KR102172873B1 - 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 srpk4 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 위황병(Fusarium wilt)에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 SRPK4(serine/arginine-rich protein kinase 4) 단백질, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 위황병 저항성 무 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 무의 위황병에 대한 저항성과 이병성을 염기서열의 차이를 통해 빠르고 정확하게 판별할 수 있는 정보를 제공하므로 위황병에 대한 저항성이 우수한 무 품종을 안정적으로 검출, 선발 및 육종할 수 있을 뿐만 아니라, 위황병으로 인한 무 작물의 생산성 저하를 방지할 수 있어 농가의 피해를 줄이는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 SRPK4 유전자 및 이의 용도{SRPK4 gene for enhancing plant resistance to fusarium wilt and uses thereof}

본 발명은 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 SRPK4 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

토양전염성 병원균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)에 의한 위황병(Fusarium wilt)은 무(radish, Raphanus sativus L.) 등을 포함하는 십자화과(Cruciferae) 식물에 심각한 질병으로, 이 병원균은 적절한 숙주 식물의 부재에도 오랜 기간 동안 살아남을 수 있는 특징이 있다. 푸사리움 옥시스포럼에는 120개 이상의 분화형(forma specialis; f. sp.)이 존재하며, 무 위황병을 일으키는 병원균은 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp. raphani)로서 불완전균류에 속하는 토양전염성 균이다. 무 위황병의 병징은 유묘기에는 뿌리 도관이 황갈색에서 흑갈색으로 변색하고 지상부는 시들어 곧 고사하며, 생육기에는 신엽에서 시들음 증상이 나타나다가 점차 아랫잎으로부터 황변하여 떨어지고 속잎 1 ~ 2장만 남기고 고사하게 된다. 뿌리는 발병초기에 도관의 일부분이 다갈색에서 흑갈색으로 변색하지만 병이 심해지면 다른 도관으로 침해되어 심하게 변색된다. 이 병의 방제를 위하여 토양훈증, 종사소독, 윤작 등이 사용되고 있으나, 이들 방법은 경제성이 낮고 뚜렷한 방제효과가 없어 이 병에 대한 저항성 품종육성이 절실히 필요한 실정이다.

