KR102358788B1 - 저온 내성 양배추 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

저온 내성 양배추 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저온 내성 양배추 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 BoCSDP5 유전자 내 존재하는 InDel 분자마커 및 상기 분자마커 증폭용 프라이머 세트는 저온 내성 양배추 품종과 저온 민감성 양배추 품종을 신속하고 정확하게 구별할 수 있으므로, 재배 농가 및 소비자에게 고품질의 양배추 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

저온 내성 양배추 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker and for discriminating low temperature-tolerant cabbage cultivar and uses thereof}
본 발명은 저온 내성 양배추 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
저온(low temperature) 스트레스는 20℃ 이하의 칠링(chilling) 온도 및 0℃ 이하의 냉동(freezing) 온도에서 발생할 수 있으며, 식물의 생장과 발달에 심각한 영향을 미쳐 작물 생산성을 제한하는 주요 환경 스트레스이다. 다양한 식물 종은 유전자 발현을 프로그래밍하여 생리, 대사 및 성장을 조절함으로써 저온 스트레스에 대처한다.
양배추(Brassica oleracea)와 같은 브라시카 식물의 겨울철 생존 능력은 중요한 원예 형질이며, 이러한 특성은 동결 내성, 춘화처리에 의한 개화 유도, 잎의 특징 등과 같은 저온반응 형질을 결정하는 유전자들의 변이에 의해 영향을 받을 수 있다. 새로운 저온 내성 작물 품종을 개발하기 위한 최선의 접근 방법은 저온 내성에 대한 특이적 유전인자를 발굴하고, 확인된 유전자좌를 엘리트 품종으로 도입하는 것이다. 최종적으로 표적 유전자좌가 도입된 개체 선발의 정확한 판단을 위해 분자마커의 활용은 육종에 필수 불가결한 접근 방식이 되었다.
분자마커 개념이 도입된 분자 육종은 선발의 효율성과 정확성으로 인해 육종 연한을 기존 육종에 비해 1/3 이상 단축할 수 있고 환경에 의한 영향도 없으며, 조기에 정밀 검정을 통해 비용을 절감시킬 수 있는 이점이 있다. 분자마커는 신뢰할 수 있고 시간 및 비용을 효율적으로 절약할 수 있으므로, 농업경제학에서 부작용 없이 육종 능력과 작물의 품질 및 특성을 향상시키기 위한 도구로 사용되고 있다. 따라서 분자마커와 같은 기술을 육종도구로 이용하면, 단기간에 좋은 품질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 한 품종이 여러 가지 우수한 형질을 함유할 수 있도록 육성할 수 있기 때문에 고부가가치 품종을 개발할 수 있다. 특히, InDel(insertion/deletion) 분자마커는 DNA 염기서열 분석을 통해 발견된 품종 간 특정 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 한 것으로, 이를 증폭하는 프라이머를 제작하여 PCR 분석을 수행한 결과 나타나는 다형화 현상을 통해 쉽고 간단하게 결과를 해석할 수 있다.
양배추의 저온 내성 평가는 육종 전문가의 의견과 전해질 누출 값에 의존하고 있으며, 대부분의 한국산 종자에는 저온 내성에 관한 원예 특성이 잘 알려진 생식질에 충분하지 않다. 따라서, 저온 내성 양배추 품종을 쉽고 간단하게 선별할 수 있는 방법의 개발이 절실히 필요하나 아직까지 그에 대한 연구가 미미한 실정이다.
한편, 한국등록특허 제2051578호에는 '양배추 TPPI 유전자를 이용한 내서성 품종의 선별을 위한 특이 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1485831호에는 '저온 저항성 관련 유전자 및 형질전환 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '저온 내성 양배추 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 저온 내성 형질을 가지는 양배추와 저온 민감성 형질을 가지는 양배추에서 발현 양상의 차이를 보이는 BoCSDP5 유전자를 선발하였고, BoCSDP5 유전자의 염기서열 분석을 통해 InDel 다형성 부위를 확인하여 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였고, 이를 이용하여 양배추 계통들을 분석한 결과, 본 발명의 InDel 분자마커와 프라이머 세트는 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통과 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통을 효과적으로 구별하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 저온 내성 양배추와 저온 민감성 양배추 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 InDel 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 저온 내성 양배추 품종 선별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 저온 내성 양배추 품종 선별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 저온 내성 양배추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 분자마커는 저온 내성 양배추 품종을 효율적으로 선별할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감할 수 있으며, 재배 농가 및 소비자에게 고품질의 양배추 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통과 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통에서의 저온 내성에 관여하는 유전자의 발현 양상을 다양한 온도에서 분석한 PCR 결과이다. BN106 및 BN553; 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통, BN107 및 BN554; 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통.
