KR102438610B1

KR102438610B1 - 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102438610B1
Application number: KR1020220015580A
Authority: KR
Inventors: 임용표; 최수련; 김승호
Original assignee: 충남대학교 산학협력단
Priority date: 2022-02-07
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2022-08-31

Abstract

본 발명은 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 시들음병에 대한 저항성 또는 감수성을 보이는 무 개체를 정확하게 판별할 수 있으므로, 무 시들음병에 대해 저항성을 가지는 무 개체를 조기에 선별하여 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도{Primer set composition for discriminating Fusarium wilt-resistant or sensitive Raphanus sativus cultivar and uses thereof}

본 발명은 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

배추과 채소인 무(Raphanus sativus L.)는 우리나라 대표 채소 중 하나로, 국내 생산 과채류 중 배추와 더불어 총 생산량의 60% 이상을 차치하고 있는 매우 중요한 작물이다. 최근에 무 연작 재배지에서 각종 병해와 생리적장해 발생이 증가하여 무 재배에 어려움을 겪고 있다. 현재까지 무에 발생하는 병해로 국내에서는 시들음병(Fusarium wilt), 뿌리혹병(cluroot), 검은썩음병(black rot), 노균병(downy mildew), 검은무늬병(black spot), 균검은무늬병(bacterial leaf spot) 등 19종이 보고되었다.

푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 의해 발생하는 시들음병은 예전에 위황병(yellows)로 불렸던 토양전염성 병으로, 수백 종의 작물에 발생하여 세계적으로 큰 피해를 일으키고 있다. 무 시들음병은 F. oxysporum f. sp. raphani에 의해 발생하며, 전세계적으로 발생하여 막대한 피해를 일으키고 있는 무의 주요 병해이다. 무 시들음병은 1934년 미국 캘리포니아주 San Benito에 있는 white Chinese winter radish 채종포에서 처음 보고된 이후, 1946년 위스콘신주 Waukesha의 무 포장에서, 그리고 현재 미국 각지에서 발생하고 있다. 국내에서도 오래 전부터 발생되었을 것으로 생각되며, 1981년 청원군 미농 재배단지에서 처음 보고되었고 계속된 연작으로 인해 시들음병 발생이 점차 증가하고 있는 추세이다.

무 시들음병을 방제하기 위한 방법으로 저항성 품종을 재배하거나 윤작, 건전종자 소독 후 파종, 석회 시용, 질소비료의 과용 금지, 토양 소독 등이 사용되고 있다. 이러한 방법들 중에서 저항성 품종의 재배는 무 시들음병 방제에 있어 가장 환경 친화적인 방법으로 인식되고 있다. 따라서, 시들음병 저항성 무 품종의 개발을 위한 무 시들음병 저항성 유전자 규명과 분자마커 개발에 대한 연구가 필요하다.

한편, 한국등록특허 제1361296호에 '무의 위황병 저항성 연관 마커를 포함하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1733464호에 '십자화과 시들음병 저항성 품종을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 무 시들음병에 대한 저항성과 밀접하게 연관된 무 7번 염색체에 존재하는 Rs382940 및 Rs382200 유전자에 기반한 본 발명의 '시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 무 시들음병 병원균(Fusarium oxysporum f. sp raphani)의 병원형 59A에 대해 저항성을 보이는 YR4 계통과 감수성을 보이는 YR18 계통을 이용하여, 무 7번 염색체 상에 존재하는 무 시들음병 저항성 관련 QTL(FoRsR7.1 ^59A )을 확인한 후, 상기 FoRsR7.1 ^59A QTL 영역에서 무 시들음병 저항성과 밀접하게 연관된 Rs382940 및 Rs382200 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 개발된 프라이머 세트가 무 시들음병에 대한 저항성 또는 감수성 무 개체를 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 시들음병(Fusarium wilt) 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는, 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 무 시들음병에 대한 저항성 또는 감수성을 보이는 무 개체를 정확하게 판별할 수 있으므로, 시들음병에 대해 저항성을 가지는 무 개체를 조기에 선별하여 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 시들음병 병원균(Fusarium oxysporum f. sp raphani)의 병원형 59A가 접종된 무 식물체에서 무 시들음병의 발병도 등급을 보여준다. grade 0: 무증상, grade 1: 지하부는 갈변되나 지상부는 시들지 않고 병징이 없는 것, grade 2: 지하부는 갈변되고 지상부는 생장이 다소 억제되는 것, grade 3: 지하부는 갈변되고 지상부는 생장이 느려지면서 황화하는 것, grade 4: 지하부는 갈병되고 지상의 생장이 완전히 억제된 것, grade 5: 고사.
도 2는 양친 계통인 YR4(저항성) 및 YR18(감수성)과 이들의 F₁ 식물체(저항성)에 무 시들음병 병원균(F. oxysporum f. sp raphani)의 병원형 57A, 59A 및 147A를 각각 접종하거나 HN와 JHW를 혼합하여 접종한 후 표현형을 확인한 결과이다.
도 3은 양친 계통인 YR4(저항성)와 YR18(감수성)의 게놈을 서열을 비교하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 또는 InDel(insertion/deletion)을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 작성된 무의 유전자 지도이다.
도 5는 본 발명의 무 유전자 지도에서 7번 염색체(R7) 및 9번 염색체(R9)에 위치한 무 시들음병 저항성과 관련된 QTL(quantitative trait locus)을 보여준다.
도 6은 양친 계통인 YR4(저항성) 및 YR18(감수성)에서 무 시들음병 저항성 관련 후보 유전자들의 발현 수준을 확인한 PCR 결과이다. DAI: 무 시들음병 병원균의 병원형 59A의 접종 후 일수. R gene: 질병 저항성 관련 후보 유전자, Unknown geme: 기능이 알려지지 않은 후보 유전자.
도 7은 본 발명의 프라이머 세트가 표적으로 하는 Rs382940(A)와 Rs382200(B) 유전자 내 위치와 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과이다. YR4: 무 시들음병 저항성 개체, YR18: 무 시들음병 감수성 개체, F₁: 무 시들음병에 대해 저항성을 보이는 YR4와 YR18의 잡종 1세대.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 시들음병(Fusarium wilt) 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물은 바람직하게는 상기 10개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 10개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 시들음 저항성 또는 감수성 무 개체를 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 20의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 20의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시들음병은 무 시들음병균인 Fusarium oxysporum f. sp raphani에 의해 발병한 것일 수 있고, 바람직하게는 Fusarium oxysporum f. sp raphani의 병원형(pathotype) 59A에 의해 발병한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 프라이머 세트 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 10의 프라이머 세트는 무 시들음병균인 Fusarium oxysporum f. sp raphani의 병원형 59A의 저항성과 관련된 무 7번 염색체 상에 존재하는 FoRsR7.1 ^59A QTL 영역에서, 무 시들음병 저항성과 밀접하게 연관된 Rs382940 유전자(14,336,249~14,338,394 bp)에 특이적인 프라이머 세트이고, 서열번호 11 내지 20의 프라이머 세트는 Rs382200 유전자(15,038,338~15,040,701 bp)에 특이적인 프라이머 세트이다.