한편, 한국등록특허 제1361296호에는 '무의 위황병 저항성 연관 마커를 표지하는 프라이머 세트 및 이를 이용한 저항성 무 품종 선발 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1761293호에는 '무 위황병 저항성 판별용 SNP 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 SRPK4 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp. raphani)에 의한 위황병에 저항성인 'B2'와 이병성인 '835'를 교배하여 F₂ 맵핑 집단을 생산한 후, 이들의 유전체를 분석하여 유전자 지도를 작성하였고, 참조 무 게놈 서열과 비교하여 주요 위황병-저항성 QTL인 Fwr1 좌의 후보 유전자를 선발하였다. 선발된 15개의 후보 유전자(ORF1 ~ 15) 중 ORF4 유전자가 'B2' 계통에서 '835' 계통에 비해 발현 수준이 높으며, 병원균 접종 후 유전자의 발현 수준이 현저히 상향 조절되는 것이 확인되었다. 또한, 'B2'와 '835'에서 상기 ORF4 서열을 클로닝 및 시퀀싱 분석한 결과, 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation)를 유도하는 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 다형성이 확인되어 상기 ORF4가 코딩하고 있는 SRPK4(serine/arginine-rich protein kinase 4) 단백질이 무의 위황병 저항성 Fwr1 좌의 유전자임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 위황병(Fusarium wilt) 저항성 무 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 위황병 저항성 무 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 위황병 저항성 무 품종 판별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 무 유래의 SRPK4(serine/arginine-rich protein kinase 4) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 위황병에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 위황병에 대한 식물체의 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 무의 위황병에 대한 저항성과 이병성을 염기서열의 차이를 통해 빠르고 정확하게 판별할 수 있는 정보를 제공한다. 이에 따라 위황병에 대한 저항성이 우수한 무 품종을 안정적으로 검출, 선발 및 육종할 수 있을 뿐만 아니라, 위황병으로 인한 무 작물의 생산성 저하를 방지할 수 있어 농가의 피해를 줄이는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 Fwr1 지역에 상응하는 무와 애기장대 게놈의 신터니(synteny) 맵이다. (a)는 이전에 보고된 Fwr1 좌의 맵이고, (b)는 384개의 재조합 식물체에 근거한 무 게놈의 Fwr1 지역 맵과 무 참조 서열의 염색체 5번과 이에 상응하는 애기장대 게놈 지역의 신터니 맵이다.
도 2는 Fwr1 좌의 Fine-mapping 결과로, 컬럼의 상단에 마커명을 표기하였으며, 선발된 재조합 식물체의 유전형 및 F₂ 식물체로부터 유래한 F_2:3 식물체의 발병도(DI)를 나타내었다. 검정색 박스는 'B2'(위황병 저항성 무 계통)의 저항성 대립유전자를 동형접합으로 가지고 있음을 의미하며, 회색 박스는 '835'(위황병 이병성 무 계통)의 이병성 대립유전자를 동형접합으로 가지고 있음을 의미하며, 흰색 박스는 이형접합을 의미한다. Fwr1 좌는 무 참조 게놈에서 FM-82와 FM-87 마커 사이의 139.8 kb 지역이다.
도 3은 'B2' 및 '835' 식물체의 잎(a)과 뿌리(b) 조직에서 후보 유전자의 발현 수준을 역전사 PCR로 확인한 결과이다. 1과 2는 각각 '835'와 'B2' 식물체의 병원균 접종 전의 시료를 의미하고, 3과 4는 각각 '835'와 'B2' 식물체의 병원균 접종 후 8시간 째의 시료를 의미한다.
도 4는 ORF3 및 ORF4의 발현 수준을 정량적 실시간 PCR로 확인한 결과이다. (a)는 병원균 접종 후 잎 조직에서 ORF3의 발현 수준을, (b)는 병원균 접종 후 뿌리 조직에서 ORF3의 발현 수준을, (c)는 병원균 접종 후 잎 조직에서 ORF4의 발현 수준을, (d)는 병원균 접종 후 뿌리 조직에서 ORF4의 발현 수준을 분석한 것이다.
도 5는 십자화과 식물체의 SRPK 단백질 아미노산 서열을 다중 정렬한 결과이다. Arabidopsis thaliana (AT3G53030), Raphanus sativus paralog of RS258060 (Rs568250), R. sativus SRPK reference sequence (Rs258060), 'B2' SRPK (Rs258060), '835' SRPK (Rs258060), Brassica rapa (Bra006970), Brassica oleracea (Bol025090), Brassica napus (GSBRNA2T00109131001), Brassica juncea (BjuA035510), Zea mays (ONM09221.1), Oryza sativa (XP_015630587.1), Solanum lycopersicum (XP_004250999.1), 및 Capsicum annuum (XP_016547285.1).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 위황병(Fusarium wilt) 저항성 무 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 위황병은 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp. raphani)에 의해 유발되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 위황병에 저항성인 무 계통 'B2'의 게놈 DNA에서는 154 bp의 증폭 산물이 확인되지만, 이병성인 무 계통 '835'의 게놈 DNA에서는 증폭 산물이 확인되지 않아(도 3a 및 3b의 ORF4 유전자 1, 2 레인 참고), 위황병에 저항성을 보이는 무를 특이적으로 구분할 수 있는 프라이머 세트이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 위황병 저항성 무 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 위황병 저항성 무 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 무 식물체의 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 무 시료는 이에 한정되지 않으나, 무 식물체의 잎, 뿌리, 또는 이의 종자일 수 있다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 위황병 저항성 무 품종을 판별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 무(Raphanus sativus L.) 유래의 SRPK4(serine/arginine-rich protein kinase 4) 단백질 및 상기 SRPK4 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 SRPK4 단백질은, 무의 위황병 저항성 QTL인 Fwr1 좌의 새롭게 밝혀진 유전자가 코딩하고 있는 단백질로, 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp. raphani)에 대해 저항성을 보이는 무 'B2'로부터 분리되었으며, 무 참조 게놈 서열((http://radish-genome.org) 및 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니에 대해 이병성을 보이는 무 '385'로부터 분리된 SRPK4 단백질과 아미노산 서열 상에 변이를 보이는 것이 특징이다(도 5 참고).

