＣＲ反応を行うことにより達成される。

（４０） さらなる実施形態において、本発明は、灰色かび病菌に耐性を示すトマト果実を得るための方法を提供し、
ｉ．実施形態１〜２２のうちのいずれか１つに記載の植物、または前述の実施形態のいずれかに記載の方法において得られた植物の種子を播種するステップと、
ｉｉ．果実を産生するために該植物を生育するステップと、該植物によって産生された果実を収穫するステップを含む。

（４１） さらに別の実施形態において、本発明は、植物受入ＮＣＩＭＢ４１６２３の連鎖群６にマッピングし、かつ配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーで表される少なくとも第１のＤＮＡマーカー、ならびに／または配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される少なくとも第２のＤＮＡマーカーと関連する、灰色かび病菌耐性付与ＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分に関し、具体的には、（４２）の該ＱＴＬまたはその機能部分は、該第１および第２のＤＮＡマーカーにより隣接される。

（４３） さらに別の実施形態において、本発明は、植物受入ＮＣＩＭＢ４１６２３の連鎖群１ｂにマッピングし、かつ配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される少なくとも第１のＤＮＡマーカーと関連する、灰色かび病菌耐性付与ＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分に関し、具体的には、（４１）該ＱＴＬまたはその機能部分は、該第１および第２のＤＮＡマーカーにより隣接される。

（４４） さらなる実施形態において、本発明は、植物受入ＮＣＩＭＢ４１６２３の連鎖群９ｂにマッピングし、かつ配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーで表される少なくとも第１のＤＮＡマーカー、ならびに／または配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される隣接マーカーと関連する、灰色かび病菌耐性付与ＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分に関し、具体的には、（４５）該ＱＴＬまたはその機能部分は、該第１および第２のＤＮＡマーカーにより隣接される。

（４６） 本発明は、前述の実施形態のいずれかに記載のトマト植物から入手可能である、果実を産生し、該果実を収穫するために、ボトリチス耐性植物を生育するための、灰色かび病菌耐性繁殖物質の使用にも関する。

（４７） さらに別の実施形態において、本発明は、灰色かび病菌による感染に対して、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物の作物を保護する方法を提供し、該方法は、実施形態２２に記載の種子を植えることと、灰色かび病菌に対する耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物を生育することを特徴とし、具体的には、（４８）該トマト植物または作物は、該耐性を示さないトマト作物よりも低い濃度または低い頻度で、灰色かび病菌に対して活性を有する作物保護化学物質で噴霧される。

（４９） 一実施形態において、本発明は、ボトリチス属に耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物の雑種種子を産生する方法に関し、
ｉ．雄性不稔性雌性植物または系統、および雄性稔性植物または系統を植えるステップであって、該雄性もしくは雌性植物または系統のうちの少なくとも１つは、実施形態１〜２１のいずれかに記載の植物である、ステップと、
ｉｉ．両系統間で他家受粉を生じさせるステップと、
ｉｉｉ．着果まで子孫植物を生育するステップと、
ｉｖ．果実を収集するステップと、
ｖ．雑種種子を得るステップと、を含む。

（５０） 特定の実施形態において、本発明は、ボトリチス属に耐性を示すトマト植物、具体的には、栽培トマト植物の雑種種子を産生するための方法に関し、
ｉ．雄性不稔性雌性植物または系統、および雄性稔性植物または系統を植えるステップであって、該雄性もしくは雌性植物または系統のうちの少なくとも１つは、前述の実施形態のいずれかに記載の植物である、ステップと、
ｉｉ．両系統間で他家受粉を生じさせるステップと、
ｉｉｉ．本明細書に開示のマーカーのうちの少なくとも１つを用いて、ボトリチス耐性を示し、ステップａ）の該少なくとも１つのマーカー遺伝子座との関連性を実証する該交配から子孫を選択するステップと、
ｉｖ．着果までｉｉｉ）で選択される子孫植物を生育するステップと、
ｖ．果実を収集するステップと、
ｖｉ．雑種種子を得るステップと、を含む。

定義
本出願の範囲内で用いられる技術用語および表現は、概して、別途以下の本明細書に示されない限り、植物繁殖および栽培の関連技術において、それらに一般に適用される意味をもたらすべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形参照対象を含む。したがって、例えば、「ある植物」への言及は、１つ以上の植物を含み、「ある細胞」への言及は、細胞および組織の混合物等を含む。

「栽培トマト」植物は、本発明の範囲内で、もはや天然状態ではないが、ヒトの手を介して、ヒトの使用および／または生育目的および／または消費のために作成された植物を指すと理解される。「栽培トマト植物」は、天然の形質および／またはそれらの天然の遺伝的特徴の一部として、この本発明の主題である形質を含む野生型種を除外するとさらに理解される。

「発現を誘導または制御する遺伝的決定因子」は、本明細書において、ＤＮＡ自体のレベルで、最終のポリペプチド産物の翻訳、転写、および／または活性化のレベルで、すなわち、耐性の形質発現につながる寄生を下方調節し、それに対抗するために、この耐性形質の発現に影響を及ぼすことによって、病原体に対する植物の耐性に寄与することができる遺伝性の遺伝要素を指すと理解される。

「対立遺伝子」は、本発明の範囲内で、遺伝子または同定可能な遺伝要素の任意の種類の異なる形態と同一あるいは関連している様々な遺伝子単位の代替物もしくは変形を指すと理解され、それらは、相同染色体中の同一の遺伝子座に位置付けられるため、遺伝的形質における代替物である。そのような代替物もしくは変形は、一塩基多型、挿入、逆位、転座、または欠失の結果、あるいは例えば、化学的もしくは構造的修飾、転写調節、または翻訳後修飾／調節によって引き起こされる遺伝子調節の結末であり得る。２倍体細胞もしくは生物において、所与の遺伝子または遺伝要素の２つの対立遺伝子は、典型的には、一対の相同染色体上で対応する遺伝子座を占有する。

質的形質と関連する対立遺伝子は、単一遺伝子もしくは複数の遺伝子またはそれらの産物、あるいはさらには分裂するか、または遺伝子座で表される表現型に寄与する遺伝因子によって制御される遺伝子と同一もしくは関連しているものを含む、様々な遺伝子単位の代替物もしくは変形を含み得る。

本明細書で使用される「マーカー対立遺伝子」という用語は、表現型形質の可変性に寄与する染色体上に対立遺伝子を含有する遺伝子座を位置付けるためのマーカーとして用いられる場合に、上述の本明細書に定義されるような遺伝子単位の代替物もしくは変形を指す。

本明細書で使用される、「繁殖」という用語およびその文法的変形は、子孫個体を生成する任意の過程を指す。繁殖は、有性もしくは無性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。繁殖の例示的な種類には、交配、自家受粉、倍加半数体誘導体生成、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。

本明細書で使用される「確立された繁殖集団」という語句は、繁殖プログラム、例えば、商業的な繁殖プログラムにおける親により産生され、および／または親として用いられる潜在的な繁殖パートナーの収集を指す。確立された繁殖集団のメンバーは、典型的には、遺伝的におよび／または表現型的によく特徴付けられる。例えば、いくつかの関心の表現型形質を、例えば、異なる環境条件下で、複数の位置および／または異なる時間で評価したかもしれない。代替的に、または加えて、表現型形質の発現と関連する１つ以上の遺伝子座を同定したかもしれず、繁殖集団のメンバーのうちの１つ以上を、１つ以上の遺伝子座に対して、ならびに１つ以上の遺伝子座と関連する１つ以上の遺伝子マーカーに対して遺伝子型を同定したかもしれない。

本明細書で使用される「２倍体個体」という語句は、２組の染色体、典型的には、その２つの親の各々からの１組の染色体を有する個体を指す。しかしながら、いくつかの実施形態において、２倍体個体は、植物が自家受粉して植物のその後の生成を引き起こす時等に、同一の単一生物から、その「母性」および「父性」組の染色体を受容することができることが理解される。

「ホモ接合性」は、本発明の範囲内で、相同染色体上のうちの１つ以上の対応する遺伝子座における同様の対立遺伝子を指すと理解される。

「ヘテロ接合性」は、本発明の範囲内で、相同染色体上のうちの１つ以上の対応する遺伝子座における同様の対立遺伝子を指すと理解される。

「戻し交配」は、本発明の範囲内で、雑種子孫が親のうちの１つに戻って繰り返し交配する過程を指すと理解される。異なる反復親を、その後の戻し交配で用いることができる。

「遺伝子座」は、本発明の範囲内で、形質に寄与する遺伝子または任意の他の遺伝要素もしくは因子を含む、染色体上の領域を指すと理解される。

本明細書で使用される「マーカー遺伝子座」は、個体のゲノム中に存在し、１つ以上の関心の遺伝子座と関連するヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、形質に寄与する遺伝子または任意の他の遺伝要素もしくは因子を含み得る、染色体上の領域を指す。「マーカー遺伝子座」は、プローブとして用いられる核酸配列等のゲノム配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む、染色体上の領域も指す。

「遺伝子結合」は、本発明の範囲内で、遺伝子座間の組み換え率（センチモルガン、ｃＭ）により測定される、同一の染色体上の近接した遺伝子の位置による遺伝的形質における形質の関連を指すと理解される。

本発明において、「共分離」という用語は、形質における対立遺伝子およびマーカーにおける対立遺伝子が、同一の染色体上で物理的に近接するため、ともに伝送される傾向があり（それらの物理的近接のために減少したそれらの間の組み換え）、同一の染色体上のそれらの近接の結果として、それらの対立遺伝子の非ランダム関連性をもたらすという事実を指す。「共分離」は、その少なくとも１つが遺伝子的であり、偶然にも容易に説明することができない、単一植物中の２つ以上の形質の存在も指す。

本明細書で使用される「量的形質遺伝子座における遺伝子構造」という用語は、関心の表現型形質に統計的に相関しており、関心の表現型形質の基礎的な遺伝子基盤を表すゲノム領域を指す。

本明細書で使用される「有性的に交配した」および「有性生殖」という語句は、本開示の主題の文脈においては、（植物の受粉によって種子を産生するため等の、例えば、受精によって）子孫を産生するための配偶子の融合を指す。「有性交配」または「交配受精」は、いくつかの実施形態において、１つの個体の別の個体での受精である（例えば、植物の交配受粉）。「自家受粉」という用語は、いくつかの実施形態において、自家受精または自家受粉による、すなわち、花粉および胚珠が同一の植物由来である、種子の産生を指す。

本明細書で使用される「遺伝子マーカー」という語句は、１つ以上の関心の遺伝子座と関連する個体のゲノムの特徴（例えば、個体のゲノム中に存在するヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列）を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子マーカーは、状況に応じて、関心の集団または多型によって占有される遺伝子座において多型である。遺伝子マーカーは、多くの他の例のうち、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、インデル（すなわち、挿入／欠失）、単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、多様性アレイ技術（ＤＡｒＴ）マーカー、および増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を含む。遺伝子マーカーを、例えば、表現型形質の可変性に寄与する染色体上に対立遺伝子を含有する遺伝子座を位置付けるために用いることができる。「遺伝子マーカー」という語句は、プローブとして用いられる核酸配列等の、ゲノム配列に相補的なポリヌクレオチド配列を指すこともできる。

遺伝子マーカーを、それが関連する遺伝子座の内部または外部（すなわち、それぞれ、遺伝子内または遺伝子外）にある染色体上の位置に物理的に位置付けることができる。言い換えると、遺伝子または機能的変異の染色体上、例えば、関心の遺伝子座に対応する遺伝子の外部の制御素子内の位置が同定されず、関心の遺伝子マーカーと遺伝子座との間の非ゼロの速度の組み換えが存在する時に、遺伝子マーカーを典型的に採用するのに対し、本開示の主題は、物理的に遺伝子座の境界内（例えば、遺伝子のイントロンまたはエクソン内の多型等を含むが、それらに限定されない、遺伝子に対応するゲノム配列内）にある遺伝子マーカーも採用し得る。本開示の主題のいくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子マーカーは、１〜１０個のマーカーを含み、いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子マーカーは、１０個超の遺伝子マーカーを含む。