구체적으로, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 Rs382940 유전자(2,145 bp)에서 P1 영역(1,255~1,482 bp), 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 Rs382940 유전자에서 P2 영역(163~564 bp), 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트는 Rs382940 유전자에서 P3 영역(1,106~1,650 bp), 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 Rs382940 유전자에서 P4 영역(1,505~1,994 bp), 서열번호 9 및 9의 프라이머 세트는 Rs382940 유전자에서 P5 영역(357~858 bp)을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트이다.

또한 상기 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 Rs382200 유전자(2,364 bp)에서 P1 영역(83~246 bp), 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트는 Rs382200 유전자에서 P2 영역(280~1,267), 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트는 Rs382200 유전자에서 P3 영역(1,381~1,798 bp), 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트는 Rs382200 유전자에서 P4 영역(1,798~2,294 bp), 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트는 Rs382200 유전자에서 P5 영역(1,101~1,604 bp)영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는, 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 시들음병 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 무 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 시들음병 저항성 또는 감수성 무 개체를 구별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트(Rs382940_P1)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 227 bp, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트(Rs382940_P2)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 401 bp, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트(Rs382940_P3)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 522 bp, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트(Rs382940_P4)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 489 bp, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트(Rs382940_P5)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 501 bp, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트(Rs382200_P1)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 164 bp, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트(Rs382200_P2)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 987 bp, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트(Rs382200_P3)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 417 bp, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트(Rs382200_P4)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 496 bp, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트(Rs382200_P5)를 이용하여 PCR을 수행한 경우 503 bp 크기의 단일밴드를 나타내면 시들음병 저항성 무 개체로 판별할 수 있고, 단일밴드가 검출되지 않으면 시들음병 감수성 무 개체로 판별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료 및 맵핑 집단

시들음병 저항성 근교계 'YR4'와 시들음병 감수성 근교계 'YR18'(Neo Seed Co., 한국)을 교배하여 생성된 F₁ 집단을 자가수분시켜 F₂ 집단을 생성하였으며, F₂ 집단을 자가수분시켜 180 lines/families로 구성된 F_2:3 집단을 확보하였다. 각 F_2:3 계통의 10개 식물체에 시들음병 병원균(Fusarium oxysporum)을 접종하고, 증상의 발병도(disease index)에 기반하여 평가하였다. 시들음병 병원균 감염에 대한 감수성 식물체로 YR18 및 Backchun을 사용하였으며, 이들 각각의 5개체는 음성 실험군으로 시들음병 병원균을 접종하지 않았다.

2. 병원균 접종 및 증상 평가

병원형(pathotype)에 따른 근교계의 표현형을 확인하기 위해, 두 양친 계통과 이들의 F₁ 식물체에 시들음병 병원균(F. oxysporum f. sp raphani)의 병원형 57A, 59A 및 147A(Korea Research Institute of Chemical Technology, KRICT)를 각각 접종하거나, HN 및 JHW(신젠타코리아에서 분양)를 혼합하여 접종한 후 KRICT 배양실(2018년 4월 23일~5월 21일, 6월 22일~7월 18일)에서 배양되었다. 상기 병원형 HN와 JHW는 강한 병징을 보이는 해남과 장호원 지역에서 각각 수집된 것이다.

