KR20230019492A - 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 멜론 식물 - Google Patents

스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 멜론 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바람직한 농경학적 형질과 조합된 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 대한 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 식물을 검출 및/또는 선별하는 방법을 제공한다.

Description

스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 멜론 식물
본 발명은 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 대한 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 식물을 검출 및/또는 선별하는 방법을 제공한다.
클라도스포리움 (Cladosporium), 포도스파에라 크산티이 (Podosphaera xanthii) 또는 진딧물 (Aphids)과 같은 많은 병원균은 멜론 (Cucumis melo)의 배양물 (culture)에 집락을 이룰 수 있다.
클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum) Ellis 및 Arthur는 세계 여러 지역에서 여러 박과식물 (Cucurbit)의 잎 및 열매, 예를 들어, 오이 (Cucumber) 및 멜론 (Melon)을 공격하는 스캡병을 유발하는 곰팡이 (Fungus)이다.
지난 50년 동안 오이에서는 매우 높은 수준의 단일 유전자 저항성 (Monogenic Resistance)이 체계적으로 도입되었지만 멜론에서의 단일 유전자 저항성은 개시되지 않았다. 이 질병은 주로 시원하고 습한 조건에서 발생하며, 예를 들어, 생산자가 정기적으로 살균제 (Fungicide)를 사용하는 프랑스 남서부 지역에 널리 퍼져있다.
흰가루병 (Powdery mildew, PM)은 두 가지 주요 원인에 의해 발생하는 잎 (Foliar) 병이다: 골로비노마이세스 시코라세아룸 (Golovinomyces cichoracearum) 및 포도스파에라 크산티이 (Podosphaera xanthii). 포도스파에라 크산티이는 대부분의 국가에서 우세한 반면 골로비노마이세스 시코라세아룸은 온대 지역에서 질병을 일으킬 수 있다. 프랑스에서는 두 병원체의 존재에도 불구하고 포도스파에라 크산티이가 가장 흔하게 발견되는 종이다. 멜론에는 포도스파에라 크산티이 (예를 들어, Px-1, Px-2, Px-3, Px-5, Px-3-5 종)의 5종과 골로비노마이세스 시코라세아룸의 2종이 기술되어 있다.
멜론 진딧물 (Melon aphid), 예를 들어, 아피스 고시피 글로버 (Aphis gossypii Glover)는 조롱박과 같은 경제적으로 중요한 광범위한 기주 식물 (Host plant)을 잠식하는 (Colonize) 해충 (Pest)으로 주요한 해충이다. A. gossypii에 의한 박과식물의 집락화 (Colonization)는 식물의 죽음을 초래할 수 있는 발육방해 (Stunting) 및 심각한 잎 말림 (Leaf curling)을 유발한다. A. gossypii는 또한 효율적인 바이러스 벡터이므로 바이러스 질병의 확산에 기여한다. 저항성 멜론 자원 (Accession)은 1970년대부터 기술되었으며, 저항성을 담당하는 주요 유전자, 즉 Vat 유전자 (Dogimont et al., Cucurbitaceae 2008, 박과식물의 유전 및 육종에 관한 제9차 EUCARPIA 회의 간행물; Dogimont et al., 2014, The Plant Journal, 80, 993-1004)가 확인되었고, 상업적 멜론 계통으로 유전자이입 (Introgression)이 되었다. 그러나, Vat 유전자가 괴사 반응 (Flaccida necrosis) (Pitrat and Lecoq, 1982, Agronomie, 2:503-508)과 연관되어 있음이 밝혀졌다.
현재까지, Podosphaera xanthii 및 진딧물 Aphis gossypii의 여러 종에 대한 저항성은 프랑스에서 재배되는 Charentais 품종에 존재한다. Podosphaera xanthii의 1, 2, 3 및 5종에 대한 저항성을 부여하는 두 개의 독립적인 유전자좌, PmV.1 및 PmXII.1는 Perchepied et al., 2005, 미국 식물병리학회(American Phytopathological Society), Vol.95(5):556-565. 또한, Fukino et al., 2008, Theor에 의해, 저항성 멜론 자원 PI 1241112와 감수성 (Susceptible) 멜론 "Vedrantais" 사이의 교배에서 파생된 RIL 개체군을 사용하여 식별되었다. 또한, Fukino et al., 2008, Theor. Appl. Genet., 118(1):165-75에서, Podosphaera xanthii A 및 B 종에 PM 저항성을 부여하는 두 개의 QTL은 저항성 AR5 멜론 (Cantaloupe) 육종 계통과 감수성 일본 품종 "Earl's Favorite (Harukei3)"사이의 교배에서 파생된 RIL을 사용하여 연결그룹 (Linkage Group, LG)Ⅱ 및 LGXⅡ (LG12)에서 검출되었다. 이 연구에서 LGⅡ의 QTL은 CMBR8 및 CMBR120 마커와 밀접하게 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다.
Fazza et al., 2013, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 13:349-355에서, 또한 LGⅡ (LG2)의 2개의 연결된 유전자 좌에 대한 멜론 자원 PI414723의 Podosphaera xanthii의 1, 3 및 5종에 대한 저항성을 부여하는 QTL 맵핑 (Mapping)이 공개되었다. 하지만, PI 414723 자원은, 성숙기에 창백하고 가루가 많고 부드러운 과육, 큰 구멍, 성숙시에 높은 황변/주황색 껍질 및 잔은 당도 (6°Brix)와 같은 바람직하지 않은 농경학적 특성(Agronomic Trait)을 가지는 인디안 자원(Indian accession)이다 (Burger et al., 2010, Horticultural Reviews, 36, 165-198). Fazza et al.은 또한 LGⅡ가 주키니 황색 모자이크 바이러스 (Zucchini Yellow Mosaic Virus, ZYMV)에 대한 저항성을 부여하는 Zym 유전자와 같은 다른 질병 저항성 유전자를 함유하고 있다는 것을 밝히고 있다. 하지만, Zym/Zym 동형접합 식물에서 잎/줄기/열매 괴사성 줄무늬 (Streak) 표현형이 관찰되었다 (Pitrat and Lecoq, 1984, Euphytica, 33(1):57-61, US20140059712). 따라서 Zym 유전자의 존재와 관련된 해로운 괴사 효과 없이 PM에 저항성을 갖는 식물을 얻을 필요가 있다.
또한, Fukino et al.에 확인된 CMBR8 마커는 Fazza et al.에서 매핑되지 않고 CMBR120 마커는 LGⅡ에서 확인된 QTL과 상당히 떨어져 있어서, Fukino et al.의 QTL과 Fazza et al.의 QTL은 LGⅡ의 다른 부분에 있다는 것을 보여준다. 어쨌든 오늘날 멜론 게놈에서 유전적으로 매핑된 마커의 밀도가 낮기 때문에 그러한 저항성 QTL의 정확한 위치를 알기가 어렵다. 따라서 Podosphaera xanthii의 다른 종에 대한 저항성은 잠재적으로 결합 가능한지 여부를 정의한 다음 하나의 멜론 식물에서 결합할 수 있는 여부를 정의하기 위해 정확한 위치가 필요하다.
바닥(Floor)의 소독에 사용되는 식물 보호 제품의 감소와 함께, 농경지(Ground)와 관련된 모든 질병의 발병률이 증가할 것으로 예상된다. Cladosporium, Podosphaera xanthii 및 진딧물에 대한 저항성 품종 등 다제내성 품종의 개발은 또한 따라서 병원체의 영향을 제어하기 위해 보다 수용 가능하고 경제적인 수단이 필요하였다.
특허문헌 1. US20140059712
문헌 1. Burger et al., 2010, Horticultural Reviews, 36, 165-198 문헌 2. Diaz et al., 2011, "A consensus linkage map for molecular markers and Quantitative Trait Loci associated with economically important traits in melon (Cucumis melo L.)". BMC Plant Biology 2011 11:111. 문헌 3. Dogimont et al., Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae; 문헌 4. Dogimont et al., 2014, The Plant Journal, 80, 993-1004 문헌 5. Fazza et al., 2013, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 13:349-355 문헌 6. Fukino et al., 2008, Theor. Appl. Genet., 118(1):165-75 문헌 7. Garcia-Mas et al, 2012, PNAS 109(29):11872-11877. 문헌 8. Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) 문헌 9. Perchepied et al., 2005, The American Phytopathological Society, Vol.95(5):556-565 문헌 10. Pitrat and Lecoq, 1982, Agronomie, 2:503-508 문헌 11. Pitrat and Lecoq, 1984, Euphytica, 33(1):57-61
본 발명자들은 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성을 부여하고, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형 없이 바람직한 농경학적 특성과 결합된 멜론 (Cucumis melo, C.melo) 식물의 정량적 형질 유전자좌에서 유전자이입을 할 수 있었다. 따라서, 제1 양태에 있어서, 본 발명은 스캡병, 진딧물, 흰가루병 (PM)에 저항성이 있는 멜론 식물을 제공하며:
상기 식물은:
(i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci),
(ii) LG2 (LGⅡ) 및/또는 LG5 (LGV)에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
(iii) LG5 (LGV)에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함하고, 및
- 상기 식물은 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고 있다.
바람직하게는, 상기 식물은 Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없다.
일 양태에 있어서, 상기 QTL은 LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 (또한 MU45136_209, 서열번호 1로 명명) 및 마커 Cm_MU45398_32 (또한 MU45398_32, 서열번호 9로 명명)로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL이다.
일 양태에 있어서, 상기 QTL은 LG5에 있고, 마커 LG5-M1 (서열번호 13) 및 마커 Cm_MU44050_58 (또한 MU44050_58, 서열번호 20으로 명명)로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL이다.
일 양태에 있어서, 상기 QTL은 LG2에 있고, 마커 CMBR120 (서열번호 24 및 25를 갖는 프라이머를 사용하여 식별할 수 있음) 및 마커 Cm_MU47536_461 (또한 MU47536_461, 서열번호 30으로 명명)로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL이다.
일 양태에 있어서, 상기 QTL은 LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 (또한 MU45437_855, 서열번호 34로 명명) 및 마커 LG5-M3 (서열번호 42)으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치하는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL이다.
일 양태에 있어서, 스캡병, 진딧물 및 PM에 저항성이 있는 멜론 식물은 계통 MTYVVC721이며, 이에 대한 대표적인 종자 샘플이 수탁번호 NCIMB43317로 NCIMB에 기탁되었다.
또한 본 발명에 있어서 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물의 세포가 제공된다.
더 나아가 본 발명에 다른 멜론 식물로부터 얻은 식물 부분이 제공된다. 일 양태에 있어서, 상기 식물 부분은 종자 (Seed), 과일 (Fruit), 생식 물질 (Reproductive material), 뿌리 (Root), 꽃 (Flower), 대목 (Rootstock) 또는 접순 (Scion)이다.
본 발명에 있어서 또한 본 발명에 따른 식물로 성장할 때 발생하는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물의 종자 (Seed)를 제공한다.
또한 본 발명에 있어서 저항성 식물을 교배하여 얻을 수 있는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성이 있는 멜론의 잡종 식물을 제공한다.
스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물을 검출 및/또는 선별하는 방법으로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 다음의 존재 (Presence) 또는 부재 (Absence)를 감지하는 단계
(i) 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 QTL, 상기 적어도 하나의 QTL은 연결그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고,
(ii) PM에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 QTL, 상기 적어도 하나의 QTL은 LG2 및/또는 LG5상에 존재하고, (i)에서의 상기 적어도 하나의 QTL과 상이, 및
(iii) LG5에서 진딧물에 대한 저항성을 부여하는 Vat 유전자 유사체,
b) 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 상기 적어도 하나의 QTL, PM에 대한 저항성을 부여하는 상기 적어도 하나의 QTL, 진딧물에 대한 저항성을 부여하는 상기 Vat 유전자 유사체의 존재가 검출된 멜론 식물을, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성인 식물로 선택하는 단계.
더 나아가서, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성인 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물을 검출하기 위한 하나 이상의 마커의 용도를 제공하고, 상기 하나 이상의 마커는 다음 염색체 영역 중 적어도 하나에 위치한다:
- 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32에 의해 LG2에서 구분되는 염색체 영역 (Chromosomal region),
- 마커 LG5-M1 및 Cm_MU44050_58에 의해 LG5에서 구분되는 염색체 영역,
- 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461에 의해 LG2에서 구분되는 염색체 영역,
- 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3에 의해 LG5에서 구분되는 염색체 영역, 또는
- Vat 유전자 유사체.
본 발명은 또한 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성인 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물을 얻기 위한 육종 프로그램에서 육종 파트너로서 본 발명에 따른 멜론 저항성 식물의 용도를 제공하고, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는다.
또한 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 종자를 생산하는 방법이 제공된다. 일 양태에 있어서, 방법은 본 발명에 따른 멜론 식물을 그 자체 또는 또 다른 멜론 식물과 교배시키고, 생성된 종자를 수확하는 것을 포함한다.
더 나아가서, 다음을 포함하는 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성인 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물을 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 감염된 환경에서 성장시키는 것을 포함하는, 상기 환경에서 멜론 식물의 수확량을 개선하는 방법을 제공한다:
- 상기 식물은:
(i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci),
(ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
(iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함하고, 및
- 상기 식물은 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고 있다.
바람직하게는, 이러한 식물은 Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없다.
또한, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성인 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물을 재배하는 것을 포함하는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 감염 및/또는 확산으로부터 밭 (Field)을 보호하는 방법을 제공한다:
- 상기 식물은:
(i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci),
(ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
(iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함하고, 및
- 상기 식물은 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고 있다.
바람직하게는 Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없는 것이다.
스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성인 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물의, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 의한 밭의 감염을 제어하기 위한 용도가 제공된다:
- 상기 식물은:
(i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci),
(ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
(iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함하고, 및
- 상기 식물은 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고 있고,
바람직하게는 Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없다.
다음 단계를 포함하는 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성인 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물의 생산 방법이 제공된다:
i. 본 발명에 따른 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성이 있는 멜론 미세-묘목 (Micro-plantlet)을 생산하기 위해 멜론 식물의 분리된 세포 또는 조직을 체외에서 배양하는 단계, 및
ii. 선택적으로 멜론 미세-묘목을 생체내 배양 단계에 추가 적용하여 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성인 메론 (C.melo) 식물로 성장시키는 단계.
더 나아가서, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 감염된 환경에서 수확 가능한 멜론 (Cucumis melo) 식물의 수확량을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성이고 선택적으로 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않는 멜론 식물을 성장시키는 단계를 포함하고, 상기 식물은 (i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci), (ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및 (iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함한다.
또한 다음을 포함하는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 감염된 환경에서 멜론 식물의 수확량을 개선하는 방법을 제공한다:
a. 멜론 식물의 게놈에 (i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 클라도스포리움 (Cladosporium)에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 QTL, (ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및 (iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Analog)를 포함하는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 멜론 식물을 확인하는 단계, 및
b. 감염된 환경에서 상기 저항성 멜론 식물을 성장 시키는 단계.
정의
본 발명에 있어서, 용어 "식물 부분 (Plant part)"은 식물의 싹, 뿌리, 줄기, 종자, 열매, 잎, 꽃잎 (Petals), 꽃, 밑주름 (Ovules), 가지, 잎자루 (Petioles), 절간 (Internodes), 꽃가루 (Pollen), 수술 (Stamen), 뿌리줄기 (Rootstock), 접순 (Scion)을 포함하는 식물의 임의의 부분을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 용어 "양적형질유전자좌 (Quantitative Trait Loci, QTL)"는 하나 이상의 유전자 또는 조절 서열을 포함할 수 있는 게놈 영역 (Genomic region)을 의미한다. QTL은 예를 들어 유전적 저항성 또는 내성을 부여하는 제품의 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로, QTL은 예를 들어 조절 유전자 또는 그 생성물이 식물 게놈의 다른 유전자좌에서 유전자 발현에 영향을 미침으로써 저항성 또는 내성을 부여하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 QTL은 하나 이상의 분자 게놈 마커 (Genomic marker)를 사용하여 각각의 병원체 저항성 자원(Accesion)의 게놈에서 그들의 유전적 위치를 표시함으로써 정의될 수 있다. 하나 이상의 마커는 차례로 특정 위치를 나타낸다. 유전자좌 사이의 거리는 일반적으로 동일한 염색체의 유전자좌 사이의 빈도 또는 교차로 측정된다. 둘이 멀리 떨어져 있을수록 둘 사이에 교차가 발생할 가능성이 높아진다. 반대로, 두 개의 유전자좌가 서로 가까이 있으면 교차가 발생할 가능성이 적다. 일반적으로, 1센티모건 (cM)은 유전자좌 (마커)간의 1 % 재조합과 같다. QTL이 여러 마커로 표시될 수 있는 경우 종점 마커 사이의 유전적 거리가 QTL의 크기를 나타낸다.
용어 "저항성 (Resistance)"은 ISF (International Seed Federation) 야채 및 관상용 작물 섹션에서 정의한 대로 야채 종자 산업에 대한 해충 또는 병원균에 대한 식물의 반응 및 비생물적 스트레스를 설명한다.
구체적으로, 저항성은 특정 해충 또는 병원체의 성장 및 발달 및/또는 유사한 환경 조건 및 해충 또는 병원체 압력하에서 감수성 있는 식물 품종과 비교했을 때 유발하는 피해를 제한하는 식물 품종의 능력을 의미한다.
"내성 (Tolerance)"은 성장, 외관 및 수확량에 대한 심각한 결과 없이 생물학적 및 비생물적 스트레스를 견디는 식물 품종의 능력을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "감수성 (Susceptible)"은 특정 해충 또는 병원체의 성장 및 발달을 제한할 수 없는 식물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "자손 (Offspring)" 또는 "자식 (Progeny)"은 하나 이상의 부모 식물 또는 이의 후손으로부터 영양 생식 또는 유성 생식으로부터 자손으로 생성되는 임의의 식물을 지칭한다. 예를 들어, 자손 식물은 부모 식물의 복제 또는 자가 증식에 의해 또는 2개의 부모 식물을 교배함으로써 얻어질 수 있고 자가 증식 뿐만 아니라 F1 또는 F2 또는 추가 세대를 포함할 수 있다. F1은 부모로부터 생산된 1세대 자손으로서 적어도 한 부모가 형질의 공여자로서 처음 사용되는 경우이며, 반면에 2세대 (F2) 또는 후속 세대 (F3, F4 등)의 자손은 F1, F2 등의 자가 번식으로 생성된 표본이다. 따라서 F1은 (그리고 일반적으로) 두 개의 진정한 육종 부모 사이의 교배로 인한 잡종일 수 있으며 (진정 육종은 형질에 대해 동형 접합체이다), 반면에 F2는 상기 F1 잡종의 자가수분으로 인한 후손일 수 있다(일반적으로 후선이다).
본 발명에 있어서, 용어 "교차 (Cross)", "교차점 (Crossing)"은 한 식물에 있는 한 꽃의 꽃가루가 (인위적으로 또는 자연적으로) 다른 식물에 있는 꽃의 밑주 (암술머리 (Stigma))에 적용되는 과정을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 용어 "이형접합체 (Heterozygote)는 적어도 하나의 유전자좌에 존재하는 상이한 대립유전자(주어진 유전자 또는 서열의 형태)를 갖는 이배체 또는 배수체 세포 또는 식물을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "이형접합 (Heterozygous)"은 특정 유전자좌에서 상이한 대립유전자 (주어진 유전자 또는 서열의 형태)의 존재를 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "동형접합체 (Homozygote)"는 모든 상동 염색체 상의 하나 이상의 유전자좌에서 동일한 대립 유전자를 갖는 개별 세포 또는 식물을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "동형접합체 (Homozygous)"는 상동 염색체 절편의 하나 이상의 유전자좌에서 동일한 대립유전자의 존재를 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "잡종 (Hybrid)"는 하나 이상의 유전자가 다른 부모 간의 교배로 인해 발생하는 개별 세포, 조직 또는 식물을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "근친 교배 (Inbred)" 또는 "계통 (Line)"이라는 용어는 상대적으로 순종 (True-breeding strain)을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "표현형 (Phenotype)"는 개별 세포 (Individual cell), 세포 배양물 (Cell culture), 유기체 (예를 들어, 식물) 또는 개별 유전적 구성 (즉, 유전자형 (Genotype))과 환경 사이의 상호 작용으로 인해 발생하는 유기체 그룹의 관찰 가능한 특성을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "유전자이입 (Introgression)", "유전자이입된 (Introgressed)", "유전자이입하는 (Introgressing)"은 한종, 변종 또는 품종의 유전자가 다른 종, 변종 또는 품종의 게놈으로 해당종을 교배하여 이동하는 과정을 의미한다. 교차는 자연적일 수 있고, 인공적일 수도 있다. 상기 과정은 반복친 (Recurrent parent)에게 역교배함으로써 선택적으로 완료될 수 있으며, 이 경우 유전자 이입은 종간 잡종을 부모 중 하나와 반복적으로 역교배함으로써 한 종의 유전자가 다른 종의 유전자 풀에 침투하는 것을 말한다. 이입 (Introgression)은 또한 수용 식물의 게놈에 안정적으로 통합된 이종 유전 물질로 기술될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "분자 마커 (Molecular Marker)"는 핵산 서열의 특성 차이를 가시화하는 방법에 사용되는 지표를 의미한다. 그러한 지표의 예는 제한 단편 길이 다형성 (Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 마커, 증폭 단편 길이 다형성 (Amplification fragment length polymorphism, AFLP) 마커, 단일 뉴클레오티드 다형성 (Single nucleotide polymorphisms, SNPs), 삽입 돌연변이 (Insertion mutation), 미소부수체 마커 (Microsatellite markers, SSRs), 서열-특징 증폭 영역 (Sequence-characterized amplified regions, SCARs), 절단된 증폭 다형성 서열 (Cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS) 또는 이소자임 마커 (Isozyme marker) 또는 특정 유전 및 염색체 위치를 정의하는 본 발명에 기술된 조합이다. 대립 유전자 주변의 분자 마커 맵핑은 일반적인 분자 기술을 사용하여 당업자가 매우 쉽게 수행할 수 있는 절차이다.
본 발명에 있어서, 용어 "프라이머 (Primer)"는 증폭 표적에 어닐링 (Annealing)하여 DNA 중합효소가 부착되도록 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말하며, 이에 따라 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하, 예를 들어, 뉴클레오타이드 및 DNA 폴리머라제와 같은 중합제 및 적절한 온도 및 pH의 조건하에서 있을 때 DNA 합성의 개시점 역할을 한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭 효율을 최대화하기 위해 단일가닥이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 중합제의 존재 하에 연장 산물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 프라이머의 온도 및 구성 (A/T 및 G/C 함량)을 비롯한 여러 요인에 따라 달라진다. 한 쌍의 양방향 프라이머는 PCR 증폭과 같은 DNA 증폭 분야에서 일반적으로 사용되는 하나의 정방향 프라이머와 하나의 역방향 프라이머로 구성된다.
"스캡병 (Scab disease)"은 Cladosporium으로 명명된 Ascomycota 클래스 (실내 및 실외 곰팡이)의 진균에 의해 발생하는 진균 질병을 의미한다. Cladosporium 종의 예는 Cladosporium elegans, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium caryigenum, Cladosporium musae, Cladosporium brassicae, Cladosporium cucumerinum 및 Cladosporium oxysporum을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, Cladosporium 종은 Cladosporium cucumerinum (Cladosporium cucumerinum Ellis 및 Arthur로도 알려짐)이다. 질병 증상은 잎, 잎자루, 줄기 및 열매를 포함하여 식물의 모든 부분에 나타날 수 있다. 잎 병변은 옅은 녹색의 물에 젖은 부분으로 시작하여 점차 회색에서 흰색으로 변하고 각이 진다. 종종, 병변은 황색 후광으로 둘러싸여 있으며 병변 중심이 찢어져 잎에 울퉁불퉁한 구멍이 남는다. 과일에는, 작고 (1/8 인치) 회색이며 약간 움푹 들어가고 진물이 나며 곤충 "침"과 유사한 끈적끈적한 반점이 생긴다. 나중에 반점이 확대되고 마침내 뚜렷한 움푹 패인 구멍이 된다. 분화구 모양의 오목한 부분은 과일이 숙성됨에 따라 불규칙하고 딱지 모양으로 나타나며 끈적끈적한 물질이 흘러나올 수 있다 (https://extension.illinois.edu/hortanswers/detailproblem.cfm?PathogenID=141).