本明細書で使用される「遺伝子型」という用語は、細胞または生物の遺伝子構成を指す。個体の「一組の遺伝子マーカーにおける遺伝子型」は、個体のハプロタイプ中に存在する１つ以上の遺伝子マーカー遺伝子座における特定の対立遺伝子を含む。当分野で既知であるように、遺伝子型は、遺伝子座が関連するか否か、および／または結合されるか否かに関わらず、単一遺伝子座または複数の遺伝子座に関連し得る。いくつかの実施形態において、個体の遺伝子型は、それに関連する１つ以上の遺伝子に関連し、遺伝子のうちの１つ以上は、関心の表現型の発現（例えば、本明細書に定義されるような量的形質）に関与する。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子型は、量的形質のうちの１つ以上の遺伝子座における個体内に存在する１つ以上の対立遺伝子の概略を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子型は、ハプロタイプの観点から表される（以下の本明細書に定義される）。

本明細書で使用される「生殖質」という用語は、集団または他の個体群（例えば、種）の遺伝子型の全体性を指す。「生殖質」という用語は、植物材料、例えば、様々な対立遺伝子のリポジトリとして機能する植物の群を指すこともできる。「適合された生殖質」という語句は、例えば、所与の環境または地理的領域について証明された遺伝学的優位性の植物材料を指し、一方で、「適合されていない生殖質」、「生の生殖質」、および「外来生殖質」という語句は、例えば、所与の環境または地理的領域について知られていないか、あるいは証明されていない遺伝学的価値の植物材料を指し、したがって、「適合されていない生殖質」という語句は、いくつかの実施形態において、確立された繁殖集団の一部ではなく、確立された繁殖集団のメンバーとの既知の関係を有さない植物材料を指す。

本明細書で使用される「雑種」、「雑種植物」、および「雑種子孫」という用語は、遺伝的に異なる親から産生される個体（例えば、遺伝的にヘテロ接合性またはほぼヘテロ接合性の個体）を指す。

本明細書で使用される「単一交配Ｆ₁雑種」という語句は、２つの近交系間の交配から産生されるＦ₁雑種を指す。

本明細書で使用される「近交系」という語句は、遺伝的にホモ接合性またはほぼホモ接合性の集団を指す。近交系を、例えば、兄弟／姉妹繁殖もしくは自家受粉のいくつかのサイクルを通して、または二ゲノム性半数体産生において得ることができる。いくつかの実施形態において、近交系繁殖は、１つ以上の関心の表現型形質に当てはまる。「近交」、「近交系個体」、または「近交系子孫」は、近交系からサンプリングされる個体である。

本明細書で使用される「二ゲノム性半数体系」という用語は、別の培養物に由来する安定した近交系を指す。特定の培地および環境で栽培されるいくつかの花粉粒（半数体）栽培は、染色体を含有する胚を生み出すことができる。次に、これらの胚は、「倍化」され、２ｎ染色体を含有する。これらの胚の子孫は、「二ゲノム性半数体」と命名され、本質的にはそれ以上分離しない（安定している）。

本明細書で使用される「結合」という用語およびその文法的変形は、いくつかの実施形態において、それらの物理的近接の結果として、それらの伝送が独立している場合に、偶然にも予想されるであろうよりも高い頻繁でともに分離する、同一の染色体上の異なる遺伝子座における対立遺伝子の傾向を指す。

本明細書で使用される「連鎖群」という用語は、伝送され、ともに分離する傾向があり、通常所与の染色体に属する、一組の遺伝子、対立遺伝子、または遺伝子座を指す。ほとんどの場合、所与の連鎖群Ｘは、染色体Ｘに相当する。したがって、本発明の範囲内で、連鎖群６は、染色体６に相当し、連鎖群１ａおよび１ｂは、染色体１に相当し、連鎖群９ｂは、染色体９に相当する。

本明細書で使用される「核酸」という語句は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、典型的なＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡポリマー）、修飾オリゴヌクレオチド、（例えば、２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチド等の生物学的ＲＮＡまたはＤＮＡに対して典型的ではない塩基を含むオリゴヌクレオチド）等を含む、ヌクレオチドに対応することができるモノマー単位の任意の物理的ストリングを指す。いくつかの実施形態において、核酸は、一本鎖、二本鎖、複数本鎖、またはそれらの組み合わせであり得る。別途示されない限り、本開示の主題の特定の核酸配列は、任意で、明確に示される任意の配列に加えて、相補配列を含むか、あるいはコードする。

本明細書で使用される「表現型形質」という語句は、そのゲノム、プロテオーム、および／もしくはメタボロームと環境との相互作用に起因する、個体の出現または他の検出可能な特徴を指す。

本明細書で使用される「耐性」という語句は、類似の環境条件および病原体圧力下で罹病性植物と比較される時に、それらが引き起こす特定の病原体および／または損傷の増殖および発達を制限する植物の能力を指す。耐性植物は、病原体、例えば、真菌圧力下で、いくつかの病徴または損傷を示し得る。

本明細書で使用される「易罹患性」という語句は、特定の病原体の増殖および発達を適切に制限する植物の能力欠如を指す。

本明細書で使用される「ボトリチス耐性」もしくは「灰色かび病菌への耐性」または「ボトリチス耐性植物」という語句は、真菌による定着に抵抗する植物の能力を指す。

ボトリチス耐性は、本発明の範囲内で、以下の実施例１．１で詳細に説明される病理学的試験において決定される。

病理学的試験は、結果として生じる証明された耐性がトマト栽培の実際の取引条件にできるだけ近くなるよう策定される。具体的には、耐性は、葉が剪定され、切断された葉がボトリチス菌糸体で植菌された植物の茎上に現れる。この耐性の評価は、世話および収穫を促進するために、ならびに均衡のとれた植物の活力および植物の産生性のために、栽培者が継続的に外側の葉を切断および除去する、ボトリチス病原体による温室内のトマト植物の寄生の条件を模倣している。

さらに、本発明に記載の耐性試験は、異なる菌株分離株の収集から生み出された、いくつかの攻撃的および非常に攻撃的なボトリチス菌株とともに行われる（表２を参照のこと）。分離株は、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の形態およびＩＴＳ配列に基づいて特徴付けられた。

植物は、様々な長さの茎傷害、具体的には、長さ１５ｍｍ〜５０ｍｍの茎傷害によって証明されある攻撃性の異なるレベルを示す、実施例１に記載の病理学的試験における罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統に有毒である、表２に示される菌株等の菌株のコア収集が、任意の有意性の試験植物上に茎傷害、すなわち、長さ６ｍｍ未満、具体的には、５ｍｍ未満の茎傷害を生み出すことができない場合に、「ボトリチス耐性植物」と見なされる。

本明細書で使用される「複数」という用語は、２つ以上を指す。したがって、「複数の個体」は、少なくとも２つの個体を指す。いくつかの実施形態において、複数という用語は、全体の半分を超える数を指す。例えば、いくつかの実施形態において、「複数の集団」は、その集団の半数を超えるメンバーを指す。

本明細書で使用される「子孫」という用語は、特定の交配の子孫を指す。典型的には、いくつかの種（具体的には、いくつかの植物および雌雄同体動物）を自家受粉（すなわち、同一の植物が雄性および雌性配偶子の両方のドナーとして機能する）することができるが、子孫は、２つの個体の繁殖に起因する。子孫は、例えば、Ｆ₁、Ｆ₂、または任意の次世代であり得る。

本明細書で使用される「量的形質」という語句は、数値的に説明する（すなわち、定量化または数量化する）ことができる表現型形質を指す。量的形質は、典型的には、集団の個体間の連続的変形を示し、すなわち、表現型形質の数値の差異はほんのわずかであり、段階的に相互に移行する。高い頻度で、量的表現型形質の集団における度数分布は、円錐形の曲線を示す（すなわち、２つの極度の間の正規分布を示す）。本事例において、量的形質は、ボトリチス属の真菌、具体的には、灰色かび病への耐性に関して、集団の個体間の連続的変形を示し、その耐性は、寄生の重症度を評価するために寄生部位周囲の壊死性傷害の長さを用いて標準化された耐性アッセイの手段によってスコア化される。

量的形質（ＱＴＬ）は、典型的には、環境と相互作用する遺伝子座、または相互および／もしくは環境と相互作用する複数の遺伝子座の結果である。量的形質の例として、草高および収率が挙げられる。

本発明において、「共分離」という用語は、形質における対立遺伝子およびマーカーにおける対立遺伝子が、同一の染色体上で物理的に近接するため、ともに伝送される傾向があり（それらの物理的近接のために減少したそれらの間の組み換え）、同一の染色体上のそれらの近接の結果として、それらの対立遺伝子の非ランダム関連性をもたらすという事実を指す。「共分離」は、その少なくとも１つが遺伝子的であり、偶然にも容易に説明することができない、単一植物中の２つ以上の形質の存在も指す。

本明細書で使用される「量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）」および「マーカー形質関連性」という用語は、関心の形質の表現型に影響を及ぼす、遺伝子マーカーと染色体領域および／または遺伝子との間の関連性を指す。典型的には、これは、例えば、文献に公開される１つ以上の方法に基づいて、統計的に決定される。ＱＴＬは、表現型形質（量的形質または質的形質のいずれか）に差次的に影響を及ぼす少なくとも２つの対立遺伝子を有する染色体領域および／または遺伝子座であり得る。

本明細書で使用される「質的形質」という語句は、主要な表現型効果を示す１つまたは少数の遺伝子によって制御される表現型形質を指す。このため、質的形質は、典型的には、単に遺伝される。植物における例として、花の色、果実の色、および例えば、真菌斑点病耐性、立ち枯れ病耐性、またはトマトモザイクウイルス耐性等のいくつかの既知の病害耐性が含まれるが、それらに限定されない。

「マーカーに基づく選択」は、本発明の範囲内で、例えば、選択的繁殖プログラムでそれらの植物を用いる（または避ける）ことができるように、望ましい（または望ましくない）形質に遺伝子を担持する植物を同定するために、核酸が所望の形質と関連する、植物から１つ以上の核酸を検出するための遺伝子マーカーの使用を指すと理解される。

「マイクロサテライトまたはＳＳＲ（単純配列反復）マーカー」は、本発明の範囲内で、植物のゲノムの全体にわたって遺伝子座で見られ、高度に多型である可能性を有する、ＤＮＡ塩基の短配列の数々の反復から成る遺伝子マーカーの一種を指すと理解される。

「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」は、本発明の範囲内で、ゲノムのＤＮＡまたは小集団の比較的大量の特定の領域を産生し、それによって、それらの領域に基づく可能性のある様々な分析を作製する方法を指すと理解される。

「ＰＣＲプライマー」は、本発明の範囲内で、ＤＮＡの特定の領域のＰＣＲ増幅において用いられる一本鎖ＤＮＡ比較的短い断片を指すと理解される。

「表現型」は、本発明の範囲内で、遺伝的に制御される形質の識別可能な特徴を指すと理解される。

本明細書で使用される「表現型形質」という語句は、そのゲノム、プロテオーム、および／またはメタボロームと環境との相互作用に起因する、個体の出現または他の検出可能な特徴を指す。

「多型」は、本発明の範囲内で、遺伝子、遺伝子マーカー、もしくは遺伝形質、または例えば、代替的スプライシング、ＤＮＡメチル化等により入手可能である遺伝子産物の２つ以上の異なる形態の集団における存在を指すと理解される。

「選択的繁殖」は、本発明の範囲内で、親として望ましい形質を有するか、あるいは提示する植物を用いる繁殖プログラムを指すと理解される。

「試験用」植物は、本発明の範囲内で、試験される植物の形質を遺伝的に特徴付けるために用いられるソラヌム属の植物を指すと理解される。典型的には、試験される植物は、「試験用」植物と交配し、交配の子孫における形質の分離比がスコア化される。

本明細書で使用される「プローブ」は、特定の標的分子または細胞構造を認識し、それに結合することができ、したがって、標的分子または構造の検出を可能にする原子または分子の一群を指す。具体的には、「プローブ」は、分子ハイブリダイゼーションによる相補配列の存在を検出し、それを定量化するために用いることができる標識化されたＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、従来のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液が、溶液として用いられ、および／またはハイブリダイゼーション温度が、３５℃〜７０℃、好ましくは、６５℃であるハイブリダイゼーション条件を指す。ハイブリダイゼーション後、好ましくは、３５℃〜７５℃、具体的には、４５℃〜６５℃であるが、特に５９℃の温度で、最初に２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、その後、０．２×ＳＳＣで洗浄する（ＳＳＰＥ、ＳＳＣ、およびＤｅｎｈａｒｄｔｓ溶液の定義に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照のこと）。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献に記載の高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が、特に好ましい。具体的には、好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄が上述のように６５℃で発生する場合に存在する。例えば、４５℃でハイブリダイゼーションおよび洗浄が行われる非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、比較的好ましくなく、３５℃ではさらに比較的好ましくない。