또한, 병원형 59A에 대한 YR4의 저항성과 관련된 게놈 영역 및 유전적 요인을 확인하기 위해 F₂ 및 F_2:3 집단에 대한 연구가 수행되었다. 구체적으로, 표현형 평가는 KRICT 배양실(2019년 5월 15일~6월 13일)과 충남대학교 온실(2018년 9월 18을~10월 24일)에서 두 양친 계통과 이들의 F_2:3 식물체를 사용하여 수행되었다. 병원균 포자 현탁액(3×10⁶ 포자/㎖)을 준비하고, 뿌리 침지 방법(root-dipping method)을 통해 10일된 유모에 접종하여 각각의 화분(5 cm×5 cm×5 cm)에 이식한 후 광 조건(12시간), 습도 60%, 관주법 및 온도 25℃ 조건으로 재배하였다. 무 시들음병 증상은 접종 후 2주째에 평가하였으며, 평가 기준은 도 1에 나타난 총 6개 등급으로 분류되었다. 식물체들의 평균 등급이 1이하인 경우에 저항성으로 평가하였다.

3. DNA 추출 및 마커 개발

게놈 DNA는 식물체의 잎을 이용하여 CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide) 방법을 통해 추출한 후 Brassica에서 이전에 맵핑된 662개의 ACMP EST-SSR 마커(DNA Res, 2011, 18(5), 305-320), 1,519개의 BRPGM SSR 마커(B. rapa의 BAC 말단 서열에서 파생된 genomic-SSR 마커; Genome, 2010, 53, 939-947) 및 271개의 Radish EST-SSR 마커(DNA Research, 2021, 18, 401-411)를 이용하여 두 양친 계통 간의 다형성을 조사하였다. 또한, 양친 계통의 전장 유전체 재분석(whole-genome re-sequencing) 데이터와의 비교를 통해 484개의 SNP 프라이머 세트를 디자인하였다

4. Whole-genome re-sequencing 및 bioinformatics analysis

두 양친 계통의 전체 게놈 시퀀싱은 Illumina HiSeq 2500 시스템을 통한 paired-end 방식을 이용하여 수행하였다. fastqc, jellyfish 및 quake 프로그램을 이용하여 시퀀스 품질을 검사한 후 무 게놈 데이터베이스에 기반하여 SOAPdenovo를 통해 전체 게놈 스캐폴드를 조립하였다.

또한, 두 양친 계통 게놈의 상동성과 synteny를 분석하고, 메가 블라스트 분석(mega blast analysis) 분석을 통해 SNP와 InDel을 포함한 모든 변이 서열을 탐색한 후 Primer 3 프로그램(v2.3.5)을 사용하여 변이 서열을 기반으로 SNP 및 InDel 프라이머를 개발하였다. 상기 개발된 프라이머는 연관지도 작성에 사용되었다.

5. 유전자 지도 작성 및 QTL 분석

유전자 지도는 JoinMap version 4.0 소프트웨어(https://www.kyazma.nl/index.php/JoinMap/)를 이용하여 작성하였다. 연결된 유전자좌는 4.0~6.0 범위의 LOD 그룹핑 임계값(logarithm of odds threshold)을 사용하여 그룹화되었고, 총 9개의 연관 그룹(LG, linkage group)을 형성하였다. 각 연관 그룹에서 LOD 그룹핑 내 마커 순서를 배열하기 위해 재조합 빈도는 0.4, 임계값은 0.5 보다 작게 설정하였으며 재조합 빈도는 Kosambi의 계산 방법을 이용하여 cM(centiMorgans)으로 변환하였다. 또한, YT4(저항성)과 YR18(감수성) 리시퀀싱 데이터에서 생성된 SNP 마커와 이전에 보고된 Brassica SSR 마커(DNA Res, 2011, 18(5), 305-320; Genome, 2010, 53, 939-947; Shirasawa et al. 2011)를 사용하여 유전자 지도 작성과 QTL 분석을 수행하였다(표 1).

시들음병 저항성 형질의 QTL 분석은 Windows QTL Cartographer 2.5를 이용하여 CIM(composite interval mapping) 방법을 통해 수행하였으며, 위양성(false positive) QTL을 제거하기 위해서 IciMapping 4.1 소프트웨어를 사용하여 ICIM(inclusive composite interval mapping)을 추가로 수행하였다.

본 발명에서 확인된 QTL은 FoRsR9.1 ^59A , FoRsR9.2 ^59A 등으로 명명되었으며, Fo는 Fusarium oxysporum의 약어, Rs는 Radish sativus의 약어, R은 Radish linkage group의 약어, 9는 염색체 번호, 1 또는 2는 동일한 연관 그룹에서 순차적으로 식별되는 QTL의 수, 59A는 F. oxysporum의 병원형을 의미한다.

