UA124831C2 - Молекула нуклеїнової кислоти для забезпечення інсектицидних властивостей у рослин - Google Patents
Молекула нуклеїнової кислоти для забезпечення інсектицидних властивостей у рослин Download PDFInfo
- Publication number
- UA124831C2 UA124831C2 UAA201800600A UAA201800600A UA124831C2 UA 124831 C2 UA124831 C2 UA 124831C2 UA A201800600 A UAA201800600 A UA A201800600A UA A201800600 A UAA201800600 A UA A201800600A UA 124831 C2 UA124831 C2 UA 124831C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- plant
- nucleic acid
- acid molecule
- transgenic
- cell
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 156
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 129
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 152
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 271
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 124
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 61
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 57
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 55
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 47
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 34
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 14
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 claims description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 112
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 79
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 79
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 78
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 39
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 27
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 21
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 21
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 15
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 11
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 10
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 8
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 7
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 7
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 7
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 5
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 5
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 4
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 4
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000747028 Cestrum yellow leaf curling virus Species 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 3
- 102000048193 Mannose-6-phosphate isomerases Human genes 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- -1 gKEMA Proteins 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 2
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 2
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 2
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 241001520823 Zoysia Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005492 Carfentrazone-ethyl Substances 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 101000746263 Conus leopardus Conotoxin Lp5.1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- IRECWLYBCAZIJM-UHFFFAOYSA-N Flumiclorac pentyl Chemical group C1=C(Cl)C(OCC(=O)OCCCCC)=CC(N2C(C3=C(CCCC3)C2=O)=O)=C1F IRECWLYBCAZIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000654674 Homo sapiens Semaphorin-6A Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 239000005590 Oxyfluorfen Substances 0.000 description 1
- OQMBBFQZGJFLBU-UHFFFAOYSA-N Oxyfluorfen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(OCC)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 OQMBBFQZGJFLBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000008406 SarachaNachtschatten Nutrition 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100032795 Semaphorin-6A Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000004790 Solanum aculeatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 235000008424 Solanum demissum Nutrition 0.000 description 1
- 235000018253 Solanum ferox Nutrition 0.000 description 1
- 235000000208 Solanum incanum Nutrition 0.000 description 1
- 235000013131 Solanum macrocarpon Nutrition 0.000 description 1
- 235000009869 Solanum phureja Nutrition 0.000 description 1
- 240000002307 Solanum ptychanthum Species 0.000 description 1
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017622 Solanum xanthocarpum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000951943 Stenotrophomonas maltophilia Dicamba O-demethylase, oxygenase component Proteins 0.000 description 1
- 229930189330 Streptothricin Natural products 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- MLKCGVHIFJBRCD-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-chloro-3-{2-chloro-5-[4-(difluoromethyl)-3-methyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-1,2,4-triazol-1-yl]-4-fluorophenyl}propanoate Chemical group C1=C(Cl)C(CC(Cl)C(=O)OCC)=CC(N2C(N(C(F)F)C(C)=N2)=O)=C1F MLKCGVHIFJBRCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N flumioxazin Chemical compound FC1=CC=2OCC(=O)N(CC#C)C=2C=C1N(C1=O)C(=O)C2=C1CCCC2 FOUWCSDKDDHKQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCNQYNHDVRPZIH-UHFFFAOYSA-N fluthiacet-methyl Chemical group C1=C(Cl)C(SCC(=O)OC)=CC(N=C2N3CCCCN3C(=O)S2)=C1F ZCNQYNHDVRPZIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N fomesafen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 BGZZWXTVIYUUEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- CONWAEURSVPLRM-UHFFFAOYSA-N lactofen Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)OC(C)C(=O)OCC)=CC(OC=2C(=CC(=CC=2)C(F)(F)F)Cl)=C1 CONWAEURSVPLRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024121 nodulation Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008653 root damage Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000352 storage cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- NRAUADCLPJTGSF-VLSXYIQESA-N streptothricin F Chemical compound NCCC[C@H](N)CC(=O)N[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1\N=C/1N[C@H](C(=O)NC[C@H]2O)[C@@H]2N\1 NRAUADCLPJTGSF-VLSXYIQESA-N 0.000 description 1
- OORLZFUTLGXMEF-UHFFFAOYSA-N sulfentrazone Chemical compound O=C1N(C(F)F)C(C)=NN1C1=CC(NS(C)(=O)=O)=C(Cl)C=C1Cl OORLZFUTLGXMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000008511 vegetative development Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Botany (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка забезпечує експресію інсектицидних білків mСry3А та еСry3.1Ab.
Description
Винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка забезпечує експресію інсектицидних білків тСтузА та еСтузЗ.1АБ.
ЖК о Я па зсоце-ов (Вот п. о.) ! х нн РЕ В КУНА оуБіІ-дІ (ОБ оз іа щі М Ме (ЗВУ т.) сперА-оз 074 п. о) К "Ж р. естузлав (ввоп. о.) см і. Ко ї МОБ (ТОВ п. о) ня : 17529 ! ! (55 п. і й 13821 в. о. ЩІ. ебревов й К-
Об п. аа ш і й овдБИ-18 (1955 п, 2.)
БМВ й ШО? СОЮ о. 130 й. ва йо че У ЗК, | й ре ши
ОБО Й
(53 п. 8 с МИ с іно сРАТОовсмопоо и, МОТУЗА СТВ т реЗБ5-04 (531 п. в)
ЩОБ? пові
Фр.
Споріднені заявки
Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент Мо 62/184227, поданою 24 червня 2015 року та включеною в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті.
Заява щодо електронної подачі переліку послідовностей
Перелік послідовностей у текстовому форматі АЗСІЇ, представлений відповідно до 37 С.БЕ.К. 5 1.821, під назвою "80823 5Т2541хї", розміром 30 кілобайт, створений 21 квітня 2016 року і поданий за допомогою ЕЕ5-МЙ/ер, представлений замість паперової копії. Даний перелік послідовностей тим самим включено за допомогою посилання в опис даного документа для його розкриття.
Галузь техніки винаходу
Даний винахід загалом стосується послідовності нуклеїнової кислоти, яка у випадку введення в клітину забезпечує експресію інсектицидних білків тСгузА та еСтуз1АБ.
Передумови винаходу
Шкідники рослин є головним чинником втрати врожаю важливих світових сільськогосподарських культур. Види кукурудзяних жуків розглядаються як найзгубніші шкідники кукурудзи. Важливі види кукурудзяних жуків-шкідників включають Оіаргоїїса мігуіїега мігодітега, західний кукурудзяний жук; 0. Іопдісогпі5 Багбегі, північний кукурудзяний жук, ОЮ. ипаесітрипсіага поугагаї, південний кукурудзяний жук, і Ю. мігдітега 7еає, мексиканський кукурудзяний жук.
Кукурудзяного жука контролюють здебільшого шляхом інтенсивного застосування хімічних пестицидів. Таким чином, можна досягнути гарного контролю кукурудзяного жука, проте ці хімікати також можуть інколи діяти на корисні організми. Іншою проблемою, що виникає в результаті широкого застосування хімічних пестицидів, Є виникнення стійких видів комах. Це частково послаблювалось за допомогою різних практик управління стійкості, проте існує зростаюча потреба в альтернативних стратегіях контролю шкідників. Одна така альтернатива включає експресію чужорідних генів, які кодують інсектицидні білки у трансгенних рослинах. Цей підхід забезпечив ефективні засоби захисту від вибраних комах-шкідників, і були запущені у виробництво трансгенні рослини, що експресують інсектицидні токсини, що дозволяє фермерам зменшити застосування хімічних інсектицидів.
Зо Сту-білки ВасйШив ІПигіпдіепві5 (ВОЮ (що також називаються 5-ендотоксинами) являють собою білки, які формують кристалічний матрикс у Васійи5, які, як відомо, мають інсектицидну активність у випадку поїдання певними комахами. Гени, які кодують Сгу-білки, були виділені, а їхня експресія в сільськогосподарських культурах, як було показано, забезпечувала інший інструмент для контролю важливих з погляду економіки комах-шкідників. Такі трансгенні рослини, що експресують Сгу-білки, були комерціалізовані даючи можливість фермерам зменшувати або збільшувати застосування хімічних засобів контролю комах. Активні щодо твердокрилих Сгу-білки, придатні для трансгенних рослин, включають, наприклад, СтузА, СтуЗзВ і комплекс СтуЗ4/Стуз5.
Хоча застосування трансгенних рослин, що експресують Сгу-білки, є іншим інструментом у комплексі засобів щодо контролю комах, воно все ще схильне до порушення стійкості. Відомі комахи-шкідники, які на сьогодні характеризуються стійкістю до Сгу-білків, що експресуються в певних трансгенних рослинах. Стратегія щодо зниження шансів порушення стійкості являє собою "пакетування" трансгенних ознак із різноманітними механізмами дії щодо тих самих видів комах-шкідників в окремій рослині. На сьогодні трансгенні ознаки часто "пакетують" шляхом селекції та подальшого скринінгу з метою одержання деяких трансгенних ознак в одній комерційній ідіоплазмі. Ці стадії селекції та відбору необхідні для кожного різновиду ідіоплазми, в яку введення цих двох ознак є бажаним. Для багатьох агрономічно важливих культур, таких як кукурудза, ці дві ознаки необхідно підтримувати у вигляді гібридів для десятків різновидів ідіоплазми. Крім того, фактори, такі як зчеплення генів небажаних ознак або генетична рекомбінація, можуть ускладнювати введення двох ознак із двох різних локусів в один різновид ідіоплазми. Таким чином, переважним було б одержати молекулу нуклеїнової кислоти, яка несе декілька інсектицидних ознак і яку можна ввести в один локус в геномі трансгенної рослини.
Короткий опис винаходу
У даному винаході передбачена молекула нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 90 95 ідентична, щонайменше на 95 95 ідентична, щонайменше на 97 95 ідентична, щонайменше на 98 95 ідентична, щонайменше на 99 95 ідентична або на 100 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1. У даному винаході також передбачена молекула нуклеїнової кислоти, молекула химерної нуклеїнової кислоти та/або конструкція рекомбінантної нуклеїнової кислоти або вектор, які містять, складаються з або складаються, по суті, з 5ЕО ІЮ МО: 1. У даному винаході також бо передбачена молекула нуклеїнової кислоти, молекула химерної нуклеїнової кислоти та/або конструкція рекомбінантної нуклеїнової кислоти або вектор, які містять, складаються із або складаються, по суті, з послідовності нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 90 95 ідентична, щонайменше на 9595 ідентична, щонайменше на 9795 ідентична, щонайменше на 98 95 ідентична, щонайменше на 99 95 ідентична або на 100 95 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 1.
У даному винаході також передбачене застосування молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описаної в даному документі, де експресія вказаної молекули нуклеїнової кислоти у клітині забезпечує поліпшені інсектицидні властивості.
У даному винаході також передбачена трансгенна клітина-хазяїн, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описану в даному документі. Трансгенна клітина- хазяїн, описана вище, може являти собою будь-яку придатну прокаріотичну або еукаріотичну клітину, наприклад, бактеріальну клітину або рослинну клітину. В ілюстративних варіантах здійснення трансгенна бактеріальна клітина може являти собою клітину Е5спегіспіа соїї, ВасішШив (наприклад, В. Ійпигіпдіепоі5, В. 5иБій5, В. тедаїегішт; В. сегеи5 тощо), Адгобасієгічт 55р. або
Рзепдотопаб5 55р. Трансгенна рослинна клітина може знаходитись у трансгенній рослині, частині рослини, тканині рослини або культурі рослинних клітин. Трансгенна рослина може бути однодольною або дводольною рослиною. Трансгенна рослина може являти собою види рослин, зокрема без обмеження маїс, сорго, пшеницю, соняшник, помідор, хрестоцвіті, овес, газонну траву, пасовищну траву, різновиди перцю, картоплю, бавовник, рис, сою, цукрову тростину, цукровий буряк, тютюн, ячмінь і олійний рапс.
У даному винаході також передбачене потомство трансгенної рослини будь-якого покоління, де вказана трансгенна рослина містить молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описану в даному документі. У даному винаході також передбачені трансгенне насіння та трансгенна частина рослини для розмноження із указаної трансгенної рослини.
У даному винаході також передбачений спосіб одержання трансгенної рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями, що передбачає введення в рослину молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описаної в даному документі, за рахунок чого здійснюється одержання трансгенної рослини, де молекула нуклеїнової кислоти здатна експресувати гени тсСгузА та еСгузЗ.1АБ у кількості, яка забезпечує поліпшену інсектицидну активність.
Зо У даному винаході також передбачений спосіб одержання трансгенної рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями, що передбачає стадії (а) одержання молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описаної в даному документі; (б) введення в рослину, культуру тканин або рослинну клітину молекули нуклеїнової кислоти зі стадії (а) з одержанням трансформованої рослини, культури трансформованих тканин або трансформованої клітини, які характеризуються поліпшеними інсектицидними властивостями; та (с) вирощування вказаної трансформованої рослини або забезпечення регенерації трансформованої рослини з культури трансформованих тканин або трансформованої рослинної клітини з одержанням таким чином рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями. У даному винаході також передбачено спосіб одержання трансгенного насіння із трансгенної рослини, описаної вище, де рослину культивують або вирощують в придатних умовах з одержанням насіння потомка, яке є трансгенним.
У даному винаході також передбачений спосіб одержання потомків фертильної трансгенної рослини будь-якого покоління з поліпшеними інсектицидними властивостями, що передбачає стадії: (а) одержання фертильної трансгенної рослини, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описану в даному документі; (5) збирання трансгенної насінини від указаної трансгенної рослини; (с) висаджування зібраної трансгенної насінини та (а) вирощування трансгенних рослин, що являють собою потомство, з указаної насінини, де вказане потомство характеризуються поліпшеними інсектицидними властивостями порівняно з нетрансформованою рослиною.
У даному винаході також передбачений спосіб одержання рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями, що передбачає стадії: (а) статевого схрещування першої батьківської рослини із другою батьківською рослиною, де вказана перша або друга батьківська рослина являє собою трансгенну рослину, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описану в даному документі; та (б) здійснення відбору рослини-потомка першого покоління з поліпшеними інсектицидними властивостями. В ілюстративних варіантах здійснення спосіб одержання рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями передбачає стадії (а) та (Б), описані вище, та необов'язково стадію (с) забезпечення самозапилення рослини-потомка першого покоління, за рахунок чого здійснюється одержання великої кількості рослин-потомків другого покоління; та стадію (4) здійснення відбору із рослин-потомків другого покоління 60 рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями, де рослини-потомки другого покоління містять молекулу нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описану в даному документі.
Короткий опис графічних матеріалів
На фігурі 1 представлено бінарний вектор 17629, послідовність нуклеїнової кислоти якого являє собою 5ЕО ІЮ МО: 2.
Короткий опис послідовностей у переліку послідовностей
ЗЕО ІЮ МО: 1 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти трансгена та містить касети експресії, що містять послідовності, які кодують тетгузА та еСтузЗ.1АбБ.
ЗЕО ІЮ МО: 2 являє собою послідовність нуклеїнової кислоти бінарного вектора 17629.
Детальний опис винаходу
Слід розуміти, що даний винахід не обмежений конкретною методологією, протоколами, клітинними лініями, видами або родами рослин, конструктами й реагентами, фактично описаними в даному документі. Слід також розуміти, що термінологія, яку застосовують у даному документі, представлена лише для опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження обсягу даного винаходу, який буде обмежуватись лише доданою формулою винаходу. Слід відзначити, що форми однини, застосовувані в даному документі та доданій формулі винаходу, включають посилання на множину, якщо в контексті явно не вказано інше. Отже, наприклад, посилання на "рослину" є посиланням на одну або декілька рослин і включає їхні еквіваленти, відомі фахівцям у даній галузі тощо. Слово "або", застосовуване в даному документі, означає будь-який елемент із конкретного переліку, а також включає будь-яку комбінацію елементів із такого переліку (тобто включає також "ї").
Термін "приблизно", застосовуваний у даному документі, означає наближено, орієнтовано, близько або в районі. Якщо термін "приблизно" використовується у поєднанні з числовим діапазоном, то він модифікує даний діапазон, розширюючи межі вище та нижче від вказаних числових значень. Загалом, термін "приблизно", застосовуваний у даному документі, модифікує числове значення вище та нижче від вказаного значення шляхом відхилення на 20 відсотків, переважно 10 відсотків вгору або вниз (більше або менше). Що стосується температури, то термін "приблизно" означає ж1"С, переважнож0,5 С. Якщо термін "приблизно" використовується в контексті даного винаходу (наприклад, у комбінаціях із температурою або значеннями молекулярної маси), то переважним є точне значення (тобто без "приблизно").
Терміни "містить", "що містить", "включає", "що включає", "що має" і споріднені з ними за значенням слова означають "включаючи без обмеження". Термін "що складається з" означає "включаючи й обмежуючись". Термін "що складається, по суті, з" означає, що композиція, спосіб або структура можуть включати додаткові інгредієнти, стадії та/або частини, але тільки якщо додаткові інгредієнти, стадії та/або частини не суттєво змінюють основні та нові характеристики заявленої композиції, способу або структури.
Одиниці, префікси й символи можуть виражатися в їхній формі, прийнятній у системі 51.
Якщо не зазначене інше, нуклеїнові кислоти записані зліва направо в орієнтації від 5'до 3"; амінокислотні послідовності записані зліва направо в орієнтації від аміно- до карбокси-кінця, відповідно. Числові діапазони містять у собі числові значення, що визначають діапазон.
Амінокислоти в даному документі можуть позначатися або їхніми загальновідомими трибуквеними символами, або однобуквеними символами, які рекомендовані Комісією з біохімічної номенклатури ІШРАС-ІОВ. Аналогічно, нуклеотиди можуть позначатися їхніми загальноприйнятими однобуквеними кодами. Терміни, що визначаються нижче, більш повно визначені за допомогою посилання на опис винаходу в цілому. "КДНК" стосується однониткової або двониткової ДНК, яка походить із мРНК і комплементарна їй. Терміни "матрична РНК" або "мРНК" стосуються РНК, яка не містить інтронів і яка може транслюватись клітиною в білок. Терміни "білок", "пептид" і "поліпептид" застосовуються в даному документі взаємозамінно. "Контрольна рослина" або "контроль", застосовувані в даному документі, можуть являти собою в даному документі нетрансгенну рослину батьківської лінії, яку застосовують для одержання трансгенної рослини. Контрольна рослина в деяких випадках може являти собою лінію трансгенних рослин, що включають порожній вектор або маркерний ген, але не містять рекомбінантний полінуклеотид згідно з даним винаходом, який експресується в трансгенній рослині, що підлягає оцінюванню. В інших випадках контрольна рослина являє собою трансгенну рослину, яка експресує ген за допомогою конститутивного промотора. Зазвичай, контрольна рослина являє собою рослину тієї самої лінії або сорту, що й трансгенна рослина, що підлягає тестуванню, яка не має специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, якою характеризується трансгенна рослина. Така рослина-попередник, яка не містить такої специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, може являти собою природну рослину, 60 рослину дикого типу, елітну нетрансгенну рослину або трансгенну рослину без специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, якою характеризується трансгенна рослина.
Рослина-попередник, яка не містить специфічної рекомбінантної ДНК, що забезпечує ознаку, може являти собою сибс трансгенної рослини, яка має специфічну рекомбінантну ДНК, що забезпечує ознаку. Така рослина-попередник, що є сибсом, може включати іншу рекомбінантну
ДНК.
Як застосовується в даному документі, термін "кукурудза" означає 7еа тау5 або маїс і включає всі сорти рослин, які можна схрещувати з кукурудзою, в тому числі види дикого маїсу. "Доставляти" або "доставка" композиції або токсину означає, що композиція або токсин вступає в контакт з комахою, що приводить до токсичної дії та контролю комахи. Дану композицію або токсин можна доставляти багатьма відомими способами, наприклад, перорально шляхом поїдання комахою, за допомогою зкспресії в трансгенній рослині, складеної білкової композиції(композицій), розпилюваної(розпилюваних) композиції(композицій), матриці з приманкою або будь-якої іншої відомої з рівня техніки системи доставки токсину. "Контролювати" або "контроль" комах означає пригнічувати за допомогою токсичної дії здатність комах-шкідників виживати, рости, харчуватись та/або розмножуватись або обмежувати пов'язане з комахами пошкодження або втрату сільськогосподарських культур. "Контроль" комах може означати або може не означати знищення комах, хоча переважно означає знищення комах. "Ефективна для контролю комах кількість" означає ту концентрацію токсину або токсинів, яка пригнічує за допомогою токсичної дії здатність комах виживати, рости, харчуватись та/або розмножуватись або обмежує пов'язане з комахами пошкодження або втрату сільськогосподарських культур. "Ефективна для контролю комах кількість" може означати або може не означати знищення комах, хоча переважно вона означає знищення комах. "Інсектицидною" називають токсичну біологічну активність, здатну до контролю комах, переважно шляхом їх знищення. Трансгенна рослина з "поліпшеними інсектицидними властивостями" являє собою рослину, яка експресує білок або білки в ефективній для контролю комах кількості, при цьому в деяких варіантах здійснення рослина є інсектицидною щодо широкого спектра видів комах порівняно з рослиною того самого виду, яка є не трансформованою. Такий широкий спектр видів комах включає комах-шкідників рослин, таких як твердокрилі комахи-шкідники, включаючи види кукурудзяного жука. Важливі види кукурудзяних жуків-шкідників включають Оіабгоїгса мігдіїега мігдіїега, західний кукурудзяний жук; 0. Іопдісогпів рагбетгі, північний кукурудзяний жук, О. ипаесітрипсіаїа поулагаї, південний кукурудзяний жук, і 0. мігудїєта 2еає, мексиканський кукурудзяний жук. Трансгенна рослина з поліпшеними інсектицидними властивостями може проявляти стійкість до зараження кукурудзяним жуком.
Термін "полінуклеотид" включає посилання на дезоксирибополінуклеотид, рибополінуклеотид або їхні аналоги, які мають основну властивість природного рибонуклеотиду, оскільки вони гібридизуються за жорстких умов гібридизації з практично такою самою нуклеотидною послідовністю, як і нуклеотиди, що зустрічаються в природі, та/або забезпечують трансляцію в таку саму амінокислоту(-и), як і нуклеотид(-и), що зустрічається в природі.