"흰가루병 (Powdery mildew)"은 Erisyphales목의 진균에 의해 발생하는 진균성 질병을 의미한다. 바람직하게는 흰가루병은 Golovinomyces cichoracearum (Erysiphe cichoracearum DC로도 알려짐) 및/또는 Podosphaera xanthii (Sphaerotheca fuliginea 또는 Oidium erysiphoides로도 알려짐)에 의해 유발된다. 여전히 바람직하게는, 흰가루병은 Podosphaera xanthii에 의해 유발된다. 일 양태에 있어서, 흰가루병 (Powdery Mildew)은 Podosphaera xanthii 종족 Px-1, Px-2, Px-3, Px-5, 및/또는 Px3-5에 의해 유발된다. 이 질병은 줄기, 잎자루, 잎의 윗면 및/또는 아랫면, 열매에 흰색 또는 옅은 노란색의 병반이 생기는 것이 특징이다. 질병이 진행되면 병변이 커지고 밀도가 높아진다. 병변이 커짐에 따라 영향을 받은 조직에서 분생포자가 생성되고 반점이 가루처럼 보인다. 이러한 균류의 포자형성은 식물조직의 세포파괴를 일으키고, 광합성 효능의 상실로 인해 식물의 에너지 성능이 저하될 수 있다 (https://cuccap.org/disease-management/melon/powdery-mildew/).
"진딧물 (Aphid)"은 조롱박과 같이 경제적으로 중요한 광범위한 기주 식물에서 서식하는 해충을 의미하고, 주요 해중이다. 진딧물에 의한 박과류의 집락화는 발육방해 (Stunting) 및 심각한 잎 말림을 유발하여 식물이 죽을 수 있다. 진딧물은 또한 효율적인 바이러스 벡터이므로 바이러스성 질병의 확산에 기여한다. 바람직하게는, 진딧물은 Aphis gossypii Glover 종이다.
"Vat 유전자 유사체 (Vat gene analog)"는 진딧물, 더 바람직하게는 Dogimont et al.2008, Pitrat M. (ed), Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae, Avignon (France), May 21-24th, 2008, pp. 219-228에 기재된 PI414723의 Aphis gossypii Glover에 대한 저항성을 담당하는 주요 유전자를 의미한다. vat 유전자 유사체는 LG5에 위치한다 (Dogimont et al., 2014, The Plant Journal, 80, 993-1004). 일 양태에 있어서, vat 유전자 유사체는 2015년 3월 24일 업데이트된 GenBank 번호 KM513660.1 하에서 참조되는 vat 유전자에 의해 코딩되는 핵산 서열과 99.8%의 동일성을 갖는 5897 bp의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된다 (서열번호 46). 일 양태에 있어서, vat 유전자 유사체는 GenBank 번호 AIU36098.1, 업데이트 2014년 10월 27일(서열번호 47)로 참조되는 vat 단백질과 99.6% 동일성을 갖는 1473aa의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하고, 즉, Vat 유전자 유사체는 2014년 10월 27일 업데이트된 GenBank 번호 AIU36098.1(서열번호 47)로 참조되는 vat 단백질에 비해 6개의 상이한 aa를 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. Vat 유전자 유사체의 확인은 다음의 서열 5'-CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC -3'(서열번호 48)을 갖는 정방향 프라이머 Me-VatE-F 및 서열 5'-CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC -3'(서열번호 49)를 갖는 역방향 프라이머 Me-VatE-R)를 사용하여 특허출원 FR 2 849 863에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 언급한 한 쌍의 프라이머를 사용한 1723 bp 단편의 검출은 Vat 유전자 유사체의 존재를 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 동일성의 백분율은 전체 정렬을 사용하여 계산된다 (즉, 두 서열이 전체 길이에 걸쳐 비교됨). 2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 전체 길이를 고려할 때 두 시퀀스의 최적 정렬 (갭 포함)을 찾기 위해 Needleman-Wunsch 전역 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하는 ≪ needle ≫ 프로그램이 예를 들어 사용될 수 있다. needle 프로그램은 예를 들어 ebi.ac.uk 월드 와이드 웹 사이트에서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 동일성의 백분율은 바람직하게는 10.0과 동일한 "갭 개방 (Gap Open)" 파라미터, 0.5와 동일한 "갭 확장 (Gap Extend)" 파라미터 및 Blosum62 매트릭스를 갖는 EMBOSS::needle (글로벌) 프로그램을 사용하여 계산된다.
본 발명의 맥락에서, Illumina (https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_topbot.pdf)에서 개발한 TOP/BOT 방법에 따라 마커 LG2-M1, Cm_MU47536_461, LG2-M2, Cm_MU47380_465, LG2-M3, Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, Cm_MU45437_855 및 LG5-M3에 대한 DNA 가닥 및 대립유전자 지정 및 방향 지정을 수행할 수 있다.
SNP 이름의 Cm 접미사는 다음에서 생략될 수 있지만 Cucumis melo의 동일한 마커를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 2개의 마커 X 및 Y로 구분되는 염색체 영역(예를 들어, SNP)은 이들 2개의 마커의 위치 사이에 있고 상기 마커를 포함하는 염색체의 부분을 의미하고, 따라서 이 염색체 영역의 뉴클레오티드 서열은 마커 X에 해당하는 뉴클레오티드로 시작하고 마커 Y에 해당하는 뉴클레오티드로 끝나며, 즉, 마커는 구분하는 영역 내에 포함된다.
"Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형 (Necrotic phenotype linked to the Zym gene)"는 Zym 유전자 동형접합체의 존재하에 Pitrat and Lecoq, 1984, Euphytica, 33(1):57-61에 기술된 괴사성 표현형을 의미한다. 보다 구체적으로, 이러한 괴사성 표현형은 잎에서 점차 확장되어 잎 또는 줄기를 완전히 건조시킬 수 있는 잎 표피의 괴사 반점 (Necrotic spot)의 출현에 해당한다.
"상업적으로 허용되는 과일 품질 (Commercially acceptable fruit quality)"은 Charentais 유형의 과일, Western Shipper, 살색이 주황색에서 빨간색 마젠타로 변하는 하퍼 (Harper) 또는 이탈리안 멜론 (즉, Minolta 색도계로 측정한 L*c*h 값이 60<L<65, 40<c<50 및 66<h75인 색도계), 페네펠로 측정했을 때 4kg/0.5cm² +/-2의 평균값을 갖는 살의 단단함, 최소 11°의 Brix 수준, Vedrantais 품종에서 발견되는 구멍 비율(cavity ratio)의 과일 직경/크기(diameter of the fruit/size), + 12 ℃에서 8일 이상 과일을 보존함을 의미한다. 상업적으로 허용되는 과일 품질을 갖는 과일의 예로는 HM-CLAUSE의 HUGO, ALONSO 또는 FELINO 품종의 과일일 수 있다.
연관성, 또는 유전적 연관성, 및 보다 구체적으로 유전적 연결에 의해, 유전적 마커 (예를 들어, SNP 마커의 특정 대립유전자)의 다형성과 관심있는 표현형이 동시에 발생하는 것으로 이해되어야 하며, 즉, 우연히 발생할 것으로 예상되는 것 보다 더 자주 함께 유전되며, 즉, 게놈 근접성 (Genomic proximity)의 결과로서 표현형을 담당하는 대립 유전자 및 유전자 서열의 비무작위적 연관성이 있다.
서열 목록
서열번호 1은 마커 Cm_MU45136_209의 플랭킹 서열 (Flanking sequence)을 나타낸다.
서열번호 2는 Cm_MU45136_209 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 Cm_MU45136_209 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 Cm_MU45136_209 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 5는 마커 LG2-M4의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 LG2-M4 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 LG2-M4 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 LG2-M4 마커 검출을 위한 일반적인 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 9는 마커 Cm_MU45398_32의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 10은 Cm_MU45398_32 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 Cm_MU45398_32 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 12는 Cm_MU45398_32 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 마커 LG5-M1의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 14는 CMCTN2 마커 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 15는 CMCTN2 마커 검출을 위한 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 16은 마커 Cm_MU46579_322의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 17은 Cm_MU46579_322 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 18은 Cm_MU46579_322 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 19는 Cm_MU46579_322 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 20은 마커 Cm_MU44050_58의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 21은 Cm_MU44050_58 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 22는 Cm_MU44050_58 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 23은 Cm_MU44050_58 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 24는 CMBR120 마커 검출을 위한 전방 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 25는 CMBR120 마커 검출을 위한 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 26은 마커 LG2-M1의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 27은 LG2-M1 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 28은 LG2-M1 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 29는 LG2-M1 마커 검출을 위한 일반적인 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 30은 마커 Cm_MU47536_461의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 31은 Cm_MU47536_461 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 32는 Cm_MU47536_461 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 33은 Cm_MU47536_461 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 34는 마커 Cm_MU45437_855의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 35는 Cm_MU45437_855 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 36은 Cm_MU45437_855 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 37은 Cm_MU45437_855 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 38은 LG5-M2 마커 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 39는 LG5-M2 마커 검출을 위한 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 40은 CMTAN139 마커 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 41은 CMTAN139 마커 검출을 위한 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 42는 마커 LG5-M3의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 43은 LG5-M3 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 44는 LG5-M3 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 45는 LG5-M3 마커 검출을 위한 일반적인 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 46은 GenBank 번호 KM513660.1로 참조되는 Vat 유전자의 게놈 서열을 나타낸다.
서열번호 47은 GenBank 번호 AIU36098.1로 참조되는 Vat 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 48은 Vat 유전자 유사체를 증폭하기 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 49는 Vat 유전자 유사체를 증폭하기 위한 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 50은 마커 LG2-M2의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 51은 LG2-M2 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 52는 LG2-M2 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 53은 LG2-M2 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 54는 마커 Cm_MU47380_465의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 55는 Cm_MU47380_465 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 56은 Cm_MU47380_465 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 57은 Cm_MU47380_465 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 58은 마커 LG2-M3의 플랭킹 서열을 나타낸다.
서열번호 59는 LG2-M3 마커의 감수성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 60은 LG2-M3 마커의 저항성 대립유전자 검출을 위한 정방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 61은 LG2-M3 마커 검출을 위한 공통 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
도 1: 이 도면은 일 예에서 사용된 다양한 멜론 계통과 자원(Accession)을 설명하는 도면으로 구성되어 있다 - 하나는 외부 측면의 사진이고 다른 하나는 내부 측면의 사진이다.
도 2: 이 수치는 Diaz et al, 2011에 개시된 LG2의 유전자 지도를 나타내며, 본 발명에 있어서 본 발명의 마커와 해당 QTL이 추가되었다. PM은 흰가루병 저항성을, 스캡병은 스캡에 대한 저항성을, ZYMV는 Zucchini Yellow Mosaic Virus에 대한 저항성을 나타낸다.
도 3: 이 도면은 Diaz et al, 2011에 공개된 LG5의 유전자 지도를 나타내며, 본 발명의 마커 및 상응하는 QTL이 추가되었다. PM은 흰가루병 저항성(Powdery Mildew resistance)을, 스캡병(Scab disease)은 스캡(Scab)에 대한 저항성을 나타낸다.
본 발명의 첫번째 일 양태는 따라서 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물로서,
- 상기 식물은 다음을 포함한다:
(i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci),
(ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
(iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함하고, 및
- 상기 식물은 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고 있는 멜론 식물.
바람직한 일 양태에 있어서, 식물은 Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없는 것이다.
"스캡병에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 QTL (One or more QTL conferring resistance to PM)"은 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 QTL, 즉, LG2에 존재하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 QTL 및/또는 LG5에 존재하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 및 그 이상의 QTL을 의미한다.
일 양태에 있어서, QTL은 LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치하고 스캡병에 대한 저항성을 부여한다.
일 양태에 있어서, QTL은 LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치하고 스캡병에 대한 저항성을 부여한다.
일 양태에 있어서, QTL은 LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여한다.
일 양태에 있어서, QTL은 LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치하는 PM에 대한 저항성을 부여한다.
바람직하게도, 본 발명에 따른 멜론 (C. melo) 식물은 상기 정의된 바와 같은 QTL의 임의의 조합을 포함하고, 상업적으로 허용되는 과일 품질을 갖고 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype) 갖지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 멜론 (C. melo) 식물은 스캡병, 진딧물 및 PM에 대한 저항성과 관련된 QTL(들)의 다음의 조합을 포함할 수 있다:
(a) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(b) LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있고, LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(c) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있고, LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(d) LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(e) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(f) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(g) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체;
(h) LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체; 또는
(i) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체.
따라서 특히 바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명에 따른 멜론 (C. melo) 식물은:
- LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체를 포함하고,
- 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고,
- Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없다.
일 양태에 있어서, QTL은 LG2에 있고, 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 Cm_MU45136_209, LG2-M4 (서열번호 5) 및/또는 Cm_MU45398_32 마커 검출; 또는 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커에 의해 확인된다. 일 양태에 있어서, Cm_MU45136_209, LG2-M4 및/또는 Cm_MU45398_32 마커 검출은 Cm_MU45136_209, LG2-M4 및 Cm_MU45398_32 마커 각각의 저항성/감수성 대립 유전자를 증폭하는 데 사용할 수 있는 특정 프라이머를 사용하여 바람직하게는 PCR 증폭에 의해 수행된다.
특히, LG2에 있는 Cm_MU45136_209 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 1, 또는 서열번호 1의 위치 209에서 [T/C] 다형성을 포함하는 이의 단편을 포함하거나 이로 구성된 핵산을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 서열 또는 그의 상보적인 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU45136_209의 감수성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머는 서열 5'-ACAAATTTCTTGGAGCTGCAAGACTTA-3'(서열번호 2)로 구성될 수 있으며, 서열번호 1의 서열 또는 그의 상보적인 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU45136_209의 저항성 대립유전자 검출용 정방향 프라이머는 서열 5'-CAAATTTCTTGGGAGCTGCAAGACTTG-3' (서열번호 3)로, 공통적인 역방향 프라이머는 서열 5'-TATCATCGGTTCTTTGTCTCAAGAAGGAAA-3' (서열번호 4)로 구성될 수 있다. 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 1 서열로 구성된 증폭 산물의 위치 209에서 상보적 가닥의 아데닌(A)이 아닌 구아닌(G) 또는 티민(T)이 아닌 시토신(C)을 검출하는 것은 LG2에 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
특히, LG2에 있는 LG2-M4 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 5를 포함하거나 서열번호 5로 이루어진 핵산 또는 서열번호 5의 위치 61에 [G/A] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 마커 LG2-M4의 감수성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머는 서열번호 5의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여, 서열 5'-TTCACACCATTTGTAAGTTTGAACTTTG-3'(서열번호 6)로 구성될 수 있으며, 서열번호 5의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하는 마커 LG2-M4의 저항성 대립유전자 검출용 정방향 프라이머는 서열 5'-GTTTTCACACCATTTGTAAGTTTGAACTTTA-3'(서열번호 7)로 구성될 수 있으며, 공통의 역방향 프라이머는 서열 5'-GCACGTATGATAACGAGTTCTTTAGTGTT-3'(서열번호 8)로 구성될 수 있다. 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 5로 구성된 증폭산물의 위치 61에서 구아닌(G)이 아닌 아데닌(A)의 검출하는 것은 LG2에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL을 확인할 수 있다.
특히, LG2에 있는 Cm_MU45398_32 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 9를 포함하거나 또는 서열번호 9의 32번 위치에 [T/C] 다형성을 포함하는 이의 단편으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 9의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU45398_32의 감수성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머, 서열 5'-CAAAACAGGGTTGTTCCGCTTTACT-3'(서열번호 10)로 구성될 수 있으며, 서열번호 9의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU45398_32의 저항성 대립유전자 검출용 정방향 프라이머는 서열 5'-AAAACAGGGTTGTTCCGCTTTACC-3'(서열번호 11)로 구성될 수 있으며, 공통 역방향 프라이머는 서열 5'-CGTCTTCTTCTTCTTCTTCTTTGTTGCTA-3'(서열번호 12)로 구성될 수 있다. 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 프라이머를 사용하여, 서열번호 9 서열로 구성된 증폭 생성물의 위치 32에서 티민(T)이 아닌 시토신(C)의 검출은 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 LG2 상의 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
일 양태에 있어서, LG5에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL은 LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, 및/또는 Cm_MU44050_58 마커 검출; 또는 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커 검출에 의해 확인된다. 일 양태에 있어서, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322 및/또는 Cm_MU44050_58 마커의 검출은 LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322 및/또는 Cm_MU44050_58 마커 각각의 저항성/감수성 대립 유전자를 증폭하는 데 사용할 수 있는 특정 프라이머를 사용하여 증폭되고, 바람직하게는 PCR에 의해 수행된다.
특히, LG5에 있는 LG5-M1 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 13을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 13의 위치 36에 [T/C] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다 (하기 표 1 참조). 예를 들어 KASPar 분석에서 사용될 수 있는 적절한 프라이머는 숙련된 사람에 의해 쉽게 설계될 수 있다. 서열번호 13의 위치 36에서 [T/C] 다형성을 검출할 수 있는 프라이머를 사용하여, 서열번호 13 서열로 구성된 증폭 산물의 위치 36에 상보적 가닥에서 아데노신 (A)보다는 구아닌 (G)을, 또는 티민 (T)보다는 시토신 (C)의 검출하는 것으로, LG2에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
특히, LG5에 있는 CMCTN2 마커의 검출은 CMCTN2 마커의 저항성/감수성 대립유전자를 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다. 일 양태에 있어서, 상기 PCR은 증폭 산물을 제한 효소로 분해하거나 증폭 산물을 시퀀싱함으로써 수행된다. 특히, CMCTN2 마커 증폭을 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 5'-CTGAAAGCAGTTTGTGTCGA-3'(서열번호 14) 및 5'-AAAGAAGGAAGAGGCTGAGA-3' (서열번호 15)의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 14 및 서열번호 15로 구성된 프라이머를 사용하여, 195 bp의 증폭 산물의 검출하는 것은 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 LG5에 있는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 2 참조).
특히, LG5에 있는 Cm_MU46579_322 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 16을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 16의 위치 51에 [T/C] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 서열번호 16의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU46579_322의 감수성 대립유전자 검출하는 정방향 프라이머는 서열 5'-TCCGATCCTCACTGGAACTATCT-3' (서열번호 17)로 구성될 수 있으며, 서열번호 16의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU46579_322의 저항성 대립유전자 검출하는 정방향 프라이머는 서열 5'-CCGATCCTCACTGGAACTATCC-3' (서열번호 18)로 구성될 수 있으며, 공통 역방향 프라이머는 서열 5'-CAGCCTCATCGACTGTGAACTTCAT-3' (서열번호 19)로 구성될 수 있다. 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 16으로 구성된 증폭 산물의 위치 51에 상보적 가닥에서 아데닌(A)이 아닌 구아닌(G) 또는 티민(T)이 아닌 시토신(C)으로 검출하는 것은 LG5에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
특히, LG5 상의 Cm_MU44050_58 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 20을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 20의 위치 58에 [T/C] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 20의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU44050_58의 감수성 대립유전자를 검출하는 정방향 프라이머는 서열 5'-GCGTTGCTTTCATGGCGAGCTTT-3' (서열번호 21)로 구성될 수 있으며, 서열번호 20의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU44050_58의 저항성 대립유전자를 검출하는 정방향 프라이머는 서열 5'-CGTTGCTTTCATGGCGAGCTTC-3' (서열번호 22)로 구성될 수 있으며, 공통 역방향 프라이머는 서열 5'-CTGTGGAACGGAGAAGCTCAAAGAA-3' (서열번호 23)로 구성될 수 있다. 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 20으로 구성된 증폭산물의 위치 58에서 아데닌 (A)이 아닌 구아닌 (G) 또는 티민 (T)이 아닌 시토신 (C)의 검출하는 것은 LG5에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
일 양태에 있어서, LG2에 있고, PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL은 CMBR120, LG2-M1(서열번호 26) 및/또는 Cm_MU47536_461 마커의 검출; 또는 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커에 의해 식별된다. 일 양태에 있어서, CMBR120, LG2-M1 및/또는 Cm_MU47536_461 마커 검출은 CMBR120, LG2-M1 및/또는 Cm_MU47536_461 마커 각각의 저항성/감수성 대립 유전자를 증폭하는 데 사용할 수 있는 특정 프라이머를 사용하여 증폭되고, 바람직하게는 PCR에 의해 수행된다.
특히, LG2에 있는 CMBR120 마커의 검출은 CMBR120 마커의 저항성/감수성 대립 유전자를 증폭시키는데 사용될 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다. 일 양태에 있어서, 상기 PCR은 증폭 산물을 제한 효소로 분해하거나 증폭 산물을 시퀀싱함으로써 수행된다. 특히, CMBR120 마커 증폭을 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 5'-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3'(서열번호 24) 및 5'-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3'(서열번호 25)의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 24 및 서열번호 25로 구성된 프라이머를 사용하여, 165 bp의 증폭 산물을 검출하는 것은 LG2에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 2 참조).
특히, LG2에 있는 LG2-M1 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 26을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 26의 위치 69에 [C/T] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 26의 서열 또는 이의 상보적인 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 LG2-M1의 감수성 대립유전자를 검출하는 정방향 프라이머는 서열번호 26으로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 LG2-M1의 저항성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머인 서열 5'-CCTCATTTGGGCCCCGGG-3'(서열번호 27)로 구성될 수 있으며, 또는 이의 상보적인 서열은 서열 5'-AATCCTCATTTGGGCCCCGGA-3' (서열번호 28)로 구성될 수 있고, 공통 역방향 프라이머는 서열 5'-TCATGGCTTCTGATACTCGTTTCTGATAT-3' (서열번호 29)로 구성될 수 있다. 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 26으로 구성된 증폭산물의 위치 69에서 구아닌(G)이 아닌 아데닌(A) 또는 시토신(C)이 아닌 티민(T) 검출하는 것은 LG2에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
특히, LG2에 있는 Cm_MU47536_461 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 30을 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 30의 위치 51에 [A/T] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 30의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU47536_461의 감수성 대립유전자를 검출하는 정방향 프라이머는 서열 5'-ATGTACAAGATTTTGATAATGTGATTGATACA-3' (서열번호 31)로 구성될 수 있으며, 서열번호 30의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU47536_461의 저항성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머는 서열 5'-ATGTACAAGATTTTGATAATGTGATTGATACT-3' (서열번호 32)로 구성될 수 있으며, 공통의 역방향 프라이머는 서열 5'-CGAAGAATATTAGCTGAGCCTTTGATGTT-3' (서열번호 33)로 구성될 수 있다. 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 33의 서열로 구성된 증폭산물의 위치 51에서 아데닌(A)이 아닌 티민(T)의 검출하는 것은 LG2에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
일 양태에 있어서, LG5에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL은 Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및/또는 LG5-M3 마커 검출에 의해; 또는 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커에 의해 확인된다. 일 양태에 있어서, Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및/또는 LG5-M3 마커의 검출은 증폭에 의해 수행되며, 바람직하게는 각각의 Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및/또는 LG5-M3 마커의 저항성/감수성 대립유전자를 증폭하는데 사용될 수 있는 특정 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수행된다.