「配列相同性または配列同一性」は、本明細書で同義に使用される。２つ以上の核酸またはタンパク質配列の文脈において、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または目視検査によって測定される時、最大一致において比較および調整される場合に、同一であるか、あるいは同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合を有する２つ以上の配列または部分列を指す。相互に比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基の割合に関連する。本明細書で使用される、２つの配列間のパーセント同一性／相同性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、割合同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）であり、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要のあるギャップの数、各ギャップの長さを考慮する。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定を、以下の本明細書で説明されるように、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、配列同一性を、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）等のコンピュータプログラムの使用を伴う従来の方式で決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の最も高い配列同一性を有する断片を見出すために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２（１９８１），４８２−４８９の局所的相同性アルゴリズムを利用する。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％の同一性を有するかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは別の配列アラインメントプログラムを用いる時、パラメータは、好ましくは、同一性の割合が参照配列の全長にわたって計算され、参照配列におけるヌクレオチドの総数の最大５％の相同性ギャップが認められるように調整される。Ｂｅｓｔｆｉｔを用いる時、いわゆる任意のパラメータは、好ましくは、それらの既定（「初期」）値のままである。所与の配列と本発明の上述の配列との間の比較において見られる偏差は、例えば、付加、欠失、置換、挿入、または組み換えによって引き起こされる場合もある。そのような配列比較を、好ましくは、プログラム「ｆａｓｔａ２０ｕ６６」（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎおよびバージニア大学による、１９９８年９月のバージョン２．０ｕ６６、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８３，６３−９８、添付の実施例、およびｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／も参照のこと）で行うこともできる。このため、「初期」パラメータ設定を用いることができる。

２つの核酸配列が実質的には同一であるということは、２つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイゼーションすることを別に示す。「〜に特異的にハイブリダイゼーションする」という語句は、その配列が、複合混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡもしくはＲＮＡ中に存在する時に、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対して分子を結合、二重鎖形成、またはハイブリダイゼーションすることを指す。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることによって適合させることができる小規模のミスマッチを含む。

サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」とは、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの広範囲に及ぶ指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。概して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列において、熱融解点よりも約５℃低くなるように選択される。典型的には、「ストリンジェントな条件」下で、プローブは、その標的部分列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。

熱融解点は、（定義されるイオン強度およびｐＨにおいて）５０％の標的配列が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブの融解温度（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）と等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルタ上に超１００個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは、終夜行われる。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ、７２℃、約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例として、６５℃で１５分間の０．２倍のＳＳＣでの洗浄がある（ＳＳＣ緩衝液の記述については、以下、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。多くの場合、高ストリンジェンシー洗浄は、バックグラウンドプローブ信号を除去するために、低ストリンジェンシー洗浄から始まる。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖における中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１倍のＳＳＣである。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖における低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４〜６倍のＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０個のヌクレオチド）に関して、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンの塩濃度、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）を伴い、温度は、典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件を、ホルムアミド等の不安定化剤の添加を伴って達成することができる。概して、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブにおいて観察されるものの２倍（またはそれ以上）の信号対ノイズ比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝子コードによって許可される最大のコドン縮重を用いて作成される時に発生する。

「植物」は、任意の発達段階における任意の植物、具体的には、種子植物である。
「植物細胞」は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造および生理学的単位である。植物細胞は、単離した単一組織もしくは培養細胞の形態であるか、あるいは例えば、植物細胞、植物器官、または植物全体等のより高度に組織化された単位の一部であり得る。

「植物細胞培養」とは、例えば、様々な発達段階における、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子、および胚芽等の植物単位の培養を意味する。

「植物材料」または「植物から入手可能な植物材料」は、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養、または植物の任意の他の部分もしくは産物を指す。

「植物器官」は、根、茎、葉、花芽、または胚等の、植物のはっきり異なり、明白に構造化および分化した部分である。

本明細書で使用される「植物組織」は、構造および機能単位に組織化される植物細胞の一群を意味する。植物体または培養物中の植物の任意の組織が含まれる。この用語は、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物、および構造および／または機能単位に組織化される植物細胞の任意の群を含むが、それらに限定されない。上に列挙されるような、あるいはさもなければこの定義により包含されるような任意の特定の種類の植物組織と併せた、またはその不在下でのこの用語の使用は、任意の他の種類の植物組織を除外するようには意図しない。

「品種」または「複数の品種」という用語は、種に対して分類学的に下位であり、下位品種に対して下位であり、遺伝形質の潜在因子の所定のプロファイルによって特徴付けられる亜種等の分類学的下位群を含む、任意の近親交配群を指す。

本明細書で使用される「集団」という用語は、共通の遺伝的由来を共有する遺伝的に異質の植物の一群を意味する。

本明細書で使用される「トマト」という用語は、ソラヌム・リコペルシクム種セラシフォルム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｖａｒ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）、ソラヌム・ピンピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）、ソラヌム・ケエスマニアエ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）、ソラヌム・ネオリキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）、ソラヌム・クミリウスキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）、ソラヌム・ペンネリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、ソラヌム・ペルビアナム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、ソラヌム・チレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、Ｓ．リコペルシコイデス（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）、Ｓ．Ｎペルビアナム（Ｓ．Ｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、Ｓ．コルネリオムエルレリ（Ｓ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｅｌｌｅｒｉ）、Ｓ．「カレホン・デ・ウアイレス」（Ｓ．‘Ｃａｌｌｅｊｏｎ ｄｅ Ｈｕａｙｌａｓ’）、Ｓ．ガラパゲンセ（Ｓ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）、Ｓ．シチエンズ（Ｓ．ｓｉｔｉｅｎｓ）、およびソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）の任意の品種、栽培品種、または集団を意味する。

本明細書で使用される「品種」または「栽培品種」という用語は、構造的特徴および性能によって、同一の種内の他の品種から同定することができる類似の植物の群を意味する。

一実施形態において、本発明は、新規のボトリチス耐性トマト植物およびトマト系統、ならびに選択的繁殖技術において本明細書に記載の分子マーカーを利用して、それらを産生するための改善された方法に関する。より具体的には、本発明は、ある特定の新規のボトリチス耐性トマト植物を提供し、該耐性は、少なくとも１つのＱＴＬによって制御される。本明細書で特定されるＱＴＬのうちの少なくとも１つを含有しないトマト植物は、ボトリチス属による感染に感染しやすい。

具体的には、ボトリチス耐性を制御する少なくとも１つのＱＴＬは、それぞれ、染色体１、６、および９の上に位置付けられる。

したがって、本発明は、一実施形態において、灰色かび病菌への耐性を示すトマト植物に関し、該植物は、トマト植物において該灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御する少なくとも１つの外来種の遺伝的決定因子を含み、該外来種の遺伝的決定因子は、野生トマト種またはその祖先に由来し、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群にマッピングする。

該染色体上に位置付けられ、ボトリチス耐性と共分離する分子マーカーを、マーカー支援型選択を用いて同定することができ、そのための技術は、当分野において周知である。そのような選択技術で用いることができるマーカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２の所与のプライマーの群から選択される、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーで、ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーによって表される。それぞれ、上述の染色体１、６、および９の上のＱＴＬを含有するボトリチス耐性トマト植物の一供給源は、系統０４ＴＥＰ９９０３１２、ＮＣＩＭＢ４１６２３のソラヌム・ハブロカイテスであり、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で寄託されている。ボトリチス属への耐性を示し、ボトリチス耐性をコードする１つ以上のＱＴＬを含有する他の関連トマト植物を、本明細書に提供されるマーカーのうちの１つ以上を用いてこれから同定することができる。

さらに、ソラヌム・リコペルシクム種セラシフォルム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｖａｒ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）、ソラヌム・ピンピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）、ソラヌム・ケエスマニアエ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）、ソラヌム・ネオリキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）、ソラヌム・クミリウスキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、ソラヌム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）、ソラヌム・ペンネリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、ソラヌム・ペルビアナム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、ソラヌム・チレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、Ｓ．リコペルシコイデス（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）、Ｓ．Ｎペルビアナム（Ｓ．Ｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、Ｓ．コルネリオムエルレリ（Ｓ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｅｌｌｅｒｉ）、Ｓ．「カレホン・デ・ウアイレス」（Ｓ．‘Ｃａｌｌｅｊｏｎ ｄｅ Ｈｕａｙｌａｓ’）、Ｓ．ガラパゲンセ（Ｓ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）、Ｓ．シチエンズ（Ｓ．ｓｉｔｉｅｎｓ）、およびソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）を含むが、それらに限定されない関連トマト種の他の受入を、本発明のマーカーを用いて本明細書で同定されるＱＴＬのうちの少なくとも１つの存在についてこれから試験することができる。

本明細書に提供され、ボトリチス耐性に寄与する、それぞれ、染色体１、６、および９の上に位置付けられる少なくとも１つのＱＴＬと共分離する分子マーカーを用いて、該ＱＴＬまたはその機能部分のうちの１つ以上を、第１のドナー植物から第２の受容植物に遺伝子移入することができる。

受容植物は、例えば、
ａ．植物上の果実の保持能力、すなわち、堅い果皮および厚い皮を有し、古い果実が腐敗せず、古い果実の種子が発芽せず、古い果実内の糖類が分解せず、古い果実内で発酵しない、保持能力、
ｂ．著しい衰弱および病害進行を伴うことなく、３８℃のオープンスカイ条件下での機械収穫および輸送、ならびに保管に耐える果実の硬度、
ｃ．果実の表皮を剥くために、高圧蒸気に耐える果実の硬度（例えば、１０５℃〜１２０℃で１５〜３０ｐｓｉ）および／または化学物質の適用（例えば、８５℃〜９９℃で１１〜１９％ＮａＯＨ）、
ｄ．ホールトマトを調理するために、高圧蒸気に耐える果実の硬度、
ｅ．ダイストマト産物を作製するために、切断に耐える果実の硬度、ならびに
ｆ．高圧蒸気での調理に耐えるスライスおよびダイストマト産物の硬度等の農学的重要性のうちの１つ以上の形質を担持する、好ましくは、トマト植物、具体的には、栽培トマト植物、特に、栽培ソラヌム・リコペルシクムである。

本発明に従って作成されるトマト植物は、有利に、それらの形質の大部分を受容植物から導き出し、ボトリチス耐性を第１のドナー植物から導き出すことができる。本発明の一態様に従って、ボトリチス耐性をコードする遺伝子は、耐性量的形質遺伝子座に結合する分子マーカーを特定することによってマッピングされ、このマッピングは、表現型をスコア化するために、ボトリチスに耐性がある同系交配トマト植物と感染性の同系交配トマト植物との組み合わせを利用する。そのような系統の分子特徴付けを、ＭｏｎｆｏｒｔｅおよびＴａｎｋｓｌｅｙによってＧｅｎｏｍｅ，４３：８０３−８１３（２０００）で説明される技術を用いて行うことができる。限定的ではない一例として、ボトリチス耐性表現型とマーカー遺伝子型との間の関連性を、ソフトウェアパッケージＱＴＬＣａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒ（ＣＪ Ｂａｓｔｅｎ，Ｐ Ｇａｆｆｎｅｙ，ＺＢ Ｚｅｎｇ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００６）を用いて調査することができる。

本発明の別の実施形態において、本発明は、上級で新規のボトリチス耐性トマト植物を産生するための方法に関する。本発明の方法において、ボトリチス耐性をコードする１つ以上の遺伝子を、ボトリチス属に耐性を示すドナー親植物から、ボトリチス属による感染に非耐性であるか、あるいはボトリチス属による感染への中間レベルの耐性を有する植物であるかのいずれかである受容トマト植物の中に遺伝子移入する。本発明の方法に従って産生されるボトリチス耐性トマト植物は、近交系、雑種、または半数体トマト植物のいずれかであり得る。

ボトリチス属に非耐性であるか、あるいはボトリチス属への中間レベルの耐性を有する受容トマト植物の中へのボトリチス耐性をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子移入を、当分野で既知の技術を用いて達成することができる。例えば、従来の繁殖技術を用いてボトリチス耐性をコードする１つ以上の遺伝子を、ボトリチス属に非耐性であるか、あるいはボトリチス属への中間レベルの耐性を有する植物である受容トマト植物の中に遺伝子移入することができる。