6. 무 시들음병 저항성 관련 후보 유전자 탐색 및 시퀀싱 분석

두 양친 계통에 대한 리시퀀싱 어셈블리(re-sequencing assembly)는 무 참조 유전체(http://radish-genome.org; Theor Appl Genet, 2016, 129, 1357-1372; Theor Appl Genet, 2015, 128, 259-272) 정보에 맵핑되었으며, 양친 계통의 모든 유전자는 CLC Main Workbench 7.7.1(CLC Bio Co., 덴마크)을 사용하여 서열 정렬하여 변이 부분을 탐색하였다.

후보 유전자의 스크리닝을 위해 non-synonymous 아미노산과 fundamental functional 주석화(annotation)를 하였으며, 후보 유전자는 애기장대 TAIR 데이터베이스(https://www.arabi dopsis.org/)와 무 데이터베이스(http://www.radishgenome.org)를 이용하여 오쏘로그(orthologue) 유전자 기능을 기반으로 예측하였다.

7. PCR 분석

RT-PCR(reverse transcription PCR) 및 qRT-PCR(quantitative real-time PCR) 분석을 위해, 두 양친 계통에 무 시들음병 병원균의 병원형 59A를 접종한 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12시간 및 1, 2, 3, 6, 12일째에 YR4(저항성) 및 YR18(감수성) 식물체의 잎과 뿌리 조직을 수집하고, RNeasy plant Mini Kit(QIAGEN Inc., 미국)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 2 ㎍의 총 RNA가 첨가된 20 ㎕ 반응물과 TOPscript™ RT DryMix 키트(Enzynomic Co., 한국)를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, 상기 합성된 cDNA를 10배로 희석하고 2 ㎕를 취하여 총 20 ㎕의 PCR 반응물에 주형으로 첨가하였다. 무 시들음병 저항성 관련 후보 유전자들에 대한 PCR 프라이머는 무 참조 유전체 서열을 기반으로 디자인되었다(표 1).

본 발명의 프라이머 세트 정보

프라이머 명칭	정방향(5'→3') (서열번호)	역방향(5'→3') (서열번호)	크기(bp)
Rs382950_RT	ACCACCATTGCCAAGTATCT (21)	ATCCACATCATCAAGCACAG (22)	237
Rs382940_RT	TCCACAGCTTTTCAAAGTCA (1)	CAGACCTCTTGGAGAAGGAA (2)	227
Rs382860_RT	TGTGTTGGTTTTGGTTCTTG (23)	CAATACCGTGAGCTCCTCTT (24)	197
Rs382200_RT	ATAACCCAACAAACCAAGGA (11)	GGCCGAGAAGTTCTTGAATA (12)	164
Rs382850_RT	TGTGTTGGTTTTGGTTCTTG (25)	CAATACCGTGAGCTCCTCTT (26)	197
Rs383100_RT	ACCCTTCGAGCTCTTCTAAC (27)	AGGACACTTTTCCTTGTCGT (28)	161
Rs382720_RT	AGAAGCTCCTCACTGGAATC (29)	AAGTCTCATGCATCTCATCG (30)	317
Rs382060_RT	AACGATGATGGTAGAGACGA (31)	TGGGATTCACAAAAGAGATG (32)	186
Rs381550_RT	GGTTTCTTCAGCAGTTCACA (33)	GATCAAAGAAGGCCAGAAGT (34)	184
Rs381540_RT	GGGAAACCTACCGATTAAAA (35)	TTTCTTCGTGGATTGTTGAC (36)	157
Rs381090_RT	CTCCGACCATAACGATACAG (37)	GCTAGCTCGAGTAGGAGGAG (38)	159
Rs381290_RT	CAAGAAACAGTGTGAGCTTGA (39)	ACCTCTCTTTGAGCTTCGAC (40)	155
Rs381310_RT	ATCGAACTGAGGCAGAGG (41)	GAATCCTCCGGTCAAAGC (42)	152
Rs381320_RT	GGAATATGCACGCTCTTATG (43)	GATGGAAGTGACATTGATGG (44)	224
Rs381330_RT	CTCCGAAGCTTTGACTTGTA (45)	GTGCTAGTCAGCGAAGAGAA (46)	244
Rs381350_RT	TCCAAGGTACGATGATTCTG (47)	AGAAAGCCATCGAGGACTAC (48)	191
Rs380750_RT	CATACGCTAATCCCAACAAG (49)	AAGCGACCAAAGGTCTCTAC (50)	178
Rs380950_RT	TGGAAATTGGGTTGTGGG (51)	GAAGAATGAGCTTTGCGT (52)	208

또한, 무 시들음병 병원균의 병원형 59A를 두 양친 계통에 접종하고 0, 1, 3 및 6일 후에 뿌리 조직을 회수하여 이들의 게놈 DNA 시료를 대상으로 qRT-PCR을 수행하여 후보 유전자들의 발현 수준을 분석하였다. 상기 qRT-PCR은 95℃ 3분 → [95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초](34회 반복)의 조건으로 수행하였으며, PCR 증폭 산물은 1% 아가로스겔 전기영동으로 분석하였다.LightScanner system(Idaho Technologies, 미국)을 통해 분석하였다.