Полінуклеотид може мати повну довжину або являти собою підпослідовність нативного або гетерологічного структурного або регуляторного гена. Якщо не зазначено інше, термін включає посилання на визначену послідовність, а також її комплементарну послідовність. Отже, ДНК або
РНК із каркасами, модифікованими задля стабільності або з інших причин, являють собою "полінуклеотиди", як цей термін передбачений в даному документі. Більше того, в контексті даного розкриття термін полінуклеотиди включає молекули ДНК або РНК, які містять нетипові основи, як наприклад інозин, або модифіковані основи, як наприклад тритильовані основи, названі в якості лише двох прикладів. Слід розуміти, що велике різноманіття модифікацій було здійснено стосовно ДНК і РНК, які слугують для багатьох корисних цілей, відомих фахівцям у даній галузі. Термін "полінуклеотид", як він застосовується в даному документі, охоплює такі хімічно, ферментативно або метаболічно модифіковані форми полінуклеотидів, а також хімічні форми ДНК і РНК, що характерні для вірусів і клітин, включаючи серед іншого прості й складні клітини.
Термін "рекомбінантний" включає посилання на клітину або вектор, який був модифікований шляхом введення гетерологічної нуклеїнової кислоти, або посилання на те, що клітина одержана із клітини, модифікованої в такий спосіб. Отже, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, які не зустрічаються в такій самій формі в нативній (нерекомбінантній) формі клітини, або експресують нативні гени, які в інших випадках експресуються аномально, надекспресуються або не експресуються взагалі внаслідок навмисного втручання людини, або можуть мати знижену або пригнічену експресію нативного гена. Термін "рекомбінантний", 60 застосовуваний в даному документі, не охоплює зміну клітини або вектора за допомогою подій,
що зустрічаються в природі (наприклад, спонтанної мутації, природної трансформації/трансдукції/транспозиції), таких як події, що відбуваються без навмисного втручання людини.
Терміни "химерна конструкція", "химерний ген", "химерний полінуклеотид" або "химерна молекула нуклеїнової кислоти" (або подібні терміни), застосовувані у даному документі, стосуються конструкції або молекули, що містять два або більше полінуклеотидів різного походження, зібраних в одну молекулу нуклеїнової кислоти. Терміни "химерна конструкція", "химерний ген", "химерний полінуклеотид" або "химерна нуклеїнова кислота" стосуються будь- якої конструкції або молекули, що містить (1) полінуклеотиди (наприклад, ДНК), у тому числі регуляторні та кодувальні полінуклеотиди, які разом не зустрічаються у природі (тобто щонайменше один із полінуклеотидів є гетерологічним щодо щонайменше одного із його інших полінуклеотидів), або (2) полінуклеотиди, що кодують частини білків, не зв'язані в природі, або (3) частини промоторів, які не зв'язані в природі. Крім того, химерна конструкція, химерний ген, химерний полінуклеотид або химерна нуклеїнова кислота можуть містити регуляторні полінуклеотиди та кодувальні полінуклеотиди, одержані з різних джерел, або можуть містити регуляторні полінуклеотиди та кодувальні полінуклеотиди, одержані з того самого джерела, але розташовані іншим чином, ніж той, що зустрічається в природі. У переважному аспекті даного винаходу химерна конструкція, химерний ген, химерний полінуклеотид або химерна нуклеїнова кислота містять касету експресії, що містить полінуклеотиди за даним винаходом під контролем регуляторних полінуклеотидів, зокрема під контролем регуляторних полінуклеотидів, які функціонують у рослинах.
Термін "хромосома" застосовується в даному документі як загальновизнаний у рівні техніки для позначення генетичної структури, що самореплікується, в клітинному ядрі, яке містить клітинну ДНК і таку, що несе лінійний масив генів. "Полінуклеотид, що кодує" являє собою полінуклеотид, який транскрибується в РНК, як наприклад мРНК, гКЕМА, ШЕМА, зпеЕМА, сенсова РНК або антисенсова РНК. Переважно РНК потім транслюється в організмі з продукцією білка. Вона може являти собою "безперервний полінуклеотид, що кодує", тобто не мати інтрона, такого як в КкДНК, або може містити один або декілька інтронів, обмежених відповідними точками сплайсингу. "Інтрон' являє собою
Зо полі(рибо)нуклеотид, який міститься в первинному транскрипті, але який видаляється за допомогою розщеплення і повторного лігування РНК в клітині з одержанням зрілої мРНК, яка може бути трансльована в білок.
Термін "експресія" у разі застосування із посиланням на полінуклеотид, такий як ген, ОКЕ або його частина, або трансген в рослинах, стосується процесу перетворення генетичної інформації, яка кодується геном, в РНК (наприклад, мРНК, "КМА, їЇКМА або 5пЕМА) за допомогою "транскрипції" гена (тобто за рахунок ферментативної дії РНК-полімерази), і в білок, де це застосовно (наприклад, якщо ген кодує білок), за допомогою "трансляції" мРНК. Експресія гена може регулюватись на багатьох стадіях під час цього процесу. Наприклад, у разі антисенсових конструкцій або конструкцій а5КМА відповідно, експресія може стосуватись транскрипції тільки антисенсової РНК або тільки а5ЕМА. У варіантах здійснення "експресія" стосується транскрипції і стійкого накопичення сенсової (МРНК) або функціональної РНК. "Експресія" може також стосуватись продукції білка.
Термін "касета експресії? застосовуваний у даному документі, означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну керувати експресією певного полінуклеотиду або полінуклеотидів у відповідній клітині-хазяїні, що містить промотор, функціонально пов'язаний із полінуклеотидом або полінуклеотидами, які становлять інтерес, що функціонально пов'язаний/пов'язані із сигналами термінації. Вона також зазвичай містить додаткові полінуклеотиди, необхідні для належної трансляції полінуклеотиду або полінуклеотидів, що становлять інтерес. Касета експресії також може містити полінуклеотиди, які не потрібні для керування експресією полінуклеотиду, що становить інтерес, але які присутні через відповідні сайти рестрикції для вилучення касети З вектора експресії. Касета експресії, що містить полінуклеотид(полінуклеотиди), який(які) становить(становлять) інтерес, може бути химерною, що означає те, що щонайменше один із її компонентів є гетерологічним щодо щонайменше одного з її інших компонентів. Касета експресії може також являти собою послідовність, яка зустрічається в природі, але була одержана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак, зазвичай, касета експресії є гетерологічною щодо хазяїна, тобто певний полінуклеотид касети експресії не зустрічається в природі в клітині-хазяїні, і його необхідно було ввести в клітину-хазяїна або предка клітини-хазяїна за допомогою процесу трансформації, відомого в рівні техніки. Експресія полінуклеотиду(полінуклеотидів) у касеті бо експресії зазвичай знаходиться під контролем промотора. У разі багатоклітинного організму, як наприклад рослина, промотор може також бути специфічним або переважним щодо конкретної тканини або органа, або стадії розвитку. Після трансформації в рослину касета експресії або її фрагмент також можуть називатися "вставленим полінуклеотидом" або "полінуклеотидом вставки". "Ген" визначається в даному документі як одиниця спадковості, що складається з полінуклеотиду, який займає певне місце розташування на хромосомі і який містить генетичну інструкцію для певної характеристики або ознаки, властивих організму або таку одиницю спадковості із групи гетерологічних організмів залежно від контексту.
Усі терміни "генна інженерія", "трансформація" і "генетична модифікація" застосовуються в даному документі як синоніми для перенесення виділених і клонованих генів в ДНК, зазвичай хромосомну ДНК або геном іншого організму. "Трансген" стосується гена, полінуклеотиду або нуклеїнової кислоти, введеної в геном організму за допомогою генетичної маніпуляції з метою зміни його генотипу. Трансгени можуть включати, наприклад, гени, полінуклеотиди або нуклеїнові кислоти, які є або гетерологічними, або гомологічними певній рослині, яка підлягає трансформації. Крім того, трансгени можуть містити нативні гени, вставлені в ненативний організм, або химерні гени, полінуклеотиди або нуклеїнові кислоти.
Термін "генотип" стосується генетичної структури клітини або організму. "Генотип за набором генетичних маркерів" індивідуума включає специфічні алелі для одного або декількох локусів генетичних маркерів, присутніх у індивідуума. Як відомо із рівня техніки, генотип може стосуватись одного локусу або декількох локусів, незалежно від того чи є локуси спорідненими або неспорідненими та/або зчепленими або незчепленими. У деяких варіантах здійснення генотип індивідуума стосується одного або декількох генів, які пов'язані в тому плані, що один або декілька генів задіяні в експресію фенотипу, що становить інтерес (наприклад, кількісної ознаки, визначеної в даному документі) Отже, у деяких варіантах здійснення генотип передбачає суму одного або декількох алелів, присутніх у індивідуума в одному або декількох генетичних локусах, що визначають кількісну ознаку. У деяких варіантах здійснення генотип експресується у вигляді гаплотипу (визначеного в даному документі нижче). "Трансформований", "трансгенний" і "рекомбінантний" застосовуються взаємозамінно і
Зо кожний із них стосується організму-хазяїна, такого як бактерія або рослина, у який була введена гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти. Молекулу нуклеїнової кислоти можна стабільно інтегрувати в геном хазяїна, або ж молекула нуклеїнової кислоти також може бути присутньою як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути такою, що автореплікується. Передбачається, що трансформовані клітини, тканини або рослини охоплюють не тільки кінцевий продукт процесу трансформації, але також і його трансгенне потомство. "Нетрансформованим", "нетрансгенним" або "нерекомбінантним" хазяїном називають організм дикого типу, наприклад, бактерію або рослину, яка не містить молекулу гетерологічної нуклеїнової кислоти. "Диким типом" називають нормальний ген, вірус або організм, які зустрічаються в природі без будь-якої мутації або модифікації.
Термін "ідіоплазма" стосується генетичного матеріалу особини (наприклад, рослини), групи особин (наприклад, лінії, сорту або родини рослин), або клону, одержаного з лінії, сорту, виду або культури. Ідіоплазма може бути частиною організму або клітини, або може бути відділена від організму або клітини. Зазвичай, ідіоплазма забезпечує генетичний матеріал зі специфічним молекулярним складом, який забезпечує фізичну основу для деяких або всіх спадкових якостей організму або культури клітин. Як застосовується в даному документі, "ідіоплазма" включає клітини, насіння або тканини, з яких можуть вирости нові рослини або частини рослин, такі як листки, стебла, пилок або клітини, з яких можна виростити цілу рослину.
Як застосовується в даному документі, "рослинний матеріал", "частина рослини" або "рослинна тканина" означає рослинні клітини, протопласти рослин, тканинні культури рослинних клітин, з яких можна регенерувати рослини, калюси рослин, рослини, що мають спільну кореневу систему, і рослинні клітини, які є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, насінні зачатки, насіння, листки, квітки, гілки, плоди, зерна, качани, стрижні кукурудзяних качанів, оболонки, стебла, корені, кореневі кінчики, пиляки, бульби, ризоми та подібне.
Як застосовується в даному документі, термін "частина рослини для розмноження" стосується будь-якого матеріалу, який застосовують для розмноження рослини, переважно трансгенної рослини, більш переважно трансгенної рослини, що містить ЗЕО ІО МО: 1. Частина рослини для розмноження може являти собою насінину, живець або множину клітин із 60 трансгенної рослини, які можна застосовувати для одержання культури трансгенних рослин.
Як застосовується в даному документі, "зразком рослини" називають або інтактну, або неінтактну (наприклад, розмелену тканину насіння або рослини, порубану тканину рослини, ліофілізовану тканину) рослинну тканину. Це також може бути екстрактом, що містить інтактну або неінтактну тканину насіння або рослини. Біологічний зразок або екстракт можна вибрати із групи, що складається з кукурудзяного борошна, кукурудзяного борошна крупного помелу, кукурудзяної патоки, кукурудзяної олії, кукурудзяного крохмалю і виробів із злаків, виготовлених цілими або частково із вмістом вторинних продуктів кукурудзи.
Термін "гетерологічний" при використанні щодо гена або нуклеїнової кислоти стосується гена, що кодує фактор, який не знаходиться в його природному оточенні (тобто який був змінений шляхом втручання людини). Наприклад, гетерологічний ген може передбачати ген організму одного виду, введений в організм іншого виду. Гетерологічний ген також може передбачати ген, нативний щодо організму, але який був змінений певним чином (наприклад, підданий мутації, доданий у вигляді множини копій, зв'язаний із ненативним промоторним або енхансерним полінуклеотидом тощо). Гетерологічні гени додатково можуть передбачати полінуклеотиди генів рослини, які включають кДНК-форми гена рослини; кКДНК можуть експресуватися або в сенсовій (з одержанням мРНК), або антисенсовій орієнтації (з одержанням антисенсового РНК-транскрипту, комплементарного мРНК-транскрипту). Згідно з одним аспектом даного винаходу гетерологічні гени відрізняються від ендогенних генів рослини тим, що полінуклеотид гетерологічного гена, зазвичай, приєднаний до полінуклеотидів, які містять регуляторні елементи, такі як промотори, що не зустрічаються в природі як асоційовані з геном для білка, який кодується гетерологічним геном, або з полінуклеотидом гена рослини в хромосомі, або асоційовані з частинами хромосоми, в яких вони не зустрічаються в природі (наприклад, гени експресуються в локусах, у яких вказаний ген у звичайних умовах не експресується). Крім того, в варіантах здійснення "гетерологічний полінуклеотид" являє собою полінуклеотид, у природних умовах не асоційований із клітиною-хазяїном, в яку його вводять, у тому числі множинні копії, які не зустрічаються в природі, полінуклеотиду, що зустрічається в природі. "Ідентичність" або "відсоткова ідентичність" стосується ступеню подібності між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислотними послідовностями. Для порівняння послідовностей зазвичай одна послідовність виступає як еталонна послідовність, з якою порівнюють тестові послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовностей тестову та еталонну послідовності вводять у комп'ютер, за необхідності задають координати підпослідовності і задають програмні параметри алгоритму порівняння послідовностей. Потім за допомогою алгоритму порівняння послідовностей на основі заданих програмних параметрів обчислюють відсоткову ідентичність послідовностей для тестованої(тестованих) послідовності(послідовностей) відносно еталонної послідовності. Фраза "значною мірою ідентичні" щодо двох послідовностей нуклеїнових кислот або двох амінокислотних послідовностей стосується двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які характеризуються щонайменше приблизно 50 95 ідентичністю нуклеотидних або амінокислотних залишків у разі порівняння та вирівнювання для максимальної відповідності, що визначають за допомогою одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом візуального контролю. У певних варіантах здійснення в значній мірі ідентичні послідовності щонайменше на приблизно 60 95, або щонайменше на приблизно 70 95, або щонайменше на приблизно 80 95, або навіть щонайменше на приблизно 9095 або 9595 ідентичні за нуклеотидами або амінокислотними залишками. У певних варіантах здійснення значний ступінь ідентичності наявний у межах ділянки послідовностей, яка складається із щонайменше приблизно 50 залишків у довжину, або у межах ділянки, що складається із щонайменше приблизно 100 залишків, або послідовностей, значною мірою ідентичних у межах щонайменше приблизно 150 залишків. У додаткових варіантах здійснення послідовності є значною мірою ідентичними, якщо вони ідентичні по всій довжині ділянок, що кодують.
Термін "гомологія" в контексті даного винаходу стосується рівня схожості між послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислотними послідовностями у вигляді ідентичності або схожості нуклеотидів або амінокислот відповідно, тобто схожості або ідентичності послідовностей. Гомологія, гомолог і гомологічний також стосується уявлення про подібні функціональні властивості різних нуклеїнових кислот або білків. Гомологи включають гени, які є ортологічними або паралогічними. Гомологи можна визначати із застосуванням кодувальної послідовності гена, розкритої в даному документі або, що зустрічається у відповідній базі даних (такій як МОВІ або інші) одним або декількома із наступних способів.
Стосовно амінокислотної послідовності, послідовності слід порівнювати за допомогою 60 алгоритмів (для прикладу, див. розділ щодо "ідентичності" або "значної ідентичності"). Стосовно нуклеотидних послідовностей, послідовності однієї молекули ДНК можна порівнювати із послідовністю відомого або передбачуваного гомолога приблизно таким же чином. Гомологи щонайменше на 20 95 ідентичні, або щонайменше на 30 95 ідентичні, або щонайменше на 40 95 ідентичні, або щонайменше на 50 95 ідентичні, або щонайменше на 60 95 ідентичні, або щонайменше на 70 95 ідентичні, або щонайменше на 80 95 ідентичні, або щонайменше на 88 95 ідентичні, або щонайменше на 90 95 ідентичні, або щонайменше на 92 95 ідентичні, або щонайменше на 95 95 ідентичні в межах будь-якої значної ділянки молекули (молекули ДНК,
РНК або білка).
Одним із прикладів алгоритму, придатного для визначення відсотка ідентичності послідовностей і схожості послідовностей, є алгоритм ВІ А5Т, описаний в Аїйї5БспиЇ еї аї.,.). Мо).
Віої. 215: 403 410 (1990). Програмне забезпечення для проведення аналізів ВІА5ЗТ загальнодоступне завдяки Національному центру біотехнологічної інформації (пер:/Ллумли. побі.піт.пій.дом/). Даний алгоритм включає спочатку ідентифікацію пар послідовностей із найбільшою схожістю (НОР) шляхом ідентифікації коротких "слів" довжиною
МУ у запитуваній послідовності, які або збігаються, або задовольняють деякий позитивний граничний бал Т у разі вирівнювання зі "словом" такої самої довжини в послідовності з бази даних. Т називається граничним показником сусіднього "слова" (Аї5спиЇї еї аї., 1990). Ці вихідні збіги сусідніх "слів" виступають як затравки для запуску пошуків 3 метою виявлення довших
Н5Р, які їх містять. Збіги "слів" потім продовжуються в обох напрямках уздовж кожної послідовності настільки, наскільки може бути збільшений сукупний показник вирівнювання.
Сукупні показники розраховують із застосуванням для нуклеотидних послідовностей параметрів
М (бал, що нараховують для пари залишків, що збігаються; завжди » 0) та М (штраф за залишки, що не збігаються; завжди « 0). У разі амінокислотних послідовностей для розрахунків сукупного показника використовують матрицю замін. Продовження збігів "слів" у кожному напрямку припиняється, коли сукупний показник вирівнювання знижується на величину Х від його максимального досягнутого значення, при цьому сукупний показник падає до нуля або нижче внаслідок накопичення одного або декількох вирівнювань залишків із від'ємними показниками або у разі досягнення кінця однієї з послідовностей. Параметри алгоритму ВГ А5Т
М, Т ї Х визначають чутливість і швидкість вирівнювання. Програма ВІ А5ТМ (для нуклеотидних
Зо послідовностей) використовує за замовчуванням довжину "слова" (МУ), що становить 11, очікуване значення (Е), що становить 10, граничне значення, що становить 100, М-5, М-4 і порівняння обох ниток. Для амінокислотних послідовностей програма ВІ АЗТР використовує за замовчуванням довжину "слова" (М/), рівну 3, очікуване значення (Е), рівне 10, а також матрицю замін ВГОЗИМб2 (див. Непікоїй 8. Непікоїї, Ргос Маї! Асад. 5сі ОБА 89: 10915 (1989)).
Додатково до розрахунків відсоткової ідентичності послідовності алгоритм ВГАЗТ також виконує статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (див., наприклад, Кагіїп 8.
АЙйбспиЇ, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90: 5873 5787 (1993)). Однією мірою схожості, наданою алгоритмом ВІАБТ, є найменша сумарна ймовірність (Р(М)), яка передбачає показник імовірності, згідно з яким збіги між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями будуть спостерігатися випадковим чином. Наприклад, тестована послідовність нуклеїнової кислоти вважається подібною до еталонної послідовності, якщо найменша сумарна ймовірність у разі порівняння тестованої послідовності нуклеїнової кислоти з еталонною послідовністю нуклеїнової кислоти становить менше приблизно 0,1, більш переважно менше приблизно 0,01 і найбільш переважно менше приблизно 0,001.
Іншою широко використовуваною і розповсюдженою комп'ютерною програмою для виконання вирівнювань послідовностей є СГОБТАГМУ м1.6 (Тпотрзоп, еї аїЇ. Мис. Асіа5 Кев., 22: 4673-4680, 1994). Число основ, які збігаються, або амінокислот ділять на загальне число основ або амінокислот і множать на 100 з одержанням відсоткової ідентичності. Наприклад, якщо 6 дві послідовності із 580 пар основ збігалися на 145 основ, тоді вони були б ідентичними на 25 відсотків. Якщо дві порівняльні послідовності мають різну довжину, тоді число збігів ділять на більш коротку із двох довжин. Наприклад, якщо було 100 амінокислот, що збігаються, між білками із 200 і 400 амінокислот, тоді вони ідентичні на 50 відсотків відносно більш короткої послідовності. Якщо більш коротка послідовність складає менше 150 основ або 50 амінокислот в довжину, тоді число збігів ділять на 150 (у разі основ нуклеїнових кислот) або 50 (у разі амінокислот), і множать на 100 з одержанням відсоткової ідентичності.
Дві нуклеотидні послідовності також можуть вважатися значною мірою ідентичними, якщо дві послідовності гібридизуються одна з одною за жорстких умов. В ілюстративних варіантах здійснення дві нуклеотидні послідовності, які вважаються в значній мірі ідентичними, гібридизуються одна з одною за дуже жорстких умов. 60 Дві нуклеотидні послідовності також можуть вважатися значною мірою ідентичними, у випадку якщо дві послідовності гібридизуються одна з одною за жорстких умов. В ілюстративних варіантах здійснення дві нуклеотидні послідовності, які вважаються в значній мірі ідентичними, гіобридизуються одна з одною за дуже жорстких умов.
Терміни "жорсткі умови" або "жорсткі умови гібридизації" включають посилання на умови, за яких нуклеїнова кислота буде вибірково гібридизуватися з цільовою послідовністю у помітно більшому ступені, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше в 2 рази у порівнянні з нецільовою послідовністю), і необов'язково можуть в значному ступені виключати зв'язування з нецільовими послідовностями. Жорсткі умови залежать від послідовності та будуть варіювати за різних обставин. За допомогою контролю жорсткості умов гібридизації та/або відмивання можна ідентифікувати цільові послідовності, які можуть бути на 100 95 комплементарні еталонній нуклеотидній послідовності. Альтернативно, можна застосовувати умови помірної або навіть низької жорсткості для забезпечення деяких розбіжностей послідовностей з тим, щоб визначати менші рівні схожості послідовностей. Наприклад, фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що для функціонування як праймера або зонда послідовність нуклеїнової кислоти повинна бути лише достатньо комплементарною цільовій послідовності для зв'язування з нею в значній мірі з утворенням таким чином стабільної двониткової структури в умовах, що використовуються. Отже, праймери або зонди можна застосовувати за умов високої, помірної або навіть низької жорсткості. Аналогічно, умови низької або помірної жорсткості можуть бути переважними для визначення гомологічних, ортологічних та/або паралогічних послідовностей, які характеризуються більш низькими ступенями ідентичності послідовностей, ніж ті, що були б ідентифіковані за дуже жорстких умов.