도 2는 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통(BN106)의 BoCSDP5v 유전자와 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통(BN107)의 BoCSDP5 유전자에서 나타난 InDel 다형성 부위와 본 발명에서 제작된 프라이머의 위치(화살표)를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통(BN106)과 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통(BN107)을 구별한 PCR 결과이다. A는 F1xR1 프라이머 세트를 이용한 결과이고, B는 F1xR2 프라이머 세트를 이용한 결과이다.
도 4는 저온 처리 시, 전해질 누출율을 나타낸 결과로, A는 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통 BN553(RR), 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통 BN554(SS) 및 이들의 교배를 통한 F1 식물 BN551(RS)의 전해질 누출율을 나타낸 결과이고, B는 F2 분리 집단 내의 저온 내성 동형접합체(RR), 저온 민감성 동형접합체(SS) 및 저온 내성과 민감성의 이형접합체(RS)의 전해질 누출율을 나타낸 결과이다.
도 5A는 129개의 F2 개체의 유전자형을 나타낸 모식도로, 파란색은 RR로 저온 내성 형질을 가지고, 노란색은 RS로 저온 내성 형질을 가지며, 분홍색은 SS로 저온 민감성 형질을 가지는 개체를 나타낸다. 도 5B는 F1xR1 프라이머 세트를 이용하여 F2 집단의 개체에서 저온 내성 형질을 구별한 PCR 결과이다.
도 6은 F1xR1 프라이머 세트와 F1xR2 프라이머 세트를 이용하여 저온 내성의 계통 및 품종 24개(A)와 저온 민감성 계통 및 품종 15개(B)를 구별한 PCR 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저온 내성 양배추와 저온 민감성 양배추 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 InDel 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2는 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 1에 나타내었다.
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 2개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 2개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 저온 내성 양배추 품종을 더욱 효율적으로 선별할 수 있다.
본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하면 저온 내성 양배추 품종과 저온 민감성 양배추 품종에서 크기가 다른 증폭 산물이 검출되고, 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하면 저온 내성 양배추 품종에서만 증폭 산물이 검출되도록 함으로써 저온 내성 양배추 품종을 효과적으로 선별할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3, 4 및 5의 서열 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4 및 5의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 프라이머 중 서열번호 3은 정방향 프라이머이며, 서열번호 4 및 5는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열의 InDel 다형성 뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 저온 내성 양배추 품종 선별용 마이크로어레이를 제공한다.
바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 양배추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 저온 내성 양배추 품종을 선별하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 양배추 재료 및 재배 조건
본 발명에 사용된 양배추는 저온 내성에 대해 대조되는 형질을 가지는 Brassica oleracea의 내혼계로 ㈜아시아종묘에서 종자 또는 잎의 형태로 분양받았다. 저온 내성 형질을 가지는 BN106, BN553 계통과 저온 민감성 형질을 가지는 BN107, BN554 계통을 사용하였다. 종자는 파종 후 충남대학교 생장실의 광자 플럭스 밀도(140×2 μmol/m2/s)에서 16시간 명/8시간 암 조건의 광주기로 22℃에서 4주 동안 재배되었다. 저온 처리를 위해, 생장실에서 성장한 4주령의 묘목을 저온 인큐베이터(LRH-250CA, IREA Tech., Korea)를 사용하여 10℃에서 4℃, 0℃ 및 -2℃까지 순차적으로 낮춰가며 각 온도에 2시간씩 노출시켰다. 3개의 개별 식물로부터 3회 반복된 잎 샘플을 수집하여, 액체질소에서 즉시 냉동시킨 뒤 -80℃에서 저장하여 이후 실험에 사용하였다.