또한, 무 시들음병 병원균의 병원형 59A를 두 양친 계통에 접종하고 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12시간 및 1, 2, 3, 6, 12일째에 잎과 뿌리 조직을 회수하여 이들의 게놈 DNA 시료를 대상으로 SYBR Green Supermix(PhilKorea, 한국)와 CFV96™ Real-Time System(Bio-Rad Co., 미국)로 qRT-PCR을 수행하여 후보 유전자들의 발현 수준을 분석하였다. 상기 qRT-PCR은 95℃ 3분 → [95℃ 15초, 58℃ 20초](39회 반복)의 조건으로 수행하였으며, 상대적인 유전자 발현 수준은 2^-△△Ct의 방법으로 산출하였다.

실시예 1. 무 시들음병 병원균의 병원형에 따른 표현형적 반응 분석

두 양친 계통인 YR4(59A 저항성) 및 YR18(59A 감수성)과 이들의 F₁ 식물체(59A 저항성)에 무 시들음병 병원균(F. oxysporum f. sp raphani)의 병원형 57A, 59A, 147A, HN 및 JHW를 각각 접종한 결과, 병원형 HN과 JHW는 양친 계통 모두에서 시들음병에 대해 감수성 반응을 보였으나, 병원형 59A, 57A 및 147A의 경우 YR4는 시들음병에 대한 저항성을 보이고 YR18는 감수성을 보이는 것을 확인하였다.

이중에서 병원형 57A와 147A는 F₁ 식물체의 반복 실험 결과에 차이가 있었으나, 병원형 59A는 모든 F₁ 식물체에서 안정적인 저항성을 보임으로써, 병원형 59A를 선발하여 이후 실험에 사용하였다(표 2 및 도 2).

무 시들음병 병원균

Line (n=10)^a	F. oxysporum f. sp. raphani pathotype
	59A		57A		147A		HN, JHW
	DI^b	phenotype^c	DI	phenotype	DI	phenotype	DI	phenotype
YR4	0.1±0.03	R	0.1±0.03	R	0.2±0.04	R	5.0±0.00	S
YR18	4.6±0.09	S	4.9±0.03	S	4.9±0.03	S	5.0±0.00	S
F₁	0.0±0.00	R	0.4±0.10	R	1.0±0.31	S	4.6±0.14	S
YR4	0.3±0.06	R	0.5±0.08	R	0.9±0.15	R	5.0±0.00	S
YR18	5.0±0.00	S	5.0±0.00	S	5.0±0.00	S	5.0±0.00	S
F₁	0.0±0.00	R	4.2±0.15	S	3.6±0.20	S	4.5±0.11	S

^a 각 실험에서 반복되는 식물체의 수

^b DI: 질병 지수(Disease index)

^c R: 저항성(resistance), S: 감수성(susceptible)

실시예 2. 전체 게놈 시퀀싱 및 유전자 지도 작성

두 양친 계통인 YR4와 YR18의 게놈을 이용하여 시퀀싱한 결과, 각각 총 95,021,344와 104,493,253의 로우 리드(raw reads)가 생성되었다. 또한, 어탭터 서열과 낮은 품질의 리드(unknown bases, N>5%)를 제거하여 YR4 및 YR18의 총 159,057,674와 174,640,942개의 정제된 리드(clean reads)를 얻었으며, 총 염기서열 길이가 각각 13.49 Gb와 14.89 Gb임을 확인하였다.

또한, 참조 유전체 게놈에 YR4 및 YR18의 게놈을 정렬하여 맵핑율이 각각 76.7%와 77.3%임을 확인하였으며(표 3), YR4와 YR18 게놈을 서열을 비교하였을 때 161,561개의 SNP와 55,674개의 InDel을 확인하였다(도 3). 가장 많은 서열 변이 또는 가장 적은 서열 변이를 보인 염색체는 각각 6번 및 8번 염색체였으며, 9개 염색체의 평균 염기서열 변이수는 24,249개이었다.

참조 유전체에 대한 양친 계통의 맵핑 결과

Plant samples	YR4	YR18
Total No. of raw reads	190,042,688	208,986,506
Total raw bases length (bp)	19,194,311,488	21,107,637,106
Total No. of non-redundant reads	184,883,988	204,279,510
Total No. of clean reads	159,057,674	174,640,942
Total bases length of clean reads (bp)	13,486,715,865	14,859,412,353
Total No. of mapped reads	122,055,397	135,002,931
Map reads rate (%)	76.8	77.3
Mapped region (bp)	284,960,554	285,367,161
Genome coverage	~ 25.45 ×	~ 28.04 ×

무의 유전자 지도를 작성하기 위해, Brassica에서 이전에 맵핑된 총 2,936개 ACMP EST-SSR 마커, BRPGM SSR 마커, Radish EST-SSR 마커 및 SNP 마커를 이용하여 두 양친 계통 간의 다형성을 조사한 결과, 배추(Brassica rapa)에서 개발된 1,519개의 BRPGM SSR 중 74개(4.9%), 662개의 ACMP 중 50개(7.6%)만이 양친 계통에서 다형성을 보인 반면, 무(Rapanus sativus)에서 개발된 EST-SSR 마커는 271개 중 66개(24.35%)로, Brassica 종에서 개발된 마커를 이용한 이종간(inter-species) 분석보다 무에서 개발된 마커를 이용한 종내(intra-species) 분석에서 다형성이 더 높게 나타났다. 또한 YR4 및 YR18의 재배열에 따라 설계된 484개의 SNP 중 308개(63.6%)가 다형성으로 검출되었다(표 4).

