ES2905649T3 - Una molécula de ácidos nucleicos para conferir propiedades insecticidas a las plantas - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 98% a la SEQ ID NO: 1, o una de sus complementarias, que confiere la expresión de las proteínas insecticidas mCry3A y eCry3.1Ab cuando se introduce en una célula.

Description

DESCRIPCIÓN

Una molécula de ácidos nucleicos para conferir propiedades insecticidas a las plantas

DECLARACIÓN SOBRE LA PRESENTACIÓN EN FORMATO ELECTRÓNICO DE UNA LISTA DE SECUENCIAS

Se proporciona una lista de secuencias en formato de texto ASCII, presentada según el artículo 37 del Código de regulaciones federales § 1.821, titulada “80823_ST25.txt”, con un tamaño de 30 kilobytes, generada el 21 de abril de 2016 y presentada a través de EFS-Web, en lugar de una copia impresa. Por lo tanto, esta lista de secuencias se incorpora a la presente por referencia en la memoria descriptiva para su divulgación.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Por lo general, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que confiere la expresión de las proteínas insecticidas mCry3A y eCry3.1Ab cuando se introduce en una célula.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las plagas de plantas constituyen un factor importante en la pérdida de los cultivos agrícolas importantes del mundo. Las especies del gusano de la raíz del maíz están consideradas las plagas del maíz más destructivas. Las especies de plagas de tipo gusano de la raíz incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz del maíz occidental; D. longicornis barberi, el gusano de la raíz del maíz septentrional, D. undecimpunctata howardi, el gusano de la raíz del maíz meridional y D. virgifera zeae, el gusano de la raíz del maíz de México.

El gusano de la raíz del maíz se controla principalmente mediante aplicaciones intensivas de pesticidas químicos. Por lo tanto, se puede conseguir un buen control del gusano de la raíz del maíz, pero estos productos químicos a veces también afectan a organismos beneficiosos. Otro problema que resulta del uso generalizado de pesticidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Esto ha sido aliviado en parte mediante diversas prácticas del tratamiento de la resistencia, pero existe una necesidad creciente de estrategias alternativas para el control de las plagas. Una de estas alternativas incluye la expresión de genes exógenos se codifican proteínas insecticidas en plantas transgénicas. Esta estrategia ha proporcionado un medio eficaz de protección contra plagas de insectos seleccionadas y se han comercializado plantas transgénicas que expresan toxinas insecticidas, lo que ha permitido a los agricultores reducir la aplicación de insecticidas químicos.

Las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) (también denominadas 5-endotoxinas) son proteínas que forman una matriz cristalina en Bacillus que se sabe que poseen actividad insecticida cuando son ingeridas por ciertos insectos. Se han aislado los genes que codifican las proteínas Cry y se ha demostrado que su expresión en plantas de cultivo proporciona otra herramienta para el control de plagas de insectos importantes desde un punto de vista económico. Tales plantas transgénicas que expresan las proteínas Cry se han comercializado, lo que ha permitido a los agricultores reducir o aumentar las aplicaciones de agentes químicos para el control de insectos. Las proteínas Cry activas contra coleópteros útiles en las plantas transgénicas incluyen, por ejemplo, Cry3A, Cry3B y el complejo Cry34/Cry35.

Aunque la utilización de plantas transgénicas que expresan las proteínas Cry constituye otra herramienta en el conjunto de recursos para el control de insectos, sigue siendo susceptible a la pérdida de la resistencia. Existe constancia de plagas insectos que tienen en la actualidad resistencia frente a las proteínas Cry expresadas en ciertas plantas transgénicas. Una estrategia para reducir la posibilidad de la pérdida de la resistencia de la planta consiste en “apilar” rasgos transgénicos con diferentes modos de acción frente a la misma especie de plaga de insectos en una única planta. En la actualidad, los rasgos transgénicos se apilan frecuentemente mediante el cultivo selectivo y se criban posteriormente para obtener múltiples rasgos transgénicos en un único germoplasma comercial. Estos pasos de cultivo selectivo y cribado se requieren para cada variedad de germoplasma en la cual se desea introducir estos dos rasgos. Para muchos cultivos importantes en la agricultura, tal como el maíz, es necesario mantener estos dos rasgos como híbridos para docenas de variedades de germoplasma. Además, factores tales como la unión genética de recombinación genética o rasgos indeseables pueden complicar la introducción de dos rasgos procedentes de dos loci distintos en una única variedad de germoplasma. Por lo tanto, sería ventajoso crear una molécula de ácido nucleico que porte múltiples rasgos insecticidas y que se puede introducir en un único locus del genoma de la planta transgénica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 1. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico quimérico y/o un constructo o vector de ácido nucleico recombinante que comprenden, están constituidos o consisten esencialmente en la SEQ ID NO: 1. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico quimérico y/o un constructo o vector de ácido nucleico recombinante que comprenden, están constituidos o consisten esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 98%, al menos un 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 1.

La presente invención también proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente, donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula confiere propiedades insecticidas mejoradas.

La presente invención también proporciona una célula hospedadora transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente. La célula hospedadora transgénica descrita anteriormente podrá ser cualquier célula procariota o eucariota adecuada, por ej., una célula bacteriana o una célula vegetal. En realizaciones representativas, la célula bacteriana transgénica podrá ser una célula de Escherichia coli, un Bacillus (por ej. B. thuringiensis, B. subtilis, B. megaterium; B. cereus, y similares), un Agrobacterium ssp. o Pseudomonas ssp. La célula vegetal transgénica podrá encontrarse en una planta, parte de la planta, tejido vegetal o cultivo de una célula vegetal transgénicos. La planta transgénica podrá ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea. La planta transgénica podrá ser una especie vegetal que incluye sin carácter limitante maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, avena, pasto, pasto gramíneo, pimientos, papas, algodón, arroz, soja, caña de azúcar, remolacha azucarera, tabaco, cebada o colza oleaginosa.

La presente invención también proporciona una progenie de cualquier generación de una planta transgénica, donde dicha planta transgénica comprende una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente. La presente invención también proporciona una semilla transgénica y un propágulo transgénico a partir de dicha planta transgénica.

La presente invención también proporciona un método para producir una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente en una planta y producir de esta manera una planta transgénica, donde la molécula de ácido nucleico es capaz de expresar genes mCry3A y eCry3.1Ab en una cantidad que produzca una actividad insecticida mejorada.

La presente invención también proporciona un método para producir una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas, que comprende los pasos de (a) proporcionar una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente; (b) introducir en una planta, cultivo tisular o una célula vegetal la molécula de ácido nucleico del paso (a) para obtener una planta transformada, cultivo tisular transformado o una célula transformada que comprende propiedades insecticidas mejoradas; y (c) cultivar dicha planta transformada o regenerar una planta transformada a partir del cultivo tisular transformado o célula vegetal transformada, de manera que se produzca una planta con propiedades insecticidas mejoradas. La presente invención también proporciona un método para producir semillas transgénicas a partir de la planta transgénica descrita anteriormente, donde la planta se cultiva o crece en condiciones apropiadas para producir semillas de una progenie que es transgénica.

La presente invención también proporciona un método para producir una progenie de cualquier generación de una planta transgénica fértil con propiedades insecticidas mejoradas, que comprende los pasos de: (a) obtener una planta transgénica fértil que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente; (b) recolectar semillas transgénicas a partir de dicha planta transgénica; (c) plantar las semillas transgénicas recolectadas; y (d) cultivar las plantas transgénicas de la progenie a partir de dicha semilla, donde dicha progenie tiene propiedades insecticidas mejoradas en comparación con una planta no transformada.

La presente invención también proporciona un método para producir una planta con propiedades insecticidas mejoradas, que comprende los pasos de: (a) cruzar sexualmente una primera planta progenitora con una segunda planta progenitora, donde dicha primera o segunda planta progenitora es una planta transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente; y (b) seleccionar una planta de la progenie de la primera generación con propiedades insecticidas mejoradas. En realizaciones representativas, un método para producir una planta con propiedades insecticidas mejoradas comprende los pasos (a) y (b) como se describen anteriormente, y opcionalmente (c) autofecundar la planta de la progenie de la primera generación, para producir de esta manera una pluralidad de plantas de la progenie de la segunda generación; y (d) seleccionar a partir de las plantas de la progenie de la segunda generación una planta con propiedades insecticidas mejoradas, donde las plantas de la progenie de la segunda generación comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una representación de un vector binario 17629, cuya secuencia de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS DE LA LISTA DE SECUENCIAS

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ácido nucleico del transgén y comprende los casetes de expresión que comprenden las secuencias que codifican mCry3A y eCry3.1Ab.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ácido nucleico del vector binario 17629.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se debe sobreentender que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros vegetales, constructos y reactivos particulares descritos en la presente como tales. También se debe sobreentender que la terminología utilizada en la presente tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, la cual estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Cabe señalar que, como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un”, "uno/una" y "el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “una planta” es una referencia a una o más plantas e incluye sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica y así sucesivamente. La palabra “o”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista (es decir, incluye también "y").