2. RNA 추출 및 유전자 발현 분석
액체질소에서 분쇄된 샘플에 TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 처리하여 총 RNA를 분리하고 NucleoSpin RNA Clean-up 키트(Macherey-Nagel GmbH & Co., Germany)로 정제하였다. 총 RNA(1 ㎍)를 RQ1 RNase-free DNase(Promega, USA)로 처리하고, cDNA를 Oligo(dT) 프라이머(Toyobo, Japan)와 함께 Revertra Ace Kit(TOYOBO, Japan)를 사용하여 합성하였다. 합성된 cDNA를 4배 희석하고 그 중 1 ㎕를 주형으로 사용하여 총 20 ㎕의 PCR 혼합물을 제조하였다. RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다: 94℃에서 3분 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 55~64℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 30초 동안 합성하는 사이클을 29회 반복 후, 72℃에서 5분 동안 최종 연장하고 종료하였다. RT-PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 1.2~1.5% 아가로스 겔에서 분리하고 에티듐브로마이드(EtBr)로 염색하였다.
정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)은 SYBR Green Realtime Master Mix(TOYOBO, Japan)를 사용하여 MiniOpticon 시스템(Bio-Rad, USA)에서 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30 초 동안 어닐링 및 72℃에서 30초 동안 합성하는 사이클을 40회 반복하였고, 각 사이클의 마지막 단계에서 형광값을 측정하였다. 모든 분석은 3개의 생물학적 복제물로 수행되었다. 표적 유전자의 전사 수준을 BoActin2 유전자에 대해 정규화하고 2-ΔΔcT방법(Livak et al. 2001. Methods 25: 402-408)을 사용하여 분석하였다.
3. 염기서열 분석
양배추 시료의 잎으로부터 DNeasy Plant Mini 키트(Qiagen Gmbh, Germany)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. BoCSDP5 유전자의 프로모터 및 코딩 서열(CDS)을 포함한 영역을 확보하기 위해 PF:5'-AAACGAGGCAAAACCCCGCA(서열번호 6), PR:5'-GCCGATTGATTCTCTAGCGCCAT(서열번호 7), CSDP5-F3:5'-ATGGCGCTAGAGAATCAATCGGC(서열번호 8), CSDP5-R3:5'-AGGACCAGGCGAAWTCATCATTCC(서열번호 9)를 프라이머로 사용하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 3분 동안 합성하는 사이클을 30회 반복 후, 72℃에서 7분 동안 최종 연장하고 종료하였다. PCR 반응 종료 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고 LaboPass Gel Extraction Kit(COSMOGENETECH, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 T&A 클로닝 벡터(RBC, Taiwan)에 클로닝하고 대장균 균주 DH5α로 형질전환시켰다. LabBoPass Plasmid Mini Kit(COSMOGENETECH)를 이용하여 형질전환된 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. PCR 또는 서열분석 오류를 제거하고 염기서열의 대표성을 높이기 위해 각 계통 및 품종마다 6~10개의 클론을 분석하였고, 염기서열 분석은 양방향으로 읽었다(Macrogen, Korea). 수득된 서열은 다중 서열 정렬 프로그램 CLUSTAL Omega(EMBL-EBI, UK)을 사용하여 비교 및 분석하였다.
4. 분자마커의 개발 및 PCR 분석
대립되는 저온 내성 형질을 가진 양배추로부터 분리한 BoCSDP5 유전자의 염기서열의 비교를 통해 발견한 InDel 변이를 기반으로 하여 저온 내성 및 민감성을 구별하기 위한 프라이머를 제작하였다. 이를 이용한 PCR 반응액의 조성은 주형의 gDNA 10 ng, 5 pmol의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머, 5X HiPi Plus PCR 프리믹스 버퍼로 구성된 총 20 ㎕ 반응액이다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 30초 동안 변성, 60℃(F1xR1 프라이머 세트) 또는 63℃(F1xR2 프라이머 세트)에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 30초 동안 합성하는 사이클을 27회 반복 후, 72℃에서 7분 동안 최종 연장하고 종료하였다. PCR 증폭 산물 중 10 ㎕를 취해 1.5% 아가로스 겔에 로딩 후 전기 영동하여 증폭된 밴드를 분석하였다.