다형성 분석에 사용된 마커 정보

Marker ID	Marker type	Plants source	Number of marker	Number of Polymorphic	Polymorphism ratio(%)
ACMP	SSR	Brassica rapa	662	50	7.6
BRPGM	SSR	Brassica rapa	1,519	74	4.9
EST-SSR	SSR	Rapanus sativus	271	66	24.4
SNP	SNP	Rapanus sativus	484	308	63.6
Total			2,936	498

결과적으로, 두 양친 계통간의 다형성 마커는 총 498개로, 이중 403개의 마커를 이용하여 총 9개의 연관 그룹(9개 염색체 R1~R09)으로 이루어진 무의 유전자 지도를 작성하였다. 유전자 지도는 총 길이 1,074.23 cM로, 좌간 평균 거리 2.67 cM을 보여주었다. 또한, 5번 염색체(R5)는 182.75 cM의 가장 긴 연관 그룹인 반면, 3번 염색체(R3)는 72.82 cM의 가장 짧은 연관 그룹임을 확인하였다(표 5 및 도 4).

본 발명의 무 유전자 지도는 마커의 물리적 위치와 비교하였을 때 무 참조 유전체와 83% 정도 매칭되었으며, 유전자 지도에서 1 cM은 약 320 kb의 물리적 길이에 해당한다.

무의 유전자 지도 요약

Chr	Length(cM)	ACMP	BRPGM	EST-SSR	SNP	Total	Interval of markers(cM)
R01	80.11	5	7	4	31	47	1.70
R02	118.39	2	5	4	33	44	2.69
R03	72.82	3	2	5	9	18	4.05
R04	135.86	6	7	2	21	36	3.77
R05	182.75	4	1	9	36	50	3.66
R06	143.41	4	6	0	31	41	3.50
R07	104.70	6	3	2	78	89	1.18
R08	107.51	2	3	8	8	21	5.12
R09	128.68	2	3	1	51	57	2.26
Total	1074.23	34	37	35	298	403	2.67

실시예 3. 무 시들음병 저항성 관련 QTL 분석

본 발명의 무 유전자 지도를 이용하여 ICIM(Inclusive Composite Interval Mapping)을 통해 시들음병 저항서 관련 QTL을 분석하였다. 시들음병 저항성과 관련된 4개의 QTL이 표현형 결과에 따라 R09(QTL 3개; FoRsR9.1 ^59A , FoRsR9.2 ^59A , FoRsR9.3 ^59A )와 R07(QTL 1개; FoRsR7.1 ^59A )에서 감지되었다.

이러한 QTL은 3.38~12.84의 LOD 값은 가지고, 6.24~27.97%의 표현형적 변이를 보였다. 게다가 FoRsR7.1 ^59A 및 FoRsR9.3 ^59A QTL은 3번의 독립적인 테스트에서 반복적으로 중첩된 게놈 영역에서 검출되었다. 따라서 FoRsR7.1 ^59A 및 FoRsR9.3 ^59A QTL은 시들음병 저항성과 밀접하게 연관된 영역임을 알 수 있었다.

이중 FoRsR7.1 ^59A QTL 영역(14.35~16.48 Mb; 2.13 Mb 영역으로 238개의 gene 분포)는 3번의 테스트에서 표현형적 변이(R ² )가 각각 9.34%, 22.24%, 27.97%로, 7번 염색체 상에서 R7_Rs382960와 BRPGM1176 마커 사이에 위치하며, 상대적으로 높은 5.17~12.84의 LOD 값을 가진다. 또한, FoRsR9.3 ^59A 는 3번의 테스트에서 표현형적 변이(R ² )가 각각 3.24%, 8.18%, 8.82%이었으며, FoRsR9.1 ^59A 와 FoRsR9.2 ^59A 는 각각 2018년에 충남대학교에서 수행된 실험과 2019년에 KRICT에서 수행된 실험에서만 탐색되었다(표 6 및 도 5).

무 시들음병 저항성 관련 QTL 요약

		FoRsR7.1 ^59A	FoRsR9.1 ^59A	FoRsR9.2 ^59A	FoRsR9.3 ^59A
Linkage group		R7	R9	R9	R9
Confidence interval (cM)		92.70-66.21	30.63-33.56	41.31-46.46	114.64-128.68
Marker interval		R7_Rs382960 ~ BRPGM1176	R9_Rs456040 ~ R9_Rs456450	R9_Rs458830 ~ R9_Rs464870	R9_Rs490390 ~R9_Rs496270
2018 in CNU	LOD	5.17	6.10	-	3.38
	R ² (%)	9.34	10.81	-	6.24
	Add	-0.56	-0.62	-	-0.42
	Com	-0.07	0.13	-	-0.23
2018 in KRICT	LOD	11.69	-	-	4.52
	R ² (%)	22.24	-	-	8.18
	Add	-0.89	-	-	-0.58
	Com	-0.23	-	-	0.07
2019 in KRICT	LOD	12.84	-	5.16	4.46
	R ² (%)	27.97	-	10.27	8.82
	Add	-0.80	-	-0.53	-0.47
	Com	-0.24	-	0.03	0.08

이를 통해, 무 시들음병에 대한 저항성이 적어도 2개 이상의 유전자좌와 관련이 있으며, 환경에 따라 일부 차이가 있음을 알 수 있었다. 또한, 집단 내 표현형의 지속적인 변이는 무(R. sativus)에서의 저항성 형질이 질적 형질(qualitative trait)아 아닌 양적 형질(quantitative trait)임을 알 수 있다.