본 발명의 상기 SRPK4 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 무 유래의 SRPK4(serine/arginine-rich protein kinase 4) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4-λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린합성효소(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한,

상기 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 위황병에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 무, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 무 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 위황병에 대한 식물체의 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 무 유래의 SRPK4 단백질 코딩 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시킴으로써, 위황병에 대한 식물체의 저항성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

위황병 저항성 근교계 'B2'와 위황병 이병성 근교계 '835'를 교배하여 F₂ 맵핑 집단을 생산한 후, 주요 위황병-저항성 QTL인 Fwr1을 확인하였다. 상기 QTL 지역의 fine-mapping을 위한 재조합 식물체 선별을 위해 2,627개의 F₂ 식물체를 조사하였다. 2개의 SSR(simple sequence repeat) 마커 ACMP0606 및 RSS2974 (Yu et al. 2013, Theoretical and applied genetics 126:2553-2562) 사이에 재조합이 확인된 총 354개의 식물체가 Fwr1 좌의 fine-mapping을 위해 선택되었다. 354개의 F₂ 식물체를 자가수분시켜 F_2:3 계통을 생산하였다. 각 F_2:3 계통의 10개 식물체에 위황병 병원균을 접종하고, 야기되는 증상을 발병도(disease index)에 기반하여 평가하였다. F_2:3 계통에 대한 평균 표현형적 결과는 재조합 식물체를 대표하는 결과로써 사용하였다. 모든 식물체는 충남대학교 온실에서 재배 및 시험되었다.

2. 병원균 접종 및 증상 평가

푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp. raphani)는 신젠타코리아로부터 제공받았으며, 접종원을 만들기 위해, Yu 등(2013)의 방법에 따라 병원균 포자 배양액을 최종 농도 10⁶/mm²가 되도록 준비하였다. 2주령의 무 유묘에 준비된 포자 배양액을 cut-root dipping 방법(Yu et al. 2013)으로 접종하였다. 양친의 F₂ 유래 F₃ 집단에서 발병도 값을 분석하였다. 각 식물체는 위황병 발생률 및 지상부의 시들음을 포함하는 심각도 평가에 이용되었다. 발병도는 Yu 등(2013)에 기술된 방법에 따라, 병원균 접종 후 16일째에 각 식물체의 표현형에 기반하여 하기의 점수로 나타내었다: 1, 건강하며 무증상; 2, 떡잎 시들음 및 경미한 왜소증; 3, 식물체의 <25%가 질병 증상 보임; 4, 식물체의 25~50%가 질병 증상 보임; 5, 식물체의 51~90%가 질병 증상 보임; 6, 시들고 고사된 식물체; 7, 죽은 식물체.

3. Whole-genome resequencing 및 SNP/InDel 마커 개발

두 양친 계통의 DNA 시료를 Illumina HiSeq 2000 플랫폼을 이용하여 resequencing하였고, paired-end 시퀀스의 전처리는 이전의 공지된 방법(Yu et al. 2016, Frontiers in Plant Science 7:255)을 사용하여 수행하였다. Clean read 시퀀스는 BWA mem 알고리즘(Li and Durbin, 2009, Bioinformatics 25(14):1754-1760)을 이용하여, 무 게놈 참조서열(version Rs1.0: http://www.radish-genome.org)에 맵핑하고 주석을 달았다. SAM-to-BAM 포맷 전환 및 분류를 위해 SAMtools 프로그램을 사용하였으며, Picard 및 Genome Analysis Tool Kit를 마킹(marking), 중복(duplicate) 제거 및 재편성(realignment)을 위해 사용하였다. samtools mpilup을 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertions/deletions) 콜링에 사용하였고, 포맷 전환 및 필터링을 위해 bcftools 및 vcftools을 사용하였다. 필터링 옵션은 다음과 같이 설정하였다: minimum quality score > 30 및 read depth ≥ 10. 마커 디자인을 위해, 최소 150 bp의 측부영역(flanking region)을 가지는 동형의 SNP(75 bp + SNP + 75 bp) 또는 150~400 bp 측부영역을 가지는 InDel을 표적하였다. 또한, 불명의 염기 및 하나 이상의 SNP 또는 InDel을 가지는 마커를 제거하였다. 선택된 SNP 또는 InDel을 표적으로 하는 PCR 프라이머는 Primer3 프로그램으로 디자인하였으며, 96-well LightScanner^® System (Idaho Technology Inc., USA)을 SNP 유전형분석을 위해 사용하였다. InDel 프라이머를 이용하여 증폭된 산물은 6% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분석하였으며, 다형성 마커는 재조합 식물체의 유전형분석에 사용하였다.