本発明に記載され、かつ本明細書で説明されるトマト植物を、商業的トマト種子産生において用いることができる。商業的トマトは、概して、２つの親系統の交配（近交）から産生される雑種である。雑種の作成は、概して、ホモ接合性近交系の作成、これらの系統の交配、および交配の評価を必要とする。

家系繁殖および反復選択繁殖法は、繁殖集団から近交系を作成するために用いられる。繁殖プログラムは、２つ以上の近交系または様々な他の生殖質源からの遺伝的背景を、新たな近交系が自家受粉ならびに所望の表現型および特徴の選択によって作成される繁殖プールへと結集させる。新たな近交は、他の近交系と交配され、これらの交配由来の雑種は、それらのどちらが商業的可能性を有するかを決定するために評価される。植物繁殖および雑種作成は、費用がかかり、多大な労働および時間を必要とする過程である。

家系繁殖は、２つの遺伝子型の交配から始まり、他方において欠如しているか、あるいは他方を補完する、それらの各々は、病害耐性、昆虫耐性、有益な果実特徴、増加した収率等であるが、それらに限定されない、１つ以上の商業的に望ましい特徴を有し得る。２つの初代の親が全ての所望の特徴を提供しない場合、確立された繁殖集団を生成するために、他の供給源を繁殖集団中に含むことができる。家系法において、上級の植物は自家受粉され、後続世代において選択される。後世において、ヘテロ接合条件は、自家受粉および選択の結果として、同種系統に移行する。典型的には、自家受粉および選択の５世代以上を繁殖させる家系法において、Ｆ１からＦ２、Ｆ３からＦ４、Ｆ４からＦ５等を実践する。単一交配雑種は、２つの近交系の交配に起因し、それらの各々は、他方の遺伝子型を補完する遺伝子型を有する。第１世代の雑種子孫は、Ｆ１と指定される。商業的雑種の作成において、Ｆ１雑種植物のみが求められる。好ましいＦ１雑種は、それらの近交親よりも活力にあふれている。この雑種性能（雑種活力または雑種強勢）を、増加した栄養増殖および増加した収率を含む多くのポリジーン形質において明らかにすることができる。トマト植物を容易に他家受粉することができる。例えば、さらに商業的系統を得るために、従来の繁殖技術を用いて、形質を、異なる種類のトマト植物を含む、１つのトマト植物から別の植物に容易に移すこともできる。優良系統への形質の遺伝子移入は、例えば、反復選択繁殖、例えば、戻し交配によって達成される。この場合、優良系統（反復親）は、最初に、形質、具体的には、本発明に記載の「ボトリチス耐性」形質を担持するドナー近交（非反復親）と交配される。次に、この交配の子孫は、反復親と戻し交配され、その後、結果として得られた子孫において形質について選択される。形質、具体的には、本発明に記載の「ボトリチス耐性」形質における選択を有する反復親との３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の戻し交配後、子孫は、耐性を抱く遺伝子座においてヘテロ接合性であるが、大部分またはほぼ全ての他の遺伝子において反復親に類似している（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｅｈｌｍａｎ ＆ Ｓｌｅｐｅｒ（１９９５）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｃｒｏｐｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，１７２−１７５、Ｆｅｈｒ（１９８７）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３６０−３７６を参照のこと）。形質における選択が、各交配後に行われる。雄性不稔性は、トマトにおいて入手可能である。具体的には、遺伝子雄性不稔性を、商業的系統において用いることができる（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｋｉｌｃｈｅｖｓｋｙ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｉｌ Ｄｏｂｒｏｄｋｉｎ，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｖｏｌｕｍｅ２２，Ｎｕｍｂｅｒ３／Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０００を参照のこと）。

集団を、いくつかの異なる方法でスクリーニングすることができる。最初に、集団を、従来の病理学的病害スクリーニングを用いてスクリーニングすることができる。そのような病理学的病害スクリーニングは、当分野で既知である。具体的には、個体植物もしくはその部分は、気候室または温室内で、ボトリチス属とチャレンジされ、各々の植物の結果として生じる耐性または罹病性の表現型をスコア化することができる。

限定的ではない一例として、植物を、４０００〜６０００ｌｕｘ、具体的には、５０００ｌｕｘの光度で、２０℃〜２４℃、具体的には、２２℃の日中温度、かつ１６℃〜２０℃、具体的には、１８℃の夜間温度で、気候室中でスクリーニングすることができる。

症状の評価は、通常、植菌の約２〜４日、具体的には、３日後に作成される茎壊死の長さに基づいて評価される。壊死評価は、植菌の約６〜８日、具体的には、７日後に行われる。各系統において、壊死の平均の長さは、各実験から得られる各植物から記録される。

具体的には、系統および雑種の評価に関して、植物を、温室条件下の市場産生設備に近い半人工条件でスクリーニングすることができる。種子は、好適な基質、例えば、播種に適合した堆肥を有するトレイの中に播種される。トレイは、１５時間／９時間（日中／夜間）の光周期を有する気候室内でインキュベートされる。日中温度は、８０００〜１２０００ｌｕｘ、具体的には、１００００ｌｕｘの光度で、２２℃〜２６℃、具体的には、２４℃であり、夜間温度は、１６℃〜２０℃、具体的には、１８℃である。

苗木は、播種の約８〜１２日、具体的には、１０日後に、好適な基質、例えば、適合した堆肥を有するポットの中に植え替えられる。３〜５週間後、具体的には、４週間後、苗木は、温室内の土壌の中に直接植え替えられた。

胞子植菌を、増殖の約１．５〜３ヶ月、具体的には、２ヶ月後に行うことができる。各植物の２〜３枚の葉が剪定される。任意で、１０％サッカロース（重量／容積）を含む、１×１０⁵〜１×１０⁷の胞子／ｍＬの水溶液、具体的には、１×１０⁶の胞子／ｍＬの水溶液を、接種材料として用いることができる。接種材料は、剪定後すぐに創傷部分上に蔓延する。２回目の植菌、続いて３回目の植菌は、同一のプロトコルで２〜４週間毎、具体的には、３週間毎に実行される。数週間後、罹病性基準（ソラヌム・リコペルシクム優良系統）について、植物の死をもたらした壊死を観察することができる。少なくとも５０％の罹病性植物が枯死した時点で、小区画毎の枯れた植物の数を数えることにより、かつ各小区画からの各植物の最大壊死の長さを測定することにより、症状評価を行うことができる。各系統または雑種について、壊死の平均の長さが記録される。

第２に、マーカー支援型選択を、ボトリチス耐性をコードする遺伝子のうちの１つ以上を含有するそれらの雑種植物を同定するために、上で説明された分子マーカーのうちの１つ以上を用いて実行することができる。あるいは、マーカー支援型選択を、病理学的スクリーニングから得られる結果を裏付けるために用いることができる。次に、ボトリチス耐性をコードする必要な遺伝子を含有し、商業的に望ましい特徴を有する、ボトリチス耐性表現型を示すＦ２雑種植物が選択され、トマト植物が次第に近交になることを可能にするために、いくつかの世代において自家受粉される。連続した自家受粉および選択のこの過程を、５世代以上にわたって実行することができる。ボトリチス耐性と関連している遺伝子、ならびに商業的関心の形質と関連している他の遺伝子において遺伝的に相同である系統の産生が、そのような繁殖および選択の結果である。あるいは、新規で上級のボトリチス耐性近交トマト植物系統を、反復選択および戻し交配の技術を用いて作成することができる。この方法において、反復親を、（反復親とは異なり、本明細書において「非反復親」と称される）第１のドナー植物と交配させることによって、ボトリチス耐性を、（反復親と呼ばれる）標的受容植物の中に遺伝子移入することができる。反復親は、ボトリチス属に非耐性であるか、あるいはボトリチス属への中間レベルの耐性を有する植物であり、病害耐性、昆虫耐性、有益な果実特徴等であるがそれらに限定されない商業的に望ましい特徴を有する。

非反復親は、ボトリチス耐性を示し、ボトリチス耐性をコードする１つ以上の遺伝子を含有する。非反復親は、反復親と交雑受精する任意の植物品種または近交系であり得る。反復親と非反復親との間の交配に起因する子孫は、反復親に戻し交配される。次に、結果として生じる植物集団がスクリーニングされる。集団を、いくつかの異なる方法でスクリーニングすることができる。第１に、集団を、本明細書で先に説明されたような従来の病理学的スクリーニングを用いてスクリーニングすることができる。第２に、ボトリチス耐性をコードする遺伝子のうちの１つ以上を含有する子孫を同定するために、マーカー支援型選択を、上で説明された分子マーカーのうちの１つ以上を用いて実行することができる。あるいは、マーカー支援型選択を、病理学的スクリーニングから得られる結果を裏付けるために用いることができる。いったん適切な選択をすると、本過程が繰り返される。反復親への戻し交配およびボトリチス耐性における選択の過程は、約５世代以上にわたって繰り返される。この過程に起因する子孫は、ボトリチス耐性をコードする１つ以上の遺伝子においてヘテロ接合性である。次に、ホモ接合性の純粋繁殖子孫にボトリチス耐性を提供するために、最後の戻し交配世代が自家受粉される。ボトリチス耐性雑種植物を作成するために、本明細書に記載のボトリチス耐性近交トマト系統をさらなる交配で用いることができる。例えば、第１のボトリチス耐性近交トマト植物を、病害耐性、昆虫耐性、望ましい果実特徴等であるが、それらに限定されない商業的に望ましい形質を有する第２の近交トマト植物と交配させることができる。この第２の近交トマト系統は、ボトリチス属に耐性を示す場合もあり、示さない場合もある。上で説明された方法で使用されるマーカー支援型選択を段階的に行うことができ、それによって、異なるボトリチス耐性遺伝子は、２世代以上にわたって、または代替的な例として、同時に選択され、それによって、全ての耐性遺伝子を同一世代にわたって選択される。ボトリチス耐性におけるマーカー支援型選択を、病害耐性、昆虫耐性、望ましい果実特徴等の他の商業的に望ましい形質における試験および選択の前、それと同時に、またはその後に行うことができる。

具体的には、先の本明細書に記載の本発明に関連性のある遺伝子座の全てが、ホモ接合性の好ましい遺伝子型を有する個体を同定するために、マーカーに基づく選択を、表現型選択との組み合わせで、または表現型選択を受けて適用することができる。

制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅制限断片長多型（ＡＦＬＰ）、単一配列反復（ＳＳＲ）、および一塩基多型ＳＮＰを含むが、それらに限定されない、マーカーに基づく選択において用いることができる分子マーカーのいくつかの種類が存在する。

ＲＦＬＰは、特定の短い制限部位で染色体ＤＮＡを切断する制限酵素の使用を伴い、多型は、部位間の重複もしくは欠失、または制限部位での変異に起因する。

ＲＡＰＤは、無名のＤＮＡ断片の菌株特異的配列を生成するために、不定の配列の単一プライマーでの低ストリンジェンシーポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を利用する。本方法は、微量のＤＮＡ試料のみを必要とし、多数の多型遺伝子座を分析する。

ＡＦＬＰは、ＰＣＲを用いる前に制限酵素での細胞ＤＮＡの消化、および特定の断片を増幅するために、プライマー中の選択的ヌクレオチドを必要とする。この方法で、得られた断片を可視化するために電気泳動技術を用いて、１つのプライマー組み合わせ当たり最大１００個の多型遺伝子座を測定することができ、各試験において少量のＤＮＡ試料のみを必要とする。

ＳＳＲ分析は、真核生物のゲノム全体に広く分散するＤＮＡマイクロサテライト（短鎖反復）配列に基づき、それを、単純配列反復における変化を検出するために選択的に増幅する。ＳＳＲ分析において、微量のＤＮＡ試料のみが必要とされる。ＳＮＰは、点突然変異を効率的に捕らえるＰＣＲ伸長アッセイを用いる。本手順は、１つの試料当たり少量のＤＮＡを必要とする。上述の方法の１つまたは２つを、典型的なマーカーに基づく選択繁殖プログラムにおいて用いることができる。

植物ゲノムの多型領域に広がるヌクレオチド断片の増幅を達成するほとんどの好ましい方法は、その二本鎖形態における多型を定義する近位配列をハイブリダイズすることができる順方向プライマーおよびバックワードプライマーを含むプライマー対を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３ ２７３（１９８６））を採用する。