Для гібридів ДНК-ДНК Тт можна приблизно розрахувати з рівняння МеїпКоїй апа Умані, Апаї.
Віоспет., 138:267-84 (1984): Тт-81,5 "Ся-16,6 (09 М)0,41 (96 5С)-0,61 (96 формаміду)-500/; де М являє собою молярність моновалентних катіонів, 95 (С являє собою процентне відношення гуанозинових і цитозинових нуклеотидів у ДНК, 956 формаміду являє собою процент формаміду в розчині гібридизації і Її являє собою довжину гібрида у парах основ. Тт являє собою температуру (за певної іонної сили і рН), за якої 50 95 комплементарної цільової послідовності гібридизується з зондом, що абсолютно збігається. тт знижують на приблизно 1"С для кожного 1 95 розбіжності; таким чином, Тт, умови гібридизації та/або відмивання можна регулювати для гібридизації з послідовностями необхідного ступеню ідентичності.
Наприклад, якщо бажаними є послідовності з »90 95 ідентичністю, тоді тт можна знизити на 10 С. Загалом, жорсткі умови вибирають так, щоб вони були на приблизно 5 "С нижчими температурної точки плавлення (Тт) для конкретної послідовності та комплементарної до неї послідовності за заданої іонної сили і рН. Однак, за дуже жорстких умов можуть використовуватися гібридизація та/або відмивання за температурної точки плавлення (Тт) або на 1, 2, З або 4 "С нижче температурної точки плавлення (Тіт); за умов помірної жорсткості можуть використовуватися гібридизація та/або відмивання за температури на 6, 7, 8, 9 або 10"С нижче температурної точки плавлення (ТІ); за умов низької жорсткості можуть використовуватися гібридизація та/або відмивання за температури на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 7С нижче температурної точки плавлення (Тт). Якщо необхідний ступінь розбіжності дає в результаті Тт меншу 45 "С (водний розчин) або 32 "С (розчин формаміду), тоді необов'язково концентрацію 55С можна підвищити для того, щоб можна було використовувати більш високу температуру. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в ТіЇ55еп,
І арогаїогу Тесппіднез іп Віоспетівігу апа Моїесшаг Віоіоду-Нубріідіганоп м/п Мисівїс Асіа Ргобез, частина І, розділ 2, "Омегмієм/ ої ргіпсіріез ої пубгідігабоп апа (пе 5ігагеду ої писієїс асій ргоре аззаув, " ЕІбвемівї, Мем Хоїк (1993); Ситепі Ргоїосої!5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, розділ 2, за редакцією
А!йзирбеї, єї аІ., агеєпе Рибіїєпіпуд апа УМіеу-Іпіегзсіепсе, Мем Хогк (1995); і сгеєп 5 Затргоок в
Моїесшіаг Сіопіпу, А Іарогаїгу Мапиа!ї, 4-е видання, Соїй бргіпд Нагброг Ргез55, Соїй 5ргіпд
Натботг, М.У. (2012).
Зазвичай, жорсткі умови є такими, за яких концентрація солі становить менше приблизно 1,5
М концентрації іонів Ма, зазвичай приблизно 0,01-1,0 М концентрації іонів Ма (або інших солей) за рН приблизно 7,0-8,3, а температура становить щонайменше приблизно 30 "С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Жорстких умов можна також досягти у разі додавання дестабілізуючих засобів, таких як формамід або розчин Денхардта (5 г РісоїЇї, 5 г полівінілпіролідону, 5 г альбуміну бичачої сироватки в 500 мл води). Ілюстративні умови низької жорсткості включають гібридизацію з використанням буферного розчину 30 95-35 95 формаміду, 1 М Масі, 1 95 505 (додецилсульфату натрію) за 37"С і відмивання в 1Х-2Х 5502 (20Х 550-3,0
М Масі/),3 М тринатрійцитрату) за 50"С-557С. Ілюстративні умови помірної жорсткості 60 включають гібридизацію в 40 95-45 95 формаміді, 1 М Масі, 1 95 505 за 37"С і відмивання в 0,5Х-
1Х 55С за 55"С-60"С. Ілюстративні умови високої жорсткості включають гібридизацію в 50 95 формаміді, 1 М масі, 195 505 за 37"С і відмивання в 0,1Х 550 за 60"С-65"С. Додатковий необмежувальний приклад умов високої жорсткості включає гібридизацію в 4Х 55С, 5Х розчині
Денхардта, 0,1 мг/мл кип'яченої ДНК із молок лососевих, 25 мМ фосфату Ма за 65 і відмивання в 0,1Х 55С, 0,1 956 505 за 65"С. Інший приклад умов гібридизації високої жорсткості включає гібридизацію в 7 95 505, 0,5 М МаРо4, 1 мМ ЕОТА за 50 "С з відмиванням в 2Х 55С, 0195 505 за 50"С, альтернативно, з відмиванням в 1хХ 55С, 0,195 505 за 507, альтернативно, з відмиванням в 0,5Х 55С, 0,195 505 за 50"С або, альтернативно, з відмиванням в 0,1Х 55С, 0,1 95 505 за 50 "С, або навіть з відмиванням в 0,1Х 555, 0,1 95 505 за 65 "С. Спеціалістам в даній галузі буде зрозуміло, що специфічність зазвичай залежить від післягібридизаційних відмивань, при цьому важливими факторами є іонна сила та температура кінцевого розчину для відмивання.
Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною в жорстких умовах, усе ще значною мірою ідентичні, якщо білки, які вони кодують, значною мірою ідентичні (наприклад, через виродженість генетичного коду).
Ще одним показником того, що дві послідовності нуклеїнових кислот або білки значною мірою ідентичні, є те, що білок, який кодується першою нуклетовою кислотою, характеризується імунологічною перехресною реактивністю з білком, що кодується другою нуклеїновою кислотою. Отже, білок зазвичай значною мірою ідентичний другому білку, наприклад якщо два білки відрізняються лише консервативними замінами.
Терміни "комплементарний" або "комплементарність" (і схожі терміни), застосовувані в даному документі, стосуються природного зв'язування полінуклеотидів в умовах вмісту солей і температури, які допускають це, шляхом спарювання основ. Наприклад, послідовність "А-(3-Т" зв'язується з комплементарною послідовністю "Т-С-А". Комплементарність між двома одноланцюговими молекулами може бути "частковою", за якої зв'язуються лише деякі з нуклеотидів, або вона може бути повною, коли наявна абсолютна комплементарність між одноланцюговими молекулами. Ступінь комплементарності між ланцюгами нуклеїнової кислоти значно впливає на ефективність і міцність гібридизації між молекулами.
Термін "значною мірою комплементарний", застосовуваний у даному документі (і подібні
Зо терміни) означає, що дві послідовності нуклеїнової кислоти комплементарні щонайменше на приблизно 50 96, 60 95, 70 о, 75 96, 80 9о, 85 9о, 90 9Уо, 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 9, 99 90 або більше.
Альтернативно, термін "значною мірою комплементарний" (і подібні терміни) може означати, що дві послідовності нуклеїнової кислоти можуть гібридизуватися разом в умовах високої жорсткості (як описано в даному документі).
Термін "виділений" у разі застосування в контексті молекул нуклеїнової кислоти або полінуклеотидів за даним винаходом стосується полінуклеотиду, який ідентифікують в межах і виділяють/відділяють від його хромосомного полінуклеотидного оточення у відповідному організмі-джерелі. Виділена нуклеїнова кислота або полінуклеотид не є нуклеїновою кислотою, що зустрічається у своєму природному оточенні, якщо вона дійсно має аналог, що зустрічається в природі. На відміну від цього, нуклеїнові кислоти, що не є виділеними, являють собою нуклеїнові кислоти, такі як ДНК і РНК, які зустрічаються у стані, в якому вони існують в природі.
Наприклад, певний полінуклеотид (наприклад, ген) зустрічається в хромосомі клітини-хазяїна поблизу сусідніх генів. Виділена молекула нуклеїнової кислоти може знаходитись в однонитковій або двонитковій формі. Альтернативно, вона може містити як сенсову, так і антисенсову нитки (тобто молекула нуклеїнової кислоти може бути двонитковою). У переважному варіанті здійснення молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом є виділеними.
Термін "локус" стосується положення (наприклад, гена, генетичного маркера тощо) в хромосомі даного виду.
Термін "зчеплення" і його граматичні варіанти стосуються схильності алелей в різних локусах в тій же хромосомі сегрегуватись разом частіше, ніж очікується за випадкових обставин, якщо б їхня передача була б незалежною, в деяких варіантах здійснення в результаті їх фізичної близькості. Фраза "нерівноважне зчеплення" (яке також називають "алельним зв'язком") стосується феномена, за якого певні алелі в двох і більше локусах мають тенденцію залишатись разом в групах зчеплення у разі сегрегації від батьків до нащадків з більшою частотою, ніж очікується виходячи із окремих частот в даній популяції. Наприклад, алель генетичного маркера і алель ОТ. можуть характеризуватись нерівноважним зчепленням, якщо вони зустрічаються разом з частотами, які перевищують прогнозовані виходячи із окремих частот алелей. Нерівноважне зчеплення може зустрічатись за декількома причинами, у тому 60 числі без обмеження через те, що алелі знаходяться у безпосередній близькості в хромосомі.
Термін "група зчеплення" стосується всіх генів або генетичних ознак, які розташовані в одній і тій же хромосомі. У групі зчеплення ті локуси, які розташовані достатньо близько, будуть характеризуватись зчепленням в генетичних схрещуваннях. Оскільки імовірність кросинговеру збільшується зі збільшенням фізичної відстані між генами в хромосомі, тоді гени, які розташовані далеко один від одного в групі зчеплення, можуть не характеризуватись будь-яким виявленим зчепленням в прямих генетичних тестах. Термін "група зчеплення" головним чином використовується для позначення генетичних локусів, які проявляють поведінку зчеплення в генетичних системах, де віднесення до хромосом ще не були виконані. Отже, в контексті даного винаходу термін "група зчеплення" є синонімом (фізичним об'єктом) хромосоми.
Фраза "нуклеїнова кислота" або "полінуклеотид" стосується будь-якого фізичного відрізка із мономерних одиниць, який може відповідати відрізку із нуклеотидів, у тому числі полімеру із нуклеотидів (наприклад, типовий полімер ДНК або полідезоксирибонуклеотид або полімер РНК або полірибонуклеотид), модифікованих олігонуклеотидів (наприклад, олігонуклеотидів, що містять основи, які не є типовими стосовно біологічної РНК або ДНК, такі як 2'-О-метильовані олігонуклеотиди) тощо. У деяких варіантах здійснення нуклеїнова кислота або полінуклеотид можуть бути однонитковими, двонитковими, багатонитковими або являти собою їхню комбінацію. Якщо не вказано інше, то конкретна нуклеїнова кислота або полінуклеотид за даним винаходом необов'язково містять або кодують комплементарні полінуклеотиди додатково до будь-якого явно вказаного полінуклеотиду.
Слід розуміти, що "ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) в об'ємі даного винаходу стосується способу одержання відносно великих кількостей специфічних ділянок ДНК, тим самим забезпечуючи можливість проведення різних аналізів із використанням цих ділянок. "Функціонально пов'язаний" стосується асоціації полінуклеотидів на одному фрагменті нуклеїнової кислоти, внаслідок чого функція одного впливає на функцію іншого. Наприклад, промотор є функціонально пов'язаним із кодувальним полінуклеотидом або функціональною
РНК, коли він може впливати на експресію такого кодувального полінуклеотиду або функціональної РНК (тобто такий кодувальний полінуклеотид або функціональна РНК знаходяться під контролем промотора на рівні транскрипції). Кодувальний полінуклеотид у сенсовій або антисенсовій орієнтації може бути функціонально пов'язаним із регуляторними полінуклеотидами.
Термін "промотор" стосується полінуклеотиду, який зазвичай розташовується вище (5) від полінуклеотиду, що кодує його, який здійснює контроль експресії полінуклеотиду, що кодує, забезпечуючи впізнавання РіНК-полімеразою та іншими факторами, необхідними для правильної транскрипції. "Конститутивний промотор" стосується промотора, який здатен забезпечувати експресію відкритої рамки зчитування (ОКР), регуляцію якої він здійснює у всіх або майже у всіх тканинах рослини під час всіх або майже всіх стадій розвитку рослини (позначається як "конститутивна експресія"). Термін "регульований промотор" стосується промоторів, які керують експресією генів не конститутивно, а тимчасово та/або просторово регульованим чином, і включають неспецифічні, тканинопереважні та індуковані промотори. Він включає природні та синтетичні полінуклеотиди, а також полінуклеотиди, які можуть являти собою комбінацію синтетичних і природних полінуклеотидів. Різні промотори можуть управляти експресією гена в різних типах тканин або клітин, або на різних стадіях розвитку, або у відповідь на різні умови оточуючого середовища.
Терміни "тканиноспецифічний промотор" або "-«канинопереважний промотор" стосуються промоторів, що регулюються, які експресуються не у всіх рослинних клітинах, а тільки або переважно в одному або декількох типах клітин в специфічних органах (таких як листя або насіння), специфічних тканинах (таких як тканини зародка або сім'ядолі) або специфічних типах клітин (таких як клітини паренхіми листя або запасаючі клітини насіння). Ці терміни також включають промотори, які тимчасово регулюються, наприклад, на початку або в кінці ембріогенезу, під час дозрівання плодів, в насіннях або плодах, що розвиваються, в повністю диференційованому листі або на початку старіння. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що для тканиноспецифічних промоторів не потрібно, щоб вони характеризувались абсолютною тканиноспецифічністю, а опосередковували транскрипційну активність у більшості частин рослин на рівні, що складає приблизно 1 95 або менше від рівня, який досягається в частині рослини, в якій транскрипція відбувається найбільш активно. "Енхансер" або "транскрипційний енхансер" являє собою нуклеотидну послідовність, яка може стимулювати активність промотора та може являти собою природний елемент промотора або гетерологічний елемент, вбудований для підвищення рівня або тканинної специфічності промотора. Основна послідовність може перебувати в межах кожного з ланцюгів дволанцюгової бо молекули ДНК, і вона здатна функціонувати навіть у разі розташування як вище, так і нижче відносно промотора.
Кожна із "регуляторних послідовностей" або "придатних регуляторних послідовностей" стосується нуклеотидних послідовностей, розташованих вище (5'-чсекодувальної послідовності), у межах або нижче (3'-некодувальної послідовності) кодувальної послідовності, і впливає на транскрипцію, процесинг або стабільність РНК або трансляцію пов'язаної кодувальної послідовності. Регуляторні послідовності включають енхансери, промотори, трансляційні енхансерні послідовності, інтрони і сигнальні послідовності поліаденілювання. Вони включають природні і синтетичні послідовності, а також послідовності, які можуть являти собою комбінацію синтетичних і природних послідовностей. Регуляторні послідовності можуть визначати рівень експресії, просторовий і часовий патерн експресії і, для підмножини промоторів експресію в індуктивних умовах (регуляція зовнішніми факторами, такими як світло, температура, хімічні речовини і гормони). Регуляторні послідовності можуть являти собою короткі ділянки послідовності ДНК довжиною 6-100 пар основ, які визначають сайти зв'язування для діючих в транс-положенні факторів, а саме факторів транскрипції. Регуляторні послідовності можуть також бути енхансерами, більш довгими ділянками послідовності ДНК, які можуть діяти на відстані від ділянки корового промотора, іноді на відстані декількох тисяч пар основ від корової ділянки. На активність регуляторних послідовностей можуть впливати діючі в транс-положенні фактори, зокрема базовий транскрипційний апарат, фактори транскрипції і фактори збірки хроматину. "Цис-елемент" стосується діючого в цис-положенні транскрипційного регуляторного елементу, який забезпечує деякий аспект загального контролю експресії генів. Цис-елемент може мати функцію зв'язування з факторами транскрипції, діючими в транс-положенні білковими факторами, які регулюють транскрипцію. Деякі цис-елементи пов'язують більше одного транскрипційного фактора, і транскрипційні фактори можуть взаємодіяти з різними афінностями з більш ніж одним цис-елементом. Цис-елементи можуть бути ідентифіковані за допомогою декількох методик, включаючи делеційний аналіз, тобто видалення одного або декількох нуклеотидів із 5'-кінця або із внутрішньої частини промотора; аналіз зв'язування ДНК з білком за допомогою футпринтинга з використанням ДНКази І!, аналіз інтерференції метилюванням, аналіз із визначенням зміни електрофоретичної рухливості, іп мімо геномний
Зо футпринтинг за допомогою ПЛР, опосередкованої лігуванням, і інші традиційні аналізи; або за допомогою аналізу схожості послідовностей ДНК із використанням відомих мотивів цис- елементів за допомогою традиційних способів порівняння послідовностей ДНК. Тонку структуру цис-елемента можна додатково вивчати за допомогою мутагенезу (або заміни) одного або декількох нуклеотидів або іншими традиційними способами. Цис-елементи можна одержати шляхом хімічного синтезу або шляхом виділення з промоторів, які включають в себе такі елементи, і їх можна синтезувати з додатковими фланкуючими нуклеотидами, які містять придатні сайти рестрикційних ферментів для полегшення маніпуляцій з підпослідовностями. "Термінатор транскрипції" відповідає за термінацію транскрипції за межами ділянки, що кодує, і правильне поліаденілювання мРНК. Ділянка термінації може бути нативною з областю ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною послідовністю ДНК, що становить інтерес, може бути нативною з рослиною-хазяїном або може бути одержана з іншого джерела (наприклад, бути чужорідною або гетерологічною стосовно промотору, послідовності
ДНК, що становить інтерес, рослини-хазяїна або будь-якої їхньої комбінації). Належні термінатори транскрипції являють собою такі, що, як відомо, функціонують в рослинах і включають термінатор 355 САМУ, термінатор гена іті, термінатор гена нопалінсинтази і термінатор гена гос5-Е9 гороху. Їх можна застосовувати як у однодольних, так і у дводольних рослин. На додаток, можна застосовувати нативний термінатор транскрипції гена.
Термін "трансляційна енхансерна послідовність" стосується такої частини послідовності ДНК гена між промотором і кодувальною послідовністю, яка транскрибується в РНК ї наявна у повністю процесованій мРНК вище (5) трансляційного старт-кодону. Трансляційна енхансерна послідовність може впливати на процесинг первинного транскрипта в мРНК, стабільність МРНК або ефективність трансляції.
Як використовується в даному документі, термін "пакетування" генів або ознак являє собою комбінування необхідних генів або ознак в одній лінії трасгенної рослини. Як один підхід селекціонери здійснюють "пакетування" трансгенних ознак за допомогою схрещування батьків, кожен із яких має необхідну ознаку, а потім ідентифікації нащадка, який має обидві із цих необхідних ознак (так звані "селекційні гібриди"). Іншим способом "пакетування" генів є перенесення двох або більше генів в ядро клітини рослини одночасно під час трансформації.
Ще одним способом "пакетування" генів є повторна трансформація трансгенної рослини іншим бо геном, що становить інтерес. Наприклад, "пакетування" генів можна застосовувати для комбінування двох різних ознак стійкості до комах, ознаки стійкості до комах і ознаки стійкості до захворювання або ознаки стійкості до гербіциду (такому як, наприклад, ВИТ). Застосування селективного маркера, додатково до гена, що становить інтерес, також буде вважатись "пакетуванням" генів.
Термін "рослина" включає посилання на цілі рослини, органи рослини, тканини (наприклад, листки, стебла, корені тощо), насіння та рослинні клітини та їхнє потомство. Рослинна клітина, як застосовується в даному документі, включає без обмеження насіння, суспензійні культури, зародки, меристематичні ділянки, калюсну тканину, листки, корені, пагони, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори. Клас рослин, які можна застосовувати в способах за даним винаходом, зазвичай, настільки широкий, як клас вищих рослин, які підлягають методикам трансформації, включаючи як однодольні, так і дводольні рослини, у тому числі види з родів:
Сиситоіа, ВНоза, Міїів, дхидіапв, Егадагпа, І оїи5, Медісадо, Опобгуснів, Тийоїїшт, ТгідопеїІа, Мідпа,
Сішив, Гіпит, Сегапішт, Мапінйої, Оайсив, Агабідорвіх, Вгаззіса, Варпапив, 5іпарі5, Аїгора,
Сарзісит, Оаїшга, Нуозсуатив, І усорегвісоп, Місойапа, Зоїапит, Решпіа, Оідйаїв, Майогагпа,
Сіапогішт, Неїїапійиє, І асіса, Вготив, Авзрагадив5, Апійтпіпит, Неїегосаїй5, Метевів,
РеїІагдопішт, Рапіешт, Реппізеїшт, ВНапипсиціиб5, бепесіо, Заїрідіоз5ії5, Сиситів, Вгомааїа,
Сіусіпе, Різит, РІазеоіив, І от, Огуга, Амепа, Ногаєит, Зесаїе, АїйПит і Тгйсит. Особливо переважною рослиною є 7еа таух.
Термін "трансгенна рослина" включає посилання на рослину, яка містить у своєму геномі гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти. Зазвичай, гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти стабільно інтегрована в геном з тим, щоб послідовність нуклеїнової кислоти передавалась наступним поколінням. Гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти може бути інтегрована в геном окремо або як частина рекомбінантної касети експресії. Термін "трансгенний", застосовуваний у даному документі, включає будь-яку клітину, клітинну лінію, калюс, тканину, частину рослини або рослину, генотип яких був змінений через наявність гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти, включаючи трансгенні організми, початково змінені таким чином, а також трансгенні організми, одержані шляхом статевих схрещувань або безстатевого розмноження з початкових трансгенних організмів. Термін "трансгенний", застосовуваний в даному документі, не охоплює зміну геному (хромосомного або
Зо позахромосомного) за допомогою традиційних способів селекції рослин або за допомогою подій, що зустрічаються в природі, таких як випадкове перехресне запилення, нерекомбінантна вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація.