El término “aproximadamente” se utiliza en la presente para referirse a de forma aproximada, más o menos, alrededor de o en la región de. Cuando el término “aproximadamente” se utiliza junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término “aproximadamente” se utiliza en la presente para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado con una varianza de un 20 por ciento, preferentemente más o menos un 10 por ciento (mayor o menor). En lo que se refiera a temperatura, el término "aproximadamente" se refiere a ± 1 °C, preferentemente ± 0.5 °C. Cuando se utiliza el término "aproximadamente" en el contexto de esta invención (p. ej., combinado con valores de temperatura o peso molecular) se prefiere el valor exacto (es decir, sin el término "aproximadamente").

Los términos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados se refieren a “que incluye sin carácter limitante”. La expresión “constituido por” significa “que incluye y se limita a”. La expresión “constituido esencialmente por” se refiere a que la composición, método o estructura podrá incluir ingredientes, pasos y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, pasos y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicados.

Las unidades, prefijos y símbolos se podrán representar por su forma aceptada en el SI. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de 5’ a 3’; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los aminoácidos se podrán denominar en la presente con sus símbolos de tres letras habitualmente conocidos o con los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Del mismo modo, los nucleótidos se podrán denominar con sus códigos de una sola letra aceptados normalmente. Los términos que se definen a continuación se definen de un modo más completo haciendo referencia a la memoria descriptiva como un todo.

"ADNc" se refiere a un ADN monocatenario o bicatenario que es complementario al ARNm y se deriva de este. Los términos "ARN mensajero" o "ARNm" se refieren al ARN que no comprende intrones y que puede ser traducido en proteínas por la célula. Los términos “proteína”, “péptido” y “polipéptido” se utilizan indistintamente en la presente.

Una “planta de control” o “control”, tal como se utiliza en la presente, podrá ser una planta no transgénica de la línea progenitora utilizada para generar una planta transgénica de la presente. Una planta de control podrá ser, en algunos casos, una línea vegetal transgénica que incluye un vector vacío o gen marcador, pero no contiene el polinucleótido recombinante de la presente invención que se expresa en la planta transgénica que se está evaluando. Una planta de control, en otros casos, es una planta transgénica que expresa el gen con un promotor constitutivo. En general, una planta de control es una planta de la misma línea o variedad que la planta transgénica que se está evaluando, que carece del ADN recombinante, el cual confiere el rasgo específico, que caracteriza a la planta transgénica. Tal planta progenitora que carece de ese ADN recombinante que confiere el rasgo específico puede ser una planta natural de origen natural, una planta no transgénica de élite o una planta transgénica sin el ADN recombinante que confiere el rasgo específico que caracteriza a la planta transgénica. La planta progenitora que carece del ADN recombinante que confiere el rasgo específico puede ser una planta hermana de una planta transgénica que tenga el ADN recombinante que confiere el rasgo específico. Tal planta hermana progenitora podrá incluir otro ADN recombinante.

Como se utiliza en la presente, el término “maíz” se refiere a Zea mays o maíz e incluye todas las variedades de plantas que pueden cultivarse con maíz, incluidas las especies de maíz salvajes.

El término “suministrar” o la expresión “que suministra” una composición o toxina significa que la composición o toxina entra en contacto con un insecto, lo que produce un efecto tóxico y el control del insecto. La composición o toxina se puede suministrar de muchas maneras reconocidas, p. ej., por vía oral a ser ingerido por el insecto mediante la expresión en la planta transgénica, composición o composiciones proteicas formuladas, composición o composiciones proteicas pulverizarle, una matriz de cebo o cualquier otro sistema de suministro de toxinas reconocido en la técnica.

El término “controlar” o la expresión “que controla” insectos significa que se inhibe, mediante un efecto tóxico, la capacidad de la plaga de insectos de sobrevivir, crecer, alimentarse y/o reproducirse, o se limita el daño relacionado con el insecto o la pérdida en plantas de cultivo. El término “controlar” insectos podrá significar o no que se aniquilan los insectos, aunque preferiblemente se refiere a que se aniquilan los insectos.

La expresión “cantidad eficaz para controlar insectos” se refiere a la concentración de toxina o toxinas que inhiben, mediante un efecto tóxico, la capacidad de los insectos de sobrevivir, crecer, alimentarse y/o reproducirse, o que limita el daño relacionado con el insecto o la pérdida en plantas de cultivo. La expresión “cantidad eficaz para controlar insectos” podrá significar o no que los insectos son aniquilados, aunque preferiblemente significa que los insectos son aniquilados. El término “insecticida” se define como una actividad biológica tóxica capaz de controlar insectos, preferiblemente aniquilándolos. Una planta transgénica con “propiedades insecticidas mejoradas” es una planta que expresa una proteína o proteínas en cantidades eficaces para controlar insectos, es decir, en algunas realizaciones, la planta es insecticida frente a un conjunto mayor de especies de insectos, respecto a la planta del mismo tipo que no está transformada. Este mayor conjunto de especies de insectos incluye plagas de insectos que afectan a plantas, tales como las plagas de insectos coleópteros incluida la especie del gusano de la raíz del maíz. Las especies de plagas de tipo gusano de la raíz incluyen Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz del maíz occidental; D. longicornis barberi, el gusano de la raíz del maíz septentrional, D. undecimpunctata howardi, el gusano de la raíz del maíz meridional y D. virgifera zeae, el gusano de la raíz del maíz de México. Una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas podrá ser resistente a la infestación por parte del gusano de la raíz de maíz.

El término “polinucleótido” incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de estos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en el sentido de que se hibridan, en condiciones de hibridación rigurosas, con sustancialmente la misma secuencia nucleotídica que los nucleótidos de origen natural y/o permiten la traducción para obtener el o los mismos aminoácidos que el o los nucleótidos de origen natural. Un polinucleótido puede estar completo o ser una subsecuencia de un gen nativo o heterólogo estructural o regulador. A menos que se indique de otro modo, el término incluye la referencia a la secuencia especificada, así como su secuencia complementaria. De este modo, los ADN o ARN con cadenas modificadas para obtener estabilidad o por otras razones son “polinucleótidos” según el sentido que se le da al término en la presente. Además, los ADN o ARN que comprenden bases no habituales, tales como inosina o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos según el uso del término en la presente. Se debe tener en cuenta que se han realizado una gran variedad de modificaciones en el ADN y ARN que tienen muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido, tal como se utiliza en la presente, abarca tales formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de los polinucleótidos, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluidas, entre otras, células simples y complejas.

El término “recombinante” incluye la referencia a una célula o vector que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la célula deriva de una célula modificada de este modo. Por lo tanto, a modo de ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en una forma idéntica en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos que son expresados de otro modo anormalmente, subexpresados o no expresados en absoluto como resultado de una intervención humana deliberada, o podrán tener una expresión reducida o que se ha eliminado de un gen nativo. El término “recombinante”, tal como se utiliza en la presente, no engloba la alteración de la célula o vector mediante eventos de origen natural (p. ej., mutación espontánea, transformación/transducción/transposición naturales) tales como los que se producen sin una intervención humana deliberada.

La expresión "constructo quimérico", "gen quimérico", "polinucleótido quimérico" o "molécula de ácido nucleico quimérico" (y expresiones similares) tal como se utiliza en la presente se refiere a un constructo o molécula que comprende dos o más polinucleótidos de origen diferente ensamblados en una molécula de ácido nucleico. La expresión "constructo quimérico", "gen quimérico", "polinucleótido quimérico" o "ácido nucleico quimérico" se refiere a cualquier constructo o molécula que contiene (1) polinucleótidos (p. ej., ADN), incluidos polinucleótidos reguladores y codificantes que no se encuentran juntos en la naturaleza (es decir, al menos uno de los polinucleótidos es heterólogo respecto a al menos uno de los otros polinucleótidos) o (2) polinucleótidos que codifican partes de proteínas que no están unidas de manera natural o (3) partes de promotores que no están unidos de manera natural. Además, un constructo quimérico, gen quimérico, polinucleótido quimérico o ácido nucleico quimérico podrá comprender polinucleótidos reguladores y polinucleótidos codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o comprender polinucleótidos reguladores y polinucleótidos codificantes que se derivan de la misma fuente pero dispuestos de una manera diferente a la observada en la naturaleza. En un aspecto preferido de la presente invención el constructo quimérico, gen quimérico, polinucleótido quimérico o ácido nucleico quimérico comprende un casete de expresión que comprende polinucleótidos de la presente invención controlados por polinucleótidos reguladores, particularmente controlados por polinucleótidos reguladores funcionales en plantas.

El término “cromosoma” se utiliza en la presente con el significado que se la da en la técnica y se refiere a la estructura genética autorreplicante en el núcleo celular que contiene el ADN celular y que porta el conjunto lineal de genes.

Un “polinucleótido codificante” es un polinucleótido que se transcribe en forma de ARN tal como ARNm, ARNr, ARNt, ARNnp, ARN sentido o ARN antisentido. Preferentemente, el ARN se traduce posteriormente en un organismo para producir una proteína. Podrá constituir un “polinucleótido codificante ininterrumpido”, es decir, carecer de un intrón, tal como en un ADNc, o podrá incluir uno o más intrones unidos a través de zonas de corte y empalme adecuadas. Un "intrón" es un poli(rribo)nucleótido que está contenido en el transcrito primario pero que se elimina mediante escisión y religado del ARN dentro de la célula para crear el ARNm maduro que se puede traducir para obtener una proteína.