指数関数的に特定の標的を増幅するためにオリゴヌクレオチドプローブの２つの対を用いる、「リガーゼ連鎖反応」（「ＬＣＲ」）（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１８９ １９３（１９９１））等の断片を増幅するための代替方法を採用することができる。対が標的の同一の鎖の隣接配列をハイブリダイズすることを可能にするために、オリゴヌクレオチドの各対の配列を選択する。そのようなハイブリダイゼーションは、鋳型依存的リガーゼの基質を形成する。ＰＣＲに関して、結果として生じる産物は、それゆえに、その後のサイクルにおいて鋳型としての機能を果たし、所望の配列の指数関数的増幅を得る。

多型部位の同一の鎖の近位および遠位配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＬＣＲを実行することができる。一実施形態において、いずれかのオリゴヌクレオチドは、多型の実際の多型部位を含むよう策定される。そのような実施形態において、標的分子が、オリゴヌクレオチド上に存在する多型部位に相補的である特定のヌクレオチドを含有するか、あるいは欠如する場合にのみ、オリゴヌクレオチドをともに連結することができるように、反応条件が選択される。あるいは、オリゴヌクレオチドが多型部位を含まないようにそれらを選択することができる（Ｓｅｇｅｖ、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／０１０６９号を参照のこと）。

代替的に採用することができるさらなる方法は、「オリゴヌクレオチド連結反応アッセイ」（「ＯＬＡ」）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７ １０８０（１９８８））である。ＯＬＡプロトコルは、標的の単一鎖の隣接配列にハイブリダイズすることができるよう策定される２つのオリゴヌクレオチドを用いる。ＬＣＲのように、ＯＬＡは、具体的には、点突然変異の検出に適している。しかしながら、ＬＣＲとは異なり、ＯＬＡは、標的配列の指数関数的増幅というよりはむしろ、「線形」増幅をもたらす。

代替的に採用することができるさらに別の方法は、対立遺伝子特異的重複オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成される三次元錯体を開裂するために、構造特異的フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を用いる、「インベーダーアッセイ」である。標的分子中のＳＮＰ対立遺伝子に相補的であるオリゴヌクレオチドのアニーリングは、熱安定性ＦＥＮであるクリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）によるオリゴヌクレオチドの開裂を引き起こす。いくつかの異なる手法によって開裂を検出することができる。最も一般的には、開裂産物は、蛍光信号を放つために、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）カセット上で二次的開裂反応を引き起こす。あるいは、蛍光偏光（ＦＰ）プローブの使用により、または質量分析により、開裂を直接検出することができる。侵入的開裂反応は、特異性が高く、失敗率が低く、ゼプトモル量の標的ＤＮＡを検出することができる。本アッセイが、１つの反応当たりの１つの試料における１つのＳＮＰを調べるために伝統的に用いられてきた一方で、新規のチップまたはビーズに基づく手法は、この効率的で性格なアッセイを多重化かつ高生産性のＳＮＰ遺伝子型決定に適合させるために試験されている。

Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎらは、ＰＣＲおよびＯＬＡの特質を組み合わせた核酸検出アッセイを説明した（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３ ８９２７（１９９０））。この方法において、ＰＣＲは、標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成するために用いられ、次に、ＯＬＡを用いて検出される。

結果として生じる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有し、それによって、ジオリゴヌクレオチドが増幅する核酸の存在下における２つ（以上の）オリゴヌクレオチドの連結反応に基づくスキームも既知であり（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４：５６０ ５６９（１９８９））、本発明の目的に容易に適合することができる。

一実施形態において、分子マーカーは、ＰＣＲ、例えば、ＳＳＲマーカーまたはＲＡＰＤマーカーによって増幅されるＤＮＡ断片である。一実施形態において、増幅されたＤＮＡ断片の存在または不在は、形質自体の存在または不在を示すか、あるいは形質の特定の対立遺伝子を示す。一実施形態において、増幅されたＤＮＡ断片の長さの差異は、形質の特定の対立遺伝子存在を示し、意外にも形質の異なる対立遺伝子を区別することを可能にする。

本発明の特定の実施形態において、単純配列反復（ＳＳＲ）マーカーは、親植物および／またはその祖先、ならびに該親植物の交配に起因する子孫植物中の本発明に関連した対立遺伝子を同定するために用いられる。単純配列反復は、短鎖反復ＤＮＡ配列であり、全ての真核生物のゲノム中に存在し、所与のヌクレオチドモチーフの数回〜１００回超の反復から成る。ゲノム中の特定の位置に存在する反復の数が植物間で異なることが多いため、特定の対立遺伝子の不在または存在を決定するためにＳＳＲを分析することができる。

本発明の別の実施形態において、ＳＮＰマーカーは、親植物および／またはその祖先、ならびに該親植物の交配に起因する子孫植物中の本発明に関連した対立遺伝子を同定するために用いられる。

本発明において、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを含むマーカーまたは２組以上のマーカーを用いることができ、
そのプライマーは、分子重量もしくはヌクレオチド配列を示すＰＣＲ反応における増幅産物をもたらし、それは、同一のプライマー対とのＰＣＲ反応において、本質的に同一であるか、あるいはソラヌム・ハブロカイテス、系統０４ＴＥＰ９９０３１２、ＮＣＩＭＢ４１６２３から入手可能である対応するＰＣＲ増幅産物の対立遺伝子に対する対立遺伝子として見なされてもよく、またはボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーである。

本発明の一実施形態において、該増幅産物は、罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である増幅産物とは実質的には異なる長さである。

具体的には、増幅産物は、
ｉ．増幅産物につながり、２０５ｂｐ〜２３５ｂｐ、具体的には、２１０ｂｐ〜２３０ｂｐ、具体的には、２１５ｂｐ〜２２５ｂｐの範囲であり、および／または影響を受けやすいソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも１０％〜２０％、具体的には、１２％〜１８％、具体的には、約１４％短い、配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｉｉ．増幅産物につながり、２２４ｂｐ〜２２６ｂｐの範囲であり、および／または影響を受けやすいソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも０．４％〜１，８％、具体的には、０．８％〜１．５％長い、配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｉｉｉ．増幅産物につながり、１６０ｂｐ〜１７０ｂｐ、具体的には、１６２ｂｐ〜１６８ｂｐ、具体的には、１６４ｂｐ〜１６６ｂｐの範囲であり、および／または影響を受けやすいソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも３％〜１０％、具体的には、５％〜９％、具体的には、約６％短い、配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｉｖ．増幅産物につながり、８５ｂｐ〜９５ｂｐ、具体的には、８８ｂｐ〜９２ｂｐの範囲であり、および／または影響を受けやすいソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも５％〜１５％、具体的には、８％〜１２％、具体的には、約１１％短い、配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｖ．増幅産物につながり、２９０ｂｐ〜３２０ｂｐ、具体的には、２８０ｂｐ〜３１０ｂｐの範囲であり、および／または影響を受けやすいソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも５％〜１５％、具体的には、８％〜１２％、具体的には、約１０％短い、配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含むプライマー対、
ｖｉ．増幅産物につながり、１４０ｂｐ〜１６０ｂｐ、具体的には、１４５ｂｐ〜１５５ｂｐの範囲であり、および／または影響を受けやすいソラヌム・リコペルシクム優良系統、具体的には、系統Ｗ５０１６から入手可能である対応する断片よりも１０％〜３０％、具体的には、１５％〜２５％、具体的には、約２０％短い、配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含むプライマー対を用いる、ＰＣＲ反応において得られる。

第１のステップにおいて、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ試料は、既知の技術を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出することにより、葉組織等の好適な植物材料から得られる。次に、先の本明細書に開示の本発明に関連した質的形質座位内、またはそれに結合する領域内のＳＳＲを含有する領域に隣接するプライマーは、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ＤＮＡ試料を増幅するために使用される。

基本的に、ＰＣＲ増幅法は、増幅されるＤＮＡ断片に隣接する２つの短いオリゴヌクレオチドプライマー配列、または該ＤＮＡ断片に結合するアダプター配列を含むプライマーもしくは一対のプライマーの使用を含む。加熱およびＤＮＡの変性の反復サイクルの後、それらの相補的配列への低い温度でのプライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼでアニールされたプライマーの伸長が続く。プライマーは、ＤＮＡ標的配列の反対側の鎖にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、相補的ＤＮＡ鎖のアニーリングを指し、ここで相補的とは、一本鎖のヌクレオチドが反対側の鎖のヌクレオチドと結合して二重鎖構造を形成することができるようなヌクレオチド配列を指す。プライマーは、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成が、プライマー間のヌクレオチド配列にわたって双方向に進行するように配向される。手順は、１回のサイクルにおけるそのＤＮＡ断片の量を効果的に２倍にする。ＰＣＲ産物はプライマーと相補的であり、それに結合することができるため、各々の後続サイクルは、前回のサイクルにおいて合成されたＤＮＡの量を２倍にする。この手順の結果は、約２＜ｎ＞である特定の標的断片の指数関数的増幅であり、ここでｎはサイクル数である。

ＰＣＲ増幅を通じて、プライマーによって隣接されるＤＮＡ断片の何百万ものコピーが作製される。反復配列の数、または異なる対立遺伝子中の隣接プライマー間に位置する該反復に隣接する領域における挿入もしくは欠失の数の違いは、増幅されるＤＮＡ断片の長さの変化に反映される。これらの変化を、例えば、ゲル上で増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動的に分離することにより、またはキャピラリーシーケンサーを用いることにより検出することができる。ゲルまたは形状を分析することにより、その植物がホモ接合状態もしくはヘテロ接合状態にある所望の対立遺伝子を含有するか、または所望の対立遺伝子もしくは望ましくない対立遺伝子が植物ゲノムに存在しないかを決定することができる。

代替案において、所望の対立遺伝子の存在または不在を、二本鎖ＤＮＡ染色または蛍光レポータープローブ法を用いたリアルタイムＰＣＲにより決定することができる。

マーカー分析を、非常に若い植物の葉組織または種子から抽出されるＤＮＡ試料を用いて、植物発育の早期に行うことができる。これは、望ましい遺伝子構造を有する植物を、繁殖サイクルの早期に同定することを可能にし、所望の本発明に関連した対立遺伝子を含有しない植物を受粉前に排除し、したがって繁殖集団の規模を低減させ、表現型検査の必要性を低減させることが可能になる。

さらに、分子マーカーを用いることにより、ボトリチス耐性量的遺伝子座における所望の本発明に関連した対立遺伝子の２つのコピーを担持するホモ接合性植物と、１つのコピーのみを担持するヘテロ接合性植物と、好ましい対立遺伝子のうちのいずれのコピーも含有しない植物との間の区別を行うことができる。

したがって、代替的マーカーを、当業者に既知の方法により作成することができ、量的形遺伝子座、または本発明に記載され、かつ先の本明細書に開示された遺伝子座の対立遺伝子もしくは一組の対立遺伝子を有する植物を同定および選択するために用いる。

例えば、
ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、あるいは
ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、意外にも共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーを用いて、ＰＣＲ増幅で得られる増幅産物のヌクレオチド配列を、
当業者および新たに決定されたＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列に基づいて策定される新規のプライマーまたはプライマー対により得ることができる。さらに、本発明に記載され、かつ先の本明細書に開示されるマーカーを、トマトまたは他の種、具体的には、ナス科の種の遺伝子マップ上に位置付けることができ、同一またはホモログもしくはオルソログ領域をマッピングする既知のマーカーを、新規のマーカーを作成するための出発点として用いることができる。

したがって、本発明に具体的に開示されるマーカーを、ボトリチス耐性量的遺伝子座と関連する新規または追加のマーカーの同定および／もしくは作成において用いることもでき、次いで、同様に、マーカー支援型繁殖および／もしくはボトリチス耐性遺伝子座に隣接する組み換え型の探索、ならびに／または精細マッピング、ならびに／またはボトリチス耐性量的遺伝子座のクローニングにおいて用いることができる。

関心の領域において連鎖不均衡にある、ならびに／またはその領域に結合し、および／もしくはその領域に位置付けられるマーカー、ならびに質的形質の元となる、実際の原因となる変異を表すマーカーを同定および／もしくは作成するために用いることができる、当業者に既知の利用可能ないくつかの方法または手法が存在する。完全に包括的ではないが、当業者に既知のいくつかの手法は、以下を含む：