Термін "врожайність" може включати посилання на бушелі на акр зернових культур під час збирання, з поправкою на вологість зерна (для маїсу, наприклад, зазвичай становить 15 95), та об'єм утвореної біомаси (для кормових культур, таких як люцерна, і розмір коренів рослини для сільськогосподарських культур, що дають декілька врожаїв на рік). Вологість зерна вимірюють для зернової культури під час збирання. Скориговану натурну вагу зерна визначають як вагу у фунтах на бушель, з поправкою на рівень вологості зерна під час збирання. Біомасу вимірюють як вагу утвореного придатного для збирання рослинного матеріалу. На врожайність можуть впливати багато властивостей, у тому числі без обмеження висота рослини, кількість бобів, положення боба на рослині, кількість міжвузлів, частота розтріскування бобів, розмір зерна, ефективність утворення бульбочок і фіксації азоту, ефективність асиміляції поживних речовин, асиміляції вуглецю, структура рослини, відсоток проростання насіння, міць сходів і ювенільні ознаки. На врожайність також може впливати ефективність проростання (включаючи проростання в стресових умовах), швидкість росту (включаючи швидкість росту в стресових умовах), кількість качанів, кількість насінин на качан, розмір насіння, склад насіння (крохмаль, олія, білок) і характеристики наливу насіння. Врожайність рослини можна вимірювати різними способами, включаючи натурну вагу, кількість насіння на рослину, вагу насіння, кількість насіння на одиницю площі (тобто насіння, або вага насіння на акр), у бушелях на акр, тоннах на акр або кілограмах на гектар. Наприклад, урожайність кукурудзи можна вимірювати як вихід обмолочених кукурудзяних зерен на одиницю продуктивної площі, наприклад, у бушелях на акр або метричних тоннах на гектар, про що часто повідомляють на основі поправки на вологість, наприклад, на вологість 15,5 відсотка. Більше того, бушель кукурудзи визначається за законом штату Айова як 56 фунтів за вагою, при цьому корисний коефіцієнт перетворення для врожаю кукурудзи такий: 100 бушелів на акр еквівалентні 6,272 метричної тонни на гектар. Інші вимірювання врожайності є розповсюдженою практикою в даній галузі. У певних варіантах здійснення даного винаходу врожайність може бути підвищена в умовах стресу та/або в умовах відсутності стресу. бо Термін "вектор" або "конструкція" включає посилання на нуклеїнову кислоту, яку застосовують у трансфекції клітини-хазяїна, та у яку можна ввести полінуклеотид. Вектори найчастіше є репліконами. Вектори експресії забезпечують транскрипцію нуклеїнової кислоти, уведеної в них. "Вектор" включає, серед іншого, будь-яку плазміду, косміду, фаг або бінарний вектор для Адгобасієегішт в дво- або однонитковій лінійній або кільцевій формі, який може бути самопередавальним або мобілізованим або не бути таким, і який може трансформувати прокаріотичного або еукаріотичного хазяїна або за допомогою інтеграції в геном клітини, або за рахунок його позахромосомного існування (наприклад, плазміда, яка автономно реплікується, з точкою початку реплікації). Зокрема, включені шатл-вектори, за допомогою яких придатний носій ДНК може природним або спланованим чином реплікуватись у двох різних організмах- хазяїнах, які можуть бути вибрані з актиноміцетів і споріднених видів, бактерій та еукаріотів (наприклад, клітин вищих рослин, ссавців, дріжджів або грибів).
Термін "трансформація", застосовуваний в даному документі, стосується перенесення фрагмента нуклеїнової кислоти в геном клітини-хазяїна, що призводить до генетично стабільного успадкування. У деяких варіантах здійснення введення в частину рослини, рослинну тканину та/або рослинну клітину здійснюється за допомогою опосередкованої бактеріями трансформації за допомогою трансформації бомбардуванням частинками, трансформації опосередкованої фосфатом кальцію, трансформації, опосередкованої циклодекстрином, електропорації, трансформації, опосередкованої ліпосомами, трансформації, опосередкованої наночастинками, трансформації, опосередкованої полімерами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої вірусами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої ниткоподібними кристалами, мікроін'єкції, обробки ультразвуком, інфільтрації, трансформації, опосередкованої поліетиленгліколем, трансформації протопласта або будь-якого іншого електричного, хімічного, фізичного та/або біологічного механізму, який призводить до введення нуклеїнової кислоти в рослину, частину рослини та/або їх клітину, або їх комбінацію.
Процедури здійснення трансформації рослин є добре відомими і загальноприйнятими у рівні техніки та описані в літературі з усіх поглядів. Необмежувальні приклади способів трансформації рослин включають трансформацію за допомогою доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої бактеріями (наприклад, через бактерії з роду Адгобасіегішт), доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої вірусами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої
Зо карбідом кремнію або мікроголками з нуклеїновими кислотами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої ліпосомами, мікроін'єкції, бомбардування мікрочастинками, трансформації, опосередкованої фосфатом кальцію, трансформації, опосередкованої циклодекстринами, електропорації, трансформації, опосередкованої наночастинками, обробки ультразвуком, інфільтрації, поглинання нуклеїнових кислот, опосередкованого РЕС, а також будь-якого іншого електричного, хімічного, фізичного (механічного) та/або біологічного механізму, який забезпечує введення нуклеїнової кислоти в рослинну клітину, включаючи будь-яку їх комбінацію. Загальні посібники з різноманітними способами трансформації рослин, відомими з рівня техніки, включають Мікі еї аїЇ. ("Ргоседиге5 ог Іпігодисіпд Богеїдп ОМА іпіо Ріапіє" в Меїпоаз іп Ріапі
МоїІесшіаг Віоіоду апа ВіоїесппоЇоду за редакцією сіісК, В. К. і Тпотрзоп, 9. Е. (СКС Ргез5, Іпс.,
Воса Кап, 1993), ст. 67-88) і Какоугосгу-Тгоіапом5Ка (2002, Сеї! Мої Віо! І еїї 7:849-858 (2002)).
Отже, в деяких варіантах здійснення введення в частину рослини, рослинну тканину та/або рослинну клітину здійснюється за допомогою опосередкованої бактеріями трансформації, трансформації за допомогою бомбардуванням частинками, трансформації, опосередкованої фосфатом кальцію, трансформації, опосередкованої циклодекстрином, електропорації, трансформації, опосередкованої ліпосомами, трансформації, опосередкованої наночастинками, трансформації, опосередкованої полімерами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої вірусами, доставки нуклеїнових кислот, опосередкованої ниткоподібними кристалами, мікроін'єкції, обробки ультразвуком, інфільтрації, трансформації, опосередкованої поліетиленгліколем, будь-якого іншого електричного, хімічного, фізичного та/або біологічного механізму, який призводить до введення нуклеїнової кислоти в рослину, частину рослини та/або їх клітину, або їх комбінацію.
Трансформація, опосередкована Адгорасіегішт, є широко застосовуваним способом трансформації рослин, у зв'язку з його високою ефективністю трансформації та у зв'язку з його широким застосуванням щодо багатьох різних видів. Трансформація, опосередкована
Адгорасіегішт, зазвичай передбачає перенос бінарного вектора, який несе чужорідну ДНК, що становить інтерес, у відповідний штам Адгобасіегішт, що може залежати від набору міг-генів штаму-хазяїна Адгорасієгішт, розташованого або в корезидентній Ті-плазміді, або у хромосомі (ОКпез єї а). 1993 Ріапі Се! 5:159-169). Перенос рекомбінантного бінарного вектора в
Адгорасіегішт можна виконувати за допомогою методики трибатьківського схрещування з бо використанням Езспегіспіа соїї, яка несе рекомбінантний бінарний вектор, хелперного штаму Е.
соїї, що несе плазміду, яка здатна мобілізувати рекомбінантний бінарний вектор у цільовому штамі Адгобасіегішт. Альтернативно, рекомбінантний бінарний вектор можна переносити в
Адгорасієегічт шляхом трансформації нуклеїновою кислотою (Нбїдеп апа УмМіШтйлег 1988 Мисієїс
Асід5 Нез 16:9877).
Трансформація рослини за допомогою рекомбінантного Адгобасіегічшт зазвичай включає спільне культивування Адгобасіегішт з експлантатами рослини та проводиться відповідно до способів, добре відомих із рівня техніки. Трансформовану тканину, зазвичай, регенерують на селективному середовищі, що містить маркер стійкості до антибіотиків або гербіцидів між граничними послідовностями Т-ОМА бінарної плазміди.
Інший спосіб трансформації рослин, частин рослин і рослинних клітин включає впровадження інертних або біологічно активних часток у рослинні тканини та клітини. Див., наприклад, патенти США МоМо 4945050; 5036006 і 5100792. Загалом цей спосіб включає впровадження в рослинні клітини інертних або біологічно активних частинок в умовах, ефективних для проникнення крізь зовнішню поверхню клітини та можливості включення в її внутрішню частину. У разі використання інертних частинок вектор можна вводити в клітину шляхом покривання частинок вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка становить інтерес.
Альтернативно, клітина або клітини можуть бути оточені вектором таким чином, щоб вектор переносився у клітину слідом за частинкою. Біологічно активні частинки (наприклад, висушені клітини дріжджів, висушені бактерії або бактеріофаг, кожна з яких містить одну або декілька нуклеїнових кислот, які підлягають введенню) також можна ввести в рослинну тканину.
Отже, у конкретних варіантах здійснення даного винаходу рослинну клітину можна трансформувати за допомогою будь-якого способу, відомого з рівня техніки та описаного в даному документі, і можна регенерувати інтактні рослини з таких трансформованих клітин із застосуванням будь-якої з ряду відомих методик. Регенерація рослин із рослинних клітин, культури рослинної тканини та/або культивованих протопластів описана, наприклад, в Емапз5 еї аІ. (Напароок ої Ріапі СеїЇ Сийигев5, том 1, Масміїап Рибіїзпіпуд Со. Мем/ ХогКк (1983)) і Мавії І. Кк. (ред.) (СеїЇ Сийиге апа Зотаїййс СеїЇ Сепеїйіс5 ої Ріапіб5, Асад. Ргез5, Опапао, том І (1984) і том ЇЇ (1986)). Способи відбору трансформованих трансгенних рослин, рослинних клітин та/або культур рослинних тканин є звичайними в рівні техніки та можуть використовуватися в способах даного винаходу, передбачених у даному документі.
Термін "введений" передбачає вставку нуклеїнової кислоти в клітину, означає "трансфекцію", ""рансформацію" або "трансдукцію", і він включає посилання на вбудовування нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де нуклеїнова кислота може вбудовуватися в геном клітини (наприклад, в хромосомну, плазмідну, пластидну або мітохондріальну ДНК), перетворюватися на автономний реплікон або тимчасово експресуватися (наприклад, трансфікована мРНК). "Стабільна трансформація" або "стабільно трансформований", застосовувана в даному документі, означає, що нуклеїнова кислота вводиться в клітину та інтегрується в геном клітини.
Через це інтегрована нуклеїнова кислота може успадковуватися потомками, точніше, потомками декількох послідовних поколінь. "Геном" у контексті даного документа також включає ядерний і пластидний геном, а, отже, передбачається інтеграція нуклеїнової кислоти, наприклад, у геном хлоропласту. Стабільна трансформація, застосовувана у даному документі, може стосуватись також трансгена, який підтримується позахромосомно, наприклад, як мініхромосома.
Стабільну трансформацію клітини можна виявити, наприклад, за допомогою аналізу за методикою саузерн-блот-гібридизації геномної ДНК клітини з послідовностями нуклеїнових кислот, які зазнають специфічної гібридизації з нуклеотидною послідовністю трансгена, уведеного в організм (наприклад, рослину). Стабільну трансформацію клітини можна виявити, наприклад, за допомогою аналізу за методикою нозерн-блот-гібридизації РНК клітини з послідовностями нуклеїнових кислот, які зазнають специфічної гібридизації з нуклеотидною послідовністю трансгена, уведеного в рослину або інший організм. Стабільну трансформацію клітини також можна виявити, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших реакцій ампліфікації, добре відомих із даного рівня техніки, в яких використовують специфічні послідовності праймерів, які гібридизуються з цільовою послідовністю (цільовими послідовностями) трансгена, що призводить у результаті до ампліфікації послідовності трансгена, яку можна виявити відповідно до стандартних способів. Трансформацію також можна виявити за допомогою протоколів прямого секвенування та/або гібридизації, добре відомих із даного рівня техніки.
Термін "процес трансформації і регенерації" стосується процесу стабільного введення бо трансгена в рослинну клітину і регенерації рослини із трансгенної рослинної клітини.
Трансформація і регенерація, застосовувані в даному документі, включають процес селекції, за якого трансген містить селективний маркер, а трансформована клітина містить вбудований і експресований трансген таким чином, що трансформована клітина буде виживати і активно розвиватись у присутності засобу відбору. "Регенерація" стосується вирощування цілої рослини із рослинної клітини, групи рослинних клітин або частини рослини, такої як протопласт, калюс або частина тканини.
Термін "селективний маркер" або "селективний маркерний ген" стосується гена, експресія якого в рослинній клітині дає клітині перевагу під час відбору. Термін "позитивна селекція" стосується трансформованої клітини, що одержує здатність метаболізувати субстрат, який раніше вона не могла використовувати або не могла використовувати ефективно, зазвичай завдяки трансформації позитивним селективним маркерним геном і його експресії. Ця трансформована клітина, таким чином, розвивається із маси нетрансформованої тканини. Існує багато типів позитивної селекції, від неактивних форм регуляторів росту рослин, які потім перетворюються в активні форми за допомогою перенесеного ферменту, до альтернативних джерел вуглеводів, які не утилізуються ефективно нетрансформованими клітинами, наприклад, манози, яка потім стає доступною у разі трансформації геном ферменту, наприклад, фосфоманозоіїзомерази, яка дозволяє її метаболізувати. Нетрансформовані клітини або ростуть повільно порівняно з трансформованими клітинами, або зовсім не ростуть. Інші типи селекції можуть бути обумовлені тим, що клітини, трансформовані селективним маркерним геном, одержують здатність до росту в присутності засобу негативного відбору, такого як антибіотик або гербіцид, на відміну від здатності до росту нетрансформованих клітин.
Селективна перевага, яку має трансформована клітина, може також бути обумовлена втратою гена, який був у неї раніше, у так званій "негативній селекції". При цьому додають сполуку, що є токсичною лише для клітин, які не втратили специфічний ген (негативний селективний маркерний ген), присутній у батьківській клітині (типово, трансген).
Приклади селективних маркерних генів включають без обмеження гени, які забезпечують стійкість або толерантність до антибіотиків, таких як канаміцин (Оекеузег еї аї!. 1989, Ріапі Рпуз 90: 217-23), спектиноміцин (Змаб апа Маїїда 1993, Ріапі Мої Віо! 14: 197-205), стрептоміцин (Маїїда єї аї. 1988, Мої Сеп Сепеї 214: 456-459), гігроміцин В (УМаїдгоп еї аї. 1985, Ріапі Мої Віої
Зо 5: 103-108), блеоміцин (Ніїе еї аї. 1986, Ріапі Мої Віо! 7: 171-176), сульфонаміди (Спегіпеаи еї аї. 1990, Ріапі Мої! Віої! 15: 127-136), стрептотрицин (УеЇепз5кКа еї аї. 2000, Ріапі Сеї! Вер 19: 298-303) або хлорамфенікол (Ое ВіоскК еї аІ. 1984, ЕМВО у 3: 1681-1689). Інші селективні маркери включають гени, які забезпечують стійкість або толерантність до гербіцидів, наприклад, за рахунок мутацій 54 та/або Нга ацетолактатсинтази (АЇ 5), яка забезпечує стійкість до гербіцидів, зокрема сульфонілсечовинам, імідазолінонам, триазолопіримідинам і піримідинілтіобензоатам; гени 5-енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтази (ЕРБР5), у тому числі без обмеження ті, що описані в патентах США МоМо 4940935, 5188642, 5633435, 6566587, 7674598 (а також всіх споріднених заявках), і гліфосат-М-ацетилтрансферази (САТ), яка забезпечує стійкість до гліфосату (Сазйе еї аІ. 2004, бсіепсе 304:1151-1154, і опубліковані патентні заявки США МоМо 20070004912, 20050246798 і 20050060767); ВАК, яка забезпечує стійкість до глюфосинату (див., наприклад, патент США Мо 5561236); арилоксиалканоатдиоксигенази або ААО-1, ААО-12 або
ААБ-13, які забезпечують стійкість до 2,4-О0; гени, такі як НРРО Рзейдотопав, які забезпечують стійкість до НРРО; мутанти і варіанти протофорфіриногеноксидази (РРО), які забезпечують стійкість до окиснювальних в перекисі сполуки гербіцидів, зокрема фомесафену, адифлуорфен- натрію, оксифлуорфену, лактофену, флутиацет-метилу, сафлуфенацилу, флуміоксазину, флуміклорак-пентилу, карфентразон-етилу, сульфентразону; і гени, що забезпечують стійкість до дикамби, такі як ген дикамба-монооксигенази (Негтап еї аї. 2005, У ВіоЇ Спет 280: 24759- 24767 і патент США Мо 7812224 і споріднені заявки і патенти). Інші приклади селективних маркерів можна знайти в Зипдаг апа закійпімеІ (2008, 9 Ріапі РПпузіоїюду 165: 1698-1716), включеному в даний документ за допомогою посилання.
Інші системи відбору включають застосування лікарських препаратів, аналогів метаболітів, проміжних сполук метаболітів і ферментів для позитивного відбору або такого, що залежить від умов позитивного відбору трансгенних рослин. Приклади включають без обмеження ген, який кодує фосфоманозоізомеразу (РМІ), де маноза являє собою засіб відбору, або ген, який кодує ксилозоіїзомеразу, де ЮО-ксилоза являє собою засіб відбору (Наїагир еї аї. 1998, Ріапі Мої Віо! 37: 287-96). Нарешті, в інших системах селекції можна застосовувати середовище, що не містить гормонів, як засіб відбору. Одним необмежувальним прикладом є ген гомеобоксу маїсу Кп1, ектопічна експресія якого призводить до З-кратного підвищення ефективності трансформації (Іо єї аї. 2006, Ріапі Сеї! Вер 25: 403-409). Приклади різних селекційних маркерів і генів, що їх 60 кодують, розкриті в Мікі апа МеНидн (у Віотесппої, 2004, 107: 193-232, включеній за допомогою посилання).
У деяких варіантах здійснення селекційний маркер може походити від рослини. Приклад селекційного маркера, який може походити від рослини, включає без обмеження 5- енолпірувілшикімат-З-фосфатсинтазу (ЕРБР5Б). Фермент 5-енолпірувілшикімат-3- фосфатсинтаза (ЕРБР5) каталізує важливу стадію шикіматного шляху, загального для біосинтезу ароматичних амінокислот у рослин. Гербіцид гліфосат пригнічує ЕРБР5, тим самим знищуючи рослину. Трансгенні толерантні до гліфосату рослини можна одержувати за допомогою введення модифікованого трансгена ЕРБР5, на який не впливає гліфосат (наприклад, патент США 6040497, включений за допомогою посилання). Інші приклади модифікованого ЕРБР5 рослини, які можна застосовувати як селекційний маркер в присутності гліфосату, включають мутант Р10О6Ї ЕРБР5Б рису (2пои еї а! 2006, Ріапі Рпузіої 140: 184-195) і з мутацією РІ065 в ЕРБРБ5 підмаренника чіпкого (Ваегзоп еї а! 2002, Ріапі РНузіо! 129: 1265- 1275). Інші джерела ЕРБР5, які не походять із рослини і які можна застосовувати для забезпечення толерантності до гліфосату, включають без обмеження мутант ЕРЗР5 Р1015 із
ЗаіІтопеїа їурпітигішт (Сотаї єї а! 1985, Маїштге 317: 741-744) і мутований варіант СРА ЕРБ5РЗ від штаму СРА Адгобасіегішт 5р. (РипКе єї аІ 2006, РМАБ5 103: 13010-13015). Незважаючи на те, що ген ЕРБР5 рослини є ядерним, зрілий фермент локалізується в хлоропласті (Моизааїе апа
Соддіпв 1985, Ріапіа 163:241-249). ЕРЗР5 синтезується в вигляді білка- попередника, що містить транзитний пептид, і при цьому попередник потім транспортується в строму хлоропласту і обробляється протеолітичним шляхом з утворенням зрілого ферменту (деїМа-Сіорра еї а!. 1986,
РМАбБ 83: 6873-6877). Отже, для одержання трансгенної рослини, яка характеризується толерантністю до гліфосату, можна вводити придатним чином мутований варіант ЕРБР5, який належним чином уводиться в хлоропласт. У цьому разі така трансгенна рослина містить нативний геномний ген ЕРБР5, а також мутований трансген ЕРБР5. Потім гліфосат можна застосовувати як засіб відбору під час процесів трансформації і регенерації, при цьому виживають лише ті рослини або тканини рослини, які успішно трансформовані мутованим трансгеном ЕРБР5.
Термін трансгенний "об'єкт", застосовуваний в даному документі, стосується рекомбінантної рослини, одержаної за допомогою трансформації і регенерації рослинної клітини або тканини
Зо гетерологічної ДНК, наприклад, касетою експресії, яка містить ген, що становить інтерес. Термін "об'єкт" стосується вихідного трансформанта та/або потомків трансформанта, які містять гетерологічну ДНК. Термін "об'єкт" стосується потомка, одержаного за допомогою статевого ауткросинга між трансформантом та іншою лінією кукурудзи. Навіть після повторного зворотного схрещування з рекурентною батьківською особиною, вставлена ДНК і фланкуюча
ДНК від трансформованої батьківської особини присутня в потомках схрещування в тому ж хромосомному положенні. Термін "об'єкт" також стосується ДНК з вихідного трансформанта, що містить вставлену ДНК і фланкуючу геномну послідовність, що безпосередньо примикає до вставленої ДНК, яка, як можна очікувати, передається потомству, яке отримує вставлену ДНК, в тому числі трансген, що становить інтерес, в результаті статевого схрещування однієї батьківської лінії, яка містить вставлену ДНК (наприклад, вихідного трансформанта і потомка, одержаного у разі самозапилення), і батьківської лінії, яка не містить вставлену ДНК. Зазвичай трансформація тканини рослини забезпечує одержання декількох об'єктів, кожний із яких передбачає вставку конструкції ДНК у різні положення в геномі рослинної клітини. На підставі експресії трансгена або інших необхідних характеристик, відбирають певний об'єкт.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що трансгенний генотип за даним винаходом можна інтрогресувати за допомогою селекції в інші лінії рослин, що містять різні трансгенні або нетрансгенні генотипи. Наприклад, інбредну кукурудзу, що містить трансгенний генотип за даним винаходом, можна схрещувати з інбредною кукурудзою, що містить трансгенний генотип об'єкта МІК162, стійкий до лускокрилих, відомий з рівня техніки, з одержанням тим самим насіння кукурудзи, яке містить як трансгенний генотип за даним винаходом, так і трансгенний генотип МІК162. Крім того, буде зрозуміло, що можна виконувати інші комбінації з трансгенним генотипом за даним винаходом, і, таким чином, цей приклад не слід розуміти як обмежуючий.