4. Genetic mapping 및 QTL 분석

개발된 마커를 이용하여 만든 신규의 유전형 결과를 이전에 보고된 유전형 결과 및 유전자 지도와 결합하였다. JoinMap 4.0. 소프트웨어를 사용하여 유전자 지도를 구성하였고, QTL 분석은 WinQTLCart 2.5 프로그램(Wang et al., 2006, Windows QTL Cartographer V2.5. User Manual. Raleigh: Bioinformatics Research Centre; North Carolina State University.)을 이용하여 수행하였다. 합성의 지도 간격을 위해, 정방향 및 역방향 단계적 회귀분석(stepwise regression), 10 cM window, 5개의 대조 마커 및 1 cM 단계별 1,000회 반복 순열검정(permutations test)의 4가지 변수를 가지고, Model 6을 사용하여 제작하였다.

5. 후보 유전자 클로닝 및 시퀀싱

2개의 후보 유전자의 게노믹 DNA 및 cDNA를 클로닝하였다. '835' 및 'B2' 게놈 서열을 증폭하기 위해 프라이머 세트를 이용하였다. PCR 증폭산물은 AccuPrep^® Gel Purification Kit (Bioneer Co., Korea)를 사용하여 정제하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 T-Blunt 벡터 (Biofact Co., Korea)로 클로닝하였다. 클로닝된 산물을 시퀀싱하였고, 클로닝된 추정의 ORFs는 FGENSH 온라인 프로그램 (http://www.softberry.com)을 이용하여 기능 분석을 수행하였다. 예측되는 유전자의 게노믹 시퀀스 및 코딩 시퀀스는 NCBI 및 TAIR(https://www.arabidopsis.org/)데이터베이스, 그리고 무 게놈 데이터베이스(http://www.radish-genome.org/)를 이용하여 상동체를 검색하였으며, CLC Main Workbench 5.0 (CLC Bio Co., Denmark)를 사용하여 서열 정렬하였다.

6. RT-PCR 및 qRT-PCR

RT-PCR(reverse transcription PCR) 및 qRT-PCR(quantitative real-time PCR) 분석을 위해, 총 RNA를 두 양친으로부터 추출하였다. 구체적으로는, 2주령의 식물체에 위황병균을 접종하고, 접종 후 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32 및 72시간 후에 잎과 뿌리 시료를 회수하였다. 모든 시료는 수확 후 액체 질소를 이용하여 얼린 후 -70℃에 보관하였다. 총 RNA는 TRIzol™ 시약을 이용하여 추출하였고, 2㎍의 총 RNA는 oligo-(dT) 프라이머와 TOPscript™ reverse transcriptase (Enzynomics Co., Korea)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 상기 cDNA를 PCR 주형으로 하고, 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다: 94℃ 5분; [94℃ 30초 → 55℃ 30초 → 72℃ 1분](30회 반복); 72℃, 7분. PCR 산물은 1.2~1.5% 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하였다. qRT-PCR 분석은 CFV96™ Real-Time System (Bio-Rad Co., USA)과 SYBR Green Supermix를 이용하여 수행하였으며, qRT-PCR 프로그램은 하기와 같다: 95℃ 10분; [95℃ 15초 → 55-57℃ 20초 → 72℃ 15초](40회 반복). 상대적인 유전자 발현 수준은 2^-ΔΔCt의 방법으로 산출하였으며, 모든 시료는 3반복의 평균으로 계산하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 세트 정보