5. 전해질 누출 측정
전해질 누출 측정을 통해 양배추 시료의 저온 내성 정도를 조사하였다(Mao et al., 2015. Theor Appl Genet 128: 1359-1371; Dong et al., 2015. PLoS One 10: e0130451). 양배추 시료를 4℃에서 7일 동안 순응시킨 후, 0℃, -2℃ 및 -6℃ 의 각 온도에 2시간씩 순차적으로 노출시켰다. 각각의 처리가 끝날 때, 성장하는 정점으로부터 3번째~4번째 잎에서 10개의 원형 조각(r=1㎝)을 절단하여 12 ㎖의 증류수와 함께 50 ㎖ 유리관에 모은 다음, 실온(22℃)에서 30분 동안 150rpm으로 진탕하였다. 초기 전도도(Ci)는 CON110 전도도 미터(Oakton Ins. USA)를 사용하여 측정하였다. 이후, 끓는 수조에서 15분 동안 반응시키고, 실온으로 냉각시켜 최종 누출(Cf)을 측정하였다. 상대 전해질 누출은 공식 Ci/Cfx100을 사용하여 계산하였다.
실시예 1. 저온 내성 양배추 선별용 분자마커 개발
저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통 BN106, BN553 및 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통 BN107, BN554를 이용하여 저온 내성에 관여하는 유전자를 선발하였다. 각각의 개별 식물체에 -2℃까지 저온 처리를 한 후, 저온 반응성 유전자의 발현을 비교 분석하였다. 그 결과, BoCBF 유전자 및 BoCOR 유전자는 저온에 반응하는 발현 양상을 보인 반면, BoCSDP 유전자는 저온 처리에 관계없이 일관된 발현 양상을 보이는 것을 확인하였다. 특히, BoCSDP5 유전자는 저온 내성 계통과 저온 민감성 계통에서 증폭 산물의 크기가 다른 것을 확인하였고 이를 통해 BoCSDP5 유전자형에 다형성이 발생한 것을 알 수 있었다(도 1).
상기 결과를 바탕으로 저온 내성 계통 BN106, BN553 및 저온 민감성 계통 BN107, BN554로부터 BoCSDP5 유전자의 코딩 서열 부분을 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 그 결과, BN106 및 BN553의 코딩 서열은 825bp였고, BN107 및 BN554의 코딩 서열은 753bp로 확인되었다. BN107 및 BN554의 BoCSDP5 유전자 서열은 지금까지 보고된 CSDP5의 서열과 동일하여 BoCSDP5로 명명하였고, BN106 및 BN553의 BoCSDP5 유전자는 BoCSDP5v로 명명하였다.
BoCSDP5 및 BoCSDP5v 유전자의 염기서열을 비교하여 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 부위를 분석한 결과, 3개의 InDel 부위를 발견하였고 이로 인해 증폭 산물의 크기가 다르게 나타난 것임을 확인할 수 있었다. 특히, BoCSDP5v 유전자는 BoCSDP5 유전자와 달리 412~498번째 염기 사이에 삽입된 87bp의 서열이 확인되었다(도 2). 상기 삽입 또는 결실된 염기서열 정보는 하기 표 1과 같다.
Figure 112020098311941-pat00001
실시예 2. 분자마커를 이용한 저온 내성 양배추 구별
BoCSDP5 및 BoCSDP5v 유전자의 염기서열 비교분석을 통해 선별된 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였다(표 2). F1xR1 프라이머 세트의 경우, 선별된 InDel 마커 부위를 기준으로 양쪽 방향의 주변 서열을 증폭하도록 제작함으로써 PCR 분석 결과 크기가 다른 증폭 산물이 생성되도록 설계하였다. 또한, R2 프라이머를 선별된 InDel 마커의 내부 서열을 반영하여 제작함으로써 F1xR2 프라이머 세트를 이용할 경우, BoCSDP5v 유전자에서만 증폭 산물이 생성되도록 하였다.