특히, LG5에 있는 Cm_MU45437_855 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 34를 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 34의 위치 51에 [G/A] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 34의 서열로 이루어진 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU45437_855의 감수성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머는 서열 5'-AAAGTTTCTGTGTATTAAATCTGAACTCG-3' (서열번호 35)로 구성될 수 있으며, 서열번호 34의 핵산을 증폭하여 마커 Cm_MU45437_855의 저항성 대립유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머는 서열 5'-AATTAAAGTTTCTGTGTATTAAATCTGAACTCA-3' (서열번호 36)로 구성될 수 있으며, 공통의 역방향 프라이머는 서열 5'-CAGAGCACGTTTCGAAGGCACATAT-3' (서열번호 37)로 구성될 수 있다. 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 34로 구성된 증폭산물의 위치 51에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
특히, LG5에 있는 LG5-M2 마커의 검출은 LG5-M2 마커의 저항성/감수성 대립유전자를 증폭시키는데 사용될 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다. 일 양태에 있어서, 상기 PCR은 증폭 산물을 제한효소로 분해하거나 증폭 산물을 시퀀싱함으로써 수행된다. 특히, LG5-M2 마커 증폭을 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 5'-CACTTTCTAAATAGTTTGGAAAAGAG-3'(서열번호 38) 및 5'-GAGAATGTCTCTTTATCTAC-3'(서열번호 39)의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 38 및 서열번호 39로 구성된 프라이머를 사용하여 178 bp의 증폭산물을 검출하는 것은 LG5에 있는 PM에 저항성을 부여하는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 2 참조).
특히, LG5에 있는 CMTAN139 마커의 검출은 CMTAN139 마커의 저항성/감수성 대립유전자를 증폭하는데 사용할 수 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수행된다. 일 양태에 있어서, 상기 PCR은 증폭 산물을 제한 효소로 분해하거나 증폭 산물을 시퀀싱함으로써 수행된다. 특히, CMTAN139 마커 증폭을 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 5'-CGTAGAAGACACACATAATG-3' (서열번호 40) 및 5'-GAACTAGAACCACAAATCAC-3' (서열번호 41)의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 프라이머를 사용하여, 134 bp의 증폭 산물을 검출하는 것은 LG5에 있는 PM에 저항성이 있는 QTL의 존재를 확인할 수 있다 (하기 표 2 참조).
특히, LG5에 있는 LG5-M3 마커의 검출은 하나는 저항성 대립유전자에 특이적이고 다른 하나는 감수성 대립유전자에 특이적인 2개의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 2개의 정방향 프라이머는 서열번호 42를 포함하거나 이로 구성된 핵산, 또는 서열번호 42의 위치 51에 [C/T] 다형성을 포함하는 이의 단편을 증폭할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 마커 LG5-M3의 감수성 대립 유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머는 서열번호 42의 서열 또는 그의 상보적인 서열로 구성된 핵산을 증폭함으로써, 5'-CAGTCACAGAATTTGTAGACTTATAG-3' 서열 (서열번호 43)로 구성될 수 있으며, 마커 LG5-M3의 저항성 대립유전자 검출용 정방향 프라이머는 서열번호 42의 서열 또는 그의 상보적인 서열로 구성된 핵산을 증폭함으로써, 서열 5'-CAGTCACAGAATTTGTAGTAGACTTATAA-3' (서열번호 44)로 구성될 수 있으며, 공통 역방향 프라이머는 서열 5'-AGAGTTTCTTTCTAACGGGCATTGAGATT-3' (서열번호 45)로 구성될 수 있다. 서열번호 43, 서열번호 44 및 서열번호 45의 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 서열번호 42로 구성된 증폭산물의 위치 51에서 구아닌(G)이 아닌 아데닌(A) 또는 시토신(C)이 아닌 티민(T) 검출하는 것은 LG5에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL을 확인할 수 있다 (하기 표 1 참조).
일 양태에 있어서, LG5에 있는 진딧물에 대한 저항성과 연관된 Vat 유전자 유사체는 서열 5'-CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC-3'(서열번호 48)을 갖는 정방향 프라이머 Me-VatE-F 및 서열 5'-CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC-3'(서열 번호 49)을 갖는 역방향 프라이머 Me-VatE-R의 증폭 생성물에 의해 확인된다. 이 프라이머 쌍을 사용하여 1723 bp 단편의 검출은 Vat 유전자 유사체의 존재를 확인할 수 있다.
상기에서 정의된 마커에 의해 증폭된 스캡병 및 흰가루병 (PM)에 대한 저항성을 부여하는 대립 유전자는 표 1 및 표 2에 기재된 바와 같다.
표 1: 연결 그룹 2 및 5, 위치 및 플랭킹 서열에 대한 스캡병 및 PM 저항성과 관련된 마커. LG.: 연결 그룹, R: 내성, S: 감수성, PM: 흰가루병.
특성
(Trait)		 마커
(Marker)		 LG 마커를 둘러싼 시퀀스
(Sequence surrounding the marker)		 서열번호의 위치
(Position in SEQ ID)		 유형
(Type)		 대체 대립 유전자 (Alternative alleles) (R/S) 서열번호 (SEQ ID NO)
스캡병(Scab disease) Cm_MU45136_209 2 TGCTTGCTGCCGGCCTCCCTGGCGGCCGCGTGAATTTTATTTAACGGCCCAATCGGCCCACACATTGCATCAAAAAAAAATATTTCCCAAGTGTTTCTTAGCATATATTTGTTGTGTTCAAAGAAACCAAAATATCAAAAGAGGTGCGCTATTATTTTTTTATCATCGGTTCTTGTCTCAAGAAGGAAAAAAAAATGTCACTCTTTCT[T/C]AAGTCTTGCAGCTCCAAGAAATTTGTTGGTGATCATTCATTA 209 SNP C/T 1
스캡병(Scab disease) LG2-M4 2 CATGGAGTGCCGCATACGGTTGATACTTTGGTTTTCACACCATTTGTAAGTTTGAACTTT[A/G]CAAACACTAAAGAACTCGTTATCATACGTGCTTGCATTACCTTTCTTGTGATAAATGTGT 61 SNP A/G 5
스캡병(Scab disease) Cm_MU45398_32 2 AGAATAACAAAACAGGGTTGTTCCGCTTTAC[T/C]TCAAATAGCAACAAAGAAGAAGAAGAAGAAGACGATTAGAAGAGAAAGATGGAAGCGAAGGTCAGCAAATTCTTAGGCTCCGTTTCCAATTTCTTCTCCGGCGGCGATCACATACCATGGTGCGATCGCGACGTCGTTGCCGGTTGCGAAAGAGAGGCTGCTGAGGCCGAAAAGAGCTCATCTGGTGAGCTTTTGAAGGAAAGCATTATGCGTTTATCT 32 SNP C/T 9
스캡병(Scab disease) LG5-M1 5 TCCATCCATCTTTTCCAGTTTTGTGGAGTTCATTA[T/C]GATACAATTTCGCCGATCTACTTTTCTTTACAT 36 SNP C/T 13
Scab disease Cm_MU46579_322 5 GAAGACTCCGGTAGCTAAAGAAGGCGGTTCCGATCCTCACTGGAACTATC[T/C]CATGAAGTTCACAGTCGATGAGGCTGCCTTGCAGAACAATCGACTCAATC 51 SNP C/T 16
스캡병(Scab disease) Cm_MU44050_58 5 GAACCCAAAAAGCTTGGGGGTTTCGTAGCTTCGTAGCGTTGCTTTCATGGCGAGCTT[T/C]GTTTCTTTGAGCTTCTCCGTTCCACAGCTCACTCTCAAGGAAATCCCACCATGGAAATTGGCTAAAGCTACGGTAGTTTCAAGGCGAGCTGGAACAGCTTTGAAGCTTGTGCTACCCTGTTATTCAAAGAAATCCATATCTATGAATTGGGAAAACTTTCGATCTGTACGGTTAACTTCAAGACCTTTTTGGG 58 SNP C/T 20
PM LG2-M1 2 TTAATGGAATGACACAGATCAATGTTCTCATCTGTTGCCCTCATGGCTTCTGATACTCGTTCTGATAT[T/C]CCGGGGCCCAAATGAGGATTGTATGTTCTAACCCATTCTTCGTGATTGATTTCGAATTC 69 SNP T/C 26
PM Cm_MU47536_461 2 GGTAACATGTGGGAGATTGATGTACAAGATTTTGATAATGTGATTGATAC[A/T]AACATCAAAGGCTCAGCTAATATTCTTCGTCACTTCATCCCTCTTATGAT 51 SNP T/A 30
PM Cm_MU45437_855 5 CTGAATCATACCAATTGTAATTAAAGTTTCTGTGTATTAAATCTGAACTC[A/G]AGGCTTTTCCTCTATATGTGCCTTCGAAACGTGCTCTGTAACTTGATTTT 51 SNP A/G 34
PM LG5-M3 5 ATTTCAAGAGAGTTCTTTCTAACGGGCATTGAGATTCCMGAATGGTTCAG[T/C]TATAAGTCTACTACAAATTCTGTGACTGCTAGCATTCGTCACTATCCAGA 51 SNP T/C 42
표 2: 마커 LG5-M3, CMTAN139, CMTCN2, CMBR120 및 Me_VatE에 의해 증폭된 저항 대립유전자.
특성
(Trait)		 마커
(Marker)		 염색체
(Chromosome)		 타입
(Type)		 디자인
(Design)		 저항성 대립유전자(bp)
흰가루병(Powdery Mildew) LG5-M2 5 SSR 직접 라벨링(direct labelling) 178
흰가루병(Powdery Mildew) CMTAN139 5 SSR 직접 라벨링(direct labelling) 134
스캡병(Scab disease) CMCTN2 5 SSR 직접 라벨링(direct labelling) 195
흰가루병(Powdery Mildew) CMBR120 2 SSR 직접 라벨링(direct labelling) 165
진딧물(Aphis Gossypii (VatE gene)) Me_VatE 5 STS - 1723
일 양태에 있어서, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성을 부여하는 QTL(들)은 다음의 검출에 의해 확인된다:
(1) Cm_MU45136_209의 대립유전자 C, LG2-M4의 대립유전자 A 및 Cm_MU45398_32의 대립유전자 C,
(2) LG5-M1의 대립유전자 C, CMCTN2의 195 bp의 대립유전자, Cm_MU46579_322의 대립유전자 C 및 Cm_MU44050_58의 대립유전자 C,
(3) CMBR120의 165 bp의 대립유전자, LG2-M1의 대립유전자 T 및 Cm_MU47536_461의 대립유전자 T,
(4) Cm_MU45437_855의 대립유전자 A, LG5-M2의 178bp의 대립유전자, CMTAN139의 134 bp의 대립유전자 및 LG5-M3의 대립유전자 T, 또는
(5) Me_VatE의 1723bp의 대립유전자.
스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성을 부여하는 QTL은 표 1 및 2에 설명된 특정 대립유전자에 의해 식별될 수 있으며, 본 발명의 식물은 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 대립유전자의 임의의 조합을 포함하고, 상업적으로 허용되는 과실 품질을 갖고 임의로 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)을 갖지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 멜론 (C. melo) 식물은 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 대한 하기와 같은 저항성과 관련된 대립유전자의 조합을 포함할 수 있다:
I) 대립 유전자의 조합 (1), (3) 및 (5),
Ⅱ) 대립 유전자의 조합 (2), (4) 및 (5),
Ⅲ) 대립 유전자의 조합 (1), (4) 및 (5),
Ⅳ) 대립 유전자의 조합 (2), (3) 및 (5),
Ⅴ) 대립 유전자의 조합 (1), (2), (3) 및 (5),
VI) 대립 유전자의 조합 (1), (2), (4) 및 (5),
VⅡ) 대립 유전자의 조합 (1), (3), (4) 및 (5),
VⅢ) 대립유전자의 조합 (2), (3), (4) 및 (5), 또는
IX) 대립유전자 조합 (1), (2), (3), (4) 및 (5).
따라서 특히 바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명에 있어서 멜론 (C. melo) 식물은 다음과 같다:
- 상기에서 정의된 바와 같은 대립유전자의 조합 IX)를 포함하고,
- 상업적으로 허용 가능한 과일 품질을 가지고 있으며,
- 선택적으로 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는다.
일 양태에 있어서, 클라도스포리움 (Cladosporium), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성과 관련된 하나 이상의 QTL은 NCIMB 수탁 번호 43317로 종자가 기탁된 MTYVVC721 계통(line)의 식물 게놈에 존재하는 것들로부터 선택된다.
일 양태에 있어서, 클라도스포리움 (Cladosporium), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성과 관련된 하나 이상의 QTL은 기탁된 물질 MTYVVC721(NCIMB 수탁번호 43317)에 상응하는 식물의 게놈에서 발견되는 바와 같다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 따른 멜론 (C. melo) 식물은 MTYVVC721 계통이며, 이 종자는 NCIMB 수탁번호 43317로 기탁되어 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 따른 식물은 수탁번호 43317로 NCIMB에 기탁된 멜론 (C. melo) MTYVVC721 계통의 기탁된 종자로부터 성장한 식물의 자손 또는 자손일 수 있다. 기탁된 종자에서 자라는 식물은 실제로 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대해 동형접합 저항성을 나타내며, 그들은 상업적으로 허용 가능한 과일 품질을 가지고 있으며 Zym 유전자와 연결된 괴사성 표현형이 없으며, 즉, 그들은 동형 접합 상태에서 상기 정의된 바와 같이 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성과 관련된 LG2 및 LG5에 있는 QTL을 게놈에 가지고 있으며, Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않다. 그들은 Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형을 전달하지 않고 교배 및 자가교배 및/또는 역교배를 통해 LG2 및 LG5에 있는 상기 QTL을 다른 배경으로 이전하는 데 사용할 수 있다. 기탁된 종자로부터 얻은 식물의 자손은 예를 들어, Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139, LG5-M3 및/또는 Me-VatE 마커를 사용하여 당업자에게 의해 식별될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 자손은 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 3개의 상기 마커에 의해 식별되고; 바람직한 일 양태에 있어서, 마커 중 적어도 하나는 스캡병에 대한 저항성과 관련된 LG2 또는 LG5에 있는 QTL과 연관되고, 마커 중 적어도 하나는 흰가루병에 대한 저항성과 관련된 LG2 또는 LG5에 있는 QTL과 연관되며; 세 번째 마커는 Me-VatE와 같은 진딧물에 대한 저항성과 관련된 마커일 수 있다.
스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 대한 저항성은 예를 들어, Vιdrantais 계통과 같은 감수성(상업용) 계통과 비교하여 결정하는 것이 유리하다. 클라도스포리움 (Cladosporium)에 대한 저항성은 바람직하게는 실시예 1.1에 상세히 설명된 바와 같이 결정되며, 한 잎 단계 (One-leaf stage)에서 식물의 접종 테스트를 기반으로 한다. PM에 대한 저항성은 바람직하게는 실시예 1.2에 상세히 설명된 바와 같이, 한 잎 단계에서 식물의 접종 시험에 기초하거나, 분리된 잎에 적용된 분무 시험 (Spraying test)에 기초하여 결정된다. 진딧물에 대한 저항성은 바람직하게는 선행 기술에 개시된 바와 같이 결정된다.
두 번째 일 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 식물의 일부에 관한 것이다.
일 양태에 있어서, 식물의 일부는 식물 세포이다. 따라서 본 발명에 따른 멜론 (C. melo) 식물의 세포, 즉 다음과 같은 식물 세포를 제공한다:
- 상기 식물은 다음을 포함한다:
(i) 연결 그룹 2(LG2) 및/또는 연결 그룹 5(LG5)에 매핑되고, 스캡병에 대한 저항성과 연관된 하나 이상의 QTL,
(ii) LG2 및/또는 LG5에 매핑되고, (i)에서 상기 하나 이상의 QTL과 상이하며, 흰가루병에 대한 저항성과 연관된 하나 이상의 QTL,
(iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog).
LG2 및 LG5에 있는 QTL의 상이한 특징은 본 발명의 제1 측면과 관련하여 정의되었으며, 본 발명의 이러한 측면에 준용하여 적용된다. 따라서 QTL은 바람직하게는 기탁된 물질 MTYVVC721 (NCIMB 수탁번호 43317)에 상응하는 식물의 게놈에 존재하는 것들로부터 선택된다. 일 양태에 있어서, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 대한 저항성을 부여하는 LG2 및 LG5에 있는 QTL은 기탁된 물질 MTYVVC721(NCIMB 수탁번호 43317)에 상응하는 식물의 게놈에서 발견되는 바와 같다.
일 양태에 있어서, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 대한 저항성을 부여하는 LG2 및 LG5에 있는 QTL은 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같다.
일 양태에 있어서, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 대한 저항성을 부여하는 대립유전자 (Alleles)는 표 1 및 2에 기재된 바와 같다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 따른 식물 부분은 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같은 대립유전자 조합 I) 내지 IX)를 포함한다.
일 양태에 있어서, 상기 기재된 바와 같은 대립유전자의 조합 (The combination of Allele)은 기탁된 물질 MTYVVC721(NCIMB 수탁번호 43317)에 상응하는 식물의 게놈에서 발견되는 바와 같다.
본 발명의 식물 세포는 전체 식물로 재생되는 능력을 가질 수 있으며, 식물은 상업적으로 허용되는 과실 품질을 갖고 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)을 갖지 않는다.
대안적으로, 본 발명은 또한 재생 불가능하고 따라서 전체 식물을 발생시킬 수 없는 식물 세포에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 식물 세포는 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내의 LG2에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내의 LG5에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내의 LG2에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내의 LG5에 있는 흰가루병 (PM)에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및 LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함한다.
다른 일 양태에 있어서, 식물 부분 (Plant part)은 본 발명에 따른 식물의 다른 부분이고, 이는 특히 종자, 생식물질, 뿌리, 꽃, 과일, 대목 (Rootstock) 또는 접순 (Scion)일 수 있다.
본 발명의 제1 측면과 관련하여 이전 섹션에서 상세히 설명된 모든 실시예는 또한 본 발명의 제2 측면에 따른 바람직한 실시예이다.
본 발명은 보다 구체적으로 상기 정의된 바와 같은 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물로 자랄 때 발생하는 멜론 식물의 종자에 관한 것이다. 따라서 이러한 종자는 '본 발명의 식물의 종자', 즉 본 발명의 식물을 발생시키는 종자이다. 본 발명은 또한 본 발명의 식물로부터의 종자에 관한 것으로, 즉, 자가 교배 또는 교배 후 그러한 식물로부터 얻어지되, 단 종자로부터 얻은 식물이 저항성을 부여하는 상기 정의된 바와 같은 LG2 및 LG5에 있는 QTL로 인해 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있고, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 정의된 바와 같은 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물; 바람직하게는, 재생가능한 세포는 본 발명의 배아 (Embryos), 원형질체 (Protoplast), 분열조직 세포 (Meristematic cell), 캘러스 (Callus), 꽃가루 (Pollen), 잎 (Leaves), 꽃밥 (anthers), 줄기 (Stems), 잎자루 (Petioles), 뿌리 (Roots), 뿌리 끝 (Root tips), 과일 (Fruits), 종자 (Seeds), 꽃 (Flowers), 자엽 (Cotyledons) 및/또는 배축 (Hypocotyls)으로부터 유래되며, 따라서 게놈에 LG2 및 LG5에 있는 QTL을 포함하여 위에서 설명한 바와 같이 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성을 부여한다.
조직배양은 바람직하게는 전술한 멜론 (C. melo) 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생시킬 수 있고, 전술한 멜론 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생시킬 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 조직 배양물로부터 재생된 멜론 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 식물의 원형질체 또는 상기 정의된 조직 배양물로부터의 원형질체를 제공하며, 원형질체는 이의 게놈에 상기 기재된 바와 같이 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성을 부여하는 LG2 및 LG5에 있는 QTL을 포함한다.
본 발명의 제1 양태와 관련하여 이전 섹션에서 상세히 설명된 모든 실시예는 또한 본 발명의 제2 양태에 따른 실시예이다.
세 번째 일 측면에 있어서, 본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면에 따라 상술된 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 내성이 있는 멜론 식물을 얻기 위한 육종 프로그램의 육종 파트너로서 즉, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 내성이 있는 멜론 (C. melo)의 용도에 관한 것이다. 실제로, 제1 측면에 따른 이러한 멜론 식물은 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않고 이의 게놈에 상기 저항성을 부여하는 상기 정의된 바와 같은 이의 게놈 QTL을 포함한다. 이 식물을 감수성이 있거나 저항성이 적은 식물과 교배함으로써 원하는 표현형을 부여하는 이러한 QTL을 자손에게 전달하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명에 따른 식물은 멜론 식물 또는 생식질 (Germplasm) (즉, Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 이입하지 않음)에 원하는 표현형을 부여하는 유전자이입 QTL을 위한 육종파트너로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 수탁 번호 43317로 NCIMB에 기탁된 MTYVVC721의 식물 또는 종자와 동일한 용도에 관한 것이다. 상기 식물은 또한 원하는 표현형을 씨. 멜론 식물 또는 생식질에 부여하는 것을 목표로 하는 육종 프로그램에서 유전자이입 파트너로서 적합하다.
이러한 육종 프로그램에서, 원하는 표현형을 나타내는 자손 또는 원하는 표현형에 연결된 서열을 갖는 자손의 선택은 유리하게는 여기서 상기 개시된 마커의 대립유전자에 기초하여 수행될 수 있다. 자손은 바람직하게는 하기 특정 대립형질 중 하나 이상의 존재하에 선택된다: Cm_MU45136_209의 대립유전자 C, LG2-M4의 대립유전자 A, Cm_MU45398_32의 대립유전자 C, LG5-M1의 대립유전자 C, CMCTN2의 195 bp의 대립유전자, Cm_MU46579_322의 대립유전자 C, Cm_MU44050_58의 대립유전자 C, CMBR120의 165 bp의 대립유전자, 대립유전자 T LG2-M1의 대립유전자, Cm_MU47536_461의 대립유전자 T, Cm_MU45437_855의 대립유전자 A, LG5-M2의 178bp 대립유전자, CMTAN139의 134 bp 대립유전자, LG5-M3의 대립유전자 T 및 Me_VatE의 1723 bp 대립유전자. 자손은 바람직하게는 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같은 대립유전자 조합 I) 내지 IX)의 존재에 따라 선택된다.
원하는 표현형을 갖는 자손의 선택은 또한 특히 실시예의 스캡 테스트 및/또는 PM 테스트 섹션에 개시된 바와 같이, 또는 숙련된 독자에게 잘 알려진 다른 테스트와 함께 병원체 침입 조건에서 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 또는 수탁번호 NCIMB 43317로 기탁된 식물은 따라서 상업적인 멜론 계통 및 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 변종을 얻기 위한 마커 지원 선택 프로그램에서 특히 유용하나 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는다.
본 발명의 제1 및 제2 측면에 대한 일 양태에 있어서 또한 본 발명의 이러한 측면에 적용이 가능하다.
본 발명은 또한 원하는 표현형을 부여하는 유전자 서열을 식별, 시퀀싱 및/또는 클로닝하는 것을 목표로 하는 프로그램에서 상기 식물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 이전 측면에 대해 기술된 임의의 특정 일 양태는 특히 관심있는 표현형을 부여하는 QTL의 특징과 관련하여 본 발명의 이러한 측면에도 적용이 가능하다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (C. melo) 식물, 특히 상업용 식물의 생산 방법에 관한 것이다. 이러한 특징을 갖는 식물의 생산을 위한 방법 또는 공정은 다음 단계를 포함한다:
a) 본 발명의 제1 측면에 따른 식물 (예를 들어, 기탁된 종자 (NCIMB 43317)에 상응하는 식물) 및 원하는 표현형이 도입되거나 개선되어야 하는 감수성 또는 덜 저항성인 멜론 식물을 교배시키는 단계,
b) 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 식물 1종, 바람직하게는 이렇게 얻은 자손 (Progeny)에서 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않고, 또는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성과 관련된 QTL을 함유하지만 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 함유하지 않는 식물을 선택하는 단계,
c) 임의로 단계 b)에서 얻은 저항성 식물을 1회 또는 수회 자가수분 (Self-pollinating)하고, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이지만 바람직하게는 이렇게 얻은 자손에서 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는 식물을 선택하는 단계,
d) 단계 b) 또는 c)에서 선택된 저항성 식물을 감수성 멜론 식물(즉, 스캡병, 진딧물 및/또는 흰가루병에 감수성)과 역교배하는 단계, 및
e) 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이나 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않는 식물을 선택하는 단계.