Трансгенний генотип за даним винаходом можна інтрогресувати від початково трансформованої рослини, такої як рослина кукурудзи, в інбредну або гібридну рослину за допомогою відомих в даній галузі методик селекції. Метою селекції рослин є комбінація в одному сорті або гібриді різних необхідних ознак. Для польових культур такі ознаки можуть включати стійкість до комах і захворювань, толерантність до гербіцидів, витривалість до жари і засухи, зменшення проміжку часу до визрівання культури, більш високу врожайність і кращу агрономічну якість. У разі механізованого прибирання врожаю багатьох культур важливою є 60 однорідність характеристик рослин, таких як досягнення проростання і стояння, швидкість росту, визрівання і висота рослини і початку.
У даному винаході передбачена конструкція, яка містить ген тсСгузА, розкритий у патенті
США Мо 7030295 (включений у даний документ за допомогою посилання), який кодує білок тОСтузА та є придатним для контролю комах-шкідників кукурудзяних жуків (Оіабгоїїса 5рр.).
Конструкція також містить ген еСтуЗ.ТАбБ (також відомий як ЕКва), розкритий у патенті США Мо 8309516 і включений у даний документ за допомогою посилання, який кодує інсектицидний білок еСгуЗ.1АБб, також придатний для контролю комах-шкідників Юіаргоїїса 5рр. за допомогою другого режиму дії. Подвійні режими дії, що забезпечуються завдяки двом інсектицидним білкам в одній трансгенній рослині кукурудзи, забезпечує рослинника ефективнішою системою догляду за рослинами для контролю кукурудзяного жука.
Хоча існують комерційні об'єкти, які несуть або ген тСгузА (а саме об'єкт МІКб6О4, патенти
США МоМо 7361813, 7897748, 8354519 та 8884102), або ген еСгу3з.1АБ (а саме об'єкт 5307, патент США Мо 8466346), окремий об'єкт, який несе обидва гени в одному локусі, забезпечував би значні переваги. На сьогодні створення комерційно придатної трансгенної рослини, яка містить обидва трансгена тсСгузА та еСгу3З.1АБ, потребує декількох стадій селекції та значної кількості скринінгових аналізів для ідентифікації належного генотипу в належній ідіоплазмі. Ці стадії селекції і відбору необхідні для кожного різновиду ідіоплазми, в яку введення цих двох ознак є бажаним. Крім того, для багатьох агрономічно важливих культур, таких як кукурудза, ці дві ознаки необхідно підтримувати у вигляді гібридів для десятків різновидів ідіоплазми.
Нарешті, фактори, такі як зчеплення генів небажаних ознак або генетична рекомбінація можуть ускладнювати виведення двох ознак із двох різних локусів в один різновид ідіоплазми. Таким чином, було б переважним одержати молекулу нуклеїнової кислоти, яка у випадку введення в геном клітини приведе до утворення трансгенної клітини, яка несе обидві ознаки в одному локусбі.
Були одержані різні конструкції для визначення ефективності генів тСгузА та еСтуЗзЛАБв у контексті різних касет експресії. Несподівано, один вектор, 17629, забезпечував відмінні інсектицидні властивості без будь-яких негативних ефектів на вегетативний розвиток або фертильність трансгенної рослини або з мінімальними ефектами. Трансген із вектора 17629 являє собою 5ЕО ІЮ МО: 1. Цей трансген містить три касети експресії. Дві такі касети експресії
Зо містять еСгу3з.1АБ ії тСгузА, які являють собою гени, придатні для контролю твердокрилих комах-шкідників, включаючи Оіаргоїїса мігуітега мігдітега, західний кукурудзяний жук, О. мігдітега 7еае, мексиканський кукурудзяний жук, і 0. Іопдісогпіб5 Багрегі, північний кукурудзяний жук. Третя касета експресії містить ген РАТ, який забезпечує стійкість до гербіцидів, які містять глюфосинат. Ген РАТ походить із Бігеріотусев5 мігідоспготодепе5 і кодує фосфінотрицин- ацетилтрансферазу, яка забезпечує толерантність до глюфосинату. (Патенти США МоМо 5531236, 5646024, 5648477 і 5276268). Ген РАТ можна використовувати як селектовний маркер для трансформації. Трансгенні рослини, що експресують ген РАТ, також можуть характеризуватись толерантністю до гербіцидів, які містять глюфосинат. Тому трансгенна рослина, яка містить 5ЕБЕО ІЮ МО: 1, характеризується як поліпшеними інсектицидними властивостями, так і толерантністю до гербіцидів.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що у разі вставки молекули нуклеїнової кислоти, такої як ЗЕО ІЮО МО: 1, в клітину, 5'- та/або 3'-кінці вставленої молекули можна видалити або перегрупувати. Такі делеції або перегрупування можуть не впливати на функцію вставленої молекули, і ці відносно невеликі зміни приводять до того, що вставлена молекула може вважатись в значній мірі ідентичною ЗЕО ІЮ МО: 1. Фахівцю в даній галузі також буде зрозуміло, що молекула нуклеїнової кислоти, наприклад, що містить ЗЕО ІЮ МО: 1, може піддаватись повному або частковому перегрупуванню або дуплікації під час вставки таким чином, що вставлена молекула являє собою повне або часткове перегрупування або дуплікацію вихідної молекули нуклеїнової кислоти. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ця вставлена молекула може все ще мати ті самі характеристики та/або ознаки, що й вихідна молекула, завдяки тому, що вставлена молекула в значній мірі ідентична ЗЕО ІЮ МО: 1, і трансформована клітина або одержана трансформована рослина все ще можуть залишатись бажаними.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що у разі трансгена для комерційного застосування, такого як молекула нуклеїнової кислоти, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 1, можуть бути потрібними відносно незначні модифікації стосовно послідовності нуклеїнової кислоти для відповідності вимогам державних регулятивних норм. Такі модифікації не будуть впливати на функцію одержаної молекули, яка буде в значній мірі ідентична ЗЕО ІЮ МО: 1. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що молекула модифікованої нуклеїнової кислоти буде фактично такою самою, як і вихідна молекула. 60 Отже, даний винахід охоплює молекулу нуклеїнової кислоти, в значній мірі ідентичну ЗЕ ІЮ
МО: 1, де певні нуклеотиди із БЕО ІЮО МО: 1 видаляють, замінюють або перегрупують, з одержанням в результаті мутованої 5ЕО ІЮО МО/:1, і при цьому функціональність мутованої БЕО
ІО МО:1 є такою ж, як і у вихідної молекули. У даному винаході також передбачена молекула нуклеїнової кислоти, молекула химерної нуклеїнової кислоти та/або конструкція рекомбінантної нуклеїнової кислоти або вектор, які містять, складаються із або складаються головним чином із послідовності нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 90 95 ідентична, щонайменше на 95 95 ідентична, щонайменше на 97 95 ідентична, щонайменше на 98 95 ідентична, щонайменше на 9995 ідентична або на 10095 ідентична 5ЕО ІЮ МО: 1. В одному варіанті здійснення ця молекула химерної нуклеїнової кислоти може містити додаткові касети експресії, транскрипційні або трансляційні регуляторні елементи або точки початку реплікації прокаріот. В іншому варіанті здійснення молекула химерної нуклеїнової кислоти може являти собою конструкцію рекомбінантної нуклеїнової кислоти, таку як бінарний вектор або вектор, придатний для експресії у прокаріот. Конструкція рекомбінантної нуклеїнової кислоти може бути придатною для транзієнтної або стабільної експресії у рослин. В одному варіанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описана в даному документі, являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює 5ЕО ІЮ МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1 або у вигляді виділеної молекули нуклеїнової кислоти, або у вигляді частини більш крупної молекули нуклеїнової кислоти.
В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює застосування ЗЕО ІЮО МО: 1 або молекули нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІЮ МО: 1, де експресія вказаної молекули забезпечує поліпшені інсектицидні властивості, придатні для контролю твердокрилих комах-шкідників, включаючи Оіаргоїїса мігуітега мігдітега, західний кукурудзяний жук, О. мігдітега 7еае, мексиканський кукурудзяний жук, і 0. Іопдісогпі5 рагрегі, північний кукурудзяний жук.
В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює трансгенну клітину-хазяїна, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти з 5ЕО ІЮО МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІЮ МО: 1. У деяких варіантах здійснення клітина може являти собою бактеріальну клітину або рослинну клітину. У деяких варіантах здійснення бактеріальна клітина може являти собою клітину Езспегіспіа соїї, Васійи5 (Пигіпдіепвіх5, Васійи5 5иЇибБійб, Васійи5
Зо тедаїенпит; Васіїи5 сегеив, Адгобасієтцт 55р. або Роеидотопаз 55р.
В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює трансгенну рослину, частину рослини, тканину рослини, культуру рослинних клітин або рослинну клітину, що містять трансгенну рослинну клітину, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти з ЗЕО ІЮО МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична ЗЕО ІЮ МО: 1. У деяких варіантах здійснення ця молекула нуклеїнової кислоти може являти собою хромосому, в яку була інтегрована молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описана в даному документі. Трансгенна рослинна клітина може мати здатність регенерації в трансгенну рослину або не мати таку здатність. Трансгенна рослина може бути однодольною рослиною або дводольною рослиною. У деяких варіантах здійснення трансгенна рослина може являти собою культурну рослину, зокрема без обмеження маїс, сорго, пшеницю, соняшник, помідор, хрестоцвіті, овес, газонну траву, пасовищну траву, різновиди перцю, картоплю, бавовник, рис, сою, цукрову тростину, цукровий буряк, тютюн, ячмінь і олійний рапс.
В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює потомство трансгенної рослини будь- якого покоління, де потомство містить 5ЕО ІЮ МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІО МО: 1. В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює пропагулу від трансгенної рослини будь-якого покоління, де пропагула містить ЗЕО ІЮ МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІО МО: 1. У деяких варіантах здійснення пропагула може являти собою насінину або живець. Живець може бути із надземної частини трансгенної рослини, такої як стебло або листок, або підземної, такої як корінь або кореневище.
В іншому варіанті здійснення даний винахід охоплює спосіб одержання трансгенної рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями, що передбачає введення в рослину 5ЕО ІЮ МО: 1 або молекули нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІЮ МО: 1, за рахунок чого здійснюється одержання трансгенної рослини, де молекула нуклеїнової кислоти забезпечує експресію генів тСгузА та еСгу3.1 АБ у кількості, яка забезпечує контроль комах. В одному варіанті здійснення молекулу нуклеїнової кислоти можна вводити в рослину за допомогою способу трансформації включаючи без обмеження трансформацію, опосередковану
Адгобрасієгічт, або біолістичного бомбардування або бомбардування частинками. Такий спосіб буде включати стадії (а) одержання молекули нуклеїнової кислоти; (б) введення в рослину, бо культуру тканин або рослинну клітину молекули нуклеїнової кислоти зі стадії (а) з одержанням трансформованої рослини, культури трансформованих тканин або трансформованої клітини, яка характеризується поліпшеними інсектицидними властивостями; та (с) вирощування вказаної трансформованої рослини або забезпечення регенерації трансформованої рослини з культури трансформованих тканин або трансформованої рослинної клітини з одержанням таким чином трансгенної рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями.
В іншому варіанті здійснення молекулу нуклеїнової кислоти також можна вводити в рослину за допомогою селекції, включаючи самозапилення або ауткросинг, таким чином, що потомство несе молекулу нуклеїнової кислоти. В одному варіанті здійснення спосіб буде передбачати стадії а) одержання фертильної трансгенної рослини, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти з ЗЕО ІЮО МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1; Б) вирощування вказаної рослини в придатних умовах з одержанням указаної трансгенної насінини. В іншому варіанті здійснення спосіб буде передбачати стадії а) одержання фертильної трансгенної рослини, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти з БЕО ІЮ МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична 5ЕО ІО МО: 1; Б) статевого схрещування трансгенної батьківської рослини із другою батьківською рослиною; с) здійснення відбору рослини-потомка першого покоління з поліпшеними інсектицидними властивостями.
Необов'язково спосіб може передбачати додаткові стадії 4) забезпечення самозапилення рослини-потомка першого покоління, за рахунок чого здійснюється одержання великої кількості рослин-потомків другого покоління; та е) здійснення відбору з рослин-потомків другого покоління рослини з поліпшеними інсектицидними властивостями, де рослини-потомки другого покоління містять молекулу нуклеїнової кислоти з ЗЕО ІЮ МО: 1 або молекулу нуклеїнової кислоти, яка в значній мірі ідентична ЗЕО ІО МО: 1, і рослини-потомки другого покоління характеризуються поліпшеними інсектицидними властивостями порівняно з нетрансгенною рослиною.
Приклади
Приклад 1. Синтезовані конструкції
Конструювали конструкції п'яти бінарних векторів з різними комбінаціями транскрипційних енхансерів, промоторів, трансляційних енхансерів і термінаторів і варіантами цих генетичних елементів, які керують експресією варіантів тСгузА та еСгуЗ.1АБ. Усі застосовувані промотори,
Зо як відомо, є сильними конститутивними промоторами, й очікувалось, що додавання транскрипційних і трансляційних енхансерів забезпечить у трансгенних рослин відмінні рівні експресії та контроль комах. Варіанти генів тСтгузА та еСтуЗ3.1АБ одержували, враховуючи різні переваги щодо кодонів для зменшення ідентичності між двома нуклеотидними послідовностями. Ділянки ідентичності нуклеотидної послідовності між генами тсСгузА та еСтгу3з.1Ар можуть приводити до зменшення експресії генів на транскрипційному або посттранскрипційному рівні Тому розробка нуклеотидних послідовностей з мінімальною ідентичністю може приводити до підвищеної експресії одного або обох генів тСгузА та есСтуз3.1АБ у трансгенній рослині. У таблиці 1 показано п'ять одержаних конструкцій і переліки генетичних елементів із кожною кодувальною послідовністю (СО5). У таблиці 2 описаний кожний із генетичних елементів, позначених в таблиці 1.
Таблиця 1
Композиція бінарних конструкцій конструкції касети енхансер 17629..1.7.7772....Ї ..ЮюЮюЮКЮюЮюЄЙМЮМБ 1 рр-18 (тСузаої МО520 щ КБ 81111111 Іріз55-04 |сРАТОВ 01МО50501.ЮК( 18382112. | ...7.7юЮюЮ7Ю7Ю7ю7юИ/И/и/иИ/000о1рр-т8 0 (тСтузА-ої штоОрізбі-01 81111111 Іріз55-19 (сРАТ0О9 01МО5-05-01.ЙЮК( 21371 | 2 | ЮюЮБ |рпри-38 о тСуздоб МО525 6 81111111 Іріз55-19 (сРАТ0О9 01МО5-05-01.ЙЮКХ 21629... 2 | Юр. |рпби-38 о стСтузао5 (риб - 87717171 1різ55-19 |сРАТОЯ 0ІМО5-05-01.Ююхм
Таблиця 1(продовження) конструкції касети енхансер 21630, 2 | Юр: |рго0рій-Ої дтоСтуздоб |З5509.4.Й.ЙД к 6ЯиИКЖ 81111111 Іріз55-19 (сРАТ0О9 01МО5-05-01.ЙЮК( 21386 81111111 Іріз55-19 (сРАТ0О9 01МО5-05-01.ЙЮКХ 21648. | 2 | .ЮКру-.77771/71/0/0/0о|ргби-38 о стСтузао5 (риб - 81111111 Іріз55-19 (сРАТ0О9 01МО5-05-01.ЙЮКХ 21649, 2 | -ЮКрнюнюїю//1//0о|рго0рійОї тоСтуздоб 0З5509.4.Й.ЙН щ 2 " 87717171 1різ55-19 |сРАТОЯ 0ІМО5-05-01.Ююхм
Таблиця 2
Опис генетичних елементів енхансер
Модифікована енхансерна ділянка із вірусу мозаїки енхансер хОб6166.1; Май еї а. 1997, Тгтапздепіс Не5 6: 143-156). відрізняється від ЕЕММ-0О3 змінами в З п. о.
Енхансерна ділянка 355 вірусу мозаїки цвітної капусти, яка енхансер 1987, РМАБб 84: 4870-4874). відрізняється від е355-05 змінамив2 п. о.
Модифікована промоторна ділянка із вірусу мозаїки цвітної)
Промоторна ділянка вірусу цеструму, що зумовлює жовту курчавість листя (Нопп еї аї.
Промотор рісмМР-бя Курта патент США Мо 7166770). Забезпечує конститутивну експресію в магїсі.
Модифікований промотор гена убіквітину маїсу, аналогічний 5944646.1; (Спгізієпзеп вї а). 1992, РМВ 18: 675-689). п'ють рено
Промотор ргзоШбБі4-01 тетраубіквітину цукрової тростини (шбі4), номер доступу в
СепВапк АРО93504, патент США Мо 6706948.
Сконструйований ген Сгу, активний щодо певних видів (Оіаргоїїса). Патент США Мо 8309516
Таблиця 2 (продовження)
Опис генетичних елементів
Такий варіант еСтгуЗ.1АБ базується на еСгуЗ3.1ТАБ-01 та має таку саму амінокислотну послідовність, однак перевага щодо кодонів була змінена для скорочення застосування
Кодувальна еСтузтАБ-ОЗ найчастіше використовуваних кодонів і зменшення послідовність І ідентичності нуклеотидної послідовності з тсСгузА та СтуТтАбБ.
Нуклеотидну послідовність також оптимізували для комерційного застосування та для відповідності вимогам державних регулятивних норм.
Такий варіант еСтгуЗ.1АБ базується на еСгуЗ3.1ТАБ-01 та має таку саму амінокислотну послідовність, однак перевага щодо кодонів була змінена із застосуванням іншої стратегії, ні для еСтгуЗ.1Ар-03, для скорочення застосування найчастіше
Кодувальна : й й й послідовність еСту3.1АЬ-04 використовуваних кодонів і зменшення ідентичності нуклеотидної послідовності з тСтузА та СтутАБ.
Нуклеотидну послідовність також оптимізували для комерційного застосування та для відповідності вимогам державних регулятивних норм.
Такий варіант еСтуЗз.1Ар базується на еСтгуЗ.1АБ-01 їі має таку саму амінокислотну послідовність, за винятком мутації 5153Т. Перевага щодо кодонів була змінена «(із застосуванням іншої стратегії, ніж для еСтгу3з1Ар-03 або
Кодувальна еСтуз1АБ-05 еСту3з.1АрБ-04, для скорочення застосування найчастіше послідовність І використовуваних кодонів і зменшення ідентичності нуклеотидної послідовності з тСтузА та СтутАБ.
Нуклеотидну послідовність також оптимізували для комерційного застосування та для відповідності вимогам державних регулятивних норм.
Оптимізований для маїсу сгузА на підставі нативної білкової послідовності СтузА із В. Пигіпдіепзіз підвиду Тїепебгіопіб5
Кодувальна тСгузА-Ої (ЗекКаг ев! а. послідовність 1987, РМА5 84: 7036-7040; патенти США МоМо 7030295 та 7276583).
Такий варіант тСтгузА базується на тСгузА-01 і має так
Кодувальна тСгузА-04 саму амінокислотну послідовність. Нуклеотидну послідовність послідовність оптимізували для комерційного застосування та для відповідності вимогам державних регулятивних норм.
Такий варіант тСгузА базується на тСгузЗА-01 та має так саме амінокислотну послідовність, однак перевага щодо кодонів була змінена для скорочення застосування
Кодувальна найчастіше використовуваних кодонів і зменшення
Й . тСтузА-05 : . Й . . послідовність ідентичності нуклеотидної послідовності з естузЗЛАБ.
Нуклеотидну послідовність також оптимізували для комерційного застосування та для відповідності вимогам державних регулятивних норм.
Модифікований варіант гена від штаму Т0494 5ігеріотусев5 мігідоспготодепе5, що кодує селектовний маркер РАТ.
Нативна кодувальна послідовність (Му/ойпІереп еї аї. 1988,
Кодувальна о : : послідовність СРАТ-0О8 Сепе 70: 25-37) була кодон-оптимізована для посиленої експресії. РАТ забезпечує толерантність до гербіцидів, що містять глюфосинат (фосфінотрицин). (Патенти США МоМо 5531236, 5646024, 5648477 і 5276268).
Таблиця 2 (продовження)
Опис генетичних елементів послідовність саму амінокислотну послідовність.
Термінаторна послідовність із гена МОЗ А. Шштегасіеп5 . (номер доступу в МСВІ М00087.1). Утворює сайт
Термінатор ЇМО5-05-01 | рподіаденілювання (Вемап е! а. 1983, Мисівїс Асід5 Ве 11: 369-385).
Модифікована термінаторна послідовність із гена МО5 А.
Термінатор 1чО5-20 Іштеїасієп5 (номер доступу в МСВІ МО00087.1). Утворює сайт поліаденілювання (Вемап еї а!ї. 1983). . ! Термінаторна послідовність із гена 2тИ29158-3 убіквітин . ! Термінаторна послідовність із гена 2МО66361 убіквітину
Термінаторна послідовність із гена ШБії 7еа таух.
Термінатор шШвії1-05 Нуклеотидну послідовність оптимізували для комерційного застосування та для відповідності вимогам державни регулятивних норм. . Модифікований термінатор 355 вірусу мозаїки цвітної
Приклад 2. Трансформація в рослинах кукурудзи
Кожну з восьми конструкцій бінарних векторів застосовували для створення трансгенних об'єктів маїсу. Об'єкти одержували за допомогою опосередкованої Адгорасіегічт трансформації запатентованої лінії маїсу. Незрілі зародки трансформували головним чином, як описано в
Медгоно еї аї. (2000, Ріапі СеїЇ Веропз 19: 798-803). За допомогою даного способу генетичні елементи в межах лівої та правої прикордонних областей плазміди для трансформації ефективно переносились та інтегрувались в геном рослинної клітини, у той час як генетичні елементи за межами даних прикордонних областей не переносились.
Ген РАТ застосовували як селекційний маркер під час здійснення способу трансформації (Медгонйо сеї а). 2000). Зародки, які утворюють ембріогенні калюси, переносили на ряд селективних середовищ для культивування клітин, що містять біалафос як засіб селекції, і загалом культивували протягом 10-11 тижнів. Селективні середовища містили 200 мг/мл тиментину та/або 10 мл/л РРМ (суміші захисних засобів для рослин) для забезпечення видалення Адгобасіегічт із трансформованої тканини.