El término "expresión" cuando se utiliza haciendo referencia a un polinucleótido, tal como un gen, ORF o porción de este, o un transgén en plantas se refiere al proceso de convertir información genética codificada en un gen en ARN (p. ej., ARNm, ARNr, ARNt o ARNnp) mediante la "transcripción" del gen (es decir, mediante la acción enzimática de una ARN polimerasa) y para obtener una proteína cuando proceda (p. ej., si el gen codifica una proteína), mediante la "traducción" del ARNm. La expresión génica se puede regular en muchas etapas del proceso. Por ejemplo, en el caso de constructos antisentido o de ARNbc, respectivamente, la expresión se podrá referir a la transcripción del ARN antisentido únicamente o el ARNbc únicamente. En las realizaciones, la “expresión” se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o funcional. El término "expresión" también podrá referirse a la producción de la proteína.

La expresión “casete de expresión”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un polinucleótido o polinucleótidos particulares en una célula hospedadora apropiada, que comprende un promotor ligado operablemente al polinucleótido o polinucleótidos de interés que está/están ligados operablemente a señales de terminación. También suele comprender los polinucleótidos necesarios para la traducción correcta del polinucleótido o polinucleótidos de interés. El casete de expresión también podrá comprender polinucleótidos no necesarios en la expresión directa de un polinucleótido de interés pero que están presentes debido a sitios de restricción convenientes para eliminar el casete de un vector de expresión. El casete de expresión que comprende el polinucleótido o los polinucleótidos de interés podrá ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también podrá ser de origen natural pero que se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Sin embargo, el casete de expresión normalmente es heterólogo con respecto al hospedador, es decir, el polinucleótido particular del casete de expresión no está presente de manera natural en la célula hospedadora y tiene que haber sido introducido en la célula hospedadora o en un predecesor de la célula hospedadora mediante un proceso de transformación conocido en la técnica. La expresión del polinucleótido o polinucleótidos en el casete de expresión está controlado normalmente por un promotor. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor también puede ser específico o preferencial para un tejido, un órgano o una etapa de desarrollo particulares. Un casete de expresión, o un fragmento de este, también se puede denominar "polinucleótido insertado" o "polinucleótido de inserción" cuando se utiliza para transformar una planta.

Un "gen" se define en la presente como una unidad hereditaria constituida por un polinucleótido que ocupa una ubicación específica en un cromosoma y que contiene las instrucciones genéticas para una característica o rasgo particulares en un organismo o una unidad hereditaria de este tipo procedente de un grupo de organismos heterólogos dependiendo del contexto.

Las expresiones "manipulación genética", "modificación genética" y el término "transformación" se utilizan todos en la presente como sinónimos para la transferencia de genes aislados y clonados al ADN, normalmente el ADN cromosómico o genoma, de otro organismo.

El término "transgén" se refiere a un gen, polinucleótido o ácido nucleico introducido en el genoma de un organismo mediante manipulación genética con el fin de alterar su genotipo. Los transgenes podrán incluir, por ejemplo, genes, polinucleótidos o ácidos nucleicos que sean heterólogos u homólogos de la planta particular que se va a transformar. Además, los transgenes podrán comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes, polinucleótidos o ácidos nucleicos quiméricos.

El término “genotipo” se refiere a la constitución genética de un organismo o una célula. El "genotipo de un conjunto de marcadores genéticos" de un individuo incluye los alelos específicos para uno o más loci de marcadores genéticos presentes en el individuo. Como es sabido en la técnica, un genotipo puede relacionarse con un único locus o con múltiples loci, pudiendo estar los loci relacionados o no relacionados y/o ligados o no ligados. En algunas realizaciones, el genotipo de un individuo se relaciona con uno o más genes que están relacionados en el sentido de que uno o más de los genes participan en la expresión de un fenotipo de interés (p. ej., un rasgo cuantitativo tal como se define en la presente). Por lo tanto, en algunas realizaciones un genotipo comprende una suma de uno o más alelos presentes en un individuo en uno o más loci genéticos de un rasgo cuantitativo. En algunas realizaciones, un genotipo se expresa en función de un haplotipo (definido en la presente en más adelante).

Los términos “transformado” “transgénico” y “recombinante” se utilizan indistintamente y cada uno se refiere a un organismo hospedador, tal como una bacteria o una planta, en el que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo. La molécula de ácido nucleico se puede integrar de forma estable en el genoma del hospedador o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede autorreplicarse. Se sobreentenderá que las células, los tejidos o las plantas transformados no incluyen únicamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de este. Un hospedador “no transformado”, “no transgénico” o “no recombinante” se refiere a un organismo natural, p. ej., una bacteria o planta que no contiene la molécula de ácido nucleico heterólogo.

El término “natural” se refiere al gen, virus u organismo normal que se encuentra en la naturaleza sin ninguna mutación ni modificación.

El término “germoplasma” se refiere a material genético de un individuo o procedente de este (p. ej., una planta), un grupo de individuos (p. ej., una línea, una variedad o familia vegetales), o un clon derivado de una línea, variedad, especie o cultivo. El germoplasma puede ser parte de un organismo o célula, o puede estar separado del organismo o célula. En general, el germoplasma proporciona material genético con una composición molecular específica que proporciona una base física para algunas o todas las cualidades hereditarias de un organismo o cultivo celular. Tal y como se utiliza en la presente, el germoplasma incluye células, semillas o tejidos a partir de los cuales se pueden cultivar nuevas plantas, o partes de plantas, tales como hojas, tallos, polen, o células, que se pueden cultivar para obtener una planta completa.

Las expresiones “material vegetal”, “parte de una planta” o “tejido vegetal”, tal como se utilizan en la presente, se refieren a células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos celulares vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, agregados de plantas y células vegetales que están intactos en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruto, pepitas, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, tubérculos, rizomas y similares.

El término "propágulo", tal y como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier material que se utiliza para propagar una planta, preferentemente una planta transgénica, más preferentemente una planta transgénica que comprende la SEQ ID NO: 1. Un propágulo puede ser una semilla, esqueje o pluralidad de células procedentes de una planta transgénica, que se puede utilizar para producir un cultivo de plantas transgénicas.

Las expresiones “muestra vegetal” o "muestra biológica", tal como se utilizan en la presente, se refieren a tejido vegetal tanto intacto como no intacto (p. ej., semillas o tejido vegetal molidos, tejido vegetal troceado, tejido liofilizado). También puede ser un extracto que comprenda semillas o tejido vegetal intactos o no intactos. La muestra o extracto biológicos podrán seleccionarse a partir del grupo constituido por harina de maíz, polvo de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz y cereales producidos íntegros o en parte para que contengan productos secundarios de maíz.

El término "heterólogos" cuando se utiliza haciendo referencia a un gen o ácido nucleico se refiere a un gen que codifica un factor que no está en su entorno natural (es decir, que ha sido alterado por el hombre). Por ejemplo, un gen heterólogos podrá incluir un gen de una especie que sea introducido en otra especie. Un gen heterólogo también podrá incluir un gen nativo respecto a un organismo que ha sido alterado de alguna manera (p. ej., mutado, añadido en múltiples copias, ligado a un promotor o polinucleótido potenciador no nativos, etc.). Los genes heterólogos pueden comprender además polinucleótidos de genes vegetales que comprenden formas de ADNc de un gen vegetal; los ADNc se podrán expresar tanto en una orientación sentido (para producir ARNm) como antisentido (para producir un transcrito de ARN antisentido que es complementario con el transcrito de ARNm). En un aspecto de la invención, los genes heterólogos se distinguen de los genes vegetales endógenos en que los polinucleótidos génicos heterólogos están unidos normalmente con polinucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no están asociados de manera natural con el gen para la proteína codificada por el gen heterólogo o con un polinucleótido génico vegetal en el cromosoma, o están asociados con porciones del cromosoma que no se detectan en la naturaleza (p. ej., genes expresados en loci donde el gen no se expresa normalmente). Además, en las realizaciones, un polinucleótido "heterólogo" es un polinucleótido que no está asociado de forma natural con la célula hospedadora en la cual se introduce, incluidas múltiples copias de origen no natural de un polinucleótido de origen natural.

El término “identidad” o la expresión “porcentaje de identidad” se refieren al grado de similitud entre dos secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. A la hora de comparar secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo para la comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se designan las coordenadas de las subsecuencias, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa algorítmico de las secuencias. El algoritmo para la comparación de las secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad secuencial para la(s) secuencia(s) de prueba con relación a la secuencia de referencia, en función de los parámetros del programa designados. La frase “sustancialmente idénticas”, en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que poseen al menos aproximadamente un 50% de identidad entre los residuos nucleótidos o aminoacídicos, cuando se comparan y alinean para que la correspondencia sea máxima, tal como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos para la comparación de secuencias o por inspección visual. En ciertas realizaciones, las secuencias sustancialmente idénticas tienen al menos aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 80%, o incluso al menos aproximadamente un 90% o un 95% de identidad entre los residuos nucleotídicos o aminoacídicos. En ciertas realizaciones, existe una identidad sustancial a lo largo de una región de las secuencias con una longitud de al menos aproximadamente 50 residuos, o a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 residuos o las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 residuos. En realizaciones adicionales, las secuencias son sustancialmente idénticas cuando son idénticas a lo largo de toda la longitud de las regiones codificantes.