대안적으로, 방법 또는 프로세스는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
a1) 본 발명의 제1 측면에 따른 원하는 표현형을 가져오거나 개선하여 F1 인구를 생성하기 위해 식물 (예를 들어, 기탁된 종자에 상응하는 식물(NCIMB 43317))과 감수성 또는 저항성이 덜한 멜론 식물을 교배시키는 단계,
a2) F1 모집단을 자가 처리하여 F2 모집단을 생성하는 단계,
b) 저항성 개체, 바람직하게는 이렇게 얻어진 자손에서 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는 식물을 선택하는 단계,
c) 임의로 단계 b)에서 얻은 저항성 식물, 바람직하게는 이렇게 얻은 자손에서 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는 저항성 식물을 1회 또는 수회 자가수분하고 선택하는 단계,
d) 단계 b) 또는 c)에서 선택된 저항성 식물을 감수성 멜론 식물(즉, 스캡병, 진딧물 및/또는 흰가루병에 감수성)과 역교배하는 단계,
e) 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 식물, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않는 식물을 선택하는 단계.
일 양태에 있어서, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있지만 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는 식물은 단계 b), c) 및 e)에서 선택될 수 있다.
단계 e)에서 선택된 식물은 바람직하게는 특히 Charentais, Western Shipper, Harper 또는 Italian Cantaloup 유형의 과일을 갖고 있으며 과육 색상이 주황색에서 빨간색 마젠타 (즉 L*c*h 값을 갖는 측색법: Minolta 측색계로 측정한 60<L<65, 40<c<50 및 66<h75)로 변하고 페네펠 (Penefel)로 측정했을 때 4kg/0.5cm² +/-2의 평균값을 갖는 살의 단단함, 최소 11°의 Brix 수준, Vedrantais 품종에서 발견되는 구멍 비율의 과일 직경/크기 및 과일 보존이 + 12 ℃에서 8일 이상인 상업용 식물이다.
바람직하게는, 단계 d) 및 e)는 적어도 2회, 바람직하게는 3회 반복되며, 반드시 동일한 감수성 멜론 (C. melo) 식물에 관한 것은 아니다. 상기 감수성 멜론 (C. melo) 식물은 바람직하게는 육종 계통이다.
자가수분 (Self-pollination) 및 역교배 (Backcrossing) 단계는 임의의 순서대로 수행될 수 있고 삽입될 수 있으며, 예를 들어 역교배는 하나 또는 여러 번의 자가수분 전후에 수행될 수 있으며 자가수분은 하나 또는 여러 번의 역교배 전후에 수행될 수 있다.
일 양태에 있어서, 이러한 방법은 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 모든 괴사성 표현형을 포함하지 않는 식물을 선택하기 위해 단계 b), c) 및/또는 e)에서 수행되는 하나 이상의 상기 기재된 바와 같은 마커를 사용함으로써 유리하게 수행된다.
일 양태에 있어서, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있고, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는 식물을 선별하기 위한 마커는 다음과 같다:
- 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG2-M1, Cm_MU47536_461, CMBR120 및 Me-VatE 중 하나 이상, 또는 모든 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG2-M1, Cm_MU1Vat 및 Me-VatE, Me-VatE,
- 하나 이상의 마커 LG5-M1, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMCTN2, Cm_MU45437_855, LG5-M3, LG5-M2, CMTAN139 및 Me-VatE, 또는 모든 마커 LG5-M1, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMC3_CMC25, CMCTN5 -M3, LG5-M2, CMTAN139 및 Me-VatE,
- 하나 이상의 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG2-M1, Cm_MU47536_461, CMBR120, LG5-M1, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMCTN2, Cm_MU45437_855, LG5-V3E 및 LG5-V3E, LG5-M2 및 MeTAN-M2 모든 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG2-M1, Cm_MU47536_461, CMBR120, LG5-M1, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMCTN2, Cm_MU45437_855, LG5-M3, LG5-M29.
일 양태에 있어서, 단계 b), c) 및/또는 e) 중 임의의 하나에서 선택되는 식물은 바람직하게는 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같은 대립유전자 조합 I) 내지 IX) 중 하나의 존재하에 선택된다.
원하는 표현형을 갖는 자손의 선택은 특히 실시예의 Scab 테스트 및/또는 PM 테스트 섹션에 개시된 바와 같이 또는 숙련된 리더 (Reader)에게 잘 알려진 다른 테스트와 함께 병원체가 만연한 조건에서 이루어질 수도 있다.
대립유전자 검출에 사용되는 방법은 특정 염색체에서 마커의 두 가지 다른 대립유전자를 구별할 수 있는 모든 기술을 기반으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 멜론 (C. melo) 식물에 관한 것이다. 이러한 식물은 실제로 본 발명의 제1 측면에 따른 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 멜론 식물이다.
추가적인 일 측면에 따르면, 또한 본 발명은 제1 측면에 따른 저항성 식물, 예컨대 식물 MTYVVC721을 교배하여 얻을 수 있는 잡종 멜론 식물, NCIMB 수탁 번호 43317로 기탁된 대표적인 종자 샘플, 또는 하기의 멜론 식물을 갖는 상기 개시된 방법에 의해 수득 가능한 예를 들어, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 감염에 민감한 식물, 또는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 감염에 대한 상이한 수준의 저항성을 갖는 식물에 관한 것이다. 특히 바람직한 잡종 멜론 식물은 농경학적 관심의 임의의 형질 또는 표현형을 나타내는 식물이다.
본 발명은 또한 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 상업적 멜론 (C. melo) 식물을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
- 기탁된 종자 MTYVVC721(NCIMB 수탁번호 43317)을 발아시켜 얻은 식물체 또는 멜론 식물과 함께, 본 발명의 제1 측면에 따른 멜론 식물, 예를 들어, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 민감한 멜론 식물을 역교배 하는 단계,
- 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 식물을 선택하는 단계.
제2 단계에서의 선택은 바람직하게는 본 발명의 다른 방법에 대해 상술한 바와 같이 수행된다. 선택은 바람직하게는 MTYVVC721 계통에서 발견되는 바와 같이 상기 기재된 바와 같은 마커 및 vat 유전자 유사체의 특정 대립유전자 중 하나 이상의 존재에 대해 수행된다.
선택된 식물은 바람직하게는 특히 Charentais, Western Shipper, Harper 또는 Italian Cantaloup 유형의 과일을 갖고 있으며 과육 색상이 주황색에서 빨간색 마젠타 (즉 L*c*h 값을 갖는 측색법: Minolta 측색계로 측정한 60<L<65, 40<c<50 및 66<h75)로 변하고 페네펠 (Penefel)로 측정했을 때 4 kg/0.5cm² +/-2의 평균값을 갖는 살의 단단함, 최소 11°의 Brix 수준, Vedrantais 품종에서 발견되는 구멍 비율의 과일 직경/크기 및 과일 보존이 + 12 ℃에서 8일 이상인 상업용 식물이다.
멜론 식물 종자를 생산하는 방법도 제공된다. 일 양태에 있어서, 방법은 본 발명에 따른 멜론 식물을 그 자체 또는 또 다른 멜론 식물과 교배시키고, 생성된 종자를 수확하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 상세히 기술된 바와 같이 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성과 관련된 QTL의 유전자 이입에 더하여, 상기 서열은 또한 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 상업적인 멜론 (C.melo)을 얻기 위해 유전 공학에 의해 멜론 식물의 백드라운드로 도입될 수 있다. 특히 기탁물로부터 원하는 표현형을 부여하는 멜론으로부터 유전자 이입된 QTL의 식별 및 클로닝은 당업자에게 일반적인 것이다.
추가적인 일 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기술된 방법 중 하나에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 식물을 제공한다. 이러한 식물은 실제로 본 발명의 제1 측면에 따른 원하는 표현형, 즉, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성을 갖고 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않는 멜론 식물이다.
본 발명의 종자 또는 식물은 상이한 공정, 특히 UV 돌연변이 유발과 같은 기술적 공정 또는 안내된 재조합과 같은 유전 공학에 의해 수득될 수 있고 본질적으로 생물학적 공정에 의해 배타적으로 수득되지 않는다는 점에 유의한다.
이와 같은 일 측면에 따르면, 본 발명은 멜론 식물 또는 종자, 바람직하게는 비-천연 발생 멜론 식물 또는 종자에 관한 것으로, 이들은 이들의 게놈에 돌연변이 식물에 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대한 저항성을 제공하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 이러한 돌연변이는 예를 들어, 대표 샘플이 수탁번호 NCIMB 43317로 NCIMB에 기탁된 식물의 게놈에 존재한다.
바람직하게는, 돌연변이는 멜론 (C. melo) 식물의 상동서열을 대체하는 (i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci), (ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및 (iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)의 통합이다. 더 나아가 바람직하게는, 돌연변이는 (i) 대표 샘플이 수탁번호 NCIMB 43317로 NCIMB에 기탁된 식물의 게놈에 있는 LG2의 상동 서열에 의한 멜론 (C.melo) 게놈의 LG2에 있는 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32에 의해 범위가 정해진 서열의 치환, 또는 이의 단편이고, (ii) 대표 샘플이 기탁 번호 NCIMB 43317로 NCIMB에 기탁된 식물의 게놈에 있는 LG5의 상동 서열에 의한 멜론 게놈의 LG5에 있는 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58에 의해 범위가 정해진 서열의 치환, 또는 이의 단편이고, (iii) 대표 샘플이 기탁 번호 NCIMB 43317로 NCIMB에 기탁된 식물의 게놈에 있는 LG2의 상동 서열에 의한 멜론 게놈의 LG2에 있는 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461에 의해 범위가 정해진 서열의 치환, 또는 이의 단편, (iv) 대표 샘플이 기탁 번호 NCIMB 43317로 NCIMB에 기탁된 식물의 게놈에 존재하는 LG5 에 있는 상동 서열에 의한 멜론 게놈의 LG5 상의 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3에 의해 범위가 정해진 서열의 치환, 또는 이의 단편, 및 (v) 서열 또는 이의 단편이 조합될 때 스캡병, 진딧물 및 PM에 대한 저항성을 부여하는 vat 유전자 유사체이다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 식물에 스캡병, 진딧물 및 PM에 대한 저항성을 제공하는, 이의 게놈에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 멜론 식물 또는 종자를 수득하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 실시예 6에 예시되어 있으며 다음을 포함할 수 있다:
a) 변형될 멜론 식물의 M0 종자를 돌연변이 유발제 (Mutagenic agent)로 처리하여 M1 종자를 얻는 단계;
b) 이렇게 얻어진 M1 종자로부터 식물을 생육하여 M1 식물을 얻는 단계;
c) M1 식물의 자가 수정에 의해 M2 종자를 생산하는 단계; 및
d) 임의로 단계 b) 및 c)를 n회 반복하여 M2+n 종자를 얻는 단계.
M2+n 종자는 식물로 자라며 스캡병, 진딧물 및 PM 감염에 노출된다. 살아남은 식물 또는 스캡병, 진딧물 및 PM 감염의 경미한 증상이 있는 식물은 스캡병, 진딧물 및 PM 감염에 대한 저항성을 위해 계속 선택하면서 한 세대 이상 추가로 증식된다. 이 방법에서 a) 단계의 M1 종자는 EMS 돌연변이 유발과 같은 화학적 돌연변이유발을 통해 얻을 수 있다. 기타 화학적 돌연변이 유발 물질에는 디에틸 설페이트 (Diethyl sufatedes, des), 에틸렌이민 (Ethyleneimine, ei), 프로판 설톤, N-메틸-N-니트로소우레아 (Propane sultone, N-methyl-N-nitrosourethane, mnu), N-니트로소-N-메틸우레아 (N-nitroso-N-methylurea, NMU), N-에틸-N-니트로소우레아(N-ethyl-N-nitrosourea, enu) 및 아지드화나트륨 (Sodium azide)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 돌연변이는 예를 들어 엑스레이, 고속 중성자, UV 방사선으로부터 선택되는 조사에 의해 유도된다.
본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 돌연변이는 유전 공학을 통해 유도된다. 이러한 돌연변이는 또한 스캡병, 진딧물 및 PM 저항성을 부여하는 서열의 통합 뿐만 아니라, 스캡병, 진딧물 및 PM 저항성을 부여하는 대체 서열에 의한 상주 서열 (Residing sequences)의 대체를 포함한다.
사용할 수 있는 유전 공학 수단에는 유전적 변이를 통해 식물에 새로운 특성을 창출하기 위해 개발 및/또는 사용되는 다양한 기술로서, 표적 돌연변이 유발, 새로운 유전자의 표적 도입 또는 유전자 침묵 (RdDM)이 목적인 신규 육종 기술(New Breeding Techniques)라고 하는 모든 기술의 사용이 포함된다. 이러한 새로운 육종 기술의 예는 징크 핑거 뉴클레아제 (Zinc finger nuclease, ZFN) 기술 (ZFN-1, ZFN-2 및 ZFN-3, 미국 특허 번호 9,145,565 참조, 그 전문이 참조로 포함됨)의 사용, ODM(Oligonucleotide Directed Mutagenesis), Cisgenesis 및 intragenesis, RNA 의존성 DNA 메틸화(RdDM, 반드시 뉴클레오티드 서열을 변경하지는 않지만 서열의 생물학적 활성을 변경할 수 있음), 접목 (Grafting, GM 대목에), 역 육종 (Reverse breeding), 농업 침윤(agro-infiltration "sensu stricto", 농업 접종 (agro-inoculation), 플로랄 딥 (floral dip)), 35 전사 활성화제-유사 작용제 뉴클레아제(35 Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs, U.S. Pat. Nos. 8,586,363 및 9,181,535 참조), CRISPR/CAS 시스템 (미국 Pat. Nos. 8,697,359; 8,771,945; 8,795,965; 8,865,406; 8,871,445; 8,889,356; 8,895,308; 8,906,616; 8,9939; 8,939; 8,932,814; 이들은 모두 참조에 의해 본 명세서에 통합됨), 조작된 메가뉴클레아제 재설계된 귀환 엔도뉴클레아제, DNA 가이드 게놈 편집(Gao et al., Nature Biotechnology (2016), doi: 10.1038/nbt.3547, 전체 내용이 참조로 포함됨), 및 합성 5 유전체학을 통해 촉진되는 표적 서열 변경이다. 신규 육종 기술의 또 다른 방향인 오늘날의 표적 게놈 편집의 주요 부분은 수정이 의도된 게놈의 선택된 위치에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 유도하는 응용이다. DSB의 직접 복구를 통해 표적 게놈 편집이 가능하다. 이러한 응용 프로그램은 유전자의 정확한 삽입 (예를 들어, cisgenes, intragenes 또는 transgenes)뿐만 아니라 돌연변이(예를 들어, 표적 돌연변이 또는 정확한 고유 유전자 편집)를 생성하는 데 활용될 수 있다. 돌연변이로 이어지는 응용은 종종 SDN1, SDN2 및 SDN3과 같은 SDN (Site-Directed Nuclease) 기술로 식별된다. SDN1의 경우 결과는 표적화된 비특이적 유전적 결실 돌연변이이다: DNA DSB의 위치는 정확하게 선택되지만 숙주 세포에 의한 DNA 복구는 무작위적이며 작은 뉴클레오티드 삭제, 추가 또는 치환을 초래한다. SDN2의 경우 SDN을 사용하여 대상 DSB를 생성하고 DNA 복구 템플릿(1개 또는 몇 개의 뉴클레오티드 변경을 제외하고 대상 DSB DNA 시퀀스와 동일한 짧은 DNA 시퀀스)을 사용하여 DSB를 복구한다: 이는 원하는 관심 유전자에서 표적화되고 미리 결정된 점 돌연변이를 초래한다. SDN3에 있어서, SDN은 새로운 DNA 서열(예를 들어, 유전자)을 포함하는 DNA 복구 템플릿과 함께 사용된다. 이 기술의 결과는 해당 DNA 서열을 식물 게놈에 통합하는 것이다. SDN3의 사용을 설명하는 가장 유력한 응용 프로그램은 선택된 게놈 위치에서 Cisgenic, Intragenic 또는 Tansgenic 발현 카세트를 삽입하는 것이다. 이러한 각 기술에 대한 완전한 설명은 2011년 유럽연합 집행위원회 (European Commission)의 유망한 기술 연구를 위한 공동 연구 센터 (JRC) 연구소에서 작성한 "새로운 식물 육종 기술 - 최신 기술 및 상업 개발 전망"이라는 제목의 보고서에서 찾을 수 있으며, 전체 내용이 참조로 포함된다.
본 발명은 또한 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 대해 저항성이 있고 임의로 Zym 유전자에 연결된 임의의 괴사성 표현형을 갖지 않는 멜론 식물을 검출 및/또는 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci)의 존재를 검출,
(ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
(iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)의 검출, 및
(iv) 선택적으로 Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형의 부재를 검출.
바람직하게는, QTL은 LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한다. 일 양태에 있어서, QTL은 LG2에 있고 다음 마커 중 임의의 하나를 증폭함으로써 식별될 수 있다: Cm_MU45136_209, LG2-M4 및 Cm_MU45398_32; 또는 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커.
바람직하게는, QTL은 LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여한다. 일 양태에 있어서, QTL은 LG5에 있고, 다음 마커 중 임의의 하나를 증폭함으로써 식별될 수 있다: LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322 및 Cm_MU44050_58; 또는 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커.
바람직하게, QTL은 LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461에 의해 구분되는 염색체 영역 내에 위치하는 PM에 저항성을 부여한다. 일 양태에 있어서, QTL은 LG2에 있고, 다음 마커 중 임의의 하나를 증폭함으로써 식별될 수 있다: CMBR120, LG2-M1 및 Cm_MU47536_461; 또는 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커.
바람직하게, QTL은 LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한다. 일 양태에 있어서, QTL은 LG5에 있고, 다음 마커 중 하나를 증폭하여 식별할 수 있다: Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M3; 또는 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커.
바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명에 따른 식물은 LG2에 있는 Zym 유전자를 동종접합성으로 포함하지 않는다. 그러나 본 발명의 식물은 포티바이러스 (Potyviruse), 특히, ZYMV에 대한 저항성을 제공하는 유전자를 이형접합성으로 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법 또는 프로세스는 Zym 유전자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실험 부분, 특히 실시예 5에서 자세히 설명된 바와 같이, 저항성을 제공하는 Zym 유전자의 존재는 SNP 마커 LG2-M2 (서열번호 50), Cm-MU47380_465 (MU47380_465라고도 함, 서열번호 54) 및/또는 LG2-M3(서열번호 58)에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, LG2에 있는 ZYMV에 대한 내성을 부여하는 QTL 또는 유전자는 마커 LG2-M2 및 LG2-M3로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한다. 일 양태에 있어서, QTL은 LG2에 있고, 다음 마커 중 임의의 하나를 증폭함으로써 식별할 수 있다: LG2-M2, Cm-MU47380_465 및 LG2-M3; 또는 마커 LG2-M2 및 마커 LG2-M3으로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커. 본 발명에 있어서, 식물은 다음 대립형질 중 적어도 하나를 포함하는 경우 선택된다: LG2-M2의 대립유전자 C, MU47380_465의 대립유전자 G 또는 LG2-M3의 대립유전자 A. 이러한 대립유전자는 실제로 QTL 또는 유전자가 포티바이러스 (Potyviruses)에 대한 저항성을 부여하지 않음을 나타내고, 따라서 이러한 대립 유전자 중 하나 이상의 검출은 Zym 유전자가 동형접합적으로 존재하지 않음을 나타내고, 따라서 Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형이 없음을 보장한다.
ZYMV에 대한 저항성과 관련된 마커 및 대립유전자는 표 D에 나타낸 바와 같다. 마커 서열을 증폭시키고 SNP의 상이한 대립유전자 사이의 구별을 위해 사용될 수 있는 잠재적인 프라이머는 표 G에 보고되어 있다.
일 양태에 있어서, 식물은 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같은 대립유전자 조합 I) 내지 IX) 중 어느 하나이고, 선발하고자 하는 식물의 유전물질 시료에서 검출된다. 바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같이 대립유전자의 조합이 대립유전자의 조합 IX)이면 식물이 선택되고, 선발하고자 하는 식물의 유전물질 시료에서 검출된다.
바람직하게는, 본 발명의 제1 측면에서 정의된 바와 같은 대립유전자의 조합 I) 내지 IX)에 더하여, Zym 유전자의 부재를 나타내는 대립유전자 중 하나가 검출되면 식물이 검출된다.
일 양태에 있어서, 검출 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG5-M1, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, LG2-M1, Cm_MU47536_461, Cm_MU45437_855 및/또는 LG5-M3는 예를 들어, 각각의 마커에 대해 내성 대립유전자 증폭에 사용될 수 있는 하나의 정방향 프라이머, 감수성 대립유전자 증폭에 사용될 수 있는 하나의 정방향 프라이머 및 하나의 공통 역방향 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 특히, 각각의 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머는 본 발명의 제1 측면에 기재된 바와 같은 서열을 가질 수 있고 표 G에 상세히 설명되어 있다. 상기 개시된 Zym 유전자에 연결된 마커에도 동일하게 적용되며; 잠재적인 프라이머는 표 G에 개시되어 있다.
바람직한 일 양태에 있어서, 증폭은 실시예에 기술된 바와 같다. 여전히 바람직한 일 양태에 있어서, 증폭은 연장 (Elongation) 및 어닐링 (Annealing) 단계가 단일 단계로 통합되는 2단계 터치다운 방법을 사용하여 수행된다. 어닐링 단계에 사용되는 온도는 반응의 특이성을 결정하므로 프라이머가 DNA 주형에 어닐링하는 능력이 결정된다. 터치다운 PCR (Touchdown PCR)은 Taq 중합효소 활성화의 첫 번째 단계를 포함하고, 그 다음 높은 어닐링 온도를 포함하고 각 PCR 주기에서 어닐링 온도를 점진적으로 낮추는 터치다운 단계라는 두 번째 단계와 DNA 증폭의 세 번째 단계를 포함한다. 터치다운의 초기 주기에서 더 높은 어닐링 온도는 DNA와 프라이머 사이에 매우 특정한 염기쌍만 발생하도록 하며, 따라서 증폭될 첫 번째 시퀀스는 관심 있는 시퀀스일 가능성이 가장 높다. 어닐링 온도는 서서히 감소시켜 반응 효율을 높인다. 매우 특정한 초기 터치다운 주기 동안 원래 증폭된 영역은 더 증폭되어 낮은 온도에서 발생할 수 있는 모든 비특이적 증폭을 능가한다.
다른 일 양태에 있어서, SNP 마커의 증폭은 KASPar 분석에서 권장되고 실시예(실시예 5 참조)에 설명된 대로, 약 15분 동안 94 ℃에서 첫 번째 변성 단계를 포함하고, 94 ℃에서 약 20초, 이어서 첫 번째 사이클의 경우 65 ℃에서 마지막 사이클의 경우 57 ℃까지 감소하는 온도에서 약 60초의 최소 10 사이클, 94 ℃에서 약 20초에 이어 57 ℃에서 약 60초의 약 35주기로 PCR이 수행된다. 이 프로토콜은 사용된 프라이머 유형에 따라 숙련된 사람이 쉽게 조정할 수 있다.
일 양태에 있어서, 마커 LG5-M2, CMTAN139, CMCTN2, CMBR120 및/또는 Me_VatE의 검출은 예를 들어 각 마커에 대해 하나의 정방향 프라이머 및 하나의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 수행된다. 특히, 각각의 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머는 본 발명의 제1 측면에 기술된 바와 같은 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 잡종 멜론 (C.melo) 식물에 관한 것으로, 본 발명의 제1 측면에 따른 멜론 식물을 교배하여 얻거나, 멜론 식물과 상기 본 발명에 개시된 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 저항성 식물, 예를 들어, 스캡병, 진딧물 및 흰가루 (PM)에 민감한 멜론 식물, 또는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 대해 상이한 수준의 저항성을 갖는 멜론 식물에 관한 것이다.