−関心の領域で他の配列を同定するためのハイブリダイゼーション手法における開示の配列／マーカーの使用：本明細書に開示のプライマー配列、および／または本明細書に開示のプライマー配列を用いて決定することができるマーカー／遺伝子配列（またはその部分）は、マーカーに隣接する核酸配列／遺伝子、ならびに／またはボトリチス耐性遺伝子座に結合し、および／もしくはボトリチス耐性遺伝子座に関連し、および／もしくはボトリチス耐性遺伝子座に対して特異的な核酸配列／遺伝子を、ゲノム核酸試料および／またはＲＮＡもしくはｃＤＮＡ試料または試料のプール（例えば、ＢＡＣライブラリまたはｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリスクリーニングのようなゲノム源のスクリーニング）から単離する際に、（ハイブリダイゼーション）プローブとして用いられる場合もある。

−関心の領域で他の配列を同定するためのＰＣＲ手法における開示の配列／マーカーの使用：本明細書に開示のプライマー配列、および／または開示のプライマー配列を用いて決定することができるマーカー／（候補）遺伝子配列（またはその部分）は、ボトリチス耐性遺伝子座の領域に隣接し、ならびに／またはその領域に結合し、および／もしくはその領域に関連し、および／もしくはその領域に対して特異的な核酸配列／遺伝子を、特定の植物組織から、および／または植物の特定の処理後、ナス属または主に十分な相同性を有する任意の他の生物から単離されるか、あるいは単離されないゲノム核酸試料および／またはＲＮＡもしくはｃＤＮＡ試料または試料のプールから増幅するために、（ＰＣＲ）増幅プライマーとして用いられる場合もある。

−関心の領域で他の配列を同定するためのＰＣＲ手法における開示の配列／マーカーの使用：１つ以上のマーカーのヌクレオチド配列／遺伝子は、該マーカー配列における内部プライマーを策定し、ボトリチス耐性遺伝子座の領域内の追加の隣接配列／遺伝子、ならびに／または形質に遺伝的に結合および／もしくは関連する隣接配列／遺伝子をさらに決定するために用いられた後に決定される場合もある。

−同一の領域でマーカーを同定するためのマッピングおよび／または比較マッピング手法における開示の配列／マーカーの使用（他のマップ上のボトリチス耐性遺伝子座の位置決め）：本明細書に開示の位置情報および／またはマーカー情報に基づいて、任意の型のマーカーは、遺伝子マッピング手法により、最終的には、（すでに必要とされた場合）（マップ全域の共通のマーカーに基づく遺伝子マッピングもしくは外挿による）（高密度）遺伝子マップ、および／または統合された遺伝子もしくはコンセンサスマップ上の開示のマーカーの位置決めにより同定される場合もある。既知のマーカー、および／または遺伝的に結合し、ならびに／または開示のマーカーの近くに、および／もしくはボトリチス耐性遺伝子座の領域に位置付けられる新規のマーカーは、ボトリチス耐性遺伝子座の精細マッピングおよび／もしくはクローニングならびに／またはＭＡＳ適用において同定され、および／または得られ、最終的には、用いられる場合もある。

−追加の配列／マーカー／（候補）遺伝子を同定するための「インシリコ」手法における開示の配列／マーカーの使用：本明細書に開示のプライマー配列、および／または本明細書に開示のプライマー配列もしくは結合したマーカーに基づくプライマー配列を用いて決定することができるマーカー／（候補）遺伝子配列（もしくはその部分）は、本明細書に記載の形質に遺伝的に結合および／もしくは関連し、ならびに／またはボトリチス耐性遺伝子座の領域に位置付けられる、（追加の）隣接および／もしくはホモログ配列／遺伝子および／または対立遺伝子の多様性（両方ともにゲノムおよび／もしくはｃＤＮＡ配列であるか、あるいはさらにはタンパク質であり、両方ともにナス属および／もしくは任意の他の生物に由来する）について配列もしくはタンパク質データベース（例えば、ＢＬＡＳＴ）を検索するための「インシリコ」方法において用いられる場合もある。

−物理的マッピング手法における開示の配列／マーカーの使用（物理的マップもしくはゲノム配列上のボトリチス耐性遺伝子座の位置決め）：本明細書に開示のプライマー配列、および／または本明細書に開示のプライマー配列を用いて、もしくは本明細書に開示のマーカーに遺伝的に結合し、および／またはボトリチス耐性遺伝子座の領域で位置付けられる他のマーカーを用いて決定することができるマーカー／遺伝子配列（もしくはその部分）は、ボトリチス耐性遺伝子座の（精細マッピング）および／もしくはクローニングならびに／またはＭＡＳ繁殖適用において適用可能な（候補）配列／マーカー／遺伝子を同定するために、同性を有する任意の生物の物理的マップおよび／または（全）ゲノム配列上に位置付けられる場合もある。

−他の（物理的）マップもしくはゲノム上にボトリチス耐性遺伝子座を位置付けるための開示の配列／マーカーの使用（種全域で、トマトについては、他のナス科種がモデル種として用いられる場合もある）：本明細書に開示のプライマー配列、および／または本明細書に開示のプライマー配列を用いて決定することができるマーカー／遺伝子配列（もしくはその部分）は、ボトリチス耐性遺伝子座の領域において遺伝的に結合および／または位置付けられ、ボトリチス耐性遺伝子座の（精細マッピング）および／もしくはクローニングならびに／またはＭＡＳ繁殖適用において適用可能である、ホモログ領域ならびにホモログおよび／またはオルソログ配列／（候補）遺伝子を同定するために、比較ゲノムまたは合成マッピング手法において用いられる場合もある。

−遺伝子手法により関心の領域でのマーカーの同定を可能にする適切な個体を選択するための開示の配列／マーカーの使用：本明細書に開示のプライマー配列および／またはマーカーは、例えば、遺伝子関連手法および／またはバルク分離個体分析（ＢＳＡ，Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８８，９８２８−９８３２，１９９１）を、関心の特定の領域におけるマーカー／遺伝子および／または説明された形質に関連もしくは遺伝的に結合するマーカー／遺伝子同定するために用いることができる、異なる／対照的な対立遺伝子を有する個体を選択するために用いられる場合もある。

−（位置的）候補遺伝子を検索するための開示の情報の使用：開示の情報は、説明された形質と関連および／または遺伝的に結合し得る位置的および／または機能的候補遺伝子を同定するために用いられる場合もある。

遺伝子型決定に関して、マッピングまたは関連マッピング、ＤＮＡは、例えば、葉組織等の好適な植物材料から抽出される。具体的には、複数の植物の葉の体積が収集される。ＤＮＡ試料は、全体のトマトゲノムを被覆する、複数の多型ＳＳＲ、ＳＮＰ、または任意の他の好適なマーカー型を用いて遺伝子型同定される。

遺伝子型および表現型データの共同分析を、当業者に既知の標準のソフトウェアを用いて実行することができる。植物導入および生殖質を、該ボトリチス耐性遺伝子座または任意の他のマーカーに結合するマーカー遺伝子座／遺伝子座におけるマーカーのヌクレオチド配列および対立遺伝子の分子重量に基づいて、本明細書に開示の技術または当業者に既知の技術のうちの１つ以上を用いて、本明細書に開示の対応するボトリチス耐性遺伝子座における対立遺伝子に関してスクリーニングすることができる。

マーカー、結合したマーカー、または本明細書に開示のボトリチス耐性遺伝子座の核酸配列を、当業者に既知の方法で決定することができる。例えば、該ボトリチス耐性遺伝子座またはその耐性付与部分を含む核酸配列を、該植物のゲノムを断片化し、該ボトリチス耐性遺伝子座を示す１つ以上のマーカーを持つそれらの断片を選択することにより、ボトリチス耐性ドナー植物から単離することができる。続いて、またはあるいは、該耐性遺伝子座を示すマーカー配列（もしくはその部分）を、該植物から得られるゲノム核酸試料またはゲノム断片を形成する該耐性遺伝子座を含む核酸配列を増幅するために、（ＰＣＲ）増幅プライマーとして用いることができる。ボトリチス耐性遺伝子座、および／またはその中に含まれる任意の追加のマーカーのヌクレオチド配列を、標準の配列方法により得ることができる。

したがって、本発明は、本発明のボトリチス耐性遺伝子座またはその耐性付与部分を含む単離された核酸（好ましくはＤＮＡであるが、ＤＮＡに限定されない）配列にも関する。したがって、開示のマーカーを、ボトリチス耐性に結合するか、あるいはボトリチス耐性をコードする、トマトもしくは他の野菜作物、具体的には、ナス科作物からの１つ以上のマーカーまたは遺伝子の同定および単離のために用いることができる。

本発明のボトリチス耐性遺伝子座に結合する追加のマーカーのヌクレオチド配列を、例えば、ボトリチス耐性遺伝子座と関連する１つ以上のマーカーのヌクレオチド配列を決定し、次いで、該マーカー配列の外側の配列をさらに決定するために用いることができる該マーカー配列においてプライマーを策定することにより決定することができる。例えば、本明細書に開示のＳＳＲマーカー、あるいはボトリチス耐性遺伝子座の領域内で予測される、および／または該領域に結合する任意の他のマーカーのヌクレオチド配列を、当分野で周知の方法で該マーカーのＰＣＲ増幅産物を配列決定することにより、あるいは、例としてであり限定的ではないが、ＢＡＣスクリーニングで結合したヌクレオチド配列を同定するために、ＰＣＲでマーカー配列を用いることにより、またはハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより得ることができる。

本発明は、以下の非限定的な図、表、および実施例を参照することによってさらに説明される。

図１は、Ｆ４ＲＩＬ集団（系統Ａと系統Ｂとの間の交配に由来する）のボトリチス属耐性においてＱＴＬを検出するために用いられた２つの形質の分布を示す。 図２は、ボトリチス属耐性におけるＱＴＬが、Ｆ４ＲＩＬ集団（系統Ａと系統Ｂとの間の交配に由来する）において検出された、連鎖群の遺伝子マップを示す。 表Ａは、灰色かび病菌への耐性のための系統Ａと系統Ｂとの間の交配に由来するＦ４組換え近交系集団において検出されたＱＴＬを示す。ＱＴＬ検出が実行された形質は、傷害の大きさ（ｌｓ）および傷害の大きさの対数（ｌｇ（ｌｓ））である。各ＱＴＬは、接頭辞ＢｃＴに続いて、染色体の数および特有の数詞で名付けられる。

先の記述は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかしながら、そのような実施例は、本発明を実践する例示的な方法であり、本発明の範囲を限定するよう意図されていない。

以下の実施例は、本明細書を説明する。

材料
１．ボトリチス属耐性原材料
ボトリチス属への耐性は、ソラヌム・ハブロカイテス受入ＰＩ２４７０８７において同定され、それから得られた。この受入に関して、以下の供給源履歴を提供することができる：
○ 受入は、１９５８年１月１日にエクアドルで収集された。
○ 地域：ＣａｔａｍａｙｏとＧｏｎｚａｎａｍａ，Ｈａｃｉｅｎｄａ Ｃｏｌｃａ，Ｌｏｊａとの間の土手
○ 収集者：Ｃｏｒｒｅｌｌ，Ｄ．，Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ＵＳＤＡ−ＡＲＳ．
○ 受入は、１９５８年４月９日に米国メリーランド州に寄贈された。
○ 寄贈者：Ｃｏｒｒｅｌｌ，Ｄ．，Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ＵＳＤＡ−ＡＲＳ．
Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ＰＩ Ｓｔａｔｉｏｎ． ＵＳＤＡ，ＡＲＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，６３０ Ｗ．Ｎｏｒｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにより保持された。

ＮＰＧＳは、１９５８年４月９日に受容した。ＰＩは、１９５８年に譲渡した。１９５８年に発表された。

２．真菌株
灰色かび病菌の攻撃的な分離株を、ＱＴＬ分析について、ならびに系統および雑種についても、集団の表現型を評価するために用いた。菌株を、２０℃での制御温度下で、固体ポテトデキストロース寒天培地２％（ＰＤＡ）を有するペトリ皿上に保持した。固体ＰＤＡ培地において、水１リットル当たり２ｇのＰＤＡを添加した。材料を、無菌になるまでオートクレーブし、冷却し、ペトリ皿上に注いだ。