El término "homología" en el contexto de la invención se refiere al nivel de similitud entre las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos en función de la identidad o similitud de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, es decir, la similitud o identidad secuencial. Los términos homología y homólogo también se refieren al concepto de propiedades funcionales similares entre los diferentes ácidos nucleicos o proteínas. Los homólogos incluyen genes que son ortólogos y parálogos. Los homólogos se pueden determinar utilizando la secuencia codificante de un gen, divulgada en la presente o que se puede consultar en una base de datos apropiada (tal como la del NCBI u otras) en una o más de las siguientes maneras. Para una secuencia de aminoácidos, las secuencias deberán compararse utilizando algoritmos (por ejemplo, consulte la sección sobre "identidad" "identidad sustancial"). Para las secuencias de nucleótidos, la secuencia de una molécula de ADN se puede comparar con la secuencia de un homólogo conocido o putativos básicamente de la misma manera. Los homólogos son idénticos en al menos un 20%, o idénticos en al menos un 30%, o idénticos en al menos un 40%, o idénticos en al menos un 50%, o idénticos en al menos un 60%, o idénticos en al menos un 70%, o idénticos en al menos un 80%, o idénticos en al menos un 88%, o idénticos en al menos un 90%, o idénticos en al menos un 92%, o idénticos en al menos un 95%, a lo largo de cualquier región sustancial de la molécula (ADN, ARN o una molécula proteica).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad secuencial y la similitud secuencial es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403410 (1990). Se dispone de un software de acceso público para la realización de los análisis BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo incluye identificar en primer lugar pares de secuencias de puntuación elevada (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de prueba que igualen o satisfagan cierta puntuación umbral T evaluada positiva cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como la puntuación umbral de la palabra vecina (Altschul et al., 1990). Estas coincidencias iniciales de las palabras vecinas actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar los HSP más largos que las contienen. Las coincidencias de las palabras se extienden posteriormente en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de las palabras en cada dirección se ve interrumpida cuando la puntuación de alineación acumulada disminuye una cantidad X respecto a su valor máximo alcanzado, la puntuación acumulada tiende a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, un límite de corte de 100, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (consulte Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad secuencial, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (consulte, p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90: 5873 5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se produzca por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de prueba se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácidos nucleicos de prueba con la secuencia de ácidos nucleicos de referencia es menor de aproximadamente 0.1, más preferentemente menor de aproximadamente 0.01 y aún más preferentemente menor de aproximadamente 0.001.

Otro programa informático de uso extendido y aceptado para llevar a cabo las alineaciones de las secuencias es CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al., Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). El número de bases o de aminoácidos coincidentes se divide por el número total de bases o de aminoácidos y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de base tenían 145 bases coincidentes, serían idénticas en un 25 por ciento. Si las dos secuencias comparadas tienen longitudes diferentes, el número de coincidencias se divide por la menor de las dos longitudes. Por ejemplo, si había 100 aminoácidos coincidentes entre proteínas de 200 y 400 aminoácidos, estas son idénticas en un 50 por ciento con respecto a la secuencia más corta. Si la secuencia más corta tiene una longitud menor de 150 bases o 50 aminoácidos, el número de coincidencias se divide por 150 (para las bases de ácidos nucleicos) o 50 (para los aminoácidos) y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad.

También se puede considerar que dos secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas cuando las dos secuencias se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. En realizaciones representativas, dos secuencias de nucleótidos que se consideran sustancialmente idénticas se hibridan entre sí en condiciones muy rigurosas.

También se puede considerar que dos secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas cuando las dos secuencias se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. En las realizaciones representativas, dos secuencias de nucleótidos que se consideran que son sustancialmente idénticas se hibridan entre sí en condiciones sumamente rigurosos.

Las expresiones “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” incluyen la referencia a condiciones en las cuales un ácido nucleico se hibridará selectivamente con una secuencia diana, en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (p. ej., al menos 2 veces con respecto a una secuencia no diana) y de manera opcional podrá excluir sustancialmente la unión a las secuencias no diana. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y variarán en circunstancias diferentes. Controlando la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, se pueden identificar secuencias diana que pueden presentar hasta un 100% de complementariedad respecto a la secuencia nucleotídica de referencia. Como alternativa, se pueden emplear condiciones rigurosas moderada o incluso baja para permitir discrepancias en las secuencias de forma que se detecten grados de similitud secuencial menores. Por ejemplo, los expertos en la técnica apreciarán que para actuar como un cebador o sonda, una secuencia de ácido nucleico únicamente necesita ser lo suficientemente complementaria con la secuencia diana para unirse sustancialmente a esta de modo que forme una estructura bicatenaria estable en las condiciones empleadas. Por lo tanto, se puede utilizar cebadores o sondas en condiciones de rigurosidad elevada, moderada o incluso baja. Asimismo, las condiciones de rigurosidad baja o moderada pueden ser convenientes para detectar secuencias homólogas, ortólogas o parálogas que tienen grados menores de identidad secuencial de los que hubieran identificado en condiciones de rigurosidad elevada.

Para los híbridos ADN-ADN, se puede aproximar la Tm a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138:267-84 (1984): Tm = 81.5 2C 16.6 (log M) 0.41 (% de GC) - 0.61 (% de formamida) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (a un pH y una fuerza iónica definidos) a la que el 50% de la secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de discrepancia; por lo tanto, la Tm y las condiciones de hibridación y/o lavado se pueden ajustar para la hibridación con secuencias con el grado de identidad deseado. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad > 90%, la Tm se puede reducir 10 °C. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan de modo que se encuentren aproximadamente 5 °C por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complementaria a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden emplear una hibridación y/o un lavado en el punto de fusión térmica (Tm) o 1, 2, 3 o 4 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de rigurosidad moderada pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de rigurosidad baja pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm). Si el grado deseado de discrepancia da como resultado una Tm menor de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se puede aumentar opcionalmente la concentración de SSC de forma que se pueda emplear una temperatura más elevada. Se puede consultar una guía exhaustiva sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, Nueva York (1993); y en Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995); y Green y Sambrook, en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4.a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).

Normalmente, las condiciones rigurosas son aquellas en las que la concentración salina es inferior a aproximadamente 1.5 M para el ión Na, normalmente una concentración de aproximadamente 0.01 a 1.0 M para el ión Na (u otras sales) a un pH de aproximadamente 7.0 a 8.3, y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (p. ej., de más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también se pueden lograr mediante la adición de agentes destabilizantes tales como formamida o Denhardt's (5 g de Ficoll, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina sérica bovina en 500 mL de agua). Las condiciones ilustrativas de rigurosidad baja incluyen la hibridación con una solución de tampón de un 30% a un 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecilsulfato sódico) a 37 "C y un lavado en 1X-2X Ss C (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato trisódico 0.3 M) a 50 "C-55 "C. Las condiciones ilustrativas de rigurosidad moderada incluyen la hibridación en un 40% a 45% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37" C y un lavado en 0.5X-1X SSC a 55 "C-60 "C. Las condiciones ilustrativas de rigurosidad elevada incluyen la hibridación en un 50% de formamida, NaCl 1 M, 1 % de SDS a 37 "C y un lavado en 0.1X SSC a 60 "C-65 "C. Un ejemplo adicional no limitante de condiciones de rigurosidad elevada incluyen la hibridación en 4X SSC, 5X solución de Denhardt, 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón hervido, y fosfato de Na 25 mM a 65 "C y un lavado en 0.1X SSC, 0.1% de SDS a 65 "C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación de rigurosidad elevada incluye la hibridación en 7% de SDS, NaPO40.5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con un lavado en 2X SSC, 0.1% de SDS a 50 °C, de manera alternativa con un lavado en 1X SSC, 0.1% de SDS a 50 °C, de manera alternativa con un lavado en 0.5X SSC, 0.1% de SDS a 50 °C, o de manera alternativa con un lavado en 0.1X SSC, 0.1% de SDS a 50 °C, o incluso con un lavado en 0.1X SSC, 0.1% de SDS a 65°C. Los expertos en la técnica apreciarán que la especificidad normalmente es una función de los lavados poshibridación, siendo factores relevantes la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final.

Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que estos codifican son sustancialmente idénticas (p. ej., debido a la degeneración del código genético).

Una indicación adicional de que dos ácidos nucleicos o proteínas son sustancialmente idénticos es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico presente reactividad cruzada inmunológicamente con la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. Por lo tanto, normalmente una proteína es sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, si las dos proteínas se diferencian únicamente por sustituciones conservadoras.

Los términos "complementario" o "complementariedad" (y términos similares), tal como se utilizan en la presente, se refieren a la unión natural de los polinucleótidos en condiciones de temperatura y sales permisivas mediante el apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se une a la secuencia complementaria "T-C-A". La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias podrá ser parcial, donde únicamente algunos de los nucleótidos se unen, o podrá ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. El grado de complementariedad entre las hebras de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y fuerza de hibridación entre las moléculas.

La expresión "sustancialmente complementario" (y expresiones similares), tal como se utiliza en la presente, se refiere a que dos secuencias de ácidos nucleicos son complementarias en al menos aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. Como alternativa, la expresión "sustancialmente complementario" (y expresiones similares) puede referirse a que dos secuencias de ácidos nucleicos se pueden hibridar entre sí en condiciones de rigurosidad elevada (tal como se describe en la presente).