표적		염기서열 (5'→3')	서열번호	증폭산물(bp)
ORF1	정방향	AAACTCATGCAATATGGGAAAG	3	166
	역방향	CTCCTTCTTCCAAAGCCTTATT	4
ORF2	정방향	ACTTCCTTCTACAGGCCCTAAC	5	162
	역방향	CCTCGAGACTACGTCGATTG	6
ORF3	정방향	TAACATGATAAGCGTTCCAATG	7	169
	역방향	ACGAAGTATACGCTGGAGATTC	8
ORF4	정방향	GATATGTGGCGTTGAAAGTACA	9	154
	역방향	TTAGGACCAGAGTGCTTGAAAT	10
ORF5	정방향	GTAAGGTTTTCCCTTTCGACTT	11	177
	역방향	CATGGACCATTTGATCTCAGTA	12
ORF6	정방향	TCTTCTGAAGTCCTTCCCATTA	13	174
	역방향	CCGACAAAGATAGTGTCTCCTT	14
ORF7	정방향	GAAGGATCTCGGGATTAATGAT	15	172
	역방향	GAGATTCAGCACCTTCACAAC	16
ORF8	정방향	GGGCGAGAAGTATCAGATTGTA	17	163
	역방향	CTTTGATTGCCTTCTCAACTCT	18
ORF9	정방향	ACCGTTGCAAGAAGTACTACGA	19	152
	역방향	AAGACCGTTCTCCTGACAGATA	20
ORF10	정방향	AGCTTCAGCAGTCAGATGTCTA	21	159
	역방향	GAGACGTCTGGTTTCTTCCTC	22
ORF11	정방향	CTTTCCACAGGAAATGAAGAAG	23	169
	역방향	GTTGAAGAACACTTGACGTTGA	24
ORF12	정방향	AGTCAACAACACCAACGGTAA	25	177
	역방향	AAGCATCTTGTAGCTTCCTCAG	26
ORF13	정방향	TTGACTGACTTTGGTGTGAAAG	27	161
	역방향	AAAGCTGCACTAAGCTCAAGAC	28
ORF14	정방향	CTCTCCTCATCCTTCTCATCAA	29	153
	역방향	ATGACTGCAATCTCCTTCCTAA	30
ORF15	정방향	CCAAGTTTTGGACATGGTAGAT	31	165
	역방향	GAGTTCATCATGGGATTGACTT	32

실시예 1. 게놈 정보에 기반한 유전적 마커 개발

Fwr1 좌(qFW4)는 LG3의 ACMP0606와 RSS2974의 SSR 마커 사이에서 맵핑되었고, 애기장대의 3번 염색체에 있는 유전 지역과 동일선상에 있음을 보여주었다. 이 지역은 선조의 십자화과 게놈의 M 및 N 블럭에 대응된다. 무 품종 'WK10039'의 draft 게놈 어셈블리가 이용가능하기 때문에, 본 발명자는 무 참조 게놈(http://radish-genome.org)을 찾기 위해 6개의 SSR 마커 (RSS0769, ACMP0239, ACMP0740, RSS0193, RSS2249 및 RSS1763) 서열을 쿼리(query)로 하여 BLAST 알고리즘을 이용하였다. 모든 마커가 염색체 R05에 맵핑되었고, 물리적 거리는 27,527,084 bp에서 30,502,588 bp로 확인되었다. 이 좌의 물리적 지도를 참조 서열에 근거하여 제작하였다(도 1). Fwr1를 포함하는 지역의 범위를 정하기 위해서, 유전자내 지역(intragenic region)을 표적으로 하는 63개의 InDel/SNP 프라이머 세트를 제작하였고, 두 양친의 표적 지역에 인접한 스캐폴드 서열에 기반한 유전자간 지역(intergenic region)을 표적으로 하는 22개의 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 85개 프라이머 세트에서, 59개(69.4%)의 프라이머 세트가 예측된 서열을 증폭하였고, 두 양친 계통 '835'와 'B2' 사이의 명백한 다형성을 보여주었다. 이들 프라이머 세트(마커)를 'FM-00'으로 명명하고, F₂ 재조합 식물체를 이용하여, 이들의 Fwr1에 대한 유전적 연관도를 조사하였다. 이들 마커 중, 24개의 마커가 Fwr1와 연관되어 있었다. 3개의 SNP 마커와 21개의 InDel 마커에 근거하여 Fwr1 좌에 대한 고해상도 유전자 지도를 작성하였다(도 1b).

실시예 2. Fwr1 좌의 Fine-mapping

초기 Fwr1 QTL 간격은, LG3 (5번 염색체)에서 인접한 두 개의 마커 ACMP0606 및 RSS2974 사이의 17.7 cM이었다. Fwr1 좌의 표적 지역을 좁히기 위해서, 2,627개로 이루어진 F₂ 집단을 이용하였다. 먼저, ACMP0606 및 RSS2974 SSR 마커 사이에 재조합이 일어난 354개의 F₂ 식물체를 선발하였다. 선발된 F₂ 식물체 집단을 새롭게 개발한 마커를 사용하여 유전형 분석을 수행하였다. 각 유전형에 따라 14개의 그룹(G1~G14)으로 나뉘어지는 37개 재조합 식물체에 기반하여 표적 지역의 범위를 정하였다. 재조합 식물체의 평균 표현형 결과를 위황병에 대한 저항성을 보이는 'B2'와 이병성을 보이는 '835' 양친의 표현형 결과와 비교하였다.