毎月の二次培養を、菌糸体を含有する寒天の小片から作製し、新しい無菌のペトリ皿に入れた。

３．気候室評価-菌糸体での植菌
２０℃での制御温度下の活性培養物を、５日後に得た。菌糸体を含有する寒天の小片を、先端基部、概して、マイクロピペットで取り込んだ。先端は、「担持部分」として用いられる。菌糸体を含有する先端を、茎と接触している切断した葉の残存部分上に配置する。

４．ビニルハウス評価-真菌胞子溶液での植菌
新しいペトリ皿で、胞子は、４週間後に菌糸体から現れる。胞子を、外科用メスで真菌を除去することによりペトリ皿から収集し、水溶液中に入れる。胞子を含有する菌糸体を水溶液中でミキサーで混合し、Ｍａｌｌａｓｓｅｚ細胞で計数した。胞子水溶液を、１．１０⁶胞子／ｍＬに希釈した。

植菌を、１０％サッカロース（重量／容積）を有する胞子溶液を用いて行った。

実施例１：病理学的試験スクリーニング
１．１ ボトリチス菌株収集
コア収集は、２００４年および２００５年に単離された菌株の収集から構築された。単離株は、形態およびｒＤＮＡのＩＴＳ配列に基づいて特徴付けられた。

コア収集は、ＰＤＡ培地（Ｆａｂｉａｎ ｅｔ ａｌ，２００３）上のペトリ皿中の菌株形態に従って選択された。

１．２ ＢＣ２Ｆ４系統集団評価
種子を、播種に適合した堆肥を有するトレイの中に播種した。トレイを、１５時間／９時間（日中／夜間）の光周期を有する気候室中でインキュベートした。１０，０００ｌｕｘの光度を有する日中の温度は、２４℃±２℃であり、夜間の温度は、１８℃±２℃であった。

苗木を、播種の１０日後に、適合した堆肥を有するポットの中に植え替える。苗木を、同様の条件下で、第５または第６の真の葉が生育するまで、気候室内で生育した。植え替え後、植菌まで、苗木に栄養液で毎日水をやる（Ｐｌａｎｔｉｎ，Ｃｏｕｒｔｈｅｚｏｎ，ＦｒａｎｃｅからのＬｉｑｕｏｐｌａｎｔ Ｂｌｅｕ、以下のＮＰＫ組成物：２．５（全窒素）−５（Ｐ２Ｏ５）−２．５（Ｋ２Ｏ）−０．７５（ＭｇＯ）＋少数元素を有する。溶液を希釈し、２の導電性および６．５のｐＨを得る）。

植菌を、増殖の４週間後に行った。各植物の２枚の葉を剪定する。切断された葉の間に少なくとも１枚の残存した葉が存在する。５日齢の菌糸体を、接種材料として用いる。

菌糸体の一片を、茎と接触している切断した葉の残存部分上に配置する。菌糸体を、残存の植物部分とともに取り付けられた先端と保持した。

植物を、飽和湿度下で、５，０００ｌｕｘの光度を有する日中温度２２℃±２℃の気候室中でインキュベートし、夜間温度は１８℃±２℃であった。

第１の症状である、負傷した切断された植物部分上の壊死は、植菌後３日目に現れた。症状の評価を、ミリメートル単位の量的測定を用いて、茎の壊死の長さについて評価した。壊死の長さは、概して、植菌後７日目に評価される。罹病性基準に関して、壊死の長さは、概して、３０ｍｍ超である。

各系統に関して、壊死の平均の長さは、各実験から得られた各植物から記録した。
気候室を１２個の実験単位に分け、１０８０個の植物を含有することができた。
全体の集団をスクリーニングするために、６つの実験のいくつかを行った。初歩的な実験単位は、５つのＦ４植物の一群であった。５つの耐性および罹病性対照を、気候室の各実験単位で生育した。

１．３ 繁殖プログラムにおける系統および雑種の評価
ＱＴＬ研究に関して上述された手順に加えて、系統および雑種を、ビニルハウス下の市場産生設備に近い半人工条件で評価した。

種子を、播種に適合した堆肥を有するトレイの中に播種した。トレイを、１５時間／９時間（日中／夜間）の光周期を有する気候室内でインキュベートした。１０，０００ｌｕｘの光度を有する日中温度は２４℃±２℃であり、夜間温度は１８℃±２℃であった。

苗木を、播種の約１０日後に、適合した堆肥を有するポットの中に植え替える。４週間後、苗木を、ビニルハウス内の土壌に直接植え替えた。

植菌を、２ヶ月の増殖後に行った。各植物の２枚の葉を剪定する。１０％のサッカロース（重量／容積）を有する１ｘ１０⁶ 胞子／ｍＬの水溶液を用いた。接種材料を、剪定後すぐに創傷部分上に蔓延させる。２回目の植菌、続いて３回目の植菌を、同一のプロトコルで３週間毎に実行した。数週間後、罹病性基準（ソラヌム・リコペルシクム優良系統）について、植物の死をもたらした壊死を、罹病性基準（ソラヌム・リコペルシクム優良系統）で観察した。少なくとも５０％の罹病性植物が枯死した時点で、小区画毎の枯れた植物の数を数えることにより、各小区画からの各植物の最大壊死の長さを測定することにより、症状評価を行った。各系統または雑種に関して、壊死の平均の長さを記録した。

実施例２：ＱＴＬマッピング実験
２．１ ＱＴＬ決定
ボトリチス属への耐性は、ソラヌム・ハブロカイテス受入ＰＩ２４７０８７において同定された。この受入を、罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統にいったん戻し交配させ、次に、病理学的試験スクリーニングを介して各世代で最も耐性を示す植物を選択しながら、３世代の間に自家受粉した。同一のソラヌム・リコペルシクム優良系統を、罹病性対照として実施例３で用いた。

次に、最も耐性を示すＢＣ１Ｆ３植物（親Ａ）を、Ｗ５０１６（親Ｂ）に交配させた。この交配から、４９２Ｆ３系統の集団を、単粒法により作成した。Ｆ４種子を、各Ｆ３植物から得た。

遺伝子マップを、１６１個のＳＳＲマーカーを有する４９２Ｆ３植物に基づいて構築したマーカーを１９個の連鎖群内に取り付けた一方で、１０個のマーカーは結合しないままであった。１７個の連鎖群を、トマトゲノムの１０個の染色体に割り当てることができた一方で、２個が同定されないままであった。

灰色かび病菌への耐性レベルを特徴付けるために、各Ｆ３植物の自家受粉に起因するＦ４系統を用いた。耐性試験を気候室内で実行した。気候室を１２個の実験単位に分け、１０８０個の植物を含有することができた。植物を、播種の３０〜４０日後である５／６の葉の段階で植菌した。各植物を、２つの異なる節点で植菌した。耐性を、植菌の７日後に、ミリメートル単位での壊死性傷害の伸長として測定した。全体の集団をスクリーニングするために、合計で６つの実験のいくつかを行った。初歩的な実験単位は、対応するＦ３植物を表す５つのＦ４植物の一群であった。各Ｆ３植物を、５つのＦ４植物の少なくとも２つの試料を介して評価した。１つの耐性対照および１つの罹病性対照を、気候室の各実験単位で生育した。

壊死性傷害の長さを、各植物の２つの植菌点で、ミリメートル単位で測定した。次に、傷害の長さを、全てのＦ４植物および所与のＦ３植物の全ての反復にわたって平均化した。症状が罹病性対照上で完全に発現されなかった場合、所与の実験単位からもたらされるデータを考慮しなかった（２０ｍｍより短い平均傷害の長さ）。ＱＴＬ検出に用いられた形質は、傷害の長さ（ｌｓ）および傷害の長さの対数（ｌｇ（ｌｓ））であった。２つの形質の分布は、図１に示される。

ＱＴＬ検出を、ソフトウェアＱＴＬＣａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒ（ＣＪ Ｂａｓｔｅｎ，Ｐ Ｇａｆｆｎｅｙ，ＺＢ Ｚｅｎｇ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００６）を用いて実行した。検出に用いられた統計モデルは、複合区間マッピング（ＣＩＭ）モデルであった。ｐ＝５％での入出力の確率で前方および後方回帰を介した共同因子の選択を伴う選択を用いた。ＱＴＬが存在すると見なす閾値は、ＬＯＤ＝３であった。ＱＴＬ要約統計値、すなわち、ロッドスコア、遺伝的影響（ａ）、および説明された分散の割合（Ｒ２）は、表Ａに示される。遺伝的影響の兆候は、耐性対立遺伝子が親Ａから受け継がれる場合に否定的であり、それが親Ｂからもたらされる場合には、兆候は肯定的である。別の古典的なＱＴＬ検出方法である単純区間マッピング（ＳＩＭ）における結果も表Ａに示される。合計４個のＱＴＬを、３つの事例において検出し、好ましい対立遺伝子（すなわち、最小の壊死性傷害である最高レベルの耐性をもたらす対立遺伝子）は、親Ａから受け継がれたものであった一方で、好ましい対立遺伝子は、１つの事例において、親Ｂから受け継がれた。

親Ａからもたらされる耐性効果を有する３つのＱＴＬは、以下である：
−ＱＴＬ ＢＣＴ６．１。ロッドスコアピークは、形質および統計的方法により位置３４〜３８ｃＭ、すなわちマーカーＮＴ１２９３〜ＮＴ３７３６である。説明された分散の割合は、１１％〜１４％である。

−ＱＴＬ ＢＣＴ１．２。ロッドスコアピークは、形質および統計的方法により位置４２〜５２ｃＭ、すなわちマーカーＮＴ１５９７〜ＮＴ４６３６である。説明された分散の割合は、１０％〜１４％である。

−ＱＴＬ ＢＣＴ９．１。ロッドスコアピークは、マーカーＮＴ５７３４上の位置０ｃＭである。説明された分散の割合は、７％である。２−ＬＯＤ信頼区間は、マーカーＮＴ５７３４〜ＮＴ５９２１を含む。

連鎖群６、１ａ、１ｂ、および９ｂの遺伝子マップが、図２に示される。これらの隣接マーカーを遺伝子型同定することを可能にする情報は、表３に示される。

表１：隣接マーカーにおける増幅産物の大きさの概要

実施例３：系統および雑種の評価の結果
表２：罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統および系統０４ＴＥＰ９９０３１２における実施例１に記載の病理学的試験の結果

罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統において、全ての菌株は有毒であり、異なるレベルの攻撃性を示す。
耐性ドナー系統０４ＴＥＰ９９０３１２において、全ての菌株は茎の傷害を作成できず、それらをこの耐性遺伝子型において有毒であると見なすことができた。

実施例４：ＱＴＬを持つ系統の表現型データ
４．１ 第１の実験：
先の各サイクル中にそれらの表現型に従って先に選択された２９個の進化した系統ＢＣ４Ｆ３は、遺伝子型同定されており、ＱＴＬ ＢＣＴ６．１に対するソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対して固定化されることが見出された。これらの系統をともに評価し、戻し交配プログラムにおける反復として用いられる罹病性参照であるソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統（ＴＳ）と比較した。３つのＱＴＬ（ＢＣＴ１．２、ＢＣＴ６．１、およびＢＣＴ９．１）で耐性対立遺伝子を持つ耐性参照（ＴＲ）であるＢＣ２Ｆ５系統も実験に含めた。

各系統を、２４個の植物において、実施例１で説明される手順に従って評価した。
壊死の長さ（ｍｍ）のログ１０変換値の統計的有意性を、分散（ＡＮＯＶＡ）の分析により評価した。ダンカンの多重範囲検定を用いて、ＱＴＬ ＢＣＴ６．１に対してソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有する系統と、この遺伝子移入を有さない系統との間の５％の有意水準での有意差を検出した。

４．１．１ ボトリチス菌株ＢｃＴ１

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性参照系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ６．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

この実験において、ＱＴＬ ＢＣＴ６．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性であるＢＣ４Ｆ３系統は、罹病性ソラヌム・リコペルシクム優良系統とは著しく異なる。これらの系統は、壊死の長さの著しい減少を示した。

４．２ 第２の実験：
以下の２つの実験は、使用される参照の灰色かび病菌株によって異なる。第１の実験では、系統はＢｃＴ１菌株でチャレンジされ、第２の実験では、系統はＢｃＴ１９菌株でチャレンジされた。菌株は、それらの攻撃性のレベルで異なる。