El término "aislado", cuando se utiliza en el contexto de las moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos de la presente invención, se refiere a un polinucleótido que se identifica en su contexto polinucleotídico cromosómico y se aísla/separa de este dentro del organismo fuente respectivo. Un ácido nucleico o polinucleótido aislado no es un ácido nucleico tal y como se presenta en su contexto natural, si bien si que tiene un equivalente presente de manera natural. Por el contrario, los ácidos nucleicos no aislados son ácidos nucleicos tales como el ADN y ARN, que se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, un polinucleótido concreto (p. ej., un gen) se encuentra en la célula hospedadora cerca de los genes vecinos. La molécula de ácido nucleico aislado podrá estar presente en una forma monocatenaria o bicatenaria. Como alternativa, podrá contener tanto la hebra sentido como la antisentido (es decir, la molécula de ácido nucleico podrá ser bicatenaria). En una realización preferida, se sobreentiende que las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención están aisladas.

El término "locus" se refiere a una posición (p. ej., de un gen, un marcador genético o similares) en un cromosoma de una especie concreta.

El término "ligamiento" y sus variantes gramaticales se refieren a la tendencia de los alelos en loci diferentes del mismo cromosoma para segregarse juntos con una frecuencia mayor que la que cabría esperar de forma aleatoria si su trasmisión fuera independiente, en algunas realizaciones como consecuencia de su proximidad física. La frase "desequilibrio del ligamiento" (también denominado "asociación alélica") se refiere a un fenómeno donde alelos particulares en dos o más loci tienden a permanecer juntos en grupos de ligamiento cuando se segregan desde los progenitores a su descendencia con una frecuencia mayor que la que cabría esperar a partir de sus frecuencias individuales en una población concreta. Por ejemplo, un alelo marcador genético y un alelo QLT pueden mostrar un desequilibrio de ligamiento cuando se presentan juntos con frecuencias mayores que las predichas a partir de las frecuencias alélicas individuales. El desequilibrio de ligamiento puede ocurrir debido a varias razones que incluyen, sin carácter limitante, el que los alelos estén cerca en un cromosoma. La expresión "grupo de ligamento" se refiere a todos los genes o rasgos genéticos que están ubicados en el mismo cromosoma. Dentro del grupo de ligamiento, esos loci que están suficientemente próximos mostrarán ligamiento en cruzamientos genéticos. Puesto que la probabilidad de entrecruzamiento aumenta con la distancia física entre los genes en un cromosoma, los genes cuyas ubicaciones están lejanas entre sí dentro de un grupo de ligamiento puede que no muestren ningún ligamiento detectable en ensayos genéticos directos. La expresión "grupo de ligamento" se utiliza mayoritariamente para referirse a locus genéticos que muestran un comportamiento ligado en sistemas genéticos en los que todavía no se han hecho asignaciones cromosómicas. Por lo tanto, en el presente contexto, la expresión "grupo de ligamiento" es un sinónimo de (la entidad física del) cromosoma.

La frase "ácido nucleico" o el término "polinucleótido" se refieren a cualquier secuencia física de unidades monoméricas que pueden corresponder a una secuencia de nucleótidos, incluido un polímero de nucleótidos (p. ej., un polímero de ADN o polidesoxirribonucleótido o polímero de ARN o polirribonucleótido típicos), oligonucleótidos modificados (p. ej., oligonucleótidos que comprenden bases que no son habituales en el ARN o ADN biológicos, tal como oligonucleótidos 2'-0-metilados) y similares. En algunas realizaciones, un ácido nucleico o polinucleótido puede ser monocatenario, bicatenario, multicatenario o combinaciones de estos. A menos que se indique lo contrario, un ácido nucleico o polinucleótido concreto de la presente invención comprende o codifica opcionalmente polinucleótidos complementarios, además de cualquier polinucleótido indicado explícitamente.

La "PCR (reacción en cadena de la polimerasa)" se sobreentiende que, en el alcance de la invención, se refiere a un método para producir cantidades relativamente grandes de regiones específicas de ADN, para hacer posible de esta manera varios análisis que se basan en esas regiones.

La expresión "ligado operablemente" se refiere a la asociación de polinucleótidos en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de uno afecta a la función del otro. Por ejemplo, un promotor está ligado operablemente a un polinucleótido codificante o a un ARN funcional cuando es capaz de afectar la expresión de ese polinucleótido codificante o ARN funcional (es decir, que el polinucleótido codificante o el ARN funcional está controlado transcripcionalmente por el promotor). Un polinucleótido codificante en una orientación sentido o antisentido puede estar ligado operablemente a polinucleótido reguladores.

El término "promotor" se refiere a un polinucleótido que se encuentra normalmente en dirección 5' respecto a su polinucleótido codificante, que controla la expresión del polinucleótido codificante al hacer posible el reconocimiento por parte de la ARN polimerasa y otros factores requeridos para una transcripción adecuada. La expresión “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es capaz de expresar el marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) que controla en todo o en casi todos los tejidos vegetales durante todas o casi todas las etapas del desarrollo de la planta (denominada “expresión constitutiva”). La expresión "promotor regulado" o promotor preferido para el tejido se refiere a promotores que dirigen la expresión génica de manera no constitutiva, sino de una manera regulada temporal y/o espacialmente, e incluye los promotores específicos para el tejido, preferidos en el tejido e inducibles. Incluye polinucleótidos naturales y sintéticos así como también polinucleótidos que podrán ser una combinación de polinucleótidos naturales y sintéticos. Diferentes promotores podrán dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales.

La expresión “promotor específico para el tejido” o promotor preferido para el tejido se refiere a promotores regulados que no se expresan en todas las células vegetales sino tan solo o preferentemente en uno o más tipos de células en órganos específicos (tales como hojas o semillas), tejidos específicos (tales como embriones o cotiledones) o tipos de células específicos (tales como células parenquimatosas de hojas o de almacenamiento de semillas). Estos términos también incluyen promotores que están regulados temporalmente, tales como en la embriogénesis temprana o tardía, durante la maduración del fruto en frutos o semillas en desarrollo, en hojas totalmente diferenciadas o en el inicio de la senescencia. Los expertos en la técnica comprenderán que los promotores específicos para el tejido no necesitan mostrar una especificidad tisular absoluta, sino mediar la activación transcripcional en la mayoría de las partes de la planta con un nivel de aproximadamente un 1% o menos del nivel alcanzado en la parte de la planta en la cual la transcripción es más activa.

Un "potenciado^1 o "potenciador transcripcional" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o especificidad tisular de un promotor. La secuencia primaria puede estar presente en cualquier hebra de una molécula de ADN bicatenario y es capaz de funcionar incluso cuando se coloca en dirección 5' o en dirección 3' respecto al promotor.

Las “secuencias reguladoras” y “secuencias reguladoras adecuadas” se refieren cada una a secuencias de nucleótidos situadas en dirección 5' (secuencias no codificantes 5'), dentro o en dirección 3' ( secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante y que influencian la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN o traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras incluyen potenciadores, promotores, secuencias potenciadoras de la traducción, intrones y secuencias señal de poliadenilación. Incluyen secuencias naturales y sintéticas así como también secuencias que podrán ser una combinación de secuencias naturales y sintéticas. Las secuencias reguladoras podrán determinar el nivel de expresión, el patrón de expresión espacial y temporal y, para un subconjunto de promotores, la expresión en condiciones inductivas (regulación por parte de factores externos como la luz, temperatura, productos químicos y hormonas). Las secuencias reguladoras podrán ser regiones cortas de 6­ 100 pares de bases de secuencias de ADN que definen los sitios de unión para los factores que actúan en trans, tales como los factores de transcripción. Las secuencias reguladoras también podrán ser potenciadores, regiones más largas de secuencia de ADN que pueden actuar alejadas de la región promotora central, a veces a más de varias kilobases de la región central. Los factores que actúan en trans, incluidos la maquinaria de transcripción general, los factores de transcripción y los factores de ensamblaje de la cromatina, pueden afectar a la actividad de las secuencias reguladoras.

La expresión "elemento cis" se refiere a un elemento regulador de la transcripción que actúa en cis que confiere un aspecto del control global de la expresión génica. Un elemento cis podrá funcionar para unir factores transcripcionales, factores proteicos que actúan en trans que regulan la transcripción. Algunos elementos cis se unen a más de un factor transcripcional y los factores transcripcionales podrán interaccionar con diferentes afinidades con más de un elemento cis. Los elementos cis pueden identificarse mediante varias técnicas, que incluyen el análisis por eliminación, es decir, la eliminación de uno o más nucleótidos del extremo 5' o internos en un promotor; el análisis de una proteína que se une al ADN mediante ensayos de hipersensibilidad a la DNasa I (footprinting), interferencia por metilación, ensayos de retardo en la movilidad electroforética, ensayos de footprintinggenómico in vivo mediante PCR mediada por ligación y otros ensayos convencionales; o mediante análisis de la similitud de la secuencia de ADN con motivos de elementos cis conocidos mediante métodos de comparación de secuencias de ADN convencionales. La estructura fina de un elemento cis puede estudiarse además mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos, o mediante otros métodos convencionales. Los elementos cis pueden obtenerse mediante síntesis química o mediante el aislamiento a partir de promotores que incluyen tales elementos, y pueden sintetizarse con nucleótidos flanqueantes adicionales que contengan sitios de reconocimiento de una enzima de restricción útiles para facilitar la manipulación de subsecuencias.