재조합 그룹 1 내지 8에 속하는 식물체는 ACMP0606 마커에서 RSS2974 마커 쪽으로 점진적으로 크기가 작아지는 'B2' 게놈의 단편을 포함하며, 'B2'와 위황병 발병도가 유사한 것으로 확인되었으며, Fwr1 지역이 FM-82 까지로 정해졌다. 재조합 그룹 11 내지 14에 속하는 식물체는 RSS2974 마커에서 RSS0769 마커 방향의 다른 'B2' 단편을 포함하며, 위황병에 이병성인 것으로 확인되어, Fwr1 좌가 RSS2974 마커와 RSS0769 사이에 위치하는 것이 아님을 알 수 있었다. 재조합 그룹 9 및 10에 속하는 식물체는 RSS2974 마커에서 FM-77 마커쪽으로 점점 더 큰 'B2' 단편을 가지고 있으며, 위황병에 저항성을 보여, Fwr1 좌가 FM-87과 ACMP0606 사이에 위치하지 않음을 유추할 수 있었다. 상기 결과에 비추어, Fwr1 좌는 FM-87 및 FM-82 사이의 1.8 cM으로 좁혀졌으며, 상기 지역은 FM-64, FM-11, FM-68 및 FM-09 마커를 포함하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. Fwr1 좌의 물리적 맵핑 및 후보 유전자의 예측

이용가능한 'WK10039' 무 게놈 서열에 따라 Fwr1 좌를 FM-87 및 FM-82 마커 사이의 139.8 kb로 범위를 정하였고, 상기 범위 내에 15개의 유전자 (ORF1 내지 ORF15)가 예측되었다(도 2 및 도 3). 상기 15개의 유전자의 예상되는 기능 및 상세 정보는 하기 표 2와 같다.

후보 유전자 지역의 주석(annotation)

ORF ID	Radish Gene ID	Protein length	Arabidopsis gene ID	Gene symbol	Annotation (functional description)
ORF1	Rs258030	490 (a.a)	AT3G53160	UGT73C7	UDP-glucosyl transferase 73C7
ORF2	Rs258040	192	AT2G07674	-	transmembrane protein
ORF3	Rs258050	262	AT3G53140	-	O-methyltransferase family protein
ORF4	Rs258060	484	AT3G53030	SRPK4	ser/arg-rich protein kinase 4
ORF5	Rs258070	329	AT3G53000	PP2-A15	phloem protein 2-A15
ORF6	Rs258080	468	AT3G52990	-	Pyruvate kinase family protein
ORF7	Rs258090	217	AT3G52960	-	Thioredoxin superfamily protein
ORF8	Rs258100	428	AT2G36530	LOS2	Enolase
ORF9	Rs258110	1295	AT3G52930	FBA8	Aldolase superfamily protein
ORF10	Rs258120	165	AT3G52920	-	transcriptional activator (DUF662)
ORF11	Rs258130	382	AT3G52910	GRF4	growth-regulating factor 4
ORF12	Rs258140	1005	AT3G52900	-	RAB6-interacting golgin (DUF662)
ORF13	Rs258150	396	AT3G52880	MDAR1	monodehydroascorbate reductase 1
ORF14	Rs258160	156	AT3G52860	-	mediator of RNA polymerase II transcription subunit-like protein
ORF15	Rs258180	434	AT3G52820	PAP22	purple acid phosphatase 22

5개의 유전자는 단백질 변형 효소와 관련되어 있었으며 다음과 같다: ORF1 (Rs258030, UDP-glucosyl transferase), ORF3 (Rs258050, O-methyltransferase family protein), ORF8 (Rs258110, enolase), ORF13 (Rs258150, monodehydroascorbate reductase), 및 ORF15 (Rs258180, purple acid phosphatase). ORF4 (Rs258060) 및 ORF6 (Rs258080) 유전자는 각각 serine/arginine-rich protein kinase 및 pyruvate kinase family protein을 코딩하고 있었다. 또한, ORF2 (Rs258040)는 transmembrane protein을 코딩하고 있는 것으로 예측되었으며, ORF11 (Rs258130) 및 ORF7 (Rs258090)는 각각 growth-regulating factor 4-encoding transcription activator 및 thioredoxin superfamily protein을 코딩하는 것으로 예상되었다.