추가적인 측면에 있어서, 본 발명은 또한 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및/또는 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 대한 저항성을 부여하는 상기 정의된 바와 같은 LG2 및/또는 LG2에 있는 QTL에 연결된 분자 마커를 제공한다.
일 양태에 있어서, LG2에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL에 연결된 분자마커는 하나 이상의 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4 및 Cm_MU45398_32, 모든 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4 및 Cm_MU45398_32, 또는 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4 및 Cm_MU45398_32의 조합 또는 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커이다.
일 양태에 있어서, LG5에 있는 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL에 연결된 분자마커는 하나 이상의 마커 LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, 및 Cm_MU44050_58, 또는 모든 마커 LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322 및 Cm_MU44050_58, 또는 마커 LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322 및 Cm_MU44050_58의 조합, 또는 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내의 다른 마커이다.
일 양태에 있어서, LG2에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL에 연결된 분자마커는 하나 이상의 마커 CMBR120, LG2-M1 및 Cm_MU47536_461 또는 모든 마커 CMBR120, LG2-M1 및 Cm_MU47536_461 또는 마커 CMBR120, LG2-M1 및 Cm_MU47536_461의 조합 또는 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 내의 다른 마커이다.
일 양태에 있어서, LG5에 있는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL에 연결된 분자마커는 하나 이상의 마커 Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M3, 또는 모든 마커 Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M3, 또는 마커 Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139의 조합, 및 LG5-M3, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3로 구분되는 염색체 내의 다른 마커이다.
상기 언급된 바와 같은 마커의 서열은 표 1 및 2 및 실시예에 기재되어 있다.
추가적으로 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및/또는 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 식물을 검출하기 위한 하나 이상의 분자마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, Cm_MU454 LG5-8525, CMTAN139 및 LG5-M3 또는 모든 마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, Cm_MU45437_85,LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M3, 또는 마커 Cm_MU45136_209의 조합, LG2-M4 및 Cm_MU45398_32, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M3의 용도를 제공한다. 상기 용도는 또한 Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형을 나타내지 않는 멜론 식물을 검출하기 위한 하나 이상의 또는 모든 SNP 마커 LG2-M2, Cm-MU47380_ 및 LG2-M3의 용도를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 스캡병, 진딧물 및/또는 흰가루병(PM)에 대한 저항성을 부여하고, LG2 (목록의 1 내지 6번째 SNP) 및 LG5 (목록의 7 내지 14번째 SNP) 상의 QLT와 연관된, Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M3의 마커 목록 중 적어도 하나의, 상기 QTL과 관련된 대체 분자 마커를 확인하기 위한 용도에 관한 것으로, 상기 대체 분자 마커는:
＊ 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32, 또는 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461에 의해 LG2에서 구분된 염색체 영역에 있고,
＊ 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58 또는 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3에 의해 LG5에서 구분된 염색체 영역에 있으며,
＊ 본 발명의 14개 마커, 즉, Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139의 위치로부터 2메가베이스 단위 미만이다.
대안적인 분자 마커는 바람직하게는 0.05 이하, 바람직하게는 0.01 미만의 p-값으로 상기 QTL(들)과 결합된다. QTL은 기탁된 종자 NCIMB 43317에서 찾을 수 있다.
본 발명은 또한 이형접합 (Heterozygously) 또는 동형접합 (Homozygously)으로 존재할 때 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 대한 저항성을 부여하는 QTL과 관련된 분자 마커를 확인하는 방법에 관한 것으로 다음 단계를 포함한다:
- 염색체 영역에서 분자 마커 식별 단계:
＊ LG2에서 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32에 의해, 또는 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461에 의해 구분되고,
＊ LG5에서 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58에 의해, 또는 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3에 의해 구분되거나,
＊ 본 발명의 15개 SNP 마커, 즉 Cm_MU45136_209, LG2-M4, Cm_MU45398_32, CMBR120, LG2-M1, Cm_MU47536_461, LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, Cm_MU44050_58, Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및 LG5-M39의 위치로부터 2메가베이스 단위 미만이고, 및
- 상기 분자 마커가 상기 저항성을 나타내는 식물로부터 발생된 분리 집단에서 스캡병, 진딧물 및/또는 흰가루병(PM)에 대한 저항성과 연관되거나 연관되는지를 결정하는 단계.
개체군은 바람직하게는 기탁된 종자 NCIMB 43317로부터 성장한 식물 또는 본 발명에 기재된 바와 같은 스캡병, 진딧물 및/또는 흰가루병(PM)에 대한 저항성을 나타내는 이의 자손으로부터 발생된다.
본 발명에 따른 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성을 부여하는 LG2 및 LG5에 있는 QTL은 MTYVVC721(NCIMB 43317)에 존재하는 QTL이다.
유전적 연관성 (Genetic association) 또는 연결 (Linkage)은 위에서 정의한 바와 같다; 바람직하게는 연관성 및 연결은 바람직하게는 0.05 미만, 가장 바람직하게는 0.01 미만 또는 그 미만의 p-값을 갖는다.
분자마커와 저항성 표현형은 바람직하게는 감수분열의 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상에서 함께 유전된다.
추가적인 일 측면에 있어서, 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 묘목 (Plantlet)의 생산 방법으로서, 다음을 포함한다:
i. 본 발명에 따른 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 멜론 미세-묘목 (Micro-plantlet)을 생산하기 위해 멜론 식물의 분리된 세포 또는 조직을 체외에서 배양하는 단계, 및
ii. 선택적으로 멜론 미세-묘목을 생체내 배양 단계에 추가 적용하여 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 멜론 (C.melo) 식물로 성장시키는 단계.
미세 묘목을 생산하기 위해 사용되는 단리된 세포 또는 조직은 번식될 본 발명의 멜론 부모 식물로부터 무균 조건 하에 얻은 외식편 (Explant)이다. 외식편은 예를 들어 자엽 (Cotyledon), 하배축 (Hypocotyl), 줄기 조직 (Stem tissue), 잎 (Leaf), 배아 (Embryo), 분열조직 (Meristem), 마디싹 (Node bud), 새싹 정단 (Shoot apice) 또는 원형질체 (Protoplast)를 포함하거나 이로 구성된다. 외식편은 미세 증식을 위해 배양 배지에 놓기 전에 표면 멸균될 수 있다.
식물 미세 번식 (Micropropagation)에 적합하게 사용될 수 있는 조건 및 배양 배지는 식물 재배 분야의 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, "Plant Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories, eds."에 기재되어 있다.
미세번식에는 일반적으로 다음이 포함된다:
i. 엽맥의 새싹 (Axillary shoot) 생산: 엽맥의 새싹 증식은 바람직하게는 캘러스 (Callus) 형성이 최소인 새싹을 생성하기 위해 새싹 배양 배지에 사이토키닌을 첨가함으로써 유도되고;
ii. 부정지 (Adventitious shoot) 생산: 배지에 옥신 (Auxin)을 첨가하면 토양으로 옮길 수 있는 묘목을 생산하기 위해 뿌리 형성을 유도한다. 또는 뿌리 형성을 토양으로 직접 유도할 수 있다.
묘목은 실험실 조건에서 토양으로 배양한 다음 자연 기후에 점진적으로 적응하여 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성인 멜론 식물로 발달함으로써 생체내 배양 단계를 더 거칠 수 있다.
본 발명의 저항성 식물은 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 의해 유발되는 손상을 제한하는 본 발명의 저항성 식물의 저항력을 고려하였을때, 진딧물, 클라도스포리움 (Cladosporium), 포도스파에라 크산티이 (Podosphaera xanthii) 및/또는 골로비노마이세스 시코라세아룸 (Golovinomyces cichoracearum)에 의해 감염되거나 감염될 가능성이 있는 환경에서 유리하게 성장하며; 이러한 조건에서, 감수성 식물보다 더 시장성이 있는 멜론을 생산한다. 따라서 본 발명은 또한, 식물에 스캡병, 진딧물 및 흰가루병(PM)에 대한 저항성을 부여하고, 본 발명에 따른 LG2 및/또는 LG5에 있는 QTL 또는 서열을 포함하는, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성인 상기 정의된 멜론 식물을 상기 환경에서 성장시키는 단계를 포함하는, 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)이 만연한 환경에서, 멜론 식물의 수확량을 개선하거나 수확 가능한 멜론 식물 또는 과실의 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 방법은 상기 식물에 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 대한 저항성을 부여하는 관심 서열을 포함하고, 바람직하게는, Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 없는 멜론 식물을 선별하는 제1 단계를 포함한다. 이 방법은 또한 멜론 밭, 터널 또는 온실의 생산성을 증가시키는 방법 또는 멜론 생산에서 화학 물질 또는 살균제 적용의 강도 또는 횟수를 줄이는 방법으로 정의될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 멜론 식물을 성장시키는 것을 포함하는 스캡병, 진딧물 및 PM이 만연한 또는 감염된 상태에서 멜론 생산의 손실을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 저항성 식물은 또한 스캡병 및 PM에 원인이 되는 병원균 및 진딧물의 성장을 제한할 수 있어, 추가 식물의 감염 및 병원균 및 진딧물의 번식을 제한할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 밭, 터널 또는 온실 또는 임의의 다른 유형의 재배지 (Plantation)를 스캡병, 진딧물 및 흰가루병의 감염으로부터 보호하거나 적어도 감염 수준을 제한하거나 스캡병의 확산을 제한하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 바람직하게는 본 발명의 저항성 또는 관용성 식물, 즉 LG2 및/또는 LG5에 있는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 대한 저항성을 부여하는 서열을 포함하되, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형이 없는 식물을 성장시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 밭, 터널 또는 온실, 또는 다른 재배지에서 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 의한 침입을 방제하기 위한, 본 발명에 따른 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 멜론 식물의 용도에 관한 것이다.
QTL의 모든 바람직한 특징은 본 발명의 다른 측면과 관련하여 정의된 바와 같고, 즉 MTYVVC721(NCIMB 수탁 번호 43317)의 종자에 존재하는 것이 바람직하며, 본 발명에 따라 정의된 마커에 의해 식별이 가능하다.
또한 본 발명은 다음을 포함하는 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 의해 감염된 환경에서 멜론 식물의 수확량을 개선하는 방법에 관한 것이다:
a. 스캡병에 저항성인 멜론 식물, 이의 게놈에 (i) 클라도스포리움에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 QTL을 포함하는 진딧물 및 흰가루병을 확인하되, 상기 적어도 하나의 QTL은 연결 그룹 2 (LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (LG5) 상에 존재하는 단계.
b. 감염된 환경에서 저항성 멜론 식물을 성장시키는 단계.
이 방법에 의해, 멜론 식물이 증가하면 수확량이 증가하고, 특히 더 시장성 있는 멜론이 수확될 수 있거나, 더 많은 상업용 멜론이 생산되거나, 더 많은 종자가 얻어진다.
여전히 추가적인 일 측면에 있어서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 멜론의 제조방법에 관한 것이다:
a) 전술한 바와 같이, 본 발명의 멜론 식물을 성장시키는 단계;
b) 상기 식물이 열매를 맺도록 허용하는 단계; 및
c) 바람직하게는 성숙기에 및/또는 성숙 전에 상기 식물의 열매를 수확하는 단계.
멜론 식물에 관한 모든 바람직한 일 양태는 본 발명의 이전 측면과 관련하여 이미 개시되어 있다.
방법은 유리하게는 상기 멜론을 가공 식품으로 가공하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명 전반에 걸쳐, "포함하는"이라는 용어는 구체적으로 언급된 모든 특징 뿐만 아니라 선택적, 추가적, 불특정 특징을 포함하는 것으로 해석해야 한다. 본 발명에 있어서 "포함하는"이라는 용어의 사용은 또한 구체적으로 언급된 특징 이외의 어떠한 특징도 존재하지 않는 (즉, "구성되는") 구현예를 개시한다.
종자기탁 (Seed deposit)
본 발명에 따른 멜론 식물의 대표적인 종자 샘플 (즉, MTYVVC721 식물의 종자)는 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 인정에 관한 부다페스트 조약("부다페스트 조약")과 National Collection of Industrial의 요구 사항을 만족시키기 위해, 식품 및 해양 박테리아(NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, United Kingdom, 2018년 12월 13일, 수탁 번호 43317로 HM-Clause, S.A., Rue Louis Saillant, Z.I. La Motte, BP83, 26802 Portes-les-Valence cedex, France로부터 기탁되었다.
기탁된 MTYVVC721 종자는 HM-Clause, S.A., Rue Louis Saillant, Z.I. La Motte, BP83, 26802 Portes-les-Valence cedex, 프랑스에 의해서 유지된다.
실시예
다음 실험의 목적은, 분자 마커에 기인하여, 육종 계통 및 상업적 잡종에 유용하고, 두 개의 야생형 자원으로부터 연결그룹 5 (하나의 스캡 저항 QTL 및 하나의 PM/vat 저항 QTL)에 대한 두개의 저항 QTL 및 또한 두개의 야생형 자원으로부터 연결그룹 2 (야생형 자원으로부터의 하나의 PM 저항성 QTL 및 Charentais 계통에서 확인된, 스캡병에 저항성있는 QTL)에 대한 두 개의 저항 QTL, 따라서 2개의 연결그룹에 총 4개의 저항성 QTL을 축적하는 새로운 질병 저항성 패키지를 얻는 것이다.
마커의 도움으로, 일부 주기 동안 많은 수의 식물 (24개에서 100개 이상)을 가지고, PM 인공 테스트, 많은 주기의 자가 교배 및 역교배 (8번 육종 주기)를 포함한 테스트로, 본 발명자들은 야생형 자원 게놈으로부터 2개의 작은 염색체 영역을 유전자이입하고 과일의 모양 및 과피 색상과 관련된 연관 드래그(linkage drag)의 발생을 제한하는 데 성공하였다.
엘리트 육종 계통 (Elite breeding line)에 스캡 저항성을 도입하기 위해 발명가들은 야생 재래종을 사용했으며 이 재래종과 관련된 모든 바람직하지 않은 특성을 폐기해야했다. 이 멜론은 실제로 과육색이 옅고 구멍이 큰 바람직하지 않은 모양 (도 1D 참조)을 가지고 있다. 브릭스 수준도 다소 낮고 완숙 시 10-11°B 정도이고, 과육은 전환기 (Climacteric crisis) 위기 이후 빠르게 매우 부드러워진다. 그럼에도 불구하고 발명가들은 Charentais 엘리트 계통의 내부 품질, 저장 수명 잠재력, 과일 모양 및 모양을 복구할 수 있었다.
또한, 2개의 연결 그룹 (LG) 캐리어 (LG2 및 LG5)에서 2개의 식별된 QTL에 연결된 플랭킹 마커 (Flanking markers) 및 비보유 LG에 대한 무작위 마커의 사용에 더하여 역교배된 식물에 대한 인공 병리학 테스트를 사용하여, Charentais 배경의 복구가 가능해졌다.
각각의 역교배 또는 자가 번식 주기에 대해 발명가는 이러한 다양한 도구와 바람직하지 않은 것 (너무 길쭉한 모양, 부드럽고 창백한 과피, 성숙기에 주황색이 되는 회색/녹색 껍질)을 폐기하기 위한 과일 평가를 사용하여 100 내지 300개의 식물을 관리하였으며, 가장 바람직한 Charentais 엘리트 계통 특성을 가진 식물을 유지하였다.
플랭킹 마커 (Flanking marker) 및 클라도스포리움 (Cladosporium) 테스트로 스크리닝된 많은 수의 식물 덕분에 마커 분석이 가능해졌으며, 발명자들은 PM 및 스캡 저항성과 관련된 당업계에 개시된 괴사 증상뿐만 아니라 이들 멜론 접근으로부터의 바람직하지 않은 특성(공동 크기, 과육 단단함, 과육 색상??)을 피하면서 야생 자원 (Accession)으로부터 작은 게놈 단편을 유전자 이입 시켰다.
1. 재료 및 방법
1.1. 클라도스포리움 테스트 (또는 스캡병 테스트).
시험에 사용된 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum) 균주는 -80 ℃에서 보존되었다. 접종물은 접종 전 14일 동안 진균을 배양하여 준비한다.
테스트된 각 계통 또는 유전자형에 대해 20개의 서로 다른 종자/식물뿐만 아니라 2개의 감수성 컨트롤과 2개의 저항성 컨트롤이 테스트된다.
테스트는 성장의 1옆 단계 (즉, 파종 후 약 10 내지 14일)에 있는 식물에서 수행된다. 접종을 위해 분생포자를 물에 현탁시키고 여과하여 ml당 104 내지 105개의 분생포자의 농도에 도달한다. 접종은 시험할 식물의 잎에 접종물을 분무하여 수행한다. 그런 다음 식물을 첫날 동안 포화 습도 조건 하에서 14시간의 일광과 함께 18 ℃ 밤/22 ℃ 낮에 해당하는 조건에서 배양한다.
스캡 테스트 결과는 접종 7일 후 판독(1차 판독)하고, 1차 판독 후 5일 후에 2차 판독을 실시하며, 증상에 대해 1 내지 9점 척도로 다음과 같이 점수를 매긴다:
　 저항 점수 (Resistance Score) 증상 설명 (Symptom description)
감수성
(Susceptible, S)		 1 식물의 죽음
감수성
(Susceptible, S)		 3 식물의 잎 부분(잎, 자엽, 잎자루)에 영향을 미치는 괴사 병변(반점보다 큼)
중간
(Intermediate, IR)		 5 떡잎과 잎자루에서 시작하여 정단에 괴사가 적음
저항성
(Resistant, R)		 7 정점에 약간의 괴사 반점
저항성
(Resistant, R)		 9 무증상
식물 집단의 질병 지수 (Disease Index, DI)는 다음과 같이 개별 식물의 저항성 점수를 기준으로 계산된다:
DI=[(저항성 점수가 1인 식물의 0x nb) + (저항성 점수가 3인 식물의 3x Nb) + (저항성 점수가 5인 식물의 5x Nb) + (저항성 점수가 7인 식물의 7x Nb) + (저항성 점수가 9인 식물의 9x Nb)]/(9 x 총 식물 수).
DI = 1이면 모든 식물이 저항성이다.
DI = 0이면 모든 식물이 취약하다.
1.2. 흰가루병 테스트
초기 테스트 리프 디스크 분석:
포도스파에라 크산티이 (Podosphaera xanthii, Px) 및 골로비노마이세스 시코라세아룸 변종 (Golovinomyces cichoracearum var.)를 포함하여 다양한 균류가 멜론에 흰가루병을 일으킬 수 있다. 이들 균류가 절대 균류인 한, 이들은 각각 감수성인 호박 및 멜론 식물, 즉 각각 Tosca와 Edisto 변종에서 유지되었다.
테스트는 두 번째 잎이 나타나는 1엽 성장기 (즉, 파종 후 약 11 내지 13일)에 있는 식물에서 수행된다.
테스트된 각 계통 또는 유전자형에 대해, 24종의 종자/식물과 8종의 대조군(Vιdrantais, Nantais oblong, PMR 45, WMR 29, Edisto 47, PMR 5, PI 124112, MR1 및 PM1)을 테스트한다.
접종을 위해 멜론의 분생포자를 ml당 104 내지 105개의 분생포자의 농도에 도달하도록 물에 현탁시킨다. 접종은 시험할 식물의 잎에 접종물을 분무하여 수행한다. 두 번째 접종은 첫 번째 접종 3일 후에 잎에 접종물을 분무하여 수행한다.
결과 판독: 판독은 접종 후 10일에 한다. 두 번째 판독은 첫 번째 판독 후 5 내지 6일 후에 한다.
증상의 척도는 다음과 같다 (저항 점수):
점수 잎 표면에서 곰팡이의 균사 성장 및 포자 형성 다른 기관 (Other organs) 　
1 균사체 또는 포자가 있는 잎 표면의 50% 이상 강렬한 포자 형성 감수성있는
3 잎 표면의 25 내지 50% 떡잎과 첫 잎에 여러 개의 포자 형성
5 잎 표면의 5 내지 25% 떡잎과 첫 잎에 약간의 포자 형성 중간 내성
7 최대 5% 떡잎과 첫 번째 잎에 포자 형성의 밝은 반점이 거의 없음 저항성있는
9 무증상 자엽: 증상이나 괴사가 없음 높은 내성
향상된 테스트 분리 리프 테스트:
PM 테스트의 속도를 개선하기 위해 분리된 잎에 적용되는 두 번째 테스트가 설계되었다. 이 테스트를 위해 연구 중인 자손의 15가지 다른 식물이 식물당 2개의 복제 (R1 및 R2)와 식물당 2개의 렉처 (Lecture, Lect 1 및 Lect 2)로 동시에 테스트된다. 대조 식물은 식물당 2개의 리플리케이트 (replicate, R1 및 R2)과 식물당 2개의 렉쳐(lectures,Lect 1 및 Lect 2)로 1개 또는 2개의 식물에서 테스트된다. 분리한 포도스페라 크산티이 (Podosphera xanthii) 종 (Px1, Px2, Px3, Px5 및 Px3-5)의 접종 및 골로이비노마이세스 시코라세아룸 레이스 1 (Goloivinomyces cichoracearum race 1, GC)는 한천 플레이트에 펼쳐진 폴리어 디스크 (Foliar disc)에 각 종족을 살포하여 제조하였다. 각 원판에서의 포자발생은 접종 후 9일과 11일에 각각 Read 1과 Read 2로 2회 실시한다. 점수 척도 (감수성 점수 척도)는 다음과 같다: 0: 포자 형성 없음(저항성), 1: 가벼운 포자 형성 < 잎 디스크의 10% (저항성), 3: 포자 형성 < 잎 디스크의 30% (중간), 5: 포자 형성 < 잎 디스크의 60% (중간), 7: 잎 디스크의 포자 형성 > 60% (감수성), 9: 디스크의 전체 포자 형성 (감수성).
참고로, 이 테스트에 따라 결정된 감수성 점수는 다음 관계에 맞도록 조정되었다:
"감수성 점수 (Susceptibility score)" = 9 - "저항성 점수 (Resistance score)".
1.3. 괴사 테스트 (Necrosis test):
괴사의 발생은 습도가 높은 온실에서 테스트하였다. 식물은 괴사를 나타내는 여부에 따라 분류하였다.
"Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형 (Necrotic phenotype linked to the Zym gene)"은 Pitrat and Lecoq, 1984, Euphytica, 33(1):57-61에 설명된 괴사성 표현형을 의미한다. 보다 구체적으로, 이러한 괴사성 표현형은 잎에서 점차 확장되어 잎 또는 줄기를 완전히 건조시킬 수 있는 잎 표피의 괴사 반점의 출현에 해당한다.
바이러스 격리 및 유지 관리 :
괴사 표현형은 ZYMV (Zucchini Yellow Mosaic Potyvirus) 분리주를 멜론 식물에 접종하여 -80 ℃에서 플라스틱 백에 보관하거나 +4 ℃에서 건조된 감염된 잎에 접종하여 평가하였다. 접종원은 기계적 접종 과정에 따라 멜론 묘목에 번식된다.
기계적 접종 :
접종물은 카보런덤 (Carborundum)(7.5 %) 및 활성탄 (Activated carbon)(10 %)과 함께 0.2 % 소디움 디에틸디티오카바메이트 (Sodium diethyldithiocarbamate)를 함유하는 4 ml의 0.03M Na2HPO4 버퍼로 감염된 잎 1 g을 갈아서 만들었다.
테스트는 24 ℃에서 14시간의 일광 및 20 ℃에서 10시간의 밤의 광주기 아래 성장 챔버 (Growth chamber)에서 수행되었다.
증상 평가 :
접종 후 약 10 내지 14일 후 감수성 대조군이 증상을 보일 때 평가를 실시한다.