Un "terminador transcripcional" es responsable de la terminación de la transcripción más allá de la región codificante y de la poliadenilación correcta del ARNm. La región de terminación podrá ser nativa respecto a la región de iniciación transcripcional, podrá ser nativa respecto a la secuencia de ADN ligada operablemente de interés, podrá ser nativa respecto al hospedador vegetal o podrá derivarse de otra fuente (es decir, exógena o heteróloga respecto al promotor, la secuencia de ADN de interés, el hospedador vegetal o cualquier combinación de estos). Los terminadores de la transcripción adecuados son aquellos que se sabe que funcionan en plantas e incluyen el terminador CAMV 35S, el terminador tml, el terminador nopalina sintasa y el terminador rbcs E9 de la arveja. Estos pueden utilizarse tanto en plantas monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Además, podrá utilizarse un terminador de la transcripción nativo del gen.

La expresión "secuencia potenciadora de la traducción" se refiere a una porción de la secuencia de ADN de un gen entre el promotor y la secuencia codificante que se transcribe como ARN y está presente en el ARNm totalmente procesado en dirección 5' del codón de inicio de la traducción. La secuencia potenciadora de la traducción podrá afectar al procesamiento del transcrito primario en el ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficacia de la traducción.

Tal como se utiliza en la presente, un "apilamiento" de genes o rasgos es la combinación de genes o rasgos deseados en una línea vegetal transgénica. A modo de una estrategia, los cultivadores de plantas apilan rasgos transgénicos realizando cruces entre progenitores que tienen cada uno de ellos un rasgo deseado y a continuación identifican la descendencia que tiene ambos rasgos deseados (el denominado "apilamiento de cultivo selectivo"). Otro modo de apilar genes consiste en transferir dos o más genes al núcleo celular de una planta en el mismo momento durante la transformación. Otro modo de apilar genes consiste en retransformar una planta transgénica con otro gen de interés. Por ejemplo, se puede utilizar el apilamiento génico para combinar dos rasgos de resistencia a insectos diferentes, un rasgo de resistencia a insectos y un rasgo de resistencia a enfermedades, o un rasgo de resistencia a herbicidas (tal como, por ejemplo, Bt11). El uso de un marcador seleccionable además de un gen de interés también podría considerarse apilamiento génico.

El término “planta” incluye la referencia a plantas enteras, órganos, tejidos (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas de plantas, células vegetales y progenie de estas. La expresión "célula vegetal", tal como se utiliza en la presente, incluye, sin carácter limitante, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores que se pueden someter a las técnicas de transformación, incluidas las plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, que incluyen especies de los géneros: Cucúrbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Secale, Allium y Triticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays.

La expresión “planta transgénica” incluye la referencia a una planta que comprende en su genoma una secuencia de ácido nucleico heterólogo. Generalmente, la secuencia de ácido nucleico heterólogo se integra de forma estable en el genoma, de manera que la secuencia de ácido nucleico se transmite a generaciones sucesivas. La secuencia de ácido nucleico heterólogo se podrá integrar en el genoma sola o como parte de un casete de expresión recombinante. El término “transgénico” se utiliza en la presente con la intención de incluir cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de la planta o planta, cuyo genotipo se ha alterado debido a la presencia de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, incluidos los miembros transgénicos alterados inicialmente de esta manera, así como los creados mediante cruzamientos sexuales o propagación asexual a partir del miembro transgénico inicial. El término “transgénico”, tal como se utiliza en la presente, no engloba la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) mediante métodos convencionales de cultivo selectivo de plantas ni mediante eventos de origen natural tales como la fertilización cruzada aleatoria, infección vírica no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

El término “rendimiento” podrá incluir la referencia a bushels por acre de un cultivo de grano en la recolección, que se ajusta para tener en cuenta la humedad del grano (habitualmente un 15% para el maíz, por ejemplo) y el volumen de biomasa generado (para cultivos forrajeros tales como alfalfa y el tamaño de la raíz de las plantas para múltiples cultivos). La humedad del grano se mide en el grano en el momento de la recolección. Se determina que el peso de ensayo ajustado del grano es el peso en libras por bushel, ajustado para tener en cuenta el nivel de humedad del grano en la recolección. La biomasa se mide como el peso del material vegetal cosechable generado. El rendimiento se puede ver afectado por muchas propiedades, que incluyen, sin carácter limitante, la altura de la planta, el número de vainas, la posición de las vainas en la planta, el número de internodos, la incidencia de la pérdida de vainas, el tamaño de los granos, la eficacia de la nodulación y la fijación de nitrógeno, la eficacia de la asimilación de nutrientes, la asimilación de carbono, la arquitectura de la planta, el porcentaje de germinación de semillas, el vigor de las plántulas y los rasgos juveniles. El rendimiento también se puede ver afectado por la eficacia de la germinación (incluida la germinación en condiciones de estrés), la tasa de crecimiento (incluida la tasa de crecimiento en condiciones de estrés), el número de mazorcas, el número de semillas por mazorca, el tamaño de las semillas, la composición de las semillas (almidón, aceite, proteína) y las características de rellenado de las semillas. El rendimiento de una planta se puede medir de distintas maneras, que incluyen el peso de ensayo, el número de semillas por planta, el peso de las semillas, el número de semillas por unidad de área (es decir, las semillas o el peso de las semillas por acre), bushels por acre, toneladas por acre o kilo por hectárea. Por ejemplo, el rendimiento del maíz se podrá medir como la producción de granos de maíz descascarados por unidad de área de producción, por ejemplo, en bushels por acre o toneladas métricas por hectárea, que se indica a menudo de un modo ajustado teniendo en cuenta la humedad, por ejemplo, con una humedad de un 15.5 por ciento. Además, un bushel de maíz se define por ley en el Estado de Iowa como 56 libras en peso, un factor de conversión útil para el rendimiento del maíz es: 100 bushels por acre es equivalente a 6272 toneladas métricas por hectárea. Otras medidas para determinar el rendimiento son de uso común en la técnica. En ciertas realizaciones de la invención, el rendimiento podrá incrementarse en condiciones de estrés y/o condiciones que no son de estrés.

El término “vector” o "constructo" incluye la referencia a un ácido nucleico utilizado en la transfección de una célula hospedadora y en el que se puede insertar un polinucleótido. Los vectores son a menudo replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en ellos. El “vector” se define de forma que incluya, entre otros, cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario de Agrobacterium en forma lineal o circular mono- o bicatenaria que podrá autotransmitirse o movilizarse o no, y que puede transformar un hospedador eucariótico o procariótico mediante la integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (p. ej., plásmido que se replica de forma autónoma con un origen de replicación). Se incluyen específicamente vectores transportadores, los cuales hacen referencia a un vehículo de ADN capaz de replicarse, de forma natural o artificial, en dos organismos hospedadores diferentes, que se podrán seleccionar entre actinomicetos y especies relacionadas, bacterias y eucariotas (p. ej., células de plantas superiores, de mamíferos, de levaduras o fúngicas).

El término "transformación", tal y como se utiliza en la presente, se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de una célula hospedadora, la cual da como resultado una herencia genéticamente estable. En algunas realizaciones particulares, la introducción en una planta, parte de planta y/o célula vegetal se realiza mediante transformación mediada por bacterias, transformación por bombardeo de partículas, transformación mediada por fosfato de calcio, transformación mediada por ciclodextrinas, electroporación, transformación mediada por liposomas, transformación mediada por nanopartículas, transformación mediada por polímeros, suministro de ácidos nucleicos mediado por virus, suministro de ácidos nucleicos mediado por filamentos finos, microinyección, sonicación, infiltración, transformación mediada por polietilenglicol, transformación del protoplasto o cualquier otro mecanismo eléctrico, químico, físico y/o biológico que dé como resultado la introducción dé ácido nucleico en la planta, parte de planta y/o célula de esta, o una combinación de estos.

Los procedimientos para transformar plantas son muy conocidos y de uso rutinario en la técnica y se describen en la bibliografía. Los ejemplos no limitantes de métodos para transformar plantas incluyen la transformación mediante el suministro de ácidos nucleicos mediado por bacterias (p. ej., mediante bacterias del género Agrobacterium), suministro de ácidos nucleicos mediado por virus, suministro de ácidos nucleicos mediado por carburo de silicio o filamentos finos de ácidos nucleicos, suministro de ácidos nucleicos mediado por liposomas, microinyección, bombardeo de micropartículas, transformación mediada por fosfato de calcio, transformación mediada por ciclodextrinas, electroporación, transformación mediada por nanopartículas, sonicación, infiltración, captación de ácidos nucleicos mediada por PEG, así como también cualquier otro mecanismo eléctrico, químico, físico (mecánico) y/o biológico que dé como resultado la introducción de ácido nucleico en la célula vegetal, incluidas cualquiera de sus combinaciones. Algunas guías generales de varios métodos de transformación de plantas conocidos en la técnica incluyen Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. y Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1993), páginas 67-88) y Rakowoczy-Trojanowska (2002, Cell Mol Biol Lett 7:849-858 (2002)).

De este modo, en algunas realizaciones particulares, la introducción en una planta, parte de planta y/o célula vegetal se realiza mediante transformación mediada por bacterias, transformación por bombardeo de partículas, transformación mediada por fosfato de calcio, transformación mediada por ciclodextrinas, electroporación, transformación mediada por liposomas, transformación mediada por nanopartículas, transformación mediada por polímeros, suministro de ácidos nucleicos mediado por virus, suministro de ácidos nucleicos mediado por filamentos finos, microinyección, sonicación, infiltración, transformación mediada por polietilenglicol y cualquier otro mecanismo eléctrico, químico, físico y/o biológico que dé como resultado la introducción de ácido nucleico en la planta, parte de planta y/o célula de esta, o una combinación de estos.