Регенеровані проростки тестували щодо присутності гена РАТ й інших цільових генів за допомогою ПЛР-аналізу в реальному часі із застосуванням ТАОМАМФ), розробленого Іпопат еї а!. (Віоїесппіднев 31(1):132-4, 136-40, 2001). Рослини, позитивні щодо гена РАТ і цільових генів, що також називаються об'єктами, переносили в теплицю для подальшого розмноження.
Приклад 3. Експресія генів, визначена за допомогою кількісного'сендвіч"-ЕГ ІА
Для визначення рівнів експресії тСтуза та еСтуЗ3.1Ар виконували кількісний ЕГІЗА із застосуванням дуплексного способу для визначення кількості білків тСгтуза та еСту3з1АБ одночасно в тому самому зразку. Зразки одержували з коренів трансгенних об'єктів й екстрагували в фосфатно-сольовому буферному розчині з рН 7,3 (РВ5), що містив 0,05 95
Тмжееп-20 (РВЗТ). Загальний розчинний білок (ТОР) в екстракті вимірювали із застосуванням аналізу для визначення білків за допомогою ВСА від Ріегсе (Тпегто Зсіепійіс, Рокфорд,
Іллінойс). 9б6-лункові планшети (Мипс Махізогр) із високою зв'язувальною здатністю покривали за допомогою 2 мкг/мл МАБ170 до тстгузА в буфері. Планшети промивали три рази фосфатно-
Зо сольовим буферним розчином з рН 7,3 (РВ5), що містив 0,05 95 Гувеп-20 (РВЗТ). У планшет додавали зразки або стандартні зразки у розріджувачі для ЕГІБА (РВЗТ, що містив 1 95 альбуміну бичачої сироватки) (100 мкл/лунка), інкубували протягом 1 год. за кімнатної температури (КТ) зі струшуванням і промивали п'ять разів. У планшет додавали 100 мкл/лунка 0,5 мкг/мл кон'югованого з НЕР антитіла кролика до СтгуТАБб, 1 мкг/мл кон'югованого з біотином
МАБбБ174 до тСгтузА та 0,1 мкг/мл кон'югату стрептавідин-лужна фосфатаза (даскзоп
ІтітипоКезеагсі І арх, Вест-Грув, Пенсильванія) у розріджувачі для ЕГІЗА, інкубували протягом 1 год. за ЕКТ/струшування та промивали, як описано раніше. Додавали субстрат п- нітрофенілфосфат (ЗигМодісх, Іден Прейрі, Міннесота) (100 мкл/лунка) та забезпечували проявлення кольору протягом 30 хв. за кімнатної температури. Поглинання вимірювали за 405 нм за допомогою зчитувального пристрою для мікропланшетів (ВіоТек Рожшегмаме Х52, Вінускі,
Вермонт) для кількісного визначення тСгузА. Планшет промивали, як описано раніше.
Додавали субстрат тетраметилбензидин (Зідта, Сент-Луїс, Міссурі) (100 мкл/лунка) та забезпечували проявлення кольору протягом 30 хв. за кімнатної температури зі струшуванням.
Реакцію зупиняли із застосуванням 1 н. НСІ (100 мкл/лунка). Поглинання вимірювали за 450 нм для визначення еСгуЗ.1АБ. Для нормалізації ефективності екстракції концентрацію речовини, що аналізували (тСгузА або еСгуЗ3.1АБ), ділили на концентрацію загального розчинного білка (Т5Р). Для стандартної кривої застосовували чотирипараметричний підбір кривої для відкладення на графіку концентрацій залежно від поглинання.
Таблиця З
Узагальнення даних щодо експресії тСтузА значення) ни ГТ: В ПО ГТ НЯ ПОЛОН То ПО
Накопичення білка тСгузА в середньому було найвищим в об'єктах, одержаних трансформацією бінарною конструкцією 18382. Трансгенні рослини, одержані трансформацією бінарними конструкціями 21371, 21629, 21630, 21386, 21648 та 21649 характеризувались низькою ефективністю щодо південного кукурудзяного жука внаслідок низьких рівнів білка.
Таблиця 4
Узагальнення даних щодо експресії еСгуЗ.1Ар (середнє значення) 11221938611Ї111111111111421|111111111111101
Кількості білка еСгуЗз1Ар у середньому були найвищими в об'єктах, одержаних трансформацією бінарною конструкцією 17629. Несподівано, що об'єкти, одержані з рештою конструкцій, характеризувались набагато меншими кількостями білка еСту3.1АбБ.
Приклад 4. Дослідження ефективності об'єктів, що містять трансгени 17629 та 18382
У 49 трансгенних об'єктах кукурудзи, що містили трансген 17629, і 12 трансгенних об'єктах, що містили трансген 18382, оцінювали ефективність щодо південного кукурудзяного жука в польових умовах у двох різних гібридах (гібриди А та В) загалом у 8 різних місцях на території
Сполучених Штатів. Об'єкти висаджували на ділянки в три ряди з З повторами кожного. На 6
Зо рослин із центрального ряду були нанесені чотирьохдюймові кореневі пошкодження, зумовлені харчуванням. У випадку гібрида А, 21 із 49 об'єктів, що містили трансоген 17629, і 12 із 12 об'єктів, що містили трансген 18382, характеризувались прийнятною ефективністю щодо південного кукурудзяного жука за довірчого рівня 5 95. У випадку гібрида В, 31 із 49 об'єктів, що містили трансген 17629, і 12 із 12 об'єктів, що містили трансген 18382, характеризувались прийнятною ефективністю щодо південного кукурудзяного жука.
Приклад 5. Дослідження агрономічної еквівалентності об'єктів, що містять трансгени 17629 та18382
У 49 трансгенних об'єктах кукурудзи, що містили трансген 17629, і 12 трансгенних об'єктах, що містили трансген 18382, оцінювали ефективність щодо південного кукурудзяного жука в польових умовах у двох різних гібридах (гібриди А та В) загалом у 16 різних місцях на території
Сполучених Штатів. Об'єкти висаджували на ділянки в два ряди з З повторами кожного. Урожай зерна визначали як кількість бушелів на акр, і здійснювали аналіз із визначення середнього значення методом найменших квадратів. У випадку гібрида А, всі об'єкти, що містили трансген 17629, продемонстрували результат, порівнянний щонайменше з контрольним зразком, який являв собою трансгенну рослину, що містить такий самий трансген еСгузЗ.1АБ, як і об'єкт 5307.
Однак у випадку гібрида А, 8 із 11 об'єктів, що містили трансген 18382, продемонстрували значно гірший результат, ніж контрольний зразок. У випадку гібрида В, усі об'єкти, що містили трансген 17629, продемонстрували результат, порівняний щонайменше з контрольним зразком.
У випадку гібрида В, 1 із 11 об'єктів, що містили трансген 18382, продемонстрував значно гірший результат, ніж контрольний зразок. Несподівано, що не зважаючи на відмінні рівні білка тегузА та білка еСтгуЗ.1АБ (як показано в таблицях З і 4) та відмінну ефективність у польових умовах, як описано у прикладі 4, об'єктів, одержаних із застосуванням вектора 18382, лише об'єкти, одержані із застосуванням вектора 17629, характеризувались як гарною ефективністю, так ії гарною продуктивністю. Тому лише вектор 17629 задовольняє всім вимогам одержання трансгенних об'єктів маїсу з високою продуктивністю.
Усі публікації та патентні заявки, згадані в даному описі, є показником рівня компетентності фахівців у галузі, якої стосується даний винахід. Усі публікації та патентні заявки включені в даний документ за допомогою посилання в тій же мірі, як якщо б кожну окрему публікацію або патентну заявку конкретно і окремо включили за допомогою посилання.
Хоча викладений вище винахід для ясності й розуміння був досить докладно описаний у вигляді ілюстрації та прикладу, стане очевидним, що в межах обсягу переліку вищезгаданих
Зо варіантів здійснення і доданої формули винаходу можна здійснювати конкретні зміни і модифікації.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Бупдепса Ракгрісірасіоп5з, АС
Містепаокї, мМо1їКег
Сопуі1і11е, багейд
Нірзкіпа, дбойпп Рапієї
А7пакапапдат, Казіштаі1аї
Мое, Апагехж
БЕеї, Хіасуїп
БрРопопПце, Кеуїп У. «1205 Молекула нуклеїнової кислоти для поліпшення інсектицидних властивостей у рослин «1305 80823-05-І1-ОВО-МАТ «1505 75 62/184,227 «1515 2015-06-24 «1605 2 «1705 РагепсІпПп версія 3.5 «2105 1 «2115 8295 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
«223» Організми-джерела включають вірус цеструму, що зумовлює жовту курчавість листя, Васі1і1їцв ЕПигіпдієпзівз, Адгорастегіцт Сиптетбасієепв, леа шаув і вірус мозаїки цвітної капусти «4005 1
Есаєєсдадсу дачаассаад ддадссасдеЕ саєдассссс дссдаєсдасу сдддасаадс бо сСЯчЕЕссасдє Есодаасода садаассоддса асдаасаєсд дсадасааад єддсадасає 120 асЕдссссас ааасчаачає ддаассьдса ааадаааасд сдєсдаааєаа єЄдсдЕСТтСдас 180 аааддеєсадчд ЕСЯдстдсс Срааєссааса ссааадеддс ссстрассасд аєддааааас 240 гЕдеЕдсадссуд ЧдсЧЕсЕЕЧдсСЕЄЄЕ ЄЕсСсСЕдасдаа сааасаадає ссаосддссда сададсдадЧад 300
Ессассаєде дааддсасєсі ссадассса асаасддадс аасдасдеєаа дддсЕгасда
З6о аагаачсаач дасадеЕссда чааасдесса сісасссдєсс адсстасааа бассвадссс 420 сЕСсССсССсСЕСсСасфє дессаадддад сааааєссса дадачаєадс сссададада дааадададс
Зо 480 аадтадсста даадеддаєс сассаєдасе адеаасддсес дссадесдеЕдс єддасаєссдас 540 ссеЕтаєдасуд дссдасааса асассдаддс седдасадса дсассассаа ддасчдаєдчатсс бо садаадддса єсадсдсдЧдЕ дддсчдасстід седддасЧдЕдЯа ЕдоддсЕсссс сЕссоддсоадс бо дссстддеєда дсеЕсстасас саассесстод аасассарсе ддсссадсда ддасссст4дд 720 ааддсссєса гддадсадді ддаддсссод асбддассада адаєсдссда стасдссаад 780 аасааддсас гддссдадсо асадддсссс садаасаасд гддадчдаста єдсдадсдсс 840 сЕдчадсадсе ддсадаадаа ссссдстрдса ссдЕсссдса асссссасад ссадддссдас 900 асссдсдадс гЕДдеЕсСсадсса ддссддададс сасесссдса асадсасдсесс садсеЕєсдсс 960 ассадсддсс асчаддсєдсс дЕссСсЕДдасс асстасдссс аддссдссаа сасссасстд 19020 гЕСсСсСтдседа аддасдссса аасссасоода чдчадчдадеддд дссасдадаа ддаддасаєс чдссдадесеЕссі асаадсдсса дсгдаадссд асссаддадс асассдасса седсдеЕдаад 1140 гддрасаасчд ЕдадЧдЕССТада саадсеЕссдс ддсадсадсеі асдададстд дадасдаасес 1200 аассдстасс дссдсдадає дассстдасс дЕдстддасс гєдассдссст дЕєссссстд 1260 гасдасдєдс дссодсассс саадчаддсд аадассдадс гдасссдсда сдідседасс 1320 чассссаєсЯд гдддсдєдаа саасстдсдс додстасддса ссассосссад саасаєсдвад 1380 аастасаєсс дсаадсссса сстдсЕСсСЧдас сасстрдсасс дсаєссадес ссасасдсде 1440 еЕссадсссу дссрассасдуа саасдасадс сссаастасеі ддадсддсаа стасдеЕдадс 1500 асссдсссса дсаєсддсад саасдасаєс аєсассадсс ссусстасудд саасаачадс 1550 адсдадссся гдсадаассо сдадсеЕсаас додсдачаадд Едсассдсдс сдсддстаас 1620
Зо ассаасстдд ссасдсдодсс сЕСтдсадесд сбасадсддсд Єдассаадчачі ддчвадесссадс 1680 садсасаасуд ассадассда сдаддссадс асссадассої асдасадсаа дсдсаасаєд
З5 1740 часдссдєда дсрдддасад сасєсдассад срдссссссд адассассда сзадсссстд 1800 чачаадддсє асадссасса дсгдаастас деЕЧчаєдесдсе єсстдаєдса дддсадссос 1860 часассаєсс ссдасбдстдас сеЕддасссас аададсдесд ассєссссаа саєдаєсдвас 1920 адсаадаада ссасссадссї дссссрдасс аададсасса ассгдддсад сддсассадс 1980 чЧчЕддсдаадд дссссоддсесс сассддсоудадс дасассстьдс дссдсассад ссссддссад 2040 ассадсассс гдсдсдєдаа сассассдсс сссстідадсс адсдссассд сдесссдсаєс 2100 сдстасдсса дсассассаа сстдсадеьсєс сасассадса ссдасддсесд ссссаєсаас 2160 садддсаасо Есадсдссас сасдадсадс ддсадсаасс гдсададсдд садсеЕєссдас ассдесдддсс єсассасссс сеЕсСсаасьсс адсаасддса дсадсдсдес сассстдадс 2280 чдсссасдЕде Есаасадсдда саасчаддєд сбасассдасс дсаєсдадеЕс сдсдсссдасс 2340 чачаєдассе ссдаддссда дсасдасствд дададддсес адааддссдє даасдачЧчстд 2400 ссассадса дсаассадаєс сддссеЕдаад ассдасдеда ссдассасса сассдаєсад 2460
ЧЕЧдЕаддадс Едадссссес агаєдасчає сдеЕссаааса Ессддсаана аадесеесева 2520 ачаєсдчдаасс срдсдссод ссСЕсЧдсдвдаєд асвтаєсаває аасєєстдеЕє даастасдаеве 2580 аадсаєдеаа гаастаасає чеЕааєсєдсаєд асдеЕсаєєса Ечадасдддає єеЕЄсСаєчасяе 2640 ачдадссссдс ааєсасасає єсаасасдсд асадааааса ааасасадсуд сдсааастад 2700 чаєааастає сдсдсдсддЕ деЕСасстаєд ссассадаєс дсддасссаа дсеЕсдсаєсдс 2760
Зо сеЕдсадсдса дсодсдасссу чдЕСЯсдсссс ссЕСТадада гааєдадсає єдсаєдесста 2820 адеЕнаєсаааа аассассаса гасссеЕссє дссасасеЕсд Ессдаадедсадестаєста
З5 2880
ЄсСЕЄсасаса гасаєссааа сеЕсстасесста сдаасаатвтає аасстасадес ассасаасаа 2940 гаєсадеЕдує ссададааєс асаєсаааєда асадеЕсадас аєддсєсстааа ддасааєтсда 3000 чеаЕєєсеєсдас аасаддассс басадеЕсса ссЕЕссвадес дсдсасдеЕдесвЙвссссЕсеве 306
ЕЕ дсааає адссесасся агасаарсасе ссаєссарєє гасвтадсаса єссаєтсад 3120 дЕЕРадудадеЕє аавчддеЕсссс л агадастаає ЄСЕЕсСсСадса саєсстаєтєтє аєєсстаєсєсе 3180 адссессааа Есаадаааас Саааасеста ссеєрадчеЕссу нтссаєссаає аассвадаєва 3240
Гааавгадаа саааагааад Єдассааааа Єбааасааає ассссстаад аааєсєсааааа 3300 аастааддаа асасЕсесстЮ сдЯссссдваде ачаєсааєдсс адсседсвсаа асдссдссда счадеЕссаас ддасассаас садсдаасса дсадсдісдс діЕсдддссаа дсдаадсада 3420 саддсасддса ЕСЕСсСЕдДЕСсСУдсС Сдссстода ссссісеЕСЧдча дадеЕЕссдЯдся ссассЯяаєсс9 3480 асЕсдсеЕссд срдЕСддсає ссадаааєєд сдсддсддад сддасадасде дадссдасас 3540 часаддсддс сіссЕСсССсСс ссесасодддса ссддсадсста содддачавєвс сьсссссасс 360 дсСЕСсССсСЕСсСусСс ЕССсСссСЕссс ссодсссодссд сааєсааасад асасссссес сасасссесь
Зббо
Ессссаасс ЕСЯСдДссдеЕс соодадсодсас асасасасаа ссадасєсесс сссаааєсса 3720 сссдессддса ссіссдсссс ааддсасдсс дсЕСУЯЄсСсісС сссссссссс ссісеЕСТасе 3780 гЕЕСЕСТтадає сддсдєєссу деЕссатадеЕс адддсессуддеЕ адеЕсстасьє свдессаєде 3840
ЕЕЧЕЧДЕСсСада ЕССЧЯБУЧЄССЯ соадстадаєссс дЕдстдеЕвад сдсеєсдасраса соаодаєсдсдас 3900
Зо сЕдвасдєса дасасаєєсєст дассдстаас ссдссадеЕдс ЕсССЕСЕСсСвд94 ддааєсстд 3960 чаєддссста дссдЕсСсСсСЯдсС адасчдчдчаєс даєєсссаєда Ессе ЄЕСЯЄвєДдсає
З5 4020 ададЕєсєсдас ссЧсссЕсссстссссстарєєс аавсасавдес дедсассвдсЕ єгЕдссоадЧЕс 4080 ассеЕсеесає сте Ч9ФЕСЕЄЧУЯЧЄєЧТ єдаєчасуєд ддчсстудеЕтду дсдадєсЧєєс 4140 гадаєсдодач гачаасссстд ЄЕеЕсСааасса ссЕдЧдсддаєс єсаєтааєсс і кдддваєстднка 4200 гЧЕЧДЕЧесдссС асасасаєєс агадесвасдча асєдаадаєд асддаєсддаа агаєссдассь 4260 аччасаддсра гасаєдеЕєдча счосчдЧаЕсЕЕ асеєдаєдсає асасададає; яссеЕсеЕсаве 4320 сСЯсСЕСЧЯЧЕсЧЯЧ ЕЧчЧаєчаєсчєд чсЕЧ9ЇЕЧЧЕСООЧд дсоддЕСЯЧЕЄС асссдєєста дассддадкса 4380 чаастсасеЕдеЕє ссааастасс єддеЕдстаєєє аєсааєєссвтуч дааседсаєвд єдеЕЧд4тдеЕсає 4440 асаєсєєссає адссасдадеіЕ Єгаачаєдада содааасаєс дассвтаддадає аддсаєсасає
ЧдЕєЧаєЄЧЕеЕЧЯ ЯЕссСвтассда сдсасасраса сдаєддсаса гєдсадсаєст аєссаваєсдс 4560
ЕсЕаасствд адсасстаєс бассаєааса аасаадсаєд ЕссСтТасааєє аєсеседассь 4620
ЕдчасавгасЕє двдаєчаєддс асаєдсадса дстастаєсуєд дасєсеесвта дссстдсесте 4680 сагасдстає єсасеєсоосес давртасЕдесє ссеЕссЧеєСЧЧа ЕДдсЕСсСассст дЕЄЯЧЕЕс9дЕ 4740
ЧдЕБасьсстд садддаєсса ссасбдасуддс сдасаасаас ассдаддсесс гддасадсад 4800 сассассаач дасчедчаєсс адаадддсає садсдєдаєд доасдассвдс єдаддсасадвеЕ 4860 чЧадсЕссссс ЕсСсСоОдсоЯодсЯЯ ссстддеЕдад сЕєСстасасс аасеЕссстьда асассаєстд 4920 дсссадсдад дасссстдда аддсстссає ддадсаддед даддссстда сддассадаа 4980 чаєсдссдас гасдссаада асааддсасе додссдадсса садддсессЕсс адаасаасде 5040
Зо ччадчастає дсдадсодссс сдадсадссд дсадаадаас сссдсрдсас сдеЕсссоасаа 5100 сссссасадс садддссдса сссоадсдадсеЕ десЕсадссад дссдададсс асссссоасаа
З5 5160 садсаєбдссс адссеЕСсдсса сСсадсддсста счаддаєдссд ЕсссеЕДдасса сстасдссса 5220 ддссдссаас асссасстдеЕ єСсСстЕдстсдаа ддасдсссаа аєстасоодад аддачдчсоадав9д 5280 стасдадаач даддасаєсуд ссдадеЕссса саадсдссад ссдаадсєда сссаддадеа 5340 сассдассас гдсдЕЧчаадеі ддсасаасЧдЕ доддЕСсадас аадсеЕссдс дсадсадста 5400 счачадсвдч дсдаасссса ассодстассд ссдсдадаєд ассседасся єдссддассь 5460 чаєсдссстд ЕссСсссстдеЕ асддасдедсд ссеЕдсасссс ааддаддеєда адассдчадсь 5520 часссдсдас дегЕдстдассуд ассссассдІ дддсдЕдаас аасстдсдсд дстасдасас 5580