하나의 '괴사 (Necrotic)' 제어 (Fn 유전자 보유); 하나의 '모자이크 (Mosaic)' 컨트롤 (유전자를 보유하지 않음)과 저항성 컨트롤이 테스트에 포함되어 테스트를 검증하고 바이러스 독성을 확인한다. 평가는 서수 척도 (Ordinal scale)에 따라 잎으로 실시하였다: 1: 식물 사멸, 완전한 식물 시들음; 3: 명백한 정맥 제거; 5: 약한 모자이크; 7: 어린 잎에 밝은 백화 반점; 9: 전혀 증상 없음.
두 번째 평가는 며칠 후에 증상의 변화를 확인하기 위해 실시할 수 있다.
1.4. 멜론 자원 및 계통 (Melon accession and lines)
Charentais 엘리트 계통 C (도 1B)는 멜론 종인 Cucumis melo L. subsp에 속한다. 이 엘리트 계열은 P. xanthii 종족 Px-1, Px-2, Px-3, Px-5 및 Px3-5에 취약하며 짙은 오렌지색과 성숙기에 단단한 과육, 짙은 녹색 봉합선, 노랗게 변하는 부드러운 껍질, 좋은 저장 수명 및 높은 당도 (15 내지 16° Brix)를 가지고 있다.
Charentais 엘리트 계통 A (도 1A)는 멜론 종인 Cucumis melo L. subsp에 속에 속한다. 이 엘리트 계통은 C. cucumerinum에 감염되기 쉽고 흰가루병에 내성이 있으며 성숙기에 오렌지색의 단단한 과육, 짙은 녹색 봉합선, 황변이 거의 없는 약간 그물 모양의 껍질, 좋은 저장 수명 및 높은 당도 (15 내지 16° Brix)를 가지고 있다.
Charentais 잡종 B는 멜론 종인 Cucumis melo L. subsp에 속한다. 이 잡종은 높은 내부 품질 (높은 Brix (15 내지 16°)의 멋진 주황색 살색, 조밀한 그물, 조기 및 우수한 저장 수명을 제공한다.
멜론 자원 (accession) PM1 (도 1E)은 모모르디카 종인 Cucumis melo sp.에 속한다. 이 자원 (accession)은 P. xanthii 종인 Px-1, Px-2, Px-3, Px-5 및 Px3-5에 내성이 있고 성숙기에 과육이 창백하고 부드러우며, 큰 구멍, 성숙기에 높은 황변/주황색 껍질, 낮은 당도 (10°Brix)를 가지고 있다.
멜론 자원 SC1 (도 1D)은 멜론 종인 Cucumis melo L. subsp에 속한다. 이 재래종은 C.cucumerinum에 내성이 있으며 성숙기에 연한 오렌지색의 부드러운 과육, 큰 구멍, 늑골 모양, 높은 껍질 황변 및 낮은 당도 (10° Brix)를 가지고 있다.
Charentais 엘리트 계통 F (도 1C)는 멜론 종인 Cucumis melo L. subsp에 속한다. 이 엘리트 종은 SCAB 및 PM에 취약하다. 자그마한 선으로 둥글고 멋진 짙은 녹색 봉합선으로 그물이 잘 잡혀 있으며 내부 품질은 중간, 오렌지색, 중간 정도의 단단함, 평균 BRIX 12 내지 14°C이며 황변 껍질이 있는 조기 성숙 계통으로 분류된다.
1.5. DNA 추출 및 유전자형 분석 프로토콜
DNA 정제
제조업체의 지침에 따라 NucleoMag® 96 식물 키트 (Macherey Nagel)를 사용하여 첫 번째 어린 잎 조직에서 게놈 DNA 자동 분리를 수행하였다.
SSR 유전자형 분석 (Genotyping)은 숙련된 독자에게 잘 알려진 방법에 따라 수행되었다. 적절한 프라이머는 하기 표 E에 개시되어 있다.
SNP 유전자형 (Genotyping)은 특히 KASPar 분석 (KBioscience Competitive Allele-Specific Polymerase 연쇄 반응 분석)에 의한 대립유전자 결정의 잘 알려진 방법에 따라 수행되었다. KBioscience의 이 SNP 유전형 검사는 분리 단계 없이 SNP를 검출하기 위한 경쟁적 대립유전자 특이적 PCR (대립유전자당 하나의 프라이머) 및 FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)를 기반으로 한다. KASPar 믹스는 각 SNP에 대해 2개의 경쟁적인 대립유전자 특이적 정방향 프라이머와 1개의 공통 역방향 프라이머를 포함하여 준비된다. KASP 분석 믹스는 표적으로 삼을 SNP에 따라 다르다. KASP Assay 믹스는 테스트할 DNA 샘플 및 범용 FRET 카세트, ROX?? 패시브 참조 염료, taq 중합효소, 유리 뉴클레오티드 및 MgCl2가 포함된 KASP Master mix®와 최적화된 완충 용액에 혼합된다.
PCR 주기는 다음과 같다:
1단계: 변성: 94 ℃에서 15분
2단계: 94 ℃에서 20초, 65-57 ℃에서 60°초의 10주기(-0.8 ℃주기)
3단계: 94 ℃에서 20초, 57 ℃에서 60°초의 35주기
4단계: 15 ℃
대립유전자 형광은 Pherastar Plate Reader에서 검출되었으며 FAM/VIC 대립유전자로의 해석은 미리 정의된 클러스터 할당 매개변수를 사용하여 KlusterCaller 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
2. Charentais 멜론에서 PM1 기탁으로부터 흰가루병 저항성의 마커 지원 유전자
다양한 품종의 P. xanthii에 대해 높은 수준의 저항성을 갖는 멜론 계통을 개발하기 위해 QTL을 사용하여 육종 계획을 수립하였다. 멜론 자원 PM1 (도 1E)에서 QTL을 도입하여 이러한 멜론 계통의 유전적 부동 (genetic drift)을 피하기 위한 노력의 일환으로, 분자 마커는 저항성 QTL을 유전자 이입하고 흰가루병(PM) 저항성을 제공하는 QTL과 관련이 있는 것으로 알려진 바람직하지 않은 농경학적 특성 (특히 성숙기에 창백하고 부드러운 살, 큰 구멍, 성숙기에 높은 황변/주황색 껍질 및 낮은 수준의 설탕 (10°Brix))과의 연결을 끊기 위해 사용되었다.
Charentais 엘리트 계통 C (도 1B)는 Cucumis melo sp.인 멜론 자원 PM1과 교배되었다. 내성이 있는 것으로 알려진 모모르디카 식물이지만 바람직하지 않은 농업적 특성을 가지고 있다. 생성된 F1 종자를 발아시키고, 발아된 종자로부터 식물을 성장시키고, 생성된 식물을 자화시켜 추가 선택 및 육종을 위한 F2 종자/식물을 생산하였다. 300개의 F2 식물이 국소 분리주 Px3-5를 사용하여 PM 잎 디스크 분석에 제출되었다. 저항성 식물 중에서 F2 식물을 선택하기 위해 약 50개의 마커 미세부수체 (Microsatellites, SSR) 세트가 사용되었다. 이러한 마커는 문헌에서 Cucumis melo sp. 모모르디카종의 흰가루병 저항성 QTL을 포함하는 것으로 알려진 LG2 및 LG5를 중심으로 한다. 동형 접합 단계에서 흰가루병의 저항성과 관련이 있는 것으로 의심되는 LG2 및 LG5에 있는 QTL을 포함하는 F2 식물을 선택하였다. F2 식물 300개 중 6개 F2 식물을 선택하고 Charentais 엘리트 계통 C와 역교배하여 BC1 종자/식물을 얻었다. 이 이형접합 수준에서는 PM 압력이 수행되지 않는다. BC1 식물의 표현형 평가만 수행되었다. BC1 식물의 열매는 내부 및 외부에서 관찰되었다. 열매가 둥글거나 너무 길지 않고 수피색이 뚜렷하며 그물이 가능한 한 규칙적으로 규칙적으로 형성된 식물체로서 단단하고 색색이 달며 당도가 높고 유리질이 아닌 열매로 12 ℃에서 5일, 개봉 후 실온에서 2일 저장 가능하게 유지된다.
대부분의 다음 선택 단계에서 동일한 접근 방식이 채택되었으며, 여기서 식물은 주로 농경학적 특징에 따라 선택되고 괴사 요인을 보이는 식물은 제거된다.
또한, 약 50개의 미소부수체 (Microsatellite, SSR)를 사용한 유전형 분석을 통해 이러한 BC1에서 반복되는 게놈의 %와 이입된 단편의 크기를 계산할 수 있는 유전형 분석이 수행되었다. 더 작은 이입 단편, 투명한 껍질 및 좋은 짙은 녹색 드로잉 (Drawing), 짙은 오렌지색 과육, 단단하고 달콤하며 가능한 약간 길쭉한 모양을 갖는 BC1 식물의 한 집단을 선택하였다. 그러한 개체군의 BC1 식물은 F2BC1 종자/식물을 생산하기 위해 자가수분 (Selfed) 되었다. 236개의 F2BC1 식물이 지역 분리 Px 3-5로 PM 테스트에 제출되었다. 그런 다음 동형접합 또는 이형접합 단계에서 LG2 및 LG5의 PM1에서 더 짧은 QTL/유전자이입을 포함하는 식물을 선택하기 위해 67개의 저항성 식물을 SSR로 스크리닝하였다. 236개의 F2BC1 식물이 지역 분리 Px 3-5로 PM 테스트에 제출되었다. 그런 다음 동형접합 또는 이형접합 단계에서 LG2 및 LG5의 PM1에서 더 짧은 QTL/유전자이입을 포함하는 식물을 선택하기 위해 67개의 저항성 식물을 SSR로 스크리닝하였다. 236개의 F2BC1 식물 중에서 5개의 F2BC1 식물을 선택하고 F3BC1의 종자/식물체를 생산하기 위해 자가수분하거나 Charentais 엘리트 계통 C와 역교배하여 BC2 종자/식물체를 얻었다. F3BC1 자손은 선택한 식물의 광범위한 스펙트럼을 검증하기 위해 리프 디스크 분석에 의해 PM 개별 종족 Px 1/2/3/5/3-5에 제출된다. 테스트된 모든 식물은 이 모든 종족에 대해 우수한 수준의 저항성을 보였다.
백칠십 (170) BC2 식물은 동일한 SSR로 스크리닝되어 캐리어 연결 그룹(LG)에 PM1의 더 짧은 단편을 유지하고 비캐리어 연결 그룹에 더 높은 반복 게놈을 유지하였다. F2BC2의 종자/식물을 생산하기 위해 170개의 BC2 식물 중에서 15개의 BC2 식물을 선택하고 자가수분하였다. F2BC2 식물을 자가수분하여 F3BC2 종자/식물을 생산하고 Charentais 엘리트 계통 C와 역교배하여 BC3 종자/식물을 얻었다. BC3 식물은 F3BC3 종자/식물을 생산하기 위해 자가수분된 F2BC3 종자/식물을 생산하기 위해 자가수분하였다. F3BC3 식물도 자가수분하여 F4BC3 종자/식물을 얻었다. 33개의 F4BC3 자손을 개별 종족 Px 1/2/3/5/3-5로 인공 PM 잎 디스크 분석 후 각 캐리어 LG (LG2용 CMAG36, NR39 및 CMBR120, LG5용 CNTAAN128, NR2 및 LG5-M2)에서 3개의 SSR로 분석하였다. 이러한 분석은 PM1의 저항성 QTL이 실제로 LG2 및 LG5에 있으며 본질적으로 표현형 선택에 기반한 육종 계획에 의해 고정되었음을 입증하였다. F4BC3의 식물을 선택하고 F선 (도 1C)과 교배하여 BC4 종자/식물을 생산하였다. 이러한 BC4 식물은 LG2 및 LG5에서 PM에 대한 내성의 QTL에 대한 공여체 계통으로 사용될 수 있는 F5 식물을 생산하기 위해 4번 자가수분하였다. 그러나 이 단계에서 LG2의 괴사 인자와의 연관성은 여전히 존재하여 물방울과 접촉한 식물의 괴사에 의한 과민 반응을 일으켰다.
3. Charentais 멜론에서 SC1 랜드레이스로부터 스캡 저항성의 마커 보조 유전자
C.cucumerinum에 대한 저항성이 높은 멜론 계통을 개발하기 위해 야생 종에 존재하는 QTL을 사용하여 육종 계획을 수립하였다. 멜론 자원 SC1 (도 1D)로부터 QTL을 도입된 야생 멜론 계통의 유전적 부동 (Genetic drift)을 피하기 위한 노력으로, 분자 마커는 저항성 QTL을 유전자 이입하고 저항성과 관련된 바람직하지 않은 농경학적 특성 (성숙기에 특히 옅은 오렌지색과 부드러운 과육, 큰 구멍, 늑골 모양, 성숙기에 높은 황변 껍질, 낮은 당도 (10°Brix))과의 관련성을 끊기 위해 사용하였다.
Charentais 엘리트 계통 A (도 1A)는 멜론 자원 SC1과 교배되었다. 생성된 F1 종자를 발아시키고, 발아된 종자로부터 식물을 성장시키고, 생성된 식물을 Charentais 엘리트 계통 A와 역교배하여 추가 선택 및 육종을 위한 BC1 종자/식물을 생산하였다. 96개의 BC1 식물이 Scab 테스트에 제출되었다 (예를 들어, 1.1 참조). 저항성 식물 중에서, 게놈 사이에 퍼져 있고 두 소스로부터 게놈 서열을 구별할 수 있는 36개의 분자 마커 세트는 가장 높은 엘리트 게놈 비율, 즉 SC1에서 유전자 이입된 최소 게놈 서열을 가진 BC1 식물을 선택하는데 사용되었다. 선별된 12개의 BC1 식물 중에서 가장 좋은 3개는 과일 평가를 기반으로 선택되었으며 자체적으로 BC1l1 종자/식물을 생산하였다. 24개의 BC1l1 식물이 스캡 테스트에 제출되었으며, BC1 식물 및 과일의 표현형 평가와 관련하여 얻은 데이터를 통해 최상의 BC1 식물 2 내지 3개를 선택하고 BC2 자손을 따를 수 있었다. 따라서, 최상의 2 내지 3개의 BC1 식물체를 Charentais 엘리트 계통 A와 역교배하여 BC2 종자/식물체를 생산하였다. 96개의 BC2 식물을 스캡 테스트에 제출하였다. 저항성 식물 중에서 엘리트 게놈 비율이 가장 높은 BC2 식물을 선택하기 위해 동일한 36개의 분자 마커 세트가 사용되었다. 선택된 BC2 식물은 BC211 종자/식물을 생산하기 위해 자생되었다. 본 발명자들은 추가 단계를 위해 선택될 식물의 농경학적 특징, 특히 과실 형태, 과육 색상 및 견고성, 구멍의 크기 및 성숙기에 수피 색깔에 중요한 선택 압력이 가해지면서 하나의 추가 역교배 공정을 추구하였다. 또한 3번째 역교배의 경우 스캡 저항성의 다양화를 촉진하는 동시에 조기성, 망상성 및 육질의 내부 품질을 가져오기 위해 대체 교배종 계통을 역교배(Recurrent parent)로 테스트하였다. 스캡 저항성 및 농경학적 특징에 대한 선택 압력을 유지하면서 2회의 추가적인 자가교배를 수행하였다. 실시예 2에서 선택된 바와 같이 흰가루병 저항성을 제공하는 PM1로부터 유전자 이입된 QTL을 함유하는 물질과 조합되도록 하나의 특정 계통을 유지하였다.
4. Charentais 멜론에서 PM1 기탁에 의한 흰가루병 저항성 및 SC1 기탁에 의한 스캡 저항성의 조합
PM1 자원 육종 방식 (실시예 2 참조)에서 나온 한 계통과 SC1 육종 방식에서 나온 한 계통 (실시예 3 참조) 사이의 교잡에서 F2 식물이 생성되었다. 400개의 F2 식물을 스캡 테스트에 제출한 다음 LG5의 마커로 분석하여 본질적으로 LG5에서 발견되는 것으로 추정되는 과일 품질 저하의 원인이 되는 서열과의 연결을 끊을 가능성이 있는 잠재적인 재조합 이벤트를 찾았다. 9개의 F2 식물은 잠재적인 재조합 이벤트 및 스캡 테스트에서의 이들의 행동에 기초하여 유지되었다. 스캡 테스트를 통해 200개의 F3 식물/자손을 제출하고, 식물들 중 약 50 %인, 저항성으로 확인된 식물에서 LG5 및 LG2에 대한 마커를 사용하여 F3 자손에 대한 선택을 하였다. 자손 당 13 내지 16개의 F3 식물을 유지하였다. 각 과 (Family)에서 외부 및 내부 과일 품질, 각 F3 식물의 괴사 거동 및 온실에서의 PM 수준을 평가하였다. 유지된 F3 식물의 F4 자손은 종 대 종 PM 테스트 및 ZYMV 테스트에 의해 테스트되었다. 본 발명자들이 얻은 결과는 F3 PM 저항성 식물의 괴사 반응이 ZYMV 유전자좌와 밀접하게 연관되어 있음을 보여주었다. 괴사가 덜한 F3 식물은 ZYMV에 민감하거나 분리되어 있다. 반대로, 모든 ZYMV 저항성 식물은 실제로 괴사한다.
따라서 선별 계획은 각각 ZYMV (자손 1607/003) 및 분리 (자손 1607/007)에 민감한 2개의 특정 F4 자손에서 실행하였다. PM 테스트는 동일한 괴사 패턴, 즉 괴사 패턴이 없는 두 번째 것 (표 A 참조)에서 약간 더 높은 수준을 나타내었다. 570번 F5 자손 (F4 1607/007에서 발급)을 스캡 저항성에 대한 추가 테스트를 하기위해 선택하였다. 구체적으로, 570번으로 번호가 매겨진 F5 자손의 20개 식물 (F4 1607/003에서 유래)을 스캡 저항성에 대해 테스트하였으며, 2개의 저항성 컨트롤과 2개의 감수성 컨트롤도 테스트하였다.
결과는 아래 표 B에 보고되어 있으며 스캡 테스트에서 이러한 식물에 대한 매우 낮은 질병 지수를 보여준다.
MTYVVC721로 명명된 이 F5 자손의 종자는 PM 및 스캡에 저항성이 있는 자가 수분에 의해 획득되었으며 2018년 12월 13일 수탁 번호 NCIMB 43317로 NCIMB에 기탁되었다. 이들 식물 (도 1F의 예시된 식물 참조)은 상업적인 멜론 계통 (도 1A, 1B 및 1C의 예시된 식물 참조)과 본질적으로 동일한 표현형 특징을 갖는다.
표 A: PM 분리 잎 테스트 결과 - 감수성 점수.
코드 (CODE) GC Px 1 Px 2 Px 3 Px5 Px3-5
Lect1
(R1/
R2)		 Lect2
(R1/
R2)		 Lect1
(R1
/R2)		 Lect2
(R1/
R2)		 Lect1
(R1/
R2)		 Lect2
(R1/
R2)		 Lect1
(R1/
R2)		 Lect2
(R1/
R2)		 Lect1
(R1/
R2		 Lect2
(R1/
R2)		 Lect1
(R1/
R2)		 Lect2
(R1/
R2)
1607/003
15개 식물의 평균 (mean of 15 plants)		 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0.07 0/0.07 0/
0.27		 0.2/
2.2
1607/00715개 식물의 평균 (mean of 15 plants) 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0.14
PM1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
베드란타이스(Vιdrantais) 3/1 7/7 5/5 7/7 7/7 7/9 5/7 7/9 5/3 5/3 5/3 5/7
낭트 오블롱 (Nantais Oblong) 0/0 0/0 5/7 7/7 7/5 7/7 5/7 7/9 5/5 7/5 5/1 7/5
PMR45 0/1 0/1 0/0 0/0 5/5 7/9 5/7 7/ND 5/5 5/5 1/0 5/0
PMR45 0/0 1/0 0/0 0/0 5/5 5/5 5/ND 7/ND 5/3 7/3 3/0 3/1
Edisto 47 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 5/5 5/7 3/0 5/3
Edisto 47 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 5/5 5/5 3/0 5/0
PMR5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1/1 0/0 0/0 0/0 1/0 5/0
PMR5 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 1/3 0/0 0/0 0/0 1/0 3/0
PM 분리 잎 테스트로 얻은 감수성 점수 결과 (실시예 1.2 참조), 두 자손 1607/003 및 16/007의 15개 식물뿐만 아니라 저항성 대조군, 즉 PM1 (이입 파트너), PMR5 (2개 식물, Podosphaera xanthii의 일부 균주에 대한 대조군) 및 감수성 대조군, 즉 베드란타이스 (Vιdrantais), 낭트 오블롱 (Nantais oblong)에 적용되었다. 적어도 하나의 균주에 저항성이 있는 것으로 알려진 식물도 테스트하였다 (Edisto 47, PMR45). ND = 결정 불가능.
표 B: 스캡 테스트 결과 - 질병 점수 및 질병 지수
식물 저항점수 9
(nb of plants)		 저항점수 7
(nb of plants)		 저항점수 5
(nb of plants)		 저항점수 3
(nb of plants)		 저항점수 1
(nb of plants)		 질병지수
F5 progeny 570 of 1607/007 15 　 5 　 　 0.89
Susceptible control 　 　 　 1 1 0,17
Resistant control 2 　 　 　 　 1,00
질병 지수는 다음과 같이 계산된다:
DI = [(저항성 점수가 1인 식물의 0x Nb) + (저항성 점수가 3인 식물의 3x Nb) + (저항성 점수가 5인 식물의 5x Nb) + (저항성 점수가 7인 식물의 7x Nb) + (9 x 저항성 점수가 9인 식물의 Nb)]/(9 x 총 식물 수).
이러한 결과는 NCIMB에 기탁된 종자가 흰가루병 (PM)에 대한 저항성과 스캡에 대한 저항성이 있음을 확인시켜준다. Vat 유전자에 의해 제공되는 진딧물에 대한 저항성도 확인하였다. 이 식물은 또한 상업적으로 허용되는 과일 품질과 측면을 가지고 있으며(도 1F 참조) Zym 유전자와 연결된 괴사 표현형이 없다.
5. 특정 마커의 개발
게놈 스캔 접근법을 사용하여 게놈을 따라 고르게 분포되고 12개의 멜론 염색체 (12개의 연결 그룹에 해당)를 잘 커버하는 4500개 이상의 SNP 마커에 대하여 계통 패널상에서 유전자형을 조사하였다. 이 패널에는 ZYMV 저항 계통, 흰가루병 저항 계통, 스캡 저항 계통 및 감수성 계통, 원래의 스캡 및 흰가루병 저항 도너 (Donor)와 함께, 즉, PM1과 SC1, 육종 과정의 기원에 감수성이 있는 계통, 즉, 엘리트 계통 A 및 C, 그리고 과일 품질에 영향을 미치지 않으면서 SCAB 및 PM QTL을 피라미네이트하는 최종 육종 계통 (MTYVVC721 및 이의 자손)이 포함되어 있다. 데이터 분석을 통해 LG2 및 LG5의 스캡 저항성 QTL과 LG2 및 LG5의 PM 저항성 QTL에 대한 특정 마커 일배체형 (Haplotype)을 식별할 수 있다.
LG2 및 LG5에 있는 스캡 저항 QTL 및 LG2 및 LG5에 있는 흰가루병 저항 QTL에 대해 플랭킹 마커 및 이러한 플랭킹 마커에 의해 구분된 영역 내의 추가 마커가 표 C에 보고되어 있다. 또한 멜론 (DHL92) 버전 3.6.1 (Garcia-Mas et al, 2012)의 게놈 어셈블리 (Genome assembly)에서 다음 http://cucurbitgenomics.org/organism/18 주소에서 입수 가능한 마커들의 위치도 표 C에 보고하였다. Diaz et al, 2011에 개시된 일부 마커에 대한 상기 마커의 위치는 또한 도 2 (LG2) 및 도 3 (LG5)에 기재되어 있다.