La transformación mediada por Agrobacterium es un método utilizado comúnmente para la transformación de plantas debido a su alta eficacia de transformación y debido a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación mediada por Agrobacterium normalmente implica la transferencia del vector binario portador de ADN exógeno de interés a una cepa de Agrobacterium adecuada que podrá depender del complemento de genes vir portados por la cepa hospedadora de Agrobacterium en un plásmido Ti corresidente o cromosómicamente (Uknes et al. 1993, Plant Cell 5:159-169). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium se puede realizar mediante un procedimiento de apareamiento triparental utilizando Escherichia coli que porte el vector binario recombinante, una cepa adyuvante de E. coli que porte un plásmido que sea capaz de movilizar el vector binario recombinante hasta la cepa de Agrobacterium diana. Como alternativa, el vector binario recombinante se puede transferir a Agrobacterium por transformación con ácidos nucleicos (Hofgen y Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res.

16:9877).

La transformación de una planta por Agrobacterium recombinante suele implicar el cultivo conjunto de Agrobacterium con explantes de la planta y sigue métodos muy conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera normalmente en un medio de selección que porta un marcador de resistencia a antibióticos o herbicidas entre los bordes del ADN-T plasmídico binario.

Otro método para transformar plantas, partes de plantas y células vegetales implica propulsar partículas inertes o biológicamente activas hacia el interior de tejidos y células vegetales. Remítase, p. ej., a las Patentes de EE. UU. N.os 4 945 050; 5 036 006 y 5 100 792. En general, este método implica propulsar partículas inertes o biológicamente activas hacia el interior de las células vegetales en condiciones eficaces para que atraviesen la superficie externa de la célula y consigan incorporarse en el interior de esta. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede introducirse en la célula recubriendo las partículas con el vector que contiene el ácido nucleico de interés. Como alternativa, la célula o células pueden estar rodeadas por el vector de tal manera que la estela de la partícula porte el vector al interior de la célula. También se pueden propulsar partículas biológicamente activas (p. ej., células de levadura desecadas, bacterias desecadas o un bacteriófago, conteniendo cada uno de los cuales uno o más ácidos nucleicos que se desean introducir) hacia el interior del tejido vegetal.

De este modo, en realizaciones particulares de la presente invención, una célula vegetal se puede transformar mediante cualquier método conocido en la técnica y según se describe en la presente y se pueden regenerar plantas intactas a partir de estas células transformadas empleando cualquiera de las diferentes técnicas conocidas. La regeneración de plantas a partir de células vegetales, cultivos de tejidos vegetales y/o protoplastos cultivados, se describe, por ejemplo, en Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMilan Publishing Co. Nueva York (1983)); y Vasil I. R. (ed.) (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I (1984), y Vol. II (1986)). Los métodos para seleccionar plantas, células vegetales y/o cultivos de tejidos vegetales transgénicos transformados son de uso rutinario en la técnica y pueden emplearse en los métodos de la invención proporcionados en la presente.

El término “introducido”, en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula, significa “transfección” o “transformación” o “transducción”, e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en la que el ácido nucleico se podrá incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plastídico o mitocondrial), convertir en un replicón autónomo, o expresar transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).

La expresión "transformación estable" o "transformado de forma estable", tal como se utiliza en la presente, se refiere a que se introduce un ácido nucleico en una célula y se integra en el genoma de la célula. En este sentido, el ácido nucleico integrado puede ser heredado por su progenie, más particularmente, por la progenie de múltiples generaciones sucesivas. El término "genoma", tal como se utiliza en la presente, también incluye el genoma plastídico y el nuclear y, por lo tanto, incluye la integración del ácido nucleico en, por ejemplo, el genoma cloroplástico. La transformación estable, tal como se utiliza en la presente, también se puede referir a un transgén que se mantiene extracromosómicamente, por ejemplo, como un minicromosoma.

La transformación estable de una célula puede detectarse mediante, por ejemplo, un ensayo de hibridación mediante la técnica de Southern de ADN genómico de la célula con secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con una secuencia de nucleótidos de un transgén introducido en un organismo (p. ej., una planta). La transformación estable de una célula puede detectarse mediante, por ejemplo, un ensayo de hibridación mediante la técnica de Northern de ARN de la célula con secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con una secuencia de nucleótidos de un transgén introducido en una planta u otro organismo. La transformación estable de una célula también puede detectarse mediante, p. ej., la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otras reacciones de amplificación que son muy conocidas en la técnica, utilizando secuencias de cebadores específicas que se hibridan con la(s) secuencia(s) diana de un transgén, lo cual da como resultado la amplificación de la secuencia del transgén, que puede detectarse de acuerdo con métodos estándar. La transformación también puede detectarse mediante protocolos de hibridación y/o secuenciación directas muy conocidos en la técnica.

La expresión "proceso de transformación y regeneración" se refiere al proceso en el que se introduce de manera estable un transgén en una célula vegetal y se regenera una planta a partir de la célula vegetal transgénica. Tal y como se utiliza en la presente, la transformación y regeneración incluyen el proceso de selección, en el cual un transgén comprende un marcador seleccionable y la célula transformada ha incorporado y expresado el transgén, de modo que la célula transformada sobrevivirá y prosperará en lo que se refiere a su desarrollo en presencia del agente de selección. El término "regeneración" se refiere al cultivo de una planta entera a partir de una célula vegetal, un grupo de células vegetales o una parte de la planta tal como a partir de un protoplasto, callo o parte tisular.

La expresión “marcador seleccionable” o "gen marcador seleccionable" se refiere a un gen cuya expresión en una célula vegetal proporciona una ventaja selectiva a la célula. La expresión "selección positiva" se refiere a la adquisición por parte de la célula transformada de la capacidad de metabolizar un sustrato que previamente no podía utilizar o no podía utilizar de manera eficaz, normalmente siendo transformada con un gen marcador seleccionables positivo y expresándolo. Esta célula transformada crece de esta manera a partir de la masa de tejido no transformado. La selección positiva puede ser de muchos tipos desde formas inactivas de reguladores del crecimiento vegetal que se convierten posteriormente en formas activas mediante la enzima transferida hasta fuentes de carbohidratos alternativas que las células no transformadas no utilizan eficazmente, por ejemplo, la manosa, las cuales pueden entonces ser utilizadas tras la transformación con una enzima, por ejemplo fosfomanosa-isomerasa, que permite que sean metabolizadas. Las células no transformadas o bien crecen lentamente en comparación con las células transformadas o bien no crecen en absoluto. Otros tipos de selección podrán deberse a que las células transformadas con el gen marcador seleccionable adquieren la capacidad de crecer en presencia de un agente de selección negativa, tal como un antibiótico o un herbicida, en comparación con la capacidad de crecer de las células no transformadas. Un atributo selectivo poseído por una célula transformada también se podrá deber a la pérdida de un gen poseído previamente en la que se denomina “selección negativa”. En esta, se añade un compuesto que es tóxico solo para células que no perdieron un gen específico (un gen marcador seleccionable negativo) presente en la célula progenitora (normalmente un transgén).

Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, sin carácter limitante, genes que proporcionan resistencia o tolerancia a los antibióticos tales como la kanamicina (Dekeyser et al. 1989, Plant Phys 90: 217-23), espectinomicina (Svab y Maliga 1993, Plant Mol Biol 14: 197-205), estreptomicina (Maliga et al. 1988, Mol Gen Genet 214: 456-459), higromicina B (Waldron et al. 1985, Plant Mol Biol 5: 103-108), bleomicina (Hille et al. 1986, Plant Mol Biol 7: 171-176), sulfonamidas (Guerineau et al. 1990, Plant Mol Biol 15: 127-136), estreptotricina (Jelenska et al. 2000, Plant Cell Rep 19: 298-303) o cloranfenicol (De Block et al. 1984, EMBO J 3: 1681-1689). Otros marcadores seleccionables incluyen genes que proporcionan resistencia o tolerancia a herbicidas, tales como las mutaciones S4 y/o Hra de la acetolactato sintasa (ALS) que confieren resistencia a herbicidas que incluyen las sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidinas y pirimidinil tiobenzoatos; genes de 5-enol-pirovil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), que incluyen, sin carácter limitante, los descritos en las patentes de e E. UU. N.os 4 940 935, 5 188642, 5633 435, 6 566 587, 7674 598 (así como también todas las solicitudes relacionadas) y la glifosato N-acetiltransferasa (GAT) que confiere resistencia al glifosato (Castle et al. 2004, Science 304:1151-1154 y publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.os 20070004912, 20050246798 y 20050060767); BAR que confiere resistencia a glufosinato (remítase, p. ej., a la patente de EE. UU. N ° 5561 236); ariloxialcanoato-dioxigenasa o AAD-1, AAD-12 o AAD-13 que confieren resistencia a 2,4-D; genes tales como HPPD de Pseudomonas que confieren resistencia a HPpD; mutantes y variantes de Sprotoporfirinógeno-oxidasa (PPO) que confieren resistencia a herbicidas peroxidantes incluidos el fomesafeno, acifluorfeno-sodio, oxifluorfeno, lactofeno, flutiacet-metilo, saflufenacilo, flumioxazin, flumiclorac-pentilo, carfentrazona-etilo, sulfentrazona); y genes que confieren resistencia a dicamba, tales como la dicambamonooxigenasa (Herman et al. 2005, J Biol Chem 280: 24759-24767 y la patente de EE. Uu . N.° 7812224 y patentes y solicitudes relacionadas). Otros ejemplos de marcadores seleccionables pueden consultarse en Sundar y Sakthivel (2008, J Plant Physiology 165: 1698-1716).