저온 내성 양배추 선별용 프라이머
유전자 이름 프라이머 이름 염기서열(5'→3')
BoCSDP5 F1 ACCGAGGAGCTTTTCGTCCACCAAT (서열번호 3)
R1 ACCAGACTGCCTCTTACTCGGACATT (서열번호 4)
R2 CCACGCTCACCGCTAGGTTTCTG (서열번호 5)
두 개의 프라이머 세트 F1xR1과 F1xR2를 이용하여 저온 내성 계통 BN106 및 저온 민감성 계통 BN107의 DNA 시료를 주형으로 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, F1xR1 프라이머 세트를 이용했을 때는 상기 선별된 InDel 마커의 삽입된 서열에 의해 저온 내성 계통 BN106(BoCSDP5v 유전자)의 증폭 산물의 크기가 더 큰 것을 확인하였고, F1xR2 프라이머 세트를 이용했을 때는 상기 선별된 InDel 마커에 의해 저온 내성 계통 BN106(BoCSDP5v 유전자)에서만 증폭 산물이 검출되는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 3. 저온 내성 형질의 유전학적 분석
저온 내성 형질과 BoCSDP5 대립 유전자와의 연관성에 관한 유전학적 분석을 수행하기 위해, 저온 내성 형질을 가지는 양배추 계통 BN553(RR)과 저온 민감성 형질을 가지는 양배추 계통 BN554(SS)의 교배를 통한 F1과 F2 유전자 집단을 확보하였다. 확보된 F1 식물을 BN551(RS)로, F2 식물을 BN552로 명명하였다. F2 분리 집단 내에서 저온 내성 동형접합체(RR), 저온 민감성 동형접합체(SS) 및 저온 내성과 민감성의 이형접합체(RS)로 나누었다. 상기 식물체를 대상으로 저온 처리 시 발생되는 전해질 누출을 측정하여 저온 내성을 평가하였다. 그 결과, BN553(RR)과 BN551(RS)은 저온 처리 시의 전해질 누출율이 유사한 반면, BN554(SS)는 다른 식물에 비해 전해질 누출이 더 많은 것을 확인하였다(도 4A). 이러한 양상은 F2 집단 내의 RR, SS 및 RS에서도 유사한 패턴으로 나타났다(도 4B).
또한, 129개의 F2 개체의 DNA 시료를 주형으로 하여 F1xR1 프라이머 세트를 이용한 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 저온 내성 동형접합체(RR)에서는 501bp 크기의 밴드가 검출되었고, 저온 민감성 동형접합체(SS)에서는 414bp 크기의 밴드가 검출되었으며, 저온 내성과 민감성의 이종접합체(RS)에서는 두 개의 밴드가 모두 검출되었다(도 5). 따라서, 상기 결과를 통해 전해질 누출율은 저온 내성 형질에 반비례하는 것을 확인하였고, 저온 내성 형질에서 BoCSDP5v 유전자형이 우성 형질임을 확인하였다.
실시예 4. 저온 내성 양배추 품종 선별을 위한 프라이머 효능 검정
본 발명의 분자마커와 이를 증폭하는 프라이머의 효능을 검정하기 위해 저온 내성의 계통 및 품종 24개와 저온 민감성 계통 및 품종 15개에 대하여 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, F1xR1 프라이머 세트는 BoCSDP5v 유전자(저온 내성 형질 양배추)와 BoCSDP5 유전자(저온 민감성 형질 양배추)를 모두 증폭시키되 증폭 산물의 크기가 다르게 나타나게 하였고, F1xR2 프라이머 세트는 BoCSDP5v 유전자(저온 내성 형질 양배추)만을 특이적으로 증폭시키는 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 본 발명의 분자마커와 이를 증폭하는 프라이머 세트는 저온 내성 형질의 양배추를 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하였다.
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Claims (8)

  1. 저온 내성 양배추와 저온 민감성 양배추 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 InDel 조성물.
  2. 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 기재된 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 저온 내성 양배추 품종 선별용 마이크로어레이.
  5. 제2항 또는 제3항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 저온 내성 양배추 품종 선별용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  7. 양배추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 저온 내성 양배추 품종을 선별하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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