또한, LG2에 있는 흰가루병 (PM) 저항성 QTL 부근에 존재하는 것으로 알려진 ZYMV 유전자를 추적함으로써, 본 발명자들은 이 유전자가 기탁된 종자에 상응하는 게놈을 갖는 식물에 더 이상 존재하지 않음을 확인하였다. 따라서 그들은 분자 수준에서 표현형 수준에서 관찰된 재조합 사건, 즉 재조합에 의한 ZYMV 유전자의 손실이 괴사 증상이 없는 식물을 발생시킨다는 것을 확인하였다. ZYMV 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되는 마커뿐만 아니라 멜론 게놈의 동일한 버전에서 물리적 위치도 표 C에 제공된다. SSR 및 SNP 유전자형 분석은 실시예 1에 자세히 설명된 대로 수행하였다.
표 D는, 표 C의 SNP 마커에 대한, 저항성 QTL의 존재와 관련된 대립유전자, 유익한 다형성을 둘러싼 서열 (다형성 뉴클레오티드 및 3' 및 5' 플랭킹 서열)과 같은 다형성을 기술한다.
표 E는, 표 C의 SSR 마커에 대한, 저항성 QTL (PM 또는 스캡 저항성 QTL)의 존재를 나타내는 증폭된 단편의 길이뿐만 아니라 미세부수체 증폭에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머를 보고한다.
표 F는, 표 D와 E의 마커를 위한, 유전자형이 조사된 계통의 패널에서 발견된 대립유전자를 보고한다.
표 G는 본 발명에 개시된 바와 같이 SNP의 대립유전자를 검출하기 위해 본 발명자들에 의해 사용된 프라이머를 기술한다.
표 C : 마커의 리스트
열 (Column)은 마커의 이름, 마커의 유형 (SSR 또는 SNP), 표시된 저항성 유형, 링키지 그룹 및 각 마커 (SNP에 대한 다형성 뉴클레오티드의 위치에 해당함; 미세부수체 (Microsatellite)의 경우 주어진 위치는 증폭에 사용되는 프라이머의 서열과 관련된다)에 대한 이 LG에 있는 멜론 게놈 버전 3.6.1에서의 위치 및 마커가 저항 QTL의 플랭킹 마커인지 여부를 나타낸다.
마커의 이름 SNP 유형
(Type of SNPs)		 저항성 유형(Type of resistance) 연결그룹 (Linkage Group) 위치 (bp) 플랭킹 마커
(Flanking maker)
CMBR120 SSR PM LG2 Around
787 830 		있음 (yes)
LG2-M1 SNP PM LG2 788 941
MU47536_461 SNP PM LG2 843 667 있음 (yes)
LG2-M2 SNP ZYMV LG2 933 153 있음 (yes)
MU47380_465 SNP ZYMV LG2 936 660
LG2-M3 SNP ZYMV LG2 968 880 있음 (yes)
MU45136_209 SNP SCAB LG2 6　454 350 있음 (yes)
LG2-M4 SNP SCAB LG2 7　036 176
MU45398_32 SNP SCAB LG2 7　476 525 있음 (yes)
LG5-M1 SNP SCAB LG5 25 228 049 있음 (yes)
CMCTN2 SSR SCAB LG5 Around
25 298 010
MU46579_322 SNP SCAB LG5 25　388 402
MU44050_58 SNP SCAB LG5 25　424 775 있음 (yes)
MU45437_855 SNP PM LG5 25　257 091 있음 (yes)
LG5-M2 SSR PM LG5 Around
26　038 930
CMTAN139 SSR PM LG5
LG5-M3 SNP PM LG5 26239817 있음 (yes)
표 D: SNP 마커.
이 표는 다형성 뉴클레오티드를 포함하여 상이한 저항성, 마커의 서열에 대해 확인된 상이한 SNP 마커를 보고한다. "Polym R/S"라는 제목의 열은 다형성 뉴클레오티드의 두 대립유전자를 나타내며, 저항에 연결된 대립유전자("저항성 대립유전자")가 먼저 언급되고 두 번째 것은 감수성을 나타내는 대립유전자이다.
마커 (Marker) QTL 서열 (Sequence) Polym
R/S		 서열번호
LG2-M1 PM TTAATGGAATGACACAGATCAATGTTCTCATCTGTTGCCCTCATGGCTTCTGATACTCGTTCTGATAT[T/C]CCGGGGCCCAAATGAGGATTGTATGTTCTAACCCATTCTTCGTGATTGATTTCGAATTC T/C 서열번호 26
MU47536_461 PM GGTAACATGTGGGAGATTGATGTACAAGATTTTGATAATGTGATTGATAC[A/T]AACATCAAAGGCTCAGCTAATATTCTTCGTCACTTCATCCCTCTTATGAT T/A 서열번호 30
LG2-M2 ZYMV GAATTCGAGGGAGTTGTGAGCTCATGAGACGAAGCGTTTGATTCATGTGAC[A/C]CCGGGTTTCCAAGAGTAACAATTTCTCGAGCTTTAGATGAWWARAWTCTCACAATGAAAWAGAAGATTTGGTAAAATATATCCAAGAATTGGAAYTKGGATTGTCGATTGTCCATTGGAATGTTTTTGGDRGGARRGGGKGKTGRATTAMW A/C 서열번호 50
MU47380_465 ZYMV TTATCCTCCATATTTAATGAATTAGTCGATCGAGTGAGCATGGATGGGAA[A/G]TTTCTACAGGAATCACTATCCAGAACTAAAAAAGGAGATGCTTTTACGTC A/G 서열번호 54
LG2-M3 ZYMV TYYGACAARTTTTGTTCTCTACATTAGATTTCCCTTCATGATGTTGTAGT[A/G]ACATGGAGGGTTGTTTCCTTTAAAAATGTACAGGTTGGTAACATTAAGGC G/A 서열번호 58
MU45136_209 스캡 (SCAB) TGCTTGCTGCCGGCCTCCCTGGCGGCCGCGTGAATTTTATTTAACGGCCCAATCGGCCCACACATTGCATCAAAAAAAAATATTTCCCAAGTGTTTCTTAGCATATATTTGTTGTGTTCAAAGAAACCAAAATATCAAAAGAGGTGCGCTATTATTTTTTTATCATCGGTTCTTGTCTCAAGAAGGAAAAAAAAATGTCACTCTTTCT[T/C]AAGTCTTGCAGCTCCAAGAAATTTGTTGGTGATCATTCATTA C/T 서열번호 1
LG2-M4 스캡 (SCAB) CATGGAGTGCCGCATACGGTTGATACTTTGGTTTTCACACCATTTGTAAGTTTGAACTTT[A/G]CAAACACTAAAGAACTCGTTATCATACGTGCTTGCATTACCTTTCTTGTGATAAATGTGT A/G 서열번호 5
MU45398_32 스캡 (SCAB) AGAATAACAAAACAGGGTTGTTCCGCTTTAC[T/C]TCAAATAGCAACAAAGAAGAAGAAGAAGAAGACGATTAGAAGAGAAAGATGGAAGCGAAGGTCAGCAAATTCTTAGGCTCCGTTTCCAATTTCTTCTCCGGCGGCGATCACATACCATGGTGCGATCGCGACGTCGTTGCCGGTTGCGAAAGAGAGGCTGCTGAGGCCGAAAAGAGCTCATCTGGTGAGCTTTTGAAGGAAAGCATTATGCGTTTATCT C/T 서열번호 9
LG5-M1 스캡 (SCAB) TCCATCCATCTTTTCCAGTTTTGTGGAGTTCATTA[T/C]GATACAATTTCGCCGATCTACTTTTCTTTACAT C/T 서열번호 13
MU46579_322 스캡 (SCAB) GAAGACTCCGGTAGCTAAAGAAGGCGGTTCCGATCCTCACTGGAACTATC[T/C]CATGAAGTTCACAGTCGATGAGGCTGCCTTGCAGAACAATCGACTCAATC C/T 서열번호 16
MU44050_58 스캡 (SCAB) GAACCCAAAAAGCTTGGGGGTTTCGTAGCTTCGTAGCGTTGCTTTCATGGCGAGCTT[T/C]GTTTCTTTGAGCTTCTCCGTTCCACAGCTCACTCTCAAGGAAATCCCACCATGGAAATTGGCTAAAGCTACGGTAGTTTCAAGGCGAGCTGGAACAGCTTTGAAGCTTGTGCTACCCTGTTATTCAAAGAAATCCATATCTATGAATTGGGAAAACTTTCGATCTGTACGGTTAACTTCAAGACCTTTTTGGG C/T 서열번호 20
MU45437_855 PM CTGAATCATACCAATTGTAATTAAAGTTTCTGTGTATTAAATCTGAACTC[A/G]AGGCTTTTCCTCTATATGTGCCTTCGAAACGTGCTCTGTAACTTGATTTT A/G 서열번호 34
LG5-M3 PM ATTTCAAGAGAGTTCTTTCTAACGGGCATTGAGATTCCMGAATGGTTCAG[T/C]TATAAGTCTACTACAAATTCTGTGACTGCTAGCATTCGTCACTATCCAGA T/C 서열번호 42
표 E: SSR 마커
이 표는 내성 QTL의 존재를 나타내는 증폭된 단편의 길이뿐만 아니라 미세부수체 영역을 증폭하는 데 사용할 수 있는 두 개의 프라이머의 서열, 상이한 내성에 대해 확인된 상이한 SSR 마커를 보고한다.
마커
(Marker)		 특성
(Trait)		 정방향 프라이머 역방향 프라이머 길이
CMBR120 PM CTggCCCCCTCCTAAACTAA
(서열번호 24)		 CAAAAAgCATCAAAATggTTg (서열번호 25) 165 bp
CMCTN2 SCAB CTGAAAGCAGTTTGTGTCGA(서열번호 14) AAAGAAGGAAGAGGCTGAGA
(서열번호 15)		 195 bp
LG5-M2 PM Cactttctaaatagtttggaaaagag(서열번호 38) Gagaatgtctctttatctac
(서열번호 v39)		 178 bp
CMTAN139 PM CGTAGAAGACACACATAATG(서열번호 40) GAACTAGAACCACAAATCAC
(서열번호 41)		 134 bp
표 F: 확인된 마커에 대한 모 계통 및 기탁된 식물의 유전형 분석
특허 마커 코드
(Patent marker code)		 특성 PM1 계통 A
(Line A)		 SC1 MTYVVC721 베드란타이스
(Vedrantais)
CMBR120 PM 165/165 172/172 163/163 165/165 163/163
LG2-M1 PM T/T T/T T/T T/T T/T
MU47536_461 PM T/T T/T T/T T/T T/T
LG2-M2 ZYMV A/A C/C C/C C/C C/C
MU47380_465 ZYMV A/A G/G G/G G/G G/G
LG2-M3 ZYMV G/G A/A A/A A/A A/A
MU45136_209 SCAB T/T C/C T/T T/C T/T
LG2-M4 SCAB G/G A/A G/G A/A G/G
MU45398_32 SCAB T/T C/C T/T C/C T/T
LG5-M1 SCAB T/T T/T C/C C/C T/T
CMCTN2 SCAB 182/182 191/191 195/195 195/195 191/191
MU46579_322 SCAB T/T T/T C/C C/C T/T
MU44050_58 SCAB T/T C/C C/C C/C C/C
MU45437_855 PM A/A G/G A/A A/A G/G
LG5-M2 PM 178/178 172/172 176/176 178/178 172/172
CMTAN139 PM 134/134 138/138 NA 134/134 138/138
LG5-M3 PM T/T C/C C/C T/T T/T
표 G: KASpar 기술 및 상응하는 서열번호를 사용하여 SNP의 대립유전자를 검출하기 위해 발명자가 사용한 프라이머.
마커 특성 정방향 프라이머 / 감수성 대립유전자 정방향 프라이머/저항성 대립유전자 역방향 프라이머
Cm_MU45136_209서열번호1 스캡병 (Scab disease) ACAAATTTCTTGGAGCTGCAAGACTTA
서열번호 2		 CAAATTTCTTGGAGCTGCAAGACTTG
서열번호 3		 TATCATCGGTTCTTGTCTCAAGAAGGAAA
서열번호 4
LG2-M4서열번호 5 스캡병 (Scab disease) TTCACACCATTTGTAAGTTTGAACTTTG
서열번호 6		 GTTTTCACACCATTTGTAAGTTTGAACTTTA
서열번호 7		 GCACGTATGATAACGAGTTCTTTAGTGTT
서열번호 8
Cm_MU45398_32서열번호 9 스캡병 (Scab disease) CAAAACAGGGTTGTTCCGCTTTACT
서열번호 10		 AAAACAGGGTTGTTCCGCTTTACC
서열번호 11		 CGTCTTCTTCTTCTTCTTCTTTGTTGCTA
서열번호 12
Cm_MU46579_322서열번호 16 스캡병 (Scab disease) TCCGATCCTCACTGGAACTATCT
서열번호 17		 CCGATCCTCACTGGAACTATCC
서열번호 18		 CAGCCTCATCGACTGTGAACTTCAT
서열번호 19
Cm_MU44050_58서열번호 20 스캡병 (Scab disease) GCGTTGCTTTCATGGCGAGCTTT
서열번호 21		 CGTTGCTTTCATGGCGAGCTTC
서열번호 22		 CTGTGGAACGGAGAAGCTCAAAGAA
서열번호 23
LG2-M1서열번호 26 PM CCTCATTTGGGCCCCGGG
서열번호 27		 AATCCTCATTTGGGCCCCGGA
서열번호 28		 TCATGGCTTCTGATACTCGTTCTGATAT
서열번호 29
Cm_MU47536_461서열번호 30 PM ATGTACAAGATTTTGATAATGTGATTGATACA
서열번호 31		 ATGTACAAGATTTTGATAATGTGATTGATACT
서열번호 32		 CGAAGAATATTAGCTGAGCCTTTGATGTT
서열번호 33
Cm_MU45437_855서열번호 34 PM AAAGTTTCTGTGTATTAAATCTGAACTCG
서열번호 35		 AATTAAAGTTTCTGTGTATTAAATCTGAACTCA
서열번호 36		 CAGAGCACGTTTCGAAGGCACATAT
서열번호 37
LG5-M3서열번호 42 PM CAGTCACAGAATTTGTAGTAGACTTATAG
서열번호 43		 CAGTCACAGAATTTGTAGTAGACTTATAA
서열번호 44		 AGAGTTCTTTCTAACGGGCATTGAGATT
서열번호 45
LG2-M2서열번호 50 ZYMV ACGAAGCGTTTGATTCATGTGACC
서열번호 51		 GACGAAGCGTTTGATTCATGTGACA
서열번호 52		 CTAAAGCTCGAGAAATTGTTACTCTTGGAA
서열번호 53
MU47380_465서열번호 54 ZYMV CTGGATAGTGATTCCTGTAGAAAC
서열번호 55		 GTTCTGGATAGTGATTCCTGTAGAAAT
서열번호 56		 GAATTAGTCGATCGAGTGAGCATGGAT
서열번호 57
LG2-M3서열번호 58 ZYMV ATTAGATTTCCCTTCATGATGTTGTAGTA
서열번호 59		 AGATTTCCCTTCATGATGTTGTAGTG
서열번호 60		 TGTACATTTTTAAAGGAAACAACCCTCCAT
서열번호 61
6. Ethyl Methane Sulfonate(EMS)에 의한 멜론 종자의 유전자 변형
멜론 식물의 종자는 실온에서 24시간 동안 0.5% (w/v) 또는 0.7% EMS의 통기 용액에 약 2000개의 종자를 침수시켜 EMS로 처리해야 한다.
EMS 투여량 당 대략 1500개의 처리된 종자가 발아되고, 생성된 식물을 바람직하게는 예를 들어 3월부터 9월까지 온실에서 재배하여 종자를 생산한다.
성숙 후, M2 종자를 수확하고 처리당 품종당 하나의 풀에서 대량화한다. 생성된 M2 종자 풀은 개별 M2 종자 및 스캡, 진딧물 및 흰가루병(PM)에 저항성인 식물을 식별하기 위한 출발 물질로 사용된다.
The National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) NCIMB43317 20181213
SEQUENCE LISTING <110> VILMORIN & CIE <120> Melon plants resistant to Scab disease, aphids and powdery mildew <130> B14259WO CS <150> PCT/IB2020/000519 <151> 2020-06-03 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele G = resistant ; allele A = susceptible <400> 1 tgatcaccaa caaatttctt ggagctgcaa gacttragaa agagtgacat ttttttttcc 60 ttcttgagac a 71 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 acaaatttct tggagctgca agactta 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 caaatttctt ggagctgcaa gacttg 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 tatcatcggt tcttgtctca agaaggaaa 29 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele A = resistant ; allele G = susceptible <400> 5 ctttggtttt cacaccattt gtaagtttga actttrcaaa cactaaagaa ctcgttatca 60 tacgtgcttg c 71 <210> 6 <211> 28 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<210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 29 tcatggcttc tgatactcgt tctgatat 28 <210> 30 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele A = resistant ; allele T = susceptible <400> 30 aagtgacgaa gaatattagc tgagcctttg atgttwgtat caatcacatt atcaaaatct 60 tgtacatcaa t 71 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 31 tacatgttct aaaactatta cactaactat gt 32 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 32 tacatgttct aaaactatta cactaactat ga 32 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 33 gcttcttata atcgactcgg aaactacaa 29 <210> 34 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele A = resistant ; allele G = susceptible <400> 34 tgtaattaaa gtttctgtgt attaaatctg aactcraggc ttttcctcta tatgtgcctt 60 cgaaacgtgc t 71 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 35 aaagtttctg 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tagcaacaac aagggacaac aaaatgaaaa tttcagcaca gttatggaat gttgaagaag 720 aaggtgacga gagagatgcc acatcataaa aaattaatat tataatcatt tttgtcacat 780 cagttttctg attacttata tttaacctac acatcatttt gccgttactc aactaacgat 840 cgatatgacc tttaaagctc gatgattaaa atgtttattt tgaactttca gggactatat 900 aaatgtatat atatcaactt caaatcttag cggtcaaaag tgcattttgt tttagtttaa 960 aacaccgaga tgtgacgatt aataatgcct acacactcac gtactcacac atgcagtgag 1020 ttttttatgt tttttttaca cacattagac gcaaattgaa ttcctaattc cattccctaa 1080 gacaagtttc taatgactta tacaattcac ataggcatgc atgcagaaca agcgaaaaac 1140 gacgaattta ccttaagaaa atggcccaac caaccactta cacaatctca ggcataccat 1200 tccccgggat gaaagaattt tgcctgtaat tcattcgatc tcaggcatac aatgcatcga 1260 gaagacgcaa aatgaaagac aaaagtatag aacaacacaa tcctgtactt cattttaaac 1320 gatagttttc aaatttaacg atcgtgtaga tcatgataca cgatctcgag ccttagtggc 1380 accgagatgg cccgagatga aagaattatg tctttatttt attcgatatt aagcatacat 1440 tacttcgaga tgaaagacct ctacctttag ttattcgatc tcgagcctta attgaatcga 1500 gatgacccaa gattgataga tcgcaaagaa gatatatatc gtaagggcat atatgaaatt 1560 tatgaaaata cgatcatgtg tcataaactt ttcttatttt gttatataga ccgtaaatat 1620 tatagatttt ggttacattt gtgtaaatta ctctattttt ttttagtaaa acaaatgaat 1680 taaatttttt aaaaaaaaat tattgagagt tgaagtaatt gggtgttttc taaaagattg 1740 aaataaatac ctttattaac tttgcaaata tattttcaaa gaggctaaca aatcaaatat 1800 attttctaaa aaaatcacat tgcgttgggg ataaggtaag agtaatggaa aaatgaaagg 1860 ttgtgaacaa ttcgtactct tacttatgag atttgacaga acaaatattt ttcaaatact 1920 ctttttacgt tttctttttt aaaattaaat aacaaatact tttccactgc ttttcttttc 1980 ttccattgac tcctcaacta ataattttgg tcttcccatt attatcttct tcttcttcat 2040 ttttctctgc actgtctctt ctccatttca acatcttctt atatcttcat tcaggttaaa 2100 tatttcatcc cttaccattt ttatttacat tttccatctg atcatttcta tacttataaa 2160 ctcgataatt tgtttagact ttctttagat agtttttact tggtgatctg tatgtgttca 2220 ctcctacttt tctgttaggc aaaatcttca aaattattat ggttcattcc tcgtggtttt 2280 ttagctcttc aagtattttt gtaggttttg atccttttca agctcaagaa cagaggataa 2340 taatggacat ccttatttca gtcactgcaa aaattgccga atacactgtt gagcctgttg 2400 gacgccaact tggttatgta tttttcattc gttccaactt tcaaaaactt aagactcaag 2460 tagaaaagct gaagattaca agagagtctg tgcaacacaa gatccatagt gcaagaagaa 2520 atgctgaaga cataaaacct gccgttgagg aatggttgaa aaaggtcgat gactttgtcc 2580 gagaatctga cgagatatta gccaatgaag gtggacatgg tggactctgt tccacctatt 2640 tggtccaacg acacaagtta agtagaaaag caagcaaaat ggtagatgag gttcttgaga 2700 tgaaaaatga gggggaaagt tttgatatgg tatcctataa aagtgttatc ccatcagttg 2760 attgttcact tccaaaagtg cctgactttc ttgactttga gtcaagaaag tcgattatgg 2820 aacaaatcat ggatgcacta tctgatggta atgtccatag gattggagta tatgggatgg 2880 ggggtgttgg caaaacaatg ctagtgaagg atattttaag aaaaattgtg gagagtaaga 2940 agccttttga tgaggtggta acatccacga tcagccaaac accagatttt agaagtatcc 3000 aaggacaact agctgacaag ctaggtttga aattcgaaca agaaacaata gaaggaaggg 3060 ctactattct acgaaagagg ttaaagatgg agagaagtat cctagttgtg ttggatgatg 3120 tttgggagta tattgatttg gaaactatag gaattccaag tgttgaagat catacggggt 3180 gcaagatctt gtttaccact aggattaaac atttgatctc aaatcaaatg tgcgccaata 3240 aaatttttga gataaaagtt ttaggaaaag atgagtcatg gaatttattt aaggcaatgg 3300 caggtgacat tgttgatgca agtgatttga agcctatagc cattcgaatt gtgagagaat 3360 gtgcaggttt gcctattgct attactactg ttgctaaggc attacgaaat aaaccttccg 3420 acatttggaa tgatgcctta gatcagctta aaactgttga tgtgggtatg gcaaacattg 3480 gagaaatgga aaagaaagtg tatttgtcac taaaactgag ttacgattgc ttgggatatg 3540 aagaggtgaa gttattattc ttgttatgca gcatgtttcc agaagacttt agcattgacg 3600 tggaagggtt gcatgtatat gccatgggca tgggattctt acatggtgtt gatactgtgg 3660 taaaaggacg acgtaggata aaaaaattgg ttgatgatct tatatcttct tctttgcttc 3720 aacaatattc tgagtatggg tgcaattatg tgaaaatgca tgatatggtt cgtgatgtag 3780 ccctattaat tgcatctaag aatgaacacg tacgtacatt gagctatgtg aaaagatcga 3840 atgaagaatg ggaagaagag aaactattgg gtaatcatac cgcagtgttc attgatggtt 3900 tacattatcc tctcccgaag ttaacgttac ccaaagttca attattaagg ttagttgcaa 3960 aatattgttg ggaacataat aagcgtgtgt cggtggtaga aacttttttt gaagaaatga 4020 aagagctcaa 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gttgagagca atagtgtacc cattcttaat tccttttcca aactcgagaa 5760 aataagaatt tggtcatgca acaatcttca aaaaatatta tttccttcaa atatgatggg 5820 cattcttaca tgccttaaag tcttagagat cagagattgt gaattgttgg aagggatatt 5880 tgaagtgcaa gagccaatta gtgttgttga gagcaataat ttacccattc ttaattcctt 5940 ttccaaactc gaggaaataa gaattgggtc atgcaacaat cttcaaaaag tattatttcc 6000 tccaaatatg atgggcattc ttacatgcct taaagtctta gagattagac attgtaattt 6060 gttggaaggg atatttgaag tgcaagagcc aattagtatt gttgaagcga gtcctatctt 6120 gctccaaaat ttatcttcgt tgatgttatg taatcttcca aaccttgagt acgtgtggag 6180 caaaaatcct tatgaacttc tgagtttgga aaatataaaa agtttgacca ttgataaatg 6240 tccaagactt agaagagaat actcagtcaa aattctaaag caacttgaag atgtaagcat 6300 agatatcaaa caattgatga aggttattga gaaggaaaag tcagcacatc ataatatgtt 6360 ggaatcaaag caatgggaga cttcatcttc ttctaaggta cgtatatatt ctacaagaaa 6420 acatgtttgt tcaatttaat tttcagaaaa taaattgttt tcaagaatta gttgaacaga 6480 attggttctg ttagttgaac agagttttaa agaaaacaaa ttattatgtt tgttctagaa 6540 acctatggaa attagtgtta ttaggggtta attatttacc tgaattaaaa aagaataagc 6600 aagtaaaccg cttaatttta atatgtttat caatagaaat taggatccgt ttggattgac 6660 ttgaatgata tgttttcctg gaaagaaact catttttgtt tgaactcatt tttatgaaaa 6720 ttggctaaaa tatatttaaa aaattaggtg gctttcaaat attcaatttt ttttttaaaa 6780 taacttattt tttgaattaa acactccaaa atgtaattca aaaacacccc taagttaatt 6840 agatatataa ttaatacata aattaattaa ttttatttag ttgagttaaa ttagttttaa 6900 tgcaaacaat aatatatttt tatagccaat atacaagaat gaaagtaaga aaagaagaca 6960 aaaaaaaatg atatgttaat tagaatttta cataaagaat gatctgatta aaagctaatc 7020 tctatcgata tagtttttta attatattaa atatagtaag tagtccatta taataattga 7080 atttttttgt accaaattaa ttaaactaat tctttttact aattattgaa tatttaagat 7140 atttttggct aattaattaa taatttgtgt gcaaatataa gttattattg catttattta 7200 atagattttg atcatcagga tggggttcta cggctgggag atggttctaa gttgtttcca 7260 aatcttaaaa gtttgaagct atatggtttt gttgattata actcaaccca tttaccaatg 7320 gaaatgttgc aaatcttatt ccaacttgta gtctttgaat tggaaggagc atttcttgaa 7380 gaaattttcc ccagcaacat actgattcca agctatatgg ttttaagaag attagctcta 7440 tctaaactac ccaagcttaa gcatttgtgg agtgaagaat gctcacaaaa caatatcacc 7500 tcagttcttc aacatttgat ttctctaaga atttcagaat gtggaagatt gagtagttta 7560 ctgtcgtcaa tagtgtgttt tacaaacttg aaacatcttc gggtttataa atgtgatgga 7620 ctaacccatt tgctgaatcc ttcggtggct acaacgcttg tgcaacttga gtctttgaca 7680 atagaagaat gcaaaaggat gagtagtgta attgagggag gatcaaccga agaagatgga 7740 aatgatgaaa tggttgtatt caacaaccta caacatttat acatttttaa ttgttccaac 7800 ctaacaagct tttattgtgg gagatgcatt attaaatttc catgtttgag gcaagtagac 7860 atttggaact gttctgaaat gaaggtcttt tcgcttggaa ttgtaagcac acctcgattg 7920 aaatatgaaa atttttcttt aaagaatgat tacgatgatg aacggtgtca tccaaaatat 7980 cccaaagata tgttggtgga agatatgaat gtcatcacca gagaatattg ggaggataat 8040 gttgataccg gaattccaaa tttatttgcc gaacaggttt gtatatttaa ttaccttttc 8100 atatttggta ataattaatt tttattattt gtgtgttaga gtatgaactt taatgaattt 8160 atttaattaa tgcagagttt ggaggaaaac cgatctgaaa attcttcttc ttcgaagaat 8220 aatgttgaga aagaataagg aattatatgg atattgttgt acactactta atatatcatt 8280 tcatccacaa ggaaaaggtc agaatcttga aatcctccat tcttttttat gagagaatat 8340 catccaatgt caaattgaaa agtctcgata gatttgttaa attaactttt gatacaagtc 8400 ataaaatgtt aattagtata ataataatat atctgatccc atcaaattaa ttagaagtaa 8460 cgacaaattt aacttctgta atatcaattc aatttgatgt ctcaatcaac tgcataaaat 8520 ttgatgtcac aaatttaact tctgtaatgt gaatcttttt tttttttccc tttgcacata 8580 aaaccaacaa gttaaaatag atataacaaa gaatttaatt cacatataat aaattcatcc 8640 aatataatgt tctttcacct ttttctctct ttcacaaaac tgtaataata atatctacca 8700 caaaaggtaa accattaata tgattcttca agaaggttgt ttatttggtc aaattttcat 8760 gaaagtatta atacagtgta tgttttgcaa aggaagctgc caaataccta cctcaatcct 8820 agcagatgcg ttctttgcaa gttggctgtc aaagacttga accatatttt