실시예 4. 예측 유전자의 발현 수준 분석

병원균의 접종 전·후, 두 양친 계통의 뿌리 및 잎 조직에서 각 후보 유전자들의 발현 수준을 RT-PCR로 분석하였다. 그 결과, Fwr1 표적 지역 내에서 예측된 대부분의 유전자(ORF1, ORF2, ORF5, ORF6, ORF7, ORF12, ORF13, ORF14 및 ORF15)에서 '835'(이병성)와 'B2'(저항성) 식물체간 발현 수준에 차이가 확인되지 않았다(도 3). 그러나, ORF4의 경우 'B2' 식물체에서 '835' 식물체에 비해 현저히 높은 발현 수준을 보여주었으며, 병원균 접종 후에는 두 양친에서 모두 발현 수준이 증가되었으나, 특히 'B2'에서 발현 증가가 더 현저한 것을 알 수 있었다. 반면, ORF3의 발현 수준은 병원균 접종 전과 후 모두에서, '835' 식물체에서 발현 수준이 'B2' 식물체보다 높게 확인되었다. 상기 결과에 근거하여, ORF3 및 ORF4의 발현 경향을 qRT-PCR을 통해 보다 명확하게 분석하였다. 그 결과, RT-PCR 결과에서와 같이, 잎과 뿌리 조직에서 ORF3의 발현은 '835' 식물체에서 'B2' 식물체보다 높게 확인되었으며, 병원균 접종 후 잎과 뿌리 조직에서 각각 8시간 및 72시간 후에 가장 높은 발현 수준을 보여주었다(도 4a 및 4b). 반면, ORF4의 발현은 'B2' 식물체에서 '835' 식물체보다 3배 정도 높은 발현 수준을 나타내었으며, 병원균 접종 후 잎과 뿌리 조직에서 ORF4의 발현 수준히 상향 조절되는 것을 알 수 있었다(도 4c 및 4d).