실시예 4. 무 시들음병 저항성 관련 후보 유전자 예측

무 참조 유전체와 비교하여 본 발명의 유전자 지도 R07의 2.18Mb 영역에서 시들음병 저항성과 관련된 후보 유전자 238개를 예측하였으며, 두 양친 계통에 대한 re-sequencing 데이터에서 238개 유전자에 대한 상동체를 확인하였다.

238개의 후보 유전자 중 95개는 비상동성 변이(non-synonymous variations) 및 양친 계통 간의 서열 변이와 연관되어 있었다. 이들 유전자 중에서 중 5개는 질병 저항성과 관련이 있고, 13개 유전자는 기능이 알려져 있지 않았으며, 이외에 5개는 F-box 유전자, 2개는 zinc finger 유전자, 3개는 MYB 전사 인자 유전자, 67개는 다른 패밀리(예: SAUR 패밀리 단백질, MADS-box 단백질 또는 ALBA RNA-binding 단백질 코딩 유전자)에 속해 있었다.

상기 5개의 질병 저항성과 관련된 유전자에는, TIR-NBS-LRR 및 TIR-NBS 질병 저항성 단백질을 코딩하는 Rs382950 및 Rs382940 유전자, LRR-RLK(leucine-rich repeat receptor like kinase) 단백질을 코딩하는 Rs382850 및 Rs382860 유전자, LRR receptor like serine/threonine-protein kinase를 코딩하는 Rs382200 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다. 이에 본 발명에서는 양친 계통의 re-sequencing data를 이용하여 상기 질병 저항성 관련 유전자 5개와 기능이 알려지지 않은 유전자 13개를 확인하였다(표 7).

무 시들음병 저항성 관련 후보 유전자

ID of gene	Position of gene		Function
Rs382850	14,447,170	14,449,010	leucine-rich repeat receptor protein kinase isoform 1
Rs382200	15,038,338	15,040,701	probable lrr receptor-like serine threonine-protein kinase
Rs382860	14,442,625	14,446,587	receptor-like protein kinase-like
Rs382950	14,314,234	14,319,173	tir-nbs-lrr class disease resistance protein
Rs382940	14,336,249	14,338,394	tmv resistance protein n-like
Rs380750	15,967,066	15,967,847	Unknown protein
Rs380950	16,112,742	16,114,484	Unknown protein
Rs381090	15,592,528	15,593,531	Unknown protein
Rs381290	15,750,596	15,752,421	Unknown protein
Rs381310	15,776,779	15,777,701	Unknown protein
Rs381320	15,797,119	15,798,123	Unknown protein
Rs381330	15,798,896	15,801,158	Unknown protein
Rs381350	15,816,766	15,819,341	Unknown protein
Rs381540	15,408,975	15,411,348	Unknown protein
Rs381550	15,403,771	15,404,981	Unknown protein
Rs382060	15,132,250	15,132,706	Unknown protein
Rs382390	14,954,433	14,955,734	Unknown protein
Rs382720	14,531,043	14,532,670	Unknown protein

시들음병에 대해 저항성을 보이는 YR4 및 B2 식물체와 감수성을 보이는 YR18 및 835 개체의 게놈 서열을 비교한 결과, Rs382940 또는 Rs382200 유전자가 시들음병 저항성 개체에서만 존재하는 것을 확인하였으며, 특히 'YR4'의 게놈 서열 데이터에는 Rs382940과 Rs382200 유전자가 존재하고 'YR18'에는 존재하지 않음을 확인하였다(표 8).

4개의 양친 계통에서 후보 유전자 내 서열 변이 확인

	Radish inbred line				Sequence variation
ID of gene	YR4(R)	YR18(S)	835(S)	B2(R)	Sequence variation
Rs382950	○	○	○	×	7 SNP
Rs382940	○	×	×	○	-
Rs382860	○	○	○	×	11 SNP
Rs382850	○	○	○	×	2 SNP
Rs382200	○	×	×	×	-

또한, 질병 저항성 관련 유전자 5개와 기능이 알려지지 않은 유전자 13개를 표적으로 하는 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 두 양친 게통의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과, Rs382940과 Rs382200 유전자가 YR4(저항성)에서만 검출되고 YR18(감수성)에서는 검출되지 않음을 확인하였다(도 6).