同一のＦ２集団からもたらされ、ＱＴＬ ＢＣＴ６．１に対するソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性であるか、あるいはソラヌム・リコペルシクムに対してホモ接合性である７６個のＢＣ４Ｆ３系統を、選択および比較した。

各系統を、実施例１で説明された手順に従って、２つの独立した実験で１２個の植物において評価した。

壊死の長さ（ｍｍ）のログ１０変換値の統計的有意性を、分散（ＡＮＯＶＡ）の分析により評価した。ダンカンの多重範囲検定を用いて、ＱＴＬ ＢＣＴ６．１に対してソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有する系統と、この遺伝子移入を有さない系統との間の５％の有意水準での有意差を検出した。

４．２．１ ボトリチス菌株ＢｃＴ１：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性参照系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ６．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ６．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

４．２．２ ボトリチス菌株ＢｃＴ１９：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性参照系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ６．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ６．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

２つの独立した実験において、ＱＴＬ ＢＣＴ６．１に対してソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有するホモ接合性系統と、有さないホモ接合性系統との間に有意差が存在する。ソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有する系統は、壊死の長さの著しい減少を示した。

４．３ 第３実験：
以下の３つの実験は、灰色かび病菌の使用した参照菌株によって異なる。第１および第２の実験では、系統はＢｃＴ１菌株でチャレンジされ、第３の実験では、系統はＢｃＴ１９菌株でチャレンジされた。菌株は、それらの攻撃性のレベルで異なる。

同一のＦ２集団からもたらされた２１個のＢＣ３Ｆ３系統を、ＱＴＬ ＢＣＴ１．２またはＢＣＴ９．１に従って選択した。ホモ接合段階でＱＴＬ ＢＣＴ１．２またはＱＴＬ ＢＣＴ９．１を持つこれらの系統を、実施例１に説明された手順で、３つの独立した実験において比較した。

各系統を、１０個の植物の４個の複製物を有する４０個の植物において試験した。壊死の長さ（ｍｍ）のログ１０変換値の統計的有意性を、分散（ＡＮＯＶＡ）の分析により評価した。ダンカンの多重範囲検定を用いて、１つのＱＴＬを有する系統と、対応するＱＴＬを有さない系統との間の５％の有意水準での有意差を検出した。

４．３．１ ボトリチス菌株ＢｃＴ１：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

４．３．２ ボトリチス菌株ＢｃＴ１：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

４．３．３ ボトリチス菌株ＢｃＴ１：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

４．３．４ ボトリチス菌株ＢｃＴ１：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

４．３．５ ボトリチス菌株ＢｃＴ１９：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

４．３．６ ボトリチス菌株 ＢｃＴ１９：

ＴＳ＝ソラヌム・リコペルシクム罹病性優良系統
ＴＲ＝ソラヌム・リコペルシクム耐性系統
Ａ＝ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有さないＢＣ４Ｆ３系統
Ｐ＝ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上のソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入に対してホモ接合性のＢＣ４Ｆ３系統

３つの独立した実験では、ＱＴＬ ＢＣＴ１．２上にソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有する系統と、有さない系統との間に有意差が存在する。ＱＴＬ ＢｃＴ１上にソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を持つ系統は、この遺伝子移入を有さない系統と比較して、壊死の長さの著しい減少を示した。

系統がＢｃＴ１菌株でチャレンジされた２つの独立した実験では、ＱＴＬ ＢＣＴ９．１上でソラヌム・ハブロカイテス（０４ＴＥＰ９９０３１２）遺伝子移入を有する系統は、この遺伝子移入を有さない系統と比較して、壊死の長さの著しい減少を示した。系統がＢｃＴ１９菌株でチャレンジされた第３の実験において、実験は、ＱＴＬ ＢＣＴ９．１に対するこれらの系統の間の有意差を示さなかった。

寄託：
ソラヌム・ハブロカイテス０４ＴＥＰ９９０３１２の以下の種子試料が、２００９年５月２１日、Ｓｙｎｇｅｎｔａ Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎｓ ＡＧの名のもとに、ブダペスト条約の規定の下で、ＮＣＩＭＢ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ２１ ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫに寄託された。

Claims (15)

1. 灰色かび病菌への耐性を示す栽培トマト植物であって、前記植物は、前記トマト植物における前記灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御する、少なくとも１つの遺伝的決定因子を含み、前記１つまたは複数の遺伝的決定因子は、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される、少なくとも１つの連鎖群にマッピングする、トマト植物。
2. 前記遺伝的決定因子は、少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合される、灰色かび病菌への前記耐性の発現を誘導または制御することができる、少なくとも１つのＱＴＬまたはその機能部分で表され、それは、前記ボトリチス耐性形質と共分離し、かつＰＣＲ反応において、
   ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
   ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
   ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
   ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
   ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
   ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
   前記ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、したがって共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより同定することができる、請求項１に記載のトマト植物。
3. 灰色かび病菌への耐性に寄与する前記トマトゲノム中の量的形質遺伝子座に少なくとも１つの対立遺伝子を含み、それは、少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合され、それは、前記灰色かび病菌耐性形質と共分離し、かつＰＣＲ反応において、
   ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
   ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
   ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
   ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
   ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
   ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
   前記ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、したがって共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより同定することができる、請求項２に記載のトマト植物。
4. 前記少なくとも１つのＱＴＬは、系統ＮＣＩＭＢ４１６２３の遺伝的背景を有するドナー植物から入手可能であり、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で、またはその子孫もしくは祖先において寄託され、前記少なくとも１つのＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分を含む、請求項２〜３のうちのいずれか１項に記載のトマト植物。
5. ｉ．ソラヌム・リコペルシクム属のトマト植物、および／あるいは
   ｉｉ．半数体、二ゲノム性半数体、近交、または雑種である、前記請求項のいずれかに記載のトマト植物。
6. 灰色かび病菌耐性トマト植物を生育することができる、前記請求項のいずれかに記載のトマト植物の種子。
7. トマト植物中の灰色かび病菌耐性遺伝子座に結合し、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から成る群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
   ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーで表されるプライマー対１、
   ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーで表されるプライマー対２、
   ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーで表されるプライマー対３、
   ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーで表されるプライマー対４、
   ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーで表されるプライマー対５、ならびに
   ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーで表されるプライマー対６ から選択される一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
   前記ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、したがって共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーを表す別のプライマーにより増幅することができる、ＤＮＡマーカー。
8. ｉ．トマト植物中の前記灰色かび病菌耐性遺伝子座の診断的選択、具体的には、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における前記灰色かび病菌耐性遺伝子座の診断的選択のため、あるいは
   ｉｉ．トマト植物中の前記灰色かび病菌耐性遺伝子座の存在を同定するため、および／またはトマト植物、具体的には、ソラヌム・リコペルシクム植物中の前記灰色かび病菌耐性遺伝子座の遺伝子移入を監視するための、請求項８に記載のＤＮＡマーカーのいくつかもしくは全ての使用。
9. ＰＣＲ反応において入手可能である増幅産物の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２から成る群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、または
   ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーで表されるプライマー対１、
   ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーで表されるプライマー対２、
   ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーで表されるプライマー対３、
   ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーで表されるプライマー対４、
   ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーで表されるプライマー対５、ならびに
   ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーで表されるプライマー対６から選択される一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、あるいは
   前記ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、したがって共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における隣接マーカーを表す別のプライマーを含み、同一のプライマーもしくはプライマー対とのＰＣＲ反応において、前記それぞれのマーカー遺伝子座は、前記トマト植物中になお存在し、および／またはその対立遺伝子と見なすことができるという条件で、その増幅産物は、ソラヌム・ハブロカイテス０４ＴＥＰ９９０３１２から入手可能である増幅産物に相当し、その種子は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１６２３で寄託されている、ポリヌクレオチド。
10. 灰色かび病菌への耐性と関連する少なくとも１つの対立遺伝子を、灰色かび病菌への耐性に寄与する量的形質遺伝子座で、前記対立遺伝子を欠如するトマト植物の中に遺伝子移入するための方法であって、ａ）前記請求項のいずれか１項に記載の第１のトマト植物を得ることと、ｂ）前記第１のトマト植物を、第２のトマト植物と交配させることであって、前記第２のトマト植物は、前記対立遺伝子を欠如し、ｃ）増加した灰色かび病菌への耐性を示し、前記灰色かび病菌耐性と共分離する少なくとも１つのマーカー対立遺伝子を含む、前記交配に起因する植物を同定することと、ｄ）任意で、前記植物を単離することと、ｅ）任意で、前記植物を、前記第１または第２のトマト植物と戻し交配させることとを含む、方法。
11. 灰色かび病菌への耐性を示すトマト植物を産生するための方法であって、
    ａ．灰色かび病菌耐性を示すソラヌム属の植物を選択するステップであって、前記耐性は、前記灰色かび病菌への耐性の発現を誘導または制御することができる、少なくとも１つのＱＴＬまたはその機能部分と関連しており、前記ＱＴＬまたはその機能部分は、前記ボトリチス耐性形質と共分離し、かつＰＣＲ反応において、
    ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマー、または
    ｉｉ．配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマー、または
    ｉｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマー、または
    ｉｖ．配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマー、または
    ｖ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマー、または
    ｖｉ．配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む、少なくとも一対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーによるか、あるいは
    前記ボトリチス耐性形質と統計的に相関し、したがって共分離する、連鎖群６、連鎖群１ｂ、および連鎖群９ｂから選択される少なくとも１つの連鎖群における任意の隣接マーカーにより同定することができる、少なくとも１つのマーカー遺伝子座に遺伝的に結合される、ステップと、
    ｂ．灰色かび病菌耐性を示すステップａ）の前記植物を、灰色かび病菌に感染しやすいか、あるいは灰色かび病菌に対して中間レベルの耐性を示すトマト植物と交配させるステップと、
    ｃ．請求項８に記載のマーカーのうちの少なくとも１つを用いて、ボトリチス耐性を示し、ステップａ）の前記少なくとも１つのマーカー遺伝子座との関連性を実証する前記交配由来の子孫を選択するステップと、を含む方法。
12. 灰色かび病菌に耐性を示すトマト果実を得るための方法であって、
    ｉ．請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物または請求項１１に記載の方法において得られた植物の種子を播種するステップと、
    ｉｉ．果実を産生するために、前記植物を生育するステップおよび前記植物によって産生された前記果実を収穫するステップと、を含む、方法。
13. ｉ．配列番号１の順方向プライマーおよび配列番号２の逆方向プライマーを含む、第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーで表される少なくとも第１のＤＮＡマーカー、ならびに／または配列番号３の順方向プライマーおよび配列番号４の逆方向プライマーを含む、第２の対のＰＣＲプライマーで表される少なくとも第２のＤＮＡマーカーと関連する、植物受入ＮＣＩＭＢ４１６２３の連鎖群６、
    ｉｉ．配列番号５の順方向プライマーおよび配列番号６の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに配列番号７の順方向プライマーおよび配列番号８の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される少なくとも第１のＤＮＡマーカーと関連する、植物受入ＮＣＩＭＢ４１６２３の連鎖群１ｂ、あるいは
    ｉｉｉ．配列番号９の順方向プライマーおよび配列番号１０の逆方向プライマーを含む第１の対のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーで表される少なくとも第１のＤＮＡマーカー、ならびに／または配列番号１１の順方向プライマーおよび配列番号１２の逆方向プライマーを含む第２の対のＰＣＲプライマーで表される隣接マーカーと関連する、植物受入ＮＣＩＭＢ４１６２３の連鎖群９ｂにマッピングする、灰色かび病菌耐性付与ＱＴＬまたはその灰色かび病菌耐性付与部分。
14. 灰色かび病菌による感染に対してトマト植物の作物を保護する方法であって、前記方法は、請求項６に記載の種子を植えることと、灰色かび病菌に対して耐性を示すトマト植物を生育することと、を特徴とする、方法。
15. ボトリチス属に耐性を示すトマトの雑種種子を産生する方法であって、
    ｉ．雄性不稔性雌性植物または系統、および雄性稔性植物または系統を植えるステップであって、前記雄性もしくは雌性植物または系統のうちの少なくとも１つは、請求項１〜５のいずれかに記載の植物である、ステップと、
    ｉｉ．両系統間で他家受粉を生じさせるステップと、
    ｉｉｉ．着果まで前記子孫植物を生育するステップと、
    ｉｖ．前記果実を収集するステップと、
    ｖ．前記雑種種子を得るステップと、を含む、方法。

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