cacaacctgt 8880 gccaattcgc aaatagcctc tgggtcaaac tgcacgacaa aattggtgga aactttgata 8940 caaacagtat caaagccctc tgttggtctc ttggctcgct gaaacaatca aacagaaaga 9000 acatcattct ctcgatgtag gtgtggatct tctttagtcc atttgggtgg aaagaaacaa 9060 taggattttc atagacacag aaagaagctt agtcacattt gggaagatat cgaaactttg 9120 attggaccat ggtcgagtag aaacaaaatg ttcaaagact acaatccaac atcaatcttt 9180 aaactttaga gctttgttag attaatgttt gttgtatatg gcttccctgt agccaaagaa 9240 atatacattg taacaatggt ttgatgaaat gataatgaag tggtatggtg tgtttcaatt 9300 gcaaaaaata tgattcttca agaaaggccg agaggataag attgtgatcg tgccatgcgc 9360 ttgggttgtg atttaattac aaatatattc atatagtatt tggagcaaaa cagtcctaat 9420 taattaaata taatgcgtta ttttattttt ctgaataagt taaatttaac cactagaaat 9480 ttttttacta agtgaacatt ttcatagcac tttcataatc cccacttcat taaaatgaat 9540 caataaagtt caaggaaagt gtagaatgat gaatctaaaa gaaacaaaaa acaaggtata 9600 taagtttaaa gcaacggtgg tagcactgta atgatccgag ggagtacaca ttttttcata 9660 aattatttta ttatcatcaa tagaagaatt cgaatttctt ttatctttta attgataata 9720 taatttcata attagctata agtggatttt tcaaatgatt ggatccacat acatatcaac 9780 ttcgatcaaa ttattaaagg tataatttta aatcactaag aagaaaagga ttgatggtgg 9840 gccttatgct attatacact ttgagtaccc tctcggcctc aacaagattc ccaagttcaa 9900 taattgaaac tttgaaaaat gtgtgcaatc acatgtattc aatttctatg tcggtatcac 9960 atattttcat gtttccatac gtttaatttc catataaaag tgaatccata attttattat 10020 attgcgaaaa aatctaccaa acatggaaat tagctatgaa aatattagta atataaataa 10080 tggatatgtt gacttatttg aaaaaaatta aaaaaatatt catttatggg tttaaattta 10140 tttttaaatt ttttgttttt atatattatt ttaaaaatat atattgaaat taatatttta 10200 ttgatattat atcatcaaaa tttttgtaaa attaagatca ttaatataac gccccagacc 10260 caagatttgg aattcggatc cctgacattc ttttgcatcc actgtgatct gataacatca 10320 tctttacttg tcttaaatta ttagactgaa agttctctcc acaaaacaat aggagtcatt 10380 tcaacatact ttgtcctcac tcacagcatc cctatcactc ataattaatg taaaatttta 10440 ttatatttgt aaatatgttt tggtgtactt tgccatatat taaaacatac tactaaacaa 10500 aacgaaatga ttaaaaagga agggaaggta ttaaaaatta taaattttaa gaaaggaaaa 10560 gaagaagaag gaaaaaaaaa aaaaaaagag aatgatgagt gagaggcacc aagtgaggac 10620 atatactact ctttgagtac ataacctaat ggttaagaaa aaaaaaaatc tcatatcaaa 10680 ttcaaagtgc catgctatta ttacttaata ttttatatgg aagttaaata aattgttaga 10740 gagaagtctt gttttctgtc tgtttgttaa ctcatttttg taattaatgt ttaatttgat 10800 cattgtcatt ccaattaatt gtaacataat tttctgccca atttatctct tttgctttcg 10860 tttttgttta gataccctac tcggctactc ctcaactttt cctcatttca ttttcagttg 10920 g 10921 <210> 47 <211> 1467 <212> PRT <213> Cucumis melo <400> 47 Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val 1 5 10 15 Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn 20 25 30 Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg Glu 35 40 45 Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp Ile 50 55 60 Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val Arg 65 70 75 80 Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys 85 90 95 Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys 100 105 110 Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp 115 120 125 Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro 130 135 140 Lys Val Pro Asp Phe Leu Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu 145 150 155 160 Gln Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val 165 170 175 Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu 180 185 190 Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser 195 200 205 Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala 210 215 220 Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ala 225 230 235 240 Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val Val 245 250 255 Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile Pro 260 265 270 Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg Ile 275 280 285 Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Ile Phe Glu Ile 290 295 300 Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met Ala 305 310 315 320 Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg Ile 325 330 335 Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala Lys 340 345 350 Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp Gln 355 360 365 Leu Lys Thr Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu Lys 370 375 380 Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr Glu 385 390 395 400 Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp Phe 405 410 415 Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly Phe 420 425 430 Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys Lys 435 440 445 Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser Glu 450 455 460 Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val Ala 465 470 475 480 Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr Val 485 490 495 Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn His 500 505 510 Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu Thr 515 520 525 Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Val Ala Lys Tyr Cys Trp Glu 530 535 540 His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met Lys 545 550 555 560 Glu Leu Lys Gly Leu Val Val Glu Asn Val Asn Ile Ser Leu Met Gln 565 570 575 Arg Pro Ser Asp Val Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg Leu 580 585 590 Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu Lys 595 600 605 Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ser Glu Ser Asn Ile Thr Gln Ile Pro 610 615 620 Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser Ser 625 630 635 640 Cys Glu Gln Leu Glu Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu Thr 645 650 655 Lys Leu Glu Glu Leu Asp Leu Glu Thr Phe Asp Gly Trp Glu Gly Glu 660 665 670 Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys Cys 675 680 685 Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu Ile 690 695 700 Met Pro Glu Asn Leu Phe Leu Val Gly Lys Leu Lys Leu Gln Lys Phe 705 710 715 720 Asn Ile Cys Ile Gly Cys Glu Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Ala Tyr 725 730 735 Lys Asn Arg Ile Lys Asn Phe Ile Gly Ile Lys Met Glu Ser Gly Arg 740 745 750 Cys Leu Asp Asp Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn Val 755 760 765 Leu Leu Glu Gly Ser Val Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu Val 770 775 780 Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile Val Asn Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Lys Met Ile Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys 805 810 815 Leu Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu 820 825 830 Phe Pro Pro Asn Met Met Asp Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu 835 840 845 Ile Lys Asn Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Gln Glu Pro 850 855 860 Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser 865 870 875 880 Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val 885 890 895 Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu Pro Cys Leu Lys Val Leu 900 905 910 Asp Ile Arg Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu 915 920 925 Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Ser Val Pro Ile Leu Asn Ser Phe 930 935 940 Ser Lys Leu Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys 945 950 955 960 Ile Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val 965 970 975 Leu Glu Ile Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu Gly Ile Phe Glu Val Gln 980 985 990 Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro Ile Leu Asn Ser 995 1000 1005 Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Gly Ser Cys Asn Asn Leu 1010 1015 1020 Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Gly Ile Leu Thr Cys 1025 1030 1035 Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg His Cys Asn Leu Leu Glu Gly Ile 1040 1045 1050 Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Ile Val Glu Ala Ser Pro Ile 1055 1060 1065 Leu Leu Gln Asn Leu Ser Ser Leu Met Leu Cys Asn Leu Pro Asn 1070 1075 1080 Leu Glu Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro Tyr Glu Leu Leu Ser Leu 1085 1090 1095 Glu Asn Ile Lys Ser Leu Thr Ile Asp Lys Cys Pro Arg Leu Arg 1100 1105 1110 Arg Glu Tyr Ser Val Lys Ile Leu Lys Gln Leu Glu Asp Val Ser 1115 1120 1125 Ile Asp Ile Lys Gln Leu Met Lys Val Ile Glu Lys Glu Lys Ser 1130 1135 1140 Ala His His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser Ser 1145 1150 1155 Ser Ser Lys Asp Gly Val Leu Arg Leu Gly Asp Gly Ser Lys Leu 1160 1165 1170 Phe Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gly Phe Val Asp Tyr 1175 1180 1185 Asn Ser Thr His Leu Pro Met Glu Met Leu Gln Ile Leu Phe Gln 1190 1195 1200 Leu Val Val Phe Glu Leu Glu Gly Ala Phe Leu Glu Glu Ile Phe 1205 1210 1215 Pro Ser Asn Ile Leu Ile Pro Ser Tyr Met Val Leu Arg Arg Leu 1220 1225 1230 Ala Leu Ser Lys Leu Pro Lys Leu Lys His Leu Trp Ser Glu Glu 1235 1240 1245 Cys Ser Gln Asn Asn Ile Thr Ser Val Leu Gln His Leu Ile Ser 1250 1255 1260 Leu Arg Ile Ser Glu Cys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 1265 1270 1275 Ile Val Cys Phe Thr Asn Leu Lys His Leu Arg Val Tyr Lys Cys 1280 1285 1290 Asp Gly Leu Thr His Leu Leu Asn Pro Ser Val Ala Thr Thr Leu 1295 1300 1305 Val Gln Leu Glu Ser Leu Thr Ile Glu Glu Cys Lys Arg Met Ser 1310 1315 1320 Ser Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Glu Glu Asp Gly Asn Asp Glu 1325 1330 1335 Met Val Val Phe Asn Asn Leu Gln His Leu Tyr Ile Phe Asn Cys 1340 1345 1350 Ser Asn Leu Thr Ser Phe Tyr Cys Gly Arg Cys Ile Ile Lys Phe 1355 1360 1365 Pro Cys Leu Arg Gln Val Asp Ile Trp Asn Cys Ser Glu Met Lys 1370 1375 1380 Val Phe Ser Leu Gly Ile Val Ser Thr Pro Arg Leu Lys Tyr Glu 1385 1390 1395 Asn Phe Ser Leu Lys Asn Asp Tyr Asp Asp Glu Arg Cys His Pro 1400 1405 1410 Lys Tyr Pro Lys Asp Met Leu Val Glu Asp Met Asn Val Ile Thr 1415 1420 1425 Arg Glu Tyr Trp Glu Asp Asn Val Asp Thr Gly Ile Pro Asn Leu 1430 1435 1440 Phe Ala Glu Gln Ser Leu Glu Glu Asn Arg Ser Glu Asn Ser Ser 1445 1450 1455 Ser Ser Lys Asn Asn Val Glu Lys Glu 1460 1465 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 48 ctccactcag aattggtagg tgcc 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 49 ccttagaaga agatgaagtc tccc 24 <210> 50 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele A = resistant ; allele C = susceptible <400> 50 tgagctcatg agacgaagcg tttgattcat gtgacmccgg gtttccaaga gtaacaattt 60 ctcgagcttt a 71 <210> 51 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 51 gaaggtgacc aagttcatgc tgacgaagcg tttgattcat gtgaca 46 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 52 gaaggtcgga gtcaacggat tacgaagcgt ttgattcatg tgacc 45 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 53 ctaaagctcg agaaattgtt actcttggaa 30 <210> 54 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele A = resistant ; allele G = susceptible <400> 54 aatgaattag tcgatcgagt gagcatggat gggaartttc tacaggaatc actatccaga 60 actaaaaaag g 71 <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 55 gaaggtcgga gtcaacggat tctggatagt gattcctgta gaaac 45 <210> 56 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 56 gaaggtgacc aagttcatgc tgttctggat agtgattcct gtagaaat 48 <210> 57 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 57 gaattagtcg atcgagtgag catggat 27 <210> 58 <211> 71 <212> DNA <213> Cucumis melo <220> <221> POLYMORPHISM <222> (36)..(36) <223> allele G = resistant ; allele A = susceptible <400> 58 tctctacatt agatttccct tcatgatgtt gtagtracat ggagggttgt ttcctttaaa 60 aatgtacagg t 71 <210> 59 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 59 gaaggtgacc aagttcatgc tattagattt cccttcatga tgttgtagta 50 <210> 60 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 60 gaaggtcgga gtcaacggat tagatttccc ttcatgatgt tgtagtg 47 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 61 tgtacatttt taaaggaaac aaccctccat 30

Claims (22)

  1. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물로서,
    - 상기 식물은:
    (i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 양적형질유전자좌 (QTL, Quantitative Trait Loci),
    (ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, 상기 (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및
    (iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Vat gene Analog)를 포함하고, 및
    - 상기 식물은 상업적으로 허용되는 과일의 품질을 가지고 있는 멜론 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물은 Zym 유전자와 연결된 어떠한 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)도 없는 것인, 멜론 식물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 QTL은:
    (i) LG2에 있고, 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL 및
    (ii) LG5에 있고, 마커 LG5-M1 및 마커 Cm_MU44050_58로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL,
    (iii) LG2에 있고, 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461로 구분되는 염색체 영역 내에 위치한 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL, 및
    (iv) LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3으로 구분되는 염색체 영역 내에 위치하는 PM에 대한 저항성을 부여하는 QTL인, 멜론 식물.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 QTL은:
    마커 Cm_MU45136_209, LG2-M4 및/또는 Cm_MU45398_32로 확인되고, 스캡병 LG2에 대한 저항성을 부여하는 QTL;
    LG5에 있고, 마커 LG5-M1, CMCTN2, Cm_MU46579_322, 및/또는 Cm_MU44050_58로 확인되고, 스캡병에 대한 저항성을 부여하는 QTL,
    LG2에 있고, 마커 CMBR120, LG2-M1, 및/또는 Cm_MU47536_461의 검출에 의해 확인되고, PM에 저항성을 부여하는 QTL,
    LG5에 있고, 마커 Cm_MU45437_855, LG5-M2, CMTAN139 및/또는 LG5-M3의 검출에 의해 확인되고, PM에 저항성을 부여하는 QTL, 및
    LG5에 있고, 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체인, 멜론 식물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery mildew)에 저항성이 있는 하나 이상의 QTL은 MTYVVC721 (NCIMB 수탁 번호 43317) 계열 식물의 게놈에 존재하는 것에서 선택되는 것인, 멜론 식물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 계통 MTYVVC721 (NCIMB 수탁 번호 43317) 식물의 자손인 것인, 멜론 식물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캡병은 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum)에 의해 유발된 것인, 멜론 식물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흰가루병은 포도스파에라 크산티이 (Podosphaera xanthii)에 의해 유발된 것인, 멜론 식물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 멜론 식물의 세포.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 멜론 식물로부터 얻은 식물 부분 (Plant Part).
  11. 제10항에 있어서, 상기 식물 부분은 종자 (Seed), 과일 (Fruit), 생식 물질 (Reproductive Material), 뿌리 (Root), 꽃 (Flower), 뿌리줄기 (Rootstock) 또는 접가지 (Scion)인 것인, 식물 부분.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 식물로 성장할 때 발생하는 멜론 식물의 종자 (Seed of C. melo plant).
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 멜론 식물을 저항성 식물과 교배시켜 얻을 수 있는 멜론의 잡종 식물 (Hybrid plant of C. melo).
  14. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo, C. melo) 식물을 검출 및/또는 선별하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 스캡병에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL을 검출하되, 상기 적어도 하나의 QTL은 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있는 단계,
    (ii) PM에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 QTL, 상기 적어도 하나의 QTL은 LG2 및/또는 LG5상에 존재하고, (i)에서의 상기 적어도 하나의 QTL과 상이, 및
    (iii) LG5에서 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체의 존재를 검출하는 단계, 및
    (iV) 선택적으로 Zym 유전자에 연결된 괴사성 표현형 (Necrotic Phenotype)의 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성이 있고, 바람직하게는 Zym 유전자에 연결된 어떠한 괴사성 표현형도 갖지 않는 멜론 식물을 얻기 위한 육종 프로그램의 육종 파트너로서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 멜론 저항성 식물의 용도.
  16. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 감염된 환경에서 수확 가능한 멜론 (Cucumis melo) 식물의 수를 증가시키는 방법으로서,
    상기 방법은,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 스캡병, 진딧물 및 PM에 저항성인 멜론 식물을 환경에서 성장시키는 것을 포함하는 방법.
  17. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)의 감염 및/또는 확산으로부터 밭 (Field)을 보호하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성인 멜론 식물을 상기 환경에서 성장시키는 것을 포함하는 방법.
  18. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 의한 밭의 감염을 조절하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 스캡병, 진딧물 및 흰가루병 (PM)에 저항성이 있는 멜론 (Cucumis melo) 식물의 용도.
  19. 다음을 포함하는 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 감염된 환경에서 멜론 식물의 수확량을 개선하는 방법:
    a. 멜론 식물의 게놈에 (i) 연결 그룹 2 (Linkage Group 2, LG2) 및/또는 연결 그룹 5 (Linkage Group 5, LG5)에 있고, 클라도스포리움 (Cladosporium)에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 QTL, (ii) LG2 및/또는 LG5에 있고, (i)의 하나 또는 그 이상의 QTL과는 상이하며, PM에 저항성이 있는 적어도 하나의 QTL, 및 (iii) LG5에 있는 진딧물 저항성과 관련된 Vat 유전자 유사체 (Analog)를 포함하는 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 멜론 식물을 확인하는 단계, 및
    b. 감염된 환경에서 상기 저항성 멜론 식물을 성장 시키는 단계.
  20. 다음 염색체 영역 중 적어도 하나에 위치하는 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 (C. melo) 식물을 검출하기 위한 하나 이상의 분자 마커 (Molecular markers):
    - 마커 Cm_MU45136_209 및 마커 Cm_MU45398_32에 의해 LG2에서 구분되는 염색체 영역 (Chromosomal region),
    - 마커 LG5-M1 및 Cm_MU44050_58에 의해 LG5에서 구분되는 염색체 영역,
    - 마커 CMBR120 및 마커 Cm_MU47536_461에 의해 LG2에서 구분되는 염색체 영역,
    - 마커 Cm_MU45437_855 및 마커 LG5-M3에 의해 LG5에서 구분되는 염색체 영역, 또는
    - Vat 유전자 유사체.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 멜론 식물 (Melon Plant), 제10항 또는 제11항에 정의된 식물 부분 (Plant Part), 제12항에 정의된 종자 (Seed), 또는 제13항에 정의된 잡종 식물 (Hybrid Plant)을 포함하는 컨테이너 (Container).
  22. 스캡병 (Scab disease), 진딧물 (Aphids) 및 흰가루병 (Powdery Mildew, PM)에 저항성이 있는 멜론 묘목 (Plantlet)의 생산 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
    i. 본 발명에 따른 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성이 있는 멜론 미세-묘목 (Micro-plantlet)을 생산하기 위해 멜론 식물의 분리된 세포 또는 조직을 체외에서 배양하는 단계, 및
    ii. 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 메론 (C.melo) 식물로 성장시키기 위해 선택적으로 멜론 미세-묘목을 생체내 배양 단계에 추가 적용하여 스캡병, 진딧물 및 흰가루병에 저항성인 메론 (C.melo) 식물로 성장시키는 단계.
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