이를 통해, 무 시들음병 저항성과 밀접하게 연관된 유전자는 무 게놈의 7번 염색체에 존재하는 Rs382940과 Rs382200 유전자임을 알 수 있었다.

실시예 5. 무 시들음병 저항성 관련 유전자 기반 프라이머 세트를 이용한 시들음병 저항성 판별능 분석

무 시들음병 저항성 관련 유전자인 Rs382940(2,364 bp)과 Rs382200(2,145 bp)에 특이적인 프라이머 세트(표 9 및 도 7)를 제작한 후 상기 제작된 프라이머 세트를 이용하여 두 양친 계통인 YR4(저항성) 및 YR18(감수성)과 이들의 F₁ 식물체(저항성)를 대상으로 PCR을 수행하였다.

본 발명의 프라이머 세트 정보

Primer name	Position of gene (bp)	Sequence (5'-3') (서열번호)		Product (bp)
Primer name	Position of gene (bp)	Forward	Reverse	Product (bp)
Rs382940_P1	1,255~1,482	TCCACAGCTTTTCAAAGTCA (1)	CAGACCTCTTGGAGAAGGAA (2)	227
Rs382940_P2	163~564	CGTGCGTAGAAGTTTGGT (3)	TGAGAGGAGAAGCCAGGT (4)	401
Rs382940_P3	1,106~1,650	CCAACAGCCTAGTTACCA (5)	AGCCAACTCACATCTTTCA (6)	522
Rs382940_P4	1,505~1,994	GTTCTGACTTGGGCTCTG (7)	TCCCTGTCCTCTTTGGTT (8)	489
Rs382940_P5	357~858	GAGCTGGTGTTTGGATGA (9)	TATGCGGAGTAGACAAGA (10)	501
Rs382200_P1	83~246	ATAACCCAACAAACCAAGGA (11)	GGCCGAGAAGTTCTTGAATA (12)	164
Rs382200_P2	280~1,267	AACACGATCGAAGGCTCA (13)	GCCACAGAAGAGAAGTCAA (14)	987
Rs382200_P3	1,381~1,798	TGAACTGGCTAAAATGGG (15)	GGGTAAGGTTGAGGAATG (16)	417
Rs382200_P4	1,798~2,294	CATTCCTCAACCTTACCC (17)	GATAAGAAACCTCCAAGAAC (18)	496
Rs382200_P5	1,101~1,604	CCAGATGCAGAGTTTAAAG (19)	AGAGCAGAGAGGAAAGAA (20)	503

그 결과, 무 시들음병 저항성 개체인 YR4와 F₁ 식물체에서만 밴드가 검출되고, 감수성 개체인 YR18에서는 밴드가 검출되지 않음을 확인하였다(도 7). 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트가 무 시들음병에 대한 저항성 또는 감수성 무 개체를 정확하게 구별할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Primer set composition for discriminating Fusarium wilt-resistant or sensitive Raphanus sativus cultivar and uses thereof <130> PN21500 <160> 52 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccacagctt ttcaaagtca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cagacctctt ggagaaggaa 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtgcgtaga agtttggt 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgagaggaga agccaggt 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccaacagcct agttacca 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agccaactca catctttca 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gttctgactt gggctctg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tccctgtcct ctttggtt 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gagctggtgt ttggatga 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tatgcggagt agacaaga 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ataacccaac aaaccaagga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggccgagaag ttcttgaata 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aacacgatcg aaggctca 18 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gccacagaag agaagtcaa 19 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgaactggct aaaatggg 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gggtaaggtt gaggaatg 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cattcctcaa ccttaccc 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gataagaaac ctccaagaac 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccagatgcag agtttaaag 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 agagcagaga ggaaagaa 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 accaccattg ccaagtatct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 atccacatca tcaagcacag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgtgttggtt ttggttcttg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 caataccgtg agctcctctt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgtgttggtt ttggttcttg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 caataccgtg agctcctctt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 acccttcgag ctcttctaac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 aggacacttt tccttgtcgt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agaagctcct cactggaatc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aagtctcatg catctcatcg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aacgatgatg gtagagacga 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tgggattcac aaaagagatg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ggtttcttca gcagttcaca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gatcaaagaa ggccagaagt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gggaaaccta ccgattaaaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tttcttcgtg gattgttgac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ctccgaccat aacgatacag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gctagctcga gtaggaggag 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 caagaaacag tgtgagcttg a 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 acctctcttt gagcttcgac 20 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 atcgaactga ggcagagg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gaatcctccg gtcaaagc 18 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ggaatatgca cgctcttatg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatggaagtg acattgatgg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 ctccgaagct ttgacttgta 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gtgctagtca gcgaagagaa 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 tccaaggtac gatgattctg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 agaaagccat cgaggactac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 catacgctaa tcccaacaag 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 aagcgaccaa aggtctctac 20 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 tggaaattgg gttgtggg 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gaagaatgag ctttgcgt 18

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 시들음병(Fusarium wilt) 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트 조성물.
제1항의 프라이머 세트 조성물을 포함하는, 시들음병(Fusarium wilt) 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하기 위한 키트.
무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 시들음병(Fusarium wilt) 저항성 또는 감수성 무 품종을 판별하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.