Зо сасссссадс аасаєсдада астасарссд саадссссас сідеЕєСсСдасо асссдсассд саєссадесс сасасдсдсєс сссадсссудд ссассасддс аасдасадсс Есаастасевд 5700 чадсддсаас гасдеєдадса сссдссссад саєсддсадс аасдасаєса єсассадссс 5760 сСЕЕСТтасддс аасаададса дсдадсссдІ дсадаассес дадесссаасуд дсдадааддчеі 5820 чЕассдсдсс дсддссааса ссаасстддс сЯЕдсддссс ЕСЄсдсадедес асадсдасдве 5880 чассааддсд дадсеЕсадсс адсасаасда ссадассддас даддссадса сссадасста 5540 счасадсаач сдсаасчдсда дсодссдсдад ссдддасадс ассдассадс єдссссссда бО0о чассассдас дадссссодд адаадддсса садссассад ссдаасстасуа єдасдЕдссе бОбо ссегдаєдсад ддсадссдсуд дсассаєсссс сдуідсеєдасс гсддасссаса ачадсчаєссвча 6120 сСЕЕСЕсСсСаас асдаєсддаса дсаачаадає сасссадссд сссстддеєда аддсстасаа 6180
Зо чдсЕССададс ддсдссадсд бдодасддсадд сссссусесс ассддсддасда асаєсаєсса 6240 чдЕдсассдад аасддсадсд ссдссассає срасдєдасс сссдасдеєда дстасадсса
З5 6300 чаадсассдс дсссдсассс астасдссад сассадссад ассасссєса ссседадссь 6360 ччдасддддсес сссеЕссаасс аасастасес сдасаадасс ассаасаадд дсдасасссть 6420 чассстасаас адссЕсаасс сддссадссе садсасссс Ессдадсвєда дсддсаасаа 6480 ссЕссадчаєсєс додсдеЕдассо дссідадсдс сддсдасаад дсдсасаєсу асаачаєсда 6540 дЕЕєСсСассссс дедаасстада ссеЕдчадддЧдЕ ассадсеЕсСсс дасдасстдс ЄаадаєсдеЕе 660 сааасасеєсд дсаагааазчзс СЄЕСЕсСаадає сдаассстдеЕ гЕдссддеЕсСеЕЄ дсдваєдаєта бббо
Есаасаєаає ЄссСЕ9дЕєдаа ЕЄстасдесаад саєсєдраасаа ссаасаєдста аєсдсаєсдвасдч 6720 саєссаєда дасдчодеЕссс л сбаєчаєстада дессссдсаає гасасаєстєвта агасдсдаєва чаааасаааа гасадсдсдс ааассаддає аааєрсаєсдс дсдсоддеЕдеЕС аєстаєсдаесе 6840 астачаєсста ассдасоддас ссддсдсодсс астєсаааєда гассддессс дсаєсдсаєсдс 6900 аддчаєссас асддадессаа адаєєсааасє ададдасста асадаасосд ссдіааадас 6960 гддсдаасад Ессавасада дЕСЕСЕсасд асеЕсааєдас аадаадаааа ЕСЕссдаєссаа 7020 саєддєсддад сасчдасасудс ЄЕдЕСсСтассс саааааєаєс ааадасасад ЕСссадаада 7080 ссааадддса ассдадассс сЕСаасааад ддеєаасаєсс ддааассесс єСдодаєссса 7140
Еедсссадсе асссдссасі свгассдедаа дчаєадсддаа ааддааддед дсісстасаа 7200 аєдссаєсає сдсдасааад даааддссає сдеЕсдаадає дссстдссу асадтдачесс 7260 сааачасдда сссссассса сдаддадсає сдєддааааа чаадасдеЕсс саассасдЕс 7320
Зо
Ессааадсаа дсдчаєсєсчає дчеЕчасаєсьсс саседасдсра адддаєдасд сасааєссса 7380 стаєсссвсу саачдасссеєєс ссеСсСТтараєса аддаадеЕсєса Есссаєссвда ададдасасд
З5 7440 сеЕдааассас гадсссасса сдДдЕСсСсссоода даддачасса десЕсдадаєта ддассадстас 7500 адсадсєеєдчає асддссдсдд ЕЄсоЧєЄЧдастає сдаєсаассає сасаєєдада сдЕСТасаде 7560 чаассссадд асададссас ааасассаса ачачсддаєсєсє даєсєдаєсвтад ачзаддеЕсдса 7620 ачаєсачастас ссЕсоодеЕсод сЕЧ9ДСЕдЧдадае єчадачЕЧчесс дсддстддва ЕЕдСсЕвас9о 7680 гдддсссвдЧ ааддссадда асдссвтасча ссддасадесс дачачсасьд ЕссСасаєдеЕс 7740 асасаддсає саааддеєсда дсстаддаєс сасасєдвнас асасасрєсвдс єєаадеЕСтТає 7800 чдчдаддсдсаа ЧЯєЕссаадеі сЕЧЕдЧєвдс гДдЕсаєаддс сЕсссааасду асссаєстде 7860 гаддеЕсдсає даддссєссда чдасасасадс дсддддеаса Есдсдсдсад сеЕддаєасаа чсаєдадсдда гЕддсаєчасу сЕдсЯСсЕСССдд дсааадчдчає Ессдадесвдс садсеЕссььс 7980 ааддссадесс аддссадсса сссачаєссд аагадсдаса Есддсодсста дассдасстд 8040 сачассдеЕєсєс ааасасєвєдуа саасгаааддеЕс єстЕсаадчаєєс даасссстуре дссоадеЕсСсЕт 8100 счаєчаєтає сасаєаассє сЕдеЕсдааєст асдеЕсаадса Єдсаасааєс аасаєсавсаає 8160 чсаєчасаєс ассссаєсдчадча Сода сЕЄсСса сдчаєсададес сссдсааєта басаєесаає 8220 асдсдасада ааасааааса сбадсдсдсаа асгадчаєаа ассаєсдсдс дсоаяадеЕдссає 8280 стаєдеЕсасе адаєсс 8295 «2105 2 «2115» 13821 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «223» Організми-джерела включають вірус цеструму, що зумовлює жовту курчавість листя, Васі1і1їцв ЕПигіпдієпзівз, Адгорастегіцт Сиптетбасієепв, л7еа шаув, вірус мозаїки цвітної капусти, 5Егерсботусев уі1ігідоспПготодепевз і Евспегкісніа со1ї1. «4005 2 асЕєсстдедЧдч Есддсаєсдса сасасаааєд дасдаасддда гааассеЕвес сасдсесевуе бо гааасаєссу асстаєєсссаа Сааасдсссе ЄсЕСЕСЕЕвад ДдЕсСвасссдс саасаваєссс 120 гдЕСааасас єЕдчасадесса аассддсасеЕ адсссаасуд ЄДдеЕєЧдастаа деЕаддссдси 180
Ессстааєса дсгсаадддас ссдддесасе дадсододадаа Есааддададс сасдеЕєаєда 240 сссссдссда сдасодсддда саадссдЕєєс гасдЕєсддда ассдасадаа ссдсаасдаа 300 таєєддсада сааадсддса дасасасрдеЕ сссасааасд аачдаєддаає сеЕдсаааада
З6о ааасдсдеєда аасаасдсдс сЕЧдасааадд ЄСсаддесддс гЕДдссЕсСсаає саасассааа 420
ЧдЕДддЕсСсста ссасдаєсдда ааааседсдс азЕСУЧдЕЕСЯ ЯясЕЄЕЕсссвд асдаасааає аачдзаєєссдєба дссдасаддеЕ дддддеЕссас саєдсдаадча сасєсеЕссада сеЕссааєсаає 540 ччадсааєда сдсаадддсс басдааасаа чдчсааддадрад Ессдоадааає деЕссасссас бо ссассадесст асааасасеєс адссссіссс єсаєтєдеЕсаа дддадсааааа ссеЕсададад бо асадссстад адачадааад ададсаадса дсстадаадс ддаєссасса Єдасвєадсаа 720 саддссодссад ЕДдЕдстоЯодса сЕСЯсссІса сдасддсесда саасаасасс даддсстддвда 780 садсадсасс ассаадчасдд Єдасссадаа доддсаєссадс дсддЕдддса асстсдстсд49ад 840 сЯчгЕдЧдЕддасС ЕсСсСсссСсса дсоддсдсссЕ ддЕдадсесс тасассаасо ЕСсСстсдаасас 900 саєсгсддссс адсдаддасс сстддааддс сЕссаєддад саддсддадда ссстдаєддва 960 ссадаачасс дссдассасуд ссаадаасаа ддсассддсс дадстасадд дссоссадаа 19020
Зо саасдєддач дассасдсда дсодсссрдад садссддсад аадаассссд сеЕдсассдее 1980 ссдсаасссс сасадссадд дссодсаєсссд счадседеЕсс адссаддсесса ададссасесе
З5 1140 ссдсаасадс асдсссадсс ЕСсдссаєсад сддстасчад дсЕдсЕдДдЕсЕсс єдассасста 1200 сдсссаддсс дссаасассс асстЕдеЕсссІ дсгдааддас дсссааасєсе асддададдва 1260 чЧчЕдддадстас дадаадчадд асассдссда дсЕСсасаад сдссадсеєда адссдассса 1320 ччадсасасс дассассдсд Єдаадеєддсра саасдсдддс ссадасаадс ЕСсСсдсоадсад 1380 садсстасдач адссдддаєда асрссаассд сграссодссодс дачаєдассс єдассдеідсь 1440 ччассрдасс дсссЕдеЕссс сссідвасда сдєдсодссоід гассссаада аддсдаадас 1500 сдадсеєдасс сдсдасдедс єдассдассс сассдеЕдддс деЕдаасаасс гдсодсдаста 1550 сддсассасс Ессадсааса ссдадаасса саєссодсаад ссссасстдеЕ єсдаствассь чдсассдсаєсс садсессаса сдсдсЕеЕссса дсссоддстас гасддсаас асадсессаа 1680 стассддадс ддсаассасд Сдадсасссд ссссадсасс додсадсаасд асаєссаєссас 1740 садссссІсс гасддсааса адачдсадсда дсссдєсбдсад аассессдаде ссаасодсдва 1800 чааддеєдвас сдсдссодсда стргаасассаа ссЕддссЯєЯд гЕддсссоста садсдеасад 1860 саддсдєЄдасс ааддеддадс ссадссадса саасдассад ассдасдадд ссадсассса 1920 часстасдас адсаадсдса асдсдддсдс сдєдадсьдда дасадсаєсд ассадссдсс 1980 ссссдадасс ассдасдадс сссгіддадаа доддссасадс сассадсєда астасдедає 2040 дЕдсСЕЕсСсгд асдсадддса дссдсддсас сасссссудрд седасстдда сссасаадад 2100 счдЕСЧасеЕсс Ессаасаєда ссдасадсаа даадаєсасс садседсссс Едассаадад 2160
Зо сассаассод ддсадсддса ссадсдесдЧдЕ даадддсссс доасеЕєсассо дсоддсдасає 2220 ссЕдсдссодс ассадссссу дссадаєсад сасссідсдс дсдаасаєса ссдссссссье
З5 2280 чадссадсдс гассдсдссс дсасссодсса сдссадсасс ассаасстдс адессссасас 2340 40 садсаєсдас ддссдсссса єсаассаддд саассссадс дссассаєсда дсадсоддвсад 2400 саассрдсад адсддсадсс сссодсассдє доддсеЕссасс ассссствса ассссадсаа 2460 45 сддсадсадс десдсЕсСассс сдадсдссса сдЕдсссаас адсддадсааса аддеєдеасає 2520 счассдсаєсс дадсЕСсСЧдсдс ссодссдаддеЕ дасссссдад дссдадсаса асссддадад 50 2580 часЕСсСадаад дссдЕдаасд адсрдеЕссас садсадсаас садаєсддес Едаадассда 2640 55 сдЕдассдас сассасаєсуд ассаддєдва ддадсеєдадс ссеЕссатаєд асчассЧєєс ааагччаєєстьду саасааа:заст ссеЕсаадчасє даассстдеЕс дссдаєстЕва счаєдаєтсає сагаєсааЕгєсє стдесеєЧчааєс асдеєсаадса сдеЕаасааєс аасаєдсаає дсаєдасдаее 2820 асрєеєсаєчадча ЕєЕдФаЧчЧЕСЕСсССса сдаєссададеі сссдсааєса гасаєссаає асодосдасада 2880 ааасааааса садсдсдсаа астаддаєаа аєстаєсдсдс дсоддеЕдеЕсає стаєдеЕсась 2940 ачаєсдсдда сссаадсссд саєрдсстдса деседсадсдєд асссддесесдє дсессссосесе 3000 ачачаєсаасд адсаєсдсаєс чЧчЕССаадесса сааааааєса ссасаравєеєє єеЕссвдссас 306 асЕдеЕсєстьдча адсдсадеесс арстаєсьЕсеЕ асасасаває єсааасевєва сЕСТасдаає 3120 аагаєсааєсі асадвассас аасаасаєса ЯчЕдЕсСсвада дааєсасава аасдаасаде 3180 гадчасаєддеЕ стаааддаса ассдадтаєсє єєдасаасадд дассстасад ЄЕеЕтассее 3240
Есадедсєдса Еч9ФЕЧЕССССС СЕС д сааасадсес сасстасава агасеесаєс 3300
Зо сарєеєсєсаєса дсасаєссає сегадддеЕєса додеЕсСааєдо єЕссСеЕвасада ссьааєтсеве 3360 гадетасаєсє асссстаєссть аєрссвтадсся ссаааєстаад аааассааааа сеЕссаєвєєєва
З5 3420 чЕЕЕЕсвтає єсааєаассєсє адасаєаааа садаасаааа гааадсдасс аааааєсааа 3480 сааавассст саадаааєс аааааааста аддааасаьєєс ЄєЕеЕсСЕвУЄєє сдадчтаата 3540 асдссадссо деЕсааасудсс дссддасдадеі ссаасддаса ссаассадсуд аассадсадс 360 чЧдЕСсСдсЯдссдуд дссаадсддаа дсадасддса сддсасрсеЕсс дЕсдстдссеЕ сеЕддассссь
Зббо сЕсдачадеЕс ссдсеЕссасс дЕсЧОдасссдд сЕссдсвдеЕсС додасаєссада аассдсоаєсдаа 3720 саддадсддса дасдедадсс ддсасддсад дсддссЕссЕ ссссссеса сддсассдадас 3780 адстасдддд даврєсстевесссассуусьсс тгЕСУДСЕСЕсСсС сСЕЄССЕСДСсСсС сдесагаата 3840
Зб аасадасасс сссіссасас сссссеЕрссс саассісдєд ЕсдЕєсддад сдсасасаса сасаассада ЕсЕсссссаа аєссасссудЕ сддсассесс дссєсааддс асдссдадсоісд 3960 гссЕсСсСсссс сссссссосг стассеЕссес садаєсєсддсд Есссоададессса гадессаддадас 4020 ссдстадеЕсєс тасеЕсстуоєє сасдеЕссуєд єсадаєссддє яса єта даєссаєдсе 4080
ЧдЕБадсдеЕсєс дсасасоадає дсдасстдса сдеЕСсадасас деЕссЕЧаєвтд стаасеЕсдсс 4140 аєвЕдеЕсссс Ессооддавдаає ссЕдддаєсодд сістадссдс ЕССЯдсадасо ддаєсчасьс 4200 саєчассьЕєсєс сссчвєсссує сосасаддачеЕ ЄСЯОДЕСЕдессС СсСЕСсЕЕСсССсСЕвЄ аєєсссаатсає 4260 ардссдєбдса сЕсЧчвссЧєс дддаєсассьь сссасрфдсьсе сєссеЕУЧєЄсСЕЄ доаєссдвеЕЧає 4320 асгдчеЕддеЕСтд ЯдсЕгДдЧдДСсСЯдЯдЧЕ СЯЄЕСТтТадає сддадсадаа ЄЕСТЕДЧЕЄссСа аастасстд 4380 гЕчдасєссасс аасЕсочає стдстаєдесдеЕ десдссаваса гасеєсасадеі єасдааєссда 4440
Зо ачаєчаєдда гєддааасаєс дчассстаддає аддрасасає чессдасдсдаа яєЕссвастсда 4500 гдсасасаса дачавЕдсссс(5 сЕдесссооссеЕ д9ачаєЕЧЄєЄЧаєо асдчеЕдаєдеда дЕєДддсодвЕ
З5 4560 счеЕєсСасеєсЯя ЕсСстадаєсо дадсадааса седеЕсссааа стасстддеєда басстаєсаа 4620 гЕЕЄсЧддаасе дчтаєдеЕдедеЕ десЕсаєасаєс єєСавтадеста сдадеЕєсаад аєсдчаєсодаа 4680 асаєсчаєсі адчавгаддса басасдеЕєсєЧча сєчсєчсаЧчЧЕСЄ ассдаєсдсає агасаєчаєд 4740 чсагаєдсад саєстаєсса сбасдсеЕСсаа ссЕєЄЧадтас стаєстаєта єаасааасаа 4800 чеагЕдеЕсетса єаастаєєєє часссвеєдаса сасеЕсодаєд асддсасаєд садсадстає; 4860 асдедчаьєєє ссссадссст дссеЕссасрас дстасєвтасс уєдсетддрас єдаеесеЕсееве 4920 дЕСЧаєдсес ассстдесрєдеЕ ЕсУОДЕДЧЕвас ЕєСЕдсадду аєссассаєбд асддадссдаса 4980 асаасассда ддсссгддас адсадсасса ссаадчасудс дасссадаад ддсассадсд гддЕЧдаддсда ссідстодддас ЧдЕЧ9ДЧ9ЇсддЧсСЕ СссссвсЯдд сддсдссста дЕДДадсесссь 5100 асассаасес ссідаасасс аєссддссса дсдаддассс сгддааддсес єЕсаєддвадсес 5160 адасддаддс ссрдаєсддас садаадчаєсуд ссдастасдс саадаасаач дсассдассд 5220 адстасаддд ссіссадаас аасчасддадчч астаєсдедад содсссудадс адссддсада 5280 ачаассссдс гдсассЯдссс сдсаассссс асадссаддд ссдсаєсссдодс дадседессса 5340 чдссаддссда дадссасссс сдсаасадса сбдсссадсес содссаєссадс ддастсасчадд 5400 гдсЕДЕссСс дассасстас дсссаддссд ссаасассса ссЕдеЕссстЯд сЕЧдааддасд 5460 сссаааєста сддадчаддад єддддстас адааддадда саєсєсдссдад ЄЕсстасаадс 5520 чдссадссдаа дсрдасссад чдадсасассд ассассдсдає даадеЕддвас аасдеЕдддЕс 5580
Зо гадасаадсе ссодсддсадс адссасдада дсЕдддЕЧдаа сЕссаассдс бассдссдадсд 5640 ачаєдасссо дассдрдссд дасстдассдд сссЕдеЕЕссс ссгдвасдас дЕдсдсеседеЕ
З5 5700 ассссаадда ддсдаачасс дадссдассс дсдасдеЕдсс дассдасссс аєсдеЕддвдасд 5760
Едаасаасст дсдсддстас ддсассассо гсадсаасає сдадаастас асссдсаадс 5820 сссасстдеЕс сдастассод сассдсаєсс адеЕсссасас дсдЕєсссад сссддстасе 5880 асддсаасда садсеЕссаас бассддадсд дсаассрасує дадсасссдс сссадсаєссд 5540 чдсадсаасда сассассасс адссссрссЕ асддсаасаа дадсадсдад сссдеЕдсада бО0о ассеЕєсдадесс саасддсдад ааддсдстасс дсдссЯдєддс гаасассаас сЕддссЧаєдеЕ бОбо ддсссЕСТдсС адедсасадс додсдеЕдасса аддсддадеЕс садссадсас аасддассада 6120 ссдасдаддс садсасссад асстасдаса дсаадсдсаа сдсдддасдасс авеЕдадстдад асадсаєсда ссадссдссс сссдадасса ссдасдадсс сссддадаад ддссасадсс 6240 ассадссдаа стасдєдчаєд сдсЕсссода сдсадддсад Щ ссдсддсасс ассссасдс 6300
Едассрддас ссасаададс дісдасеЕсєсс єсаасаєдає сдасадсаад аадаєссассс 6360 адсеЕдссссІ додасдааддсс басаадсссс ададсоддсдс садсдсддеЕд дсаддссссс 6420 дсЕєсассдуд соддсдасаєс аєссадрдса ссдадаасддд садсдссдсес ассаєстсасд 6480
Едасссссда сдєсдадссас адссадааде ассдсдсссд саєсссастас дссадсасса 6540 чдссадзаєсас ссссасссод адсссддасд дддсссссос саассаасас басесесдаса 660 адассаєсаа саадддсдас ассстдасстї асаасадсес саассрддсс адсеЕссадса бббо ссссЕсссда дседадсддс аасаасстісс ачаєсддсдс дассддсестд адсдсс9аддасд 6720
Зо асааддсдсра сассдасаад аєсчадеЕсса сссссдєдаа стадаєсвєда ддддеассад 6780 сЕСЕсЧасва ссідстаада ссадсссааас асрсєєдадсаає ааадеЕссстс аачаєссдаає
З5 6840 ссСЕдЕсЧдссЯ ДдЕСЕЕдсдає чаєсстаєсаає асаасєсєстдя єЕсдааєсася єєаадсаєдеие 6900 аасааєсаас асдеааєдса єдасдеєстаєєс гасчдадасду ЯЕЕЕсвтаєсда стададесссс 6960 чсаассавтас ассссаасасу сдасадаааа саааасаєад сдсдсааасе аддаєсаааєсе 7020 ассдсдсдса дсдссаєсста сЕЧ9деЕсасстад асстааєєда содасссддс дсдадассаєсєства 7080 аагєддсасся діЕссддсаєд саєсдсаддда сссасаєдда дссааадаєс саааєсадчад 7140 асстаасада асссдссудсра аадасеєддсд аасадсеєсає асададессес Евасдассса 7200 аєдасаадаа даааассеєс дісаасаєдд сддадсасча сасудсеєєсєдеєс тасегссаааа 7260 асаєсааада басадсссса даадассааа дддсааєєда дасЕєсссаа саааддчасаа таєссоддааа ссіссссдуда сЕССаєрдсесс садстаєстд єсасеЕссаєє деЕЧаадасад 7380 гддаааавадча аддсддсссс басааардсс ассассдсда гаааддааад дссассЧчаєтд 7440 аачаєсдссес гдссдасадсі ддссссааад аєддассссс асссасдчадд адсаєссоає9 7500 ааггаачаачда сдєсссаасс асдссеЕссаа адсаадедча ЕсЧчаєдсдає аєссссасед 7560 асдеааддда єдасдсасаа ссссастасєс сЕЕСсСдсаада сссЕєсСсСЕСЄ агасааддваа 7620
ЧдЕєСаєсєСсСа Ессодадада асасдстдаа ассассрадсс сассаєбдеЕсс ссодададда 7680 чассадсеєда дассаддсса дстасадсад сєдасаєддс сЯасддЕеЕствЧде дасаєсдева 7740 ассаєстасає сдадасдессї асадедаасої єсаддасада дссасаааса ссасаачадес 7800 ччаєєсчаєда ЕСсадачадд СЕДдсаадчаса давгассстсда ЯдЕсдЧЕсдсІ даддадесєсдвада 7860
Зо чсЕЧЕсЧсдЯдсС ЕЯ9ДЧсаєсодсос сасодседддс ссеЕддааддс гаддаасдсесс басдаєсодда 7920 садеЕсєЧчадач гассдеЕссас деЕдссасаса доадсаєссааад дЕсдддсесста ддаєсссасає
З5 7980 гдеасасаса Ессдсесаад сстаєсддадаа счдсааа:адеЕсс гаадчеЕССднва дЕсдСсСтЯста 8040 гаддссеЕссс ааасчаєсса ЕЄСЕДдЕтТаддІ єдсаєдаддс ЕЕсдддасас асадсдадсодад 8100 чеасаєсдсу содсадссдда Сбасаадсаєд дсддаєсддаса єчаєдеЕсдадс єеЕссддсааа 8160 чачасєсствєда деЕсдссадсо ссессааддс садеЕсаддсесс адсвасссад аєссдаасад 8220
Ечавгаєсддс дссіддадсєс ассрдсадає сдеЕссаааса Ессддсаана аадесеесева 8280 ачаєсдчдаасс срдсдссод ссСЕсЧдсдвдаєд асвтаєсаває аасєєстдеЕє даастасдаеве 8340 аадсаєдстаа сааєсаасає дсааєдсаєд асдєтаєста єдачаєддадеЕ ЄЕЄЕЕтТаєчася 8400 ачадссссдс аассасасає сегаасасодсд асбсадааааса ааасасадсд сдсааассад чаєааастає сдсдсдсоддЕ деЕСаєстаєд ссассадаєс содасадссстд саддааассе 8520 ассддЕдссс доаддсддссад сасддссуаба сссоасаарде дессаєсаадес єдЕСтаадсдв 8580
ЕсаасєвєдеЕє сасассасаа басаєсстдс сассадссад ссаасадссс сссдассдддс 8640 адсеЕсддсас ааааєсасса сеЕсдавасад дсадсссаєсс адааєсааєс сеЕсаєдееєвод 8700 асадсєсаєс ассдассдса сддесдсасса асдсЕссвдд сдссаддсад ссассддаад 8760 сЕдЕЧ9Чсаєсд дсЕдеЕдсадд Ссодсаааєса седсаєаасс сдасдЕСЯдСсСЕС ааддсдсасьие 8820 ссссЕстдч асааЕдеЕеЕс єєдсдсесдас ассаєсаасоддд ЕсСЕдДдсааа бассседааа 8880