두 후보 유전자의 게노믹 DNA 및 cDNA 서열을 클로닝하고 시퀀싱하여 양친 계통의 NGS 결과가 정확한지 평가하였다. 본 발명자는 ORF4 서열 내의 SNP 또는 InDel이 아미노산 서열에 영향을 미치는지 분석하였다. 5개의 SNP 및 2개의 결실이 ORF4의 엑손 2에서 확인되었고, 이들은 'B2' 식물체에서 각각 리신 (lysine, K), 아르기닌 (arginine, R), 프롤린 (proline, P), 글리신 (glycine,G) 및 트레오닌 (threonine, T)으로 확인된 반면, '835' 식물체에서는 아르기닌, 발린 (valine, V), 발린, 리신, 발린 및 2개의 알라닌 (alanine, A)으로 대응되었다(도 5). ORF3 내에서는 어떠한 비동의 돌연변이(nonsynonymous mutation)도 발견되지 않았다. 이를 통해 Fwr1 QTL에 대한 적합한 후보 유전자는 ORF4로 판단되었다. ORF4 서열은 2개의 기능적으로 보존된 도메인(STPK (serine/threonine protein kinase) 및 ATP-결합 단백질 키나제 도메인)을 가진 SRPK4(serine/arginine-rich protein kinase 4) 단백질을 코딩한다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> SRPK4 gene for enhancing plant resistance to fusarium wilt and uses thereof <130> PN19356 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1800 <212> DNA <213> Raphanus sativus <400> 1 atggaggcgg agaagtggag cagcgacggt ggcggcgaat acacttcgga ggacgaaggg 60 actgaggatt accgccgcgg cggttaccac gccgttcgga tcggcgactc cttcaagagc 120 ggccggtacg ttgtccagag caaactcggc tggggccatt tctccaccgt ctggctctcc 180 tgggacactc tatcctctag atatgtggcg ttgaaagtac aaaagagtgc acagcactat 240 accgaagctg ccatggacga gataacaata ttgcaacaga tcgctgaggg agacgctgat 300 gataccaaat gcgttgtgaa gcttttggat catttcaagc actctggtcc taacggtcag 360 catgtgtgta tggttttcga gtacttggga gataacttgc taacgcttat aaagtattct 420 gactaccgtg gcttgcctat tcccatggtt aaggagattt gttaccacat gttggttggt 480 ttggactact tgcataaaga gctctctatt atacataccg atctcaagcc tgagaatgta 540 ctgttggtat cgaggatcga tccgtctaag gatcctagga agtccggagc tccgcttgtt 600 atcgctagtg gtaaggagaa gactgttgac 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Val Cys Met Val Phe Glu Tyr 115 120 125 Leu Gly Asp Asn Leu Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly 130 135 140 Leu Pro Ile Pro Met Val Lys Glu Ile Cys Tyr His Met Leu Val Gly 145 150 155 160 Leu Asp Tyr Leu His Lys Glu Leu Ser Ile Ile His Thr Asp Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Asn Val Leu Leu Val Ser Arg Ile Asp Pro Ser Lys Asp Pro 180 185 190 Arg Lys Ser Gly Ala Pro Leu Val Ile Ala Ser Gly Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Val Asp Ser Asn Gly Asp Phe Val Lys Asn Gln Lys Lys Asp Val Arg 210 215 220 Arg Arg Lys Pro Ser Gly Ala Ala Glu Glu Asp Cys Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Thr Ala Asn Gly Gly Glu Glu Val Lys Gln Gly Gly Lys Lys Gly Ser 245 250 255 Arg Ser Ser Arg Arg His Leu Val Glu Ser Ala Asp Leu Lys Cys Lys 260 265 270 Leu Val Asp Phe Gly Asn Ala Cys Trp Thr Tyr Lys Gln Phe Thr Ser 275 280 285 Asp Ile Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Cys Pro Glu Val Ile Leu Gly Ser 290 295 300 Lys Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Leu Trp Ser Phe Ala Cys Ile Cys Phe 305 310 315 320 Glu Leu Ala Thr Gly Asp Val Leu Phe Asp Pro His Ser Gly Asp Asn 325 330 335 Tyr Asp Arg Asp Glu Asp His Leu Ala Leu Met Met Glu Leu Leu Gly 340 345 350 Met Met Pro Arg Lys Ile Ala Leu Gly Gly Arg Tyr Ser Arg Asp Leu 355 360 365 Phe Asn Arg His Gly Asp Leu Arg His Ile Arg Arg Leu Arg Phe Trp 370 375 380 Pro Met Asn Lys Val Leu Thr Glu Lys Tyr Glu Phe Ser Glu Gln Asp 385 390 395 400 Ala Asn Glu Leu Ser Asp Phe Leu Val Ser Ile Leu Asp Phe Val Pro 405 410 415 Glu Lys Arg Pro Thr Ala Ala Gln Cys Leu Leu His Pro Trp Ile Asn 420 425 430 Ser Val Pro Arg Ser Leu Glu Pro Pro Leu Ser Pro Glu Gly Lys Leu 435 440 445 Val Asp Thr Glu Arg Lys Lys Arg Glu Asn Glu Glu Gln Glu Gly Val 450 455 460 Val Val Lys Met Gly Asn Val Ala Ile Ser Ser Pro Lys Ser Lys Pro 465 470 475 480 Ala Cys Leu Phe Leu Pro Thr Val Ala Phe Pro Arg Pro Cys Ile Val 485 490 495 Ile His Pro Arg Pro Thr Val Val Lys Arg Leu Thr Ser Tyr Leu Ile 500 505 510 Arg Arg Phe Gln Gln Leu Val Gln Ala Ser Tyr Pro Phe Thr Ser Thr 515 520 525 Val Thr Val Leu Phe Pro Ala Ser Arg Ile Ser Ser Pro Leu Glu Gly 530 535 540 Val Ala Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Leu Lys 545 550 555 560 His Pro Leu Ser Ser Pro Ser Leu Pro Phe Phe Thr Ser Thr Ile Glu 565 570 575 Ala Val Tyr Thr Ala Leu Lys Glu Ala Glu Leu Arg Gly Thr Ser Gly 580 585 590 Leu Ser Pro Ala Pro Lys Arg 595 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaactcatgc aatatgggaa ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctccttcttc caaagcctta tt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acttccttct acaggcccta ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cctcgagact acgtcgattg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 taacatgata agcgttccaa tg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acgaagtata cgctggagat tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gatatgtggc gttgaaagta ca 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttaggaccag agtgcttgaa at 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtaaggtttt ccctttcgac tt 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catggaccat ttgatctcag ta 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcttctgaag tccttcccat ta 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ccgacaaaga tagtgtctcc tt 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gaaggatctc gggattaatg at 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gagattcagc accttcacaa c 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gggcgagaag tatcagattg ta 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (8)

1. 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 위황병(Fusarium wilt) 저항성 무 품종 판별용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 위황병은 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp. raphani)에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
3. 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 위황병(Fusarium wilt) 저항성 무 품종 판별용 키트.
4. 무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 위황병(Fusarium wilt) 저항성 무 품종의 판별 방법.
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