ЕчадсеЕдеЕєд асаасєстааєс асссддасесу гасааєдсдЕ ддаасєддсєда дсддасааса 8940 асеєєсасаса ддааасадчас сасдаддадаа дсдеЕсдаєсд ссдаадсаєс дасссааста 9000
Зо
Есададчвач Есддсодсєсає сдадсдссає сесдаассда састдстдадс сабасаєєстд 9060 гасддссссу садсддасда сддссеЕдаад ссасасадед асаєєчавєєс дсгддЕсас
З5 9120 чЧЕдассдтаа ддссЕЧаєсда аасаасодсудд счадссеєєда Есаасдасс єЕЕєсддааась 9180 гЕсуддсЕєсСсс сгддададад счадасєєссеЕс сдсдсеЕдстад аадссассає єдеЕсдедсас 93240 часдасаєса Есссагоддся свасссадсе аадсдсдаас гдсааєсвєда адааєддвсад 9300 сдасааєдаса ЕсссвЕдсадд басссесдад ссадссасчда Есдасаєсєєда ЕСЕСддадстаєс 93360
Есдссдасаа аадсаачадча асасадсусєеЕ дссЕсддрад дгсссадсддс ддаддаасес 3420 геЕеЕєЧСЧаєССсСЯд ЕсСсССсСЕЧДааса ддавдаєсєстасвє даддсдссаа асдааассес аасдстаєсдад 93480 аасісдссдс ссдастдддс єддсдаєдад сдаааєдстад гдсеЕвтасуаєє дЕсссдсатєь 3540
А гддсасадсуд садсаассдуда сааааєсоддсд ссдаадчаєсд ЕСсСдсЕдссда сеЕдддсааєд чадсдсстрдс соддсссадса ссадсссуаєс асасссдаад ссаддсаддс єЕстаєстєсода 9660 саачаачаєсс дсеЕсддссоІс дсодсодсадчає садеЕсддаад аасеєвдесєєса стасдедааа 9720 чддсдачдаєса ссааадстадс сддсааагаа адсестадеуд даєсссста сссаддчасєс 9780 гддсісдсду содасодсасд асдссддддс дадассагтад дсдаєсссс аааєссаасад 93840 гадсеєдсаас сіЕсдаадсдс сЕСЯСЕєЧдса асаасчаєсд адааЕєссьва єсаєааааєся 9900 чааасасеЕсд деЕссоадсасєє сеЕдссаєссд сддесадссуд сааєєстсдас дааседссса 93960
Еесвгадссодда даєчассддсра сарсстессас дсдаааарссє сссаадсдсс дЕДЧдаасаадд 19020 дЕЄСадаєєє сгадаєсдааа ддсєдадссдІ Єдааасасучє ССЕсСЕсУдЄєсС даєдасвас 19080
Есдстаєсдсу дсасстстаєє асдаарасс ссасддаєсса сдссЕссааа деЕдассоас4дад 190140
Зо гадссдасад сасссадесс асаачадсас ссЕСЕссСсоЯас дасддадссдаєс дяЕСЯєдЧдЧЧЕвд 19200
ЕеЕЧдаєсстада ЕссаддесдЕ даачаєддадс ссдадчаєсдс ЕСЯдєааєстд дсдадсаааді-
З5 190260 сЕдасасеєсс аассасааєє аєсадеддсуд ассдссЕеЕєда ддвадасдоддає аааддеЕвдчев 19320 сасссдадсеЕ аддадсаадс дасєеєстаєсу сеаадссудєс сачтаєсада дадеЕссстад 19380 сасдсасесу ддассдссосд сдсодєбдсодсс ссаасЧчеЕрдс ссдсеЕСсССсааа дассдасдадве 190440
СЕЧУ гассдассдуа асасеєтєааєс ссаддсаасд ЕСЯСЕЄЯДЧавд ЕССЯДаадсед 19500 чсдавєЧчаддЕ дааасссасуд дсаддеЕдчадеЕ ссаарсЕссо ссссдсдЕс єєададааас 10550 сссдсчдасдє ЕСТтаєсодсудс дадсаасьтсс ссаєсдссад ЕСдадсасоадс дасддадчадд 19620
ЕЄєтаєсєдасад дадсасадає деЕсстЕсСаєєс єдаддстдсуд ссдсааассс даддсачаєсс 19680 счдЕСаадссс ЕСаастідаса аааасадсаа даддсдссд єстаєєссьс дасдсдадасд гдсададееєсс дсасддадад асчаєсддсад ссеЕдадссаа Ессссадаєс сссддаддаає 19800 саддсдєЄдадс ддссдсааас сасссддсесс ддєасааасєс дадсдсддсдадс єдддЕЧчаєда 19860 ссгддЕддад аадеєсдаадд ссдсдсаддс сдсссадсдуд саасдсаєсуд аддсадаадс 19920 асдссссддЕ даассдсддс аадсддссдс бдасєсддааєсс соосааадаає; сссддасаасс 19980 чдссддсадсс ддсдсодссдс сдассаддаа дссдсссаад ддасдасдадс аассадаєссе 11040 гЕЕсСУуЯєсссуЇ асдсеЕСтаєд асдсдддсас ссдсдаєадс содсадсаєса єддасдсдас 11100
СсСЯЕЕЕЕсСсСУЯєЄ седссдаадс деЕЧдассдас адсгддсдад дедаєссдсо асччадссссс 11160 ачдасдддсас діададядеЕсєс ссдсадддес ддссддсаєдд дссадедесдеЕ додоадаєстсасва 11220 ссЕдДдсастд асддсддєсс сссаєстаас сдааєсссаєбд аассдасасс доадаачоддаа 11280
Зо чададчасаад сссддссдсд СДдЕссСсЯаєсс асасаєвєдсд дасдрасеса адсЕсседссд 11340 чсдадссдає додсддааадс адааадасчда ссеЕддсадаа асседсаєеєс ддеЕсааасас
З5 11400 сасдсасдес дссаєдсадс деасддаадаа додссаадаас ддссдссвда ЕЄдасддтаєс 11460 счадддеЕдаа дссЕсдаєста дссдстасаа дассдсааад адсдааассд ддсддссдада 11520 чеасаєсдач ассчадссдд сЕчасєєддає дсассдсдад ассасадаад дсаадаассс 11580 ччасаєдстд асддеЕссасс ссдаєстасьеє єсеЕєЧчаєсддаєс сссддсаєс яссддеЕеЕесссь 11640 стассдсстд дсасдссдсд ссодсаддсаа ддсадаадсс ачаєддєєді ссаадасчає 11700 стасдаасдс адсддсадсд ссододадчадее саадаадеЕсс гєДдсеєеЕсасся єдсдсаадсь 11760 чаєсдддіса ааєдасстдс сододадстасда єєсдааддад даддсддададдс аддстдассс 11820 чаєсстадес асдсдссасс дсаасстдає счаддадсдаа дсаєссдсса дЕсСССтТааєд гасддадсадч асдстадддс ааассдссся адсададддаа аааддссдаа ааддЕсссте 11940
ЕСсСсЕдсддодає адсасдсаса сЕдоддаассс ааадссдтрас ассдодоадаасс ддаасссдаеа 12000 саєсдддаас ссааадссдІ асаєєдддаа ссддесасас агдсаачсда сеьдатстаєсааа 12060 ачадааааааа доадасчасєсєсс ссдсстаааа сссЕссаааа сЕсаєсаааа сЕСЄваааас 12120 ссдссіддсс гДдедсасаас сдЕСсддсса дсдсасадсс даададсвєдс ааааадсдсс 12180 басссссдд ЕСЯсЕДСусСЕ ссстасодссс сдссудсессЯа сдссддсеста ЕСсдсддссдс 12240 гддссодсеса ааааврдоадсосд дсстасддсс аддсааєсста ссадддсдсу дасаадссдс 12300 дссдссдсса сссдассдсс додсдстдадда ЕСтдсстІсЯдЕ даадаадчсд Есдстдасьтс 12360 асассаддсс гдааєсодссс саєсаєссад ссадааадсд адддадссас дассдаєсвад 12420
Зо асЕсЕЧеЕсч вадчдеЕддасс адесдддвеєдає єсеЧдаасьЕсс єдсеЕеєсдсса содоадаасоадЕс 12480
ГдсЯєєдеЕсСЯ ддаачаєдсд Єдасєстдасєс ссЕСсСаасеьса дсаааадеЕеєс дассвтаєсса
З5 12540 асааадссдс сдссссаєсса адссадсуба асдсістдсс адсдеЕсасаа ссааєтаасс 12600 ааєсстєдаєє адааавгасеєс ассдадсаєс аааєдааастї дсааєєтаєє савгаєссаддва 12660 саєсаавас сасарєєєвєд ааавадссдЕ ЄЄСЕдсаасдд ааддадчаааа сесассдадд 12720 садеЕсссаса ддасддсаад аєссгсддарає сддеЕСсдсда Есссдасес єссаасаєса 12780 асасаасста єсаарєсєссс сЕСЯєсЄсаааа асааддеЕстає саадедадаа аєсассаєсда 12840
ЧЕдасчассд аасссоддсда дчаасддсааа адсеЕссдсає єааєдааєсу дссаасодсдас 12900 чавдвдачдаддс дФаєЕсдсдса єсудддсудсеЕС ЕЕССДЯДСЕЄССсС гССЄСастд асеЕсдстдс 12960 сЕСсСддЕСсСЯЄЕ соддсеЕдсддс дадсоддтаєс адсесасеса ааддсддеєаа басддеЕсаєс сасадаасса ддвддасаасуд саддааадаа саєдсдадса аааддссадс ааааддссад 13080 чаассдсааа ааддссодсує сдсуддсЯєЕ ЄсЕССавадд сіссдссссс сеЕдасдадса 13140
Есасааааає сдасдсесаа дісададдед дсдааасссу асаддастає ааадасасса 13200 дасЯасЕсссс ссрддаадсс сссісдрдсдд сЕсЕСсСсСтддеЕЄ ссдассстдс сдсевасс9дад 13260 арсассрдеЕсс дсссЕСССсСсС сЕсСЯдддаад СЯ9ЕДЯдСДдДСсСЕЄ ссесасадсо сасдстдсад 13320 чеаєсєсадеіЕ ЕСЯОЧЕЧЯЄсадуд СсСЯєссЯосесС саадссдддс гЕДдсдЕДдсас аассссссде 13380
Есадсссдас содсідсодсс басссддсаа стасєсдЕссс дадеЕссаасс сддаєаадаса 13440 сачасеєтаєсуд ссастсддсад садссастрдд бгаасаддаєсє адсададсда добасогачдч 13500 сЯадЕдссаса дачсеЕСЕсЧа адесддеЕддсс саасстасддс гасастадаа даасадтаєсе 135560
Зо гддрасстдс дсЕсЕдссда адссадесас сЕЕСододаааа ачадеЕсддта дсесеЕвеєдаєс 13620 сддсааасаа ассассодссд чЧчеадсуддсдд ЄСЕЕЕСвЧЧеЄ єдсаадсадс адасвсасдсд
З5 13680 садаааавааа дчассссаад аадаєсстьсье даєсЕсеЕсе асодддадесстьд асдсесадед 13740 чаасдаааас ссасдєтаад дчаЕєєєссдас саєсєдадаєта ссааавпаадда ссеЕєссасста 13800 чаєссЕсваа асссддааєь а
Claims (1)
- ФОРМУЛА ВИНАХОДУ1. Молекула нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка БО щонайменше на 98 95 ідентична 5ЕО ІЮО МО: 1 або її комплементарній послідовності, яка при введенні в клітину забезпечує експресію інсектицидних білків тСгузА та еСтгуЗ3.1АБ.2. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де молекула нуклеїнової кислоти являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти.3. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де послідовність нуклеїнової кислоти є щонайменше на 100 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 1.4. Вектор експресії, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1.5. Трансгенна клітина-хазяїн, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким із пп. 1-3, де вказана клітина являє собою краще бактеріальну клітину або рослинну клітину.6. Трансгенна рослина кукурудзи, частина рослини кукурудзи, тканина рослини кукурудзи, культура рослинних клітин або пропагула рослин кукурудзи, що містять трансгенну рослинну клітину за п. 5.7. Трансгенна рослина кукурудзи за п. 6, де вказана рослина являє собою однодольну рослину або дводольну рослину.8. Спосіб одержання трансгенної рослини кукурудзи, стійкої до зараження кукурудзяним жуком, що включає введення шляхом трансформації в рослину молекули нуклеїнової кислоти за п. 1, за рахунок чого здійснюється одержання трансгенної рослини, де молекула нуклеїнової кислоти експресує білок в ефективних для контролю комах кількостях.9. Спосіб одержання трансгенної рослини кукурудзи, стійкої до зараження кукурудзяним жуком, що включає стадії: а) одержання молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким із пп. 1-3; р) введення шляхом трансформації в рослину, культуру тканин або рослинну клітину молекули нуклеїнової кислоти зі стадії (а) з одержанням трансформованої рослини, культури трансформованих тканин або трансформованої клітини; і с) вирощування вказаної трансформованої рослини або забезпечення регенерації трансформованої рослини з культури трансформованих тканин або трансформованої рослинної клітини з одержанням таким чином трансгенної рослини кукурудзи, стійкої до зараження кукурудзяним жуком. МеВ ОЗ 140 п. о. оСОМЕ-ОВ (ВО пз Ї і й «ев (Я п. з оуУщі-02 (405 п. о). Ми Ша АС ИЯ (587 ьо.) сперА-оз о74 п, сій ев - | Ж остузлАь (1962п, о.) СМ І ЕЕ що (7286 п. ві» 17525 ; о 53.) . 13821 п. о. ЩІ сВресО3 М г де (7 о. В і ов 18 (1993 п. в -чів-оз у ЖУ ювисот аоіов. о) Заповіт, а ДЕ а ОВ ОБО ай53. РА с і... сват ові у пСтузА (тат. о.) ризи 08581 в.з ЯМОБ-50 1977 п. ваФГ. ї
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562184227P | 2015-06-24 | 2015-06-24 | |
| PCT/US2016/029424 WO2016209360A1 (en) | 2015-06-24 | 2016-04-27 | A nucleic acid molecule for conferring insecticidal properties in plants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA124831C2 true UA124831C2 (uk) | 2021-12-01 |
Family
ID=57586021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201800600A UA124831C2 (uk) | 2015-06-24 | 2016-04-27 | Молекула нуклеїнової кислоти для забезпечення інсектицидних властивостей у рослин |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10689664B2 (uk) |
| EP (1) | EP3313867B1 (uk) |
| CN (2) | CN113735950B (uk) |
| AR (1) | AR105039A1 (uk) |
| BR (1) | BR112017027010B1 (uk) |
| CA (1) | CA2984897C (uk) |
| CL (1) | CL2017003284A1 (uk) |
| EA (1) | EA037539B1 (uk) |
| ES (1) | ES2905649T3 (uk) |
| MX (1) | MX2017015255A (uk) |
| PT (1) | PT3313867T (uk) |
| UA (1) | UA124831C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016209360A1 (uk) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR112545A1 (es) | 2017-06-15 | 2019-11-13 | Syngenta Participations Ag | Evento de élite de maíz mzir098 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994629A (en) * | 1991-08-28 | 1999-11-30 | Novartis Ag | Positive selection |
| US7230167B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-06-12 | Syngenta Participations Ag | Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
| WO2003078587A2 (en) | 2002-03-13 | 2003-09-25 | Syngenta Participations, Ag. | Nucleic acid detection method |
| DK1620571T3 (en) | 2003-05-02 | 2015-10-05 | Dow Agrosciences Llc | MAJS TD1507 and methods for detecting it |
| EP2137211B1 (en) * | 2007-03-28 | 2016-08-24 | Syngenta Participations AG | Insecticidal proteins |
| US9522937B2 (en) | 2007-03-28 | 2016-12-20 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| WO2010077816A1 (en) | 2008-12-16 | 2010-07-08 | Syngenta Participations Ag | Corn event 5307 |
| US20110151441A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Dow Agrosciences Llc | Endpoint taqman methods for determining zygosity of corn comprising tc1507 events |
| AR097995A1 (es) | 2013-10-14 | 2016-04-27 | Syngenta Participations Ag | Método para sembrar filas de cultivos |
| EP3277709A4 (en) * | 2015-03-23 | 2018-09-26 | Syngenta Participations AG | A nucleic acid construct for conferring herbicide tolerance in plants |
-
2016
- 2016-04-27 ES ES16814863T patent/ES2905649T3/es active Active
- 2016-04-27 MX MX2017015255A patent/MX2017015255A/es unknown
- 2016-04-27 EA EA201890136A patent/EA037539B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2016-04-27 CN CN202111047411.2A patent/CN113735950B/zh active Active
- 2016-04-27 US US15/569,096 patent/US10689664B2/en active Active
- 2016-04-27 EP EP16814863.3A patent/EP3313867B1/en active Active
- 2016-04-27 PT PT168148633T patent/PT3313867T/pt unknown
- 2016-04-27 WO PCT/US2016/029424 patent/WO2016209360A1/en active Application Filing
- 2016-04-27 UA UAA201800600A patent/UA124831C2/uk unknown
- 2016-04-27 CN CN201680034471.1A patent/CN107683288B/zh active Active
- 2016-04-27 CA CA2984897A patent/CA2984897C/en active Active
- 2016-04-27 BR BR112017027010-2A patent/BR112017027010B1/pt active IP Right Grant
- 2016-06-16 AR ARP160101818A patent/AR105039A1/es unknown
-
2017
- 2017-12-20 CL CL2017003284A patent/CL2017003284A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX2017015255A (es) | 2018-02-19 |
| CN113735950A (zh) | 2021-12-03 |
| WO2016209360A1 (en) | 2016-12-29 |
| CN107683288A (zh) | 2018-02-09 |
| ES2905649T3 (es) | 2022-04-11 |
| EP3313867A4 (en) | 2018-12-05 |
| CL2017003284A1 (es) | 2018-04-20 |
| CN113735950B (zh) | 2024-03-19 |
| EA201890136A1 (ru) | 2018-06-29 |
| US20180111969A1 (en) | 2018-04-26 |
| EP3313867B1 (en) | 2021-12-01 |
| CN107683288B (zh) | 2021-09-24 |
| EP3313867A1 (en) | 2018-05-02 |
| EA037539B1 (ru) | 2021-04-09 |
| CA2984897C (en) | 2023-10-03 |
| PT3313867T (pt) | 2022-01-31 |
| BR112017027010B1 (pt) | 2023-12-26 |
| BR112017027010A2 (uk) | 2018-08-21 |
| US10689664B2 (en) | 2020-06-23 |
| AR105039A1 (es) | 2017-08-30 |
| CA2984897A1 (en) | 2016-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gao et al. | Transgenic sugarcane with a cry1Ac gene exhibited better phenotypic traits and enhanced resistance against sugarcane borer | |
| CN112852801B (zh) | 转基因玉米事件lp007-1及其检测方法 | |
| US20150344898A1 (en) | Transgenic plants with enhanced agronomic traits | |
| WO2020207125A1 (zh) | 用于检测玉米植物dbn9501的核酸序列及其检测方法 | |
| CN116144818B (zh) | 转基因玉米事件lp026-2及其检测方法 | |
| CN112831585B (zh) | 转基因玉米事件lp007-4及其检测方法 | |
| CN112852991B (zh) | 转基因玉米事件lp007-7及其检测方法 | |
| WO2009097133A2 (en) | Transgenic plants with enhanced agronomic traits | |
| CN116144817B (zh) | 转基因玉米事件lp026-4及其检测方法 | |
| CN109971880B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法 | |
| US20130145493A1 (en) | Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits | |
| CN113151534B (zh) | 转基因玉米事件lp007-5及其检测方法 | |
| CN113151533B (zh) | 转基因玉米事件lp007-6及其检测方法 | |
| JP2022543138A (ja) | ダイズ植物ｄｂｎ８００２を検出するための核酸配列およびそのための検出方法 | |
| US20140090101A1 (en) | Transgenic plants with enhanced agronomic traits | |
| GUO et al. | Rapid and convenient transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) using in planta shoot apex via glyphosate selection | |
| CN116144671A (zh) | 转基因玉米事件lp026-3及其检测方法 | |
| WO2024188236A1 (zh) | 用于检测玉米植物dbn9229的核酸序列及其检测方法 | |
| CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
| CN116144672B (zh) | 转基因玉米事件lp026-1及其检测方法 | |
| CN116574724A (zh) | 抗虫耐草甘膦转基因玉米事件kj1003及其检测方法 | |
| UA124831C2 (uk) | Молекула нуклеїнової кислоти для забезпечення інсектицидних властивостей у рослин | |
| CN116640761B (zh) | 转基因玉米事件lp018-1及其检测方法 | |
| CN113980958B (zh) | 转基因玉米事件lp007-8及其检测方法 | |
| CN116622700B (zh) | 转基因水稻事件lp126-1及其检测方法 |