Otros sistemas de selección incluyen la utilización de fármacos, análogos de metabolitos, intermedios metabólicos y enzimas para la selección positiva o selección positiva condicional de plantas transgénicas. Los ejemplos incluyen, sin carácter limitante, un gen que codifica la fosfomanosa-isomerasa (PMI) donde la manosa es el agente de selección o un gen que codifica la xilosa-isomerasa, donde la D-xilosa es el agente de selección (Haldrup et al. 1998, Plant Mol Biol 37: 287-96). Finalmente, otros sistemas de selección podrán utilizar medio exento de hormonas como el agente de selección. Un ejemplo no limitante el gen de la homosecuencia del maíz kn1, cuya expresión ectópica conlleva un incremento por un factor de 3 de la eficacia de la transformación (Luo et al. 2006, Plant Cell Rep 25: 403-409). Se divulgan ejemplos de varios marcadores seleccionables y genes que los codifican en Miki y McHugh (J Biotechnol, 2004, 107: 193-232).

En algunas realizaciones de la invención, el marcador seleccionable podrá derivarse de una planta. Un ejemplo de un marcador seleccionable que puede derivarse de una planta incluye, sin carácter limitante, la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). La enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) cataliza un paso esencial en la ruta del shikimato común en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en plantas. El herbicida glifosato inhibe la EPSPS, y de esta manera provoca la muerte de la planta. Se pueden crear plantas transgénicas tolerantes al glifosato introduciendo un transgén de EPSPS modificado que no se ve afectado por el glifosato (por ejemplo, la patente de EE. UU. 6 040 497). Otros ejemplos de una EPSPS vegetal modificada que se puede utilizar como marcador seleccionable en presencia de glifosato incluye un mutante P106L de EPSPS de arroz (Zhou et al. 2006, Plant Physiol 140: 184-195) y una mutación P106S en e Ps PS de "azotalenguas" (Baerson et al. 2002, Plant Physiol 129: 1265­ 1275). Otras fuentes de EPSPS que no se derivan de una planta y que se pueden utilizar para conferir tolerancia al glifosato incluyen, sin carácter limitante, un mutante P101S de EPSPS de Salmonella typhimurium (Comai et al. 1985, Nature 317: 741-744) y una versión mutada de EPSPS de CP4 de Agrobacterium sp. cepa CP4 (Funke et al 2006, PNAS 103: 13010-13015). Aunque el gen de EPSPS vegetal es nuclear, la enzima madura se ubica en el cloroplasto (Mousdale y Coggins 1985, Planta 163:241-249). La EPSPS es sintetizada como una preproteína que contiene un péptido de tránsito y el precursor se transporta a continuación al interior del estroma del cloroplasto y se procesa proteolíticamente para proporcionar la enzima madura (della-Cioppa et al. 1986, PNAS 83: 6873-6877). Por lo tanto, para crear una planta transgénica que sea tolerante al glifosato, se podría introducir una versión de EPSPS multada de manera adecuada que se trasloque correctamente al cloroplasto. Una planta transgénica de este tipo entonces tiene un gen de EPSPS genómico nativo así como también el transgén de EPSPS mutado. En este caso el glifosato se podría utilizar como un agente de selección durante el proceso de transformación y regeneración, para que de esta manera tan solo sobrevivan aquellas plantas o tejido vegetal que hayan sido transformados con éxito con el transgén de EPSPS mutado.

El término "evento" transgénico, tal y como se utiliza en la presente, se refiere a una planta recombinante producida mediante la transformación y regeneración de una célula o tejido vegetales con ADN heterólogo, por ejemplo, un casete de expresión que incluye un gen de interés. El término "evento" se refiere al transformante original y/o la progenie del transformante que incluyen el ADN heterólogo. El término "evento" también se refiere también a la progenie producida mediante cruzamiento sexual entre el transformante y otra línea de maíz. Incluso después del retrocruzamiento reiterado con un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante del progenitor transformado se encuentran presentes en la progenie del cruce en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también se refiere al ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado que se esperaría que se transfiera a una progenie que reciba el ADN insertado, incluido el transgén de interés, como resultado del cruce sexual de una línea progenitora que incluya el ADN insertado (p. ej., el transformante original y la progenie que se obtiene por autofecundación) y una línea progenitora que no contenga el ADN insertado. Típicamente, la transformación de tejido vegetal produce múltiples eventos, donde cada uno de los cuales representa la inserción de un constructo de ADN en una ubicación diferente en el genoma de una célula vegetal. En función de la expresión del transgén u otras características deseables, se selecciona un evento particular.

El experto en la técnica reconocerá que el genotipo transgénico de la invención se puede introgresar mediante cultivo selectivo en otras líneas vegetales que comprenden diferentes genotipos transgénicos o no transgénicos. Por ejemplo, un maíz obtenido endogámicamente que comprende el genotipo transgénico de la invención se puede cruzar con un maíz obtenido endogámicamente que comprende el genotipo transgénico del evento MIR162 resistente a lepidópteros, del que existe constancia en la técnica, para producir de esta manera semillas de maíz que comprendan tanto el genotipo transgénico de la invención como el genotipo transgénico MIR162. Se comprenderá además que se pueden realizar otras combinaciones con el genotipo transgénico de la invención y, por lo tanto, este ejemplo no debería considerarse limitante.

El genotipo transgénico de la invención se puede introgresar desde la planta transforma inicialmente, tal como una planta de maíz, en un híbrido o elemento endogámico utilizando técnicas de cultivo selectivo conocidas en la técnica. El objetivo del cultivo selectivo es combinar en una sola variedad o híbrido varios rasgos deseables. Para los cultivos de campo, estos rasgos podrán incluir la resistencia a insectos y enfermedades, tolerancia a herbicidas, tolerancia al calor y la sequía, reducción del tiempo que transcurre hasta la maduración del cultivo, rendimiento mayor y una calidad agronómica mejor. Con la recolección mecánica de muchos cultivos, la uniformidad de las características de la planta, tales como la germinación y plantación, tasa de crecimiento, maduración y altura de las espigas y plantas, es importante.

La presente invención incluye un constructo que comprende un gen mCry3A, divulgado en la patente de EE. UU. N.° 7 030 295, que codifica una proteína mCry3A y es útil para controlar plagas de insectos de tipo gusano de la raíz del maíz (Diabrotica spp.). El constructo también comprende un gen eCry3.1Ab (también conocido como FR8a), divulgado en la patente de EE. UU. N.° 8309 516, que codifica una proteína insecticida eCry3.1Ab, también útil para controlar plagas de insectos de Diabrotica spp. mediante un segundo modo de acción. Los modos duales de acción que confieren las dos proteínas insecticidas a una única planta de maíz transgénica proporcionan a los agricultores un sistema de tratamiento más eficaz para el control del gusano de la raíz del maíz.

Aunque existen eventos comerciales que portan el gen mCry3A (a saber, el evento MIR604, patentes de EE. UU. N.os 7 361 813, 7897 748, 8354 519 y 8884 102) o el gen eCry3.1Ab (a saber, el evento 5307, patente de EE. UU. N.28 466 346) un único evento que porta ambos genes en un único locus proporcionaría ventajas significativas. En la actualidad, la creación de una planta transgénica útil comercialmente que comprenda los transgenes mCry3A y eCry3.1Ab requiere múltiples pasos de cultivo selectivo y un grado significativo de cribado para identificar el genotipo correcto en el germoplasma correcto. Estos pasos de cultivo selectivo y cribado se requieren para cada variedad de germoplasma en la cual se desea introducir estos dos rasgos. Además, para muchos cultivos importantes en la agricultura, tal como el maíz, es necesario mantener estos dos rasgos como híbridos para docenas de variedades de germoplasma. Finalmente, factores tales como la unión genética de recombinación genética o rasgos indeseables pueden complicar la introducción de dos rasgos procedentes de dos loci distintos en una única variedad de germoplasma. Por lo tanto, sería ventajoso crear una molécula de ácido nucleico que cuando se introduce en el genoma de una célula, dé como resultado una célula transgénica que porte ambos rasgos en un único locus.

Se produjeron diferentes constructos para determinar la eficacia de los genes mCry3A y eCry3.1Ab en el contexto de diferentes casetes de expresión. Sorprendentemente, un vector, 17629, confirió unas propiedades insecticidas excelentes con unos efectos negativos mínimos o nulos sobre el desarrollo vegetativo o la fertilidad de la planta transgénica. El transgén del vector 17629 es la SEQ ID NO: 1. Este transgén comprende tres casetes de expresión. Dos de esos casetes de expresión comprenden eCry3.1Ab y mCry3A, que son genes que son útiles para controlar plagas de insectos coleópteros, incluidas Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz del maíz occidental, D. virgifera zeae, el gusano de la raíz del maíz de México y D. longicornis barberi, el gusano de la raíz del maíz septentrional. El tercer casete de expresión comprende el gen PAT, que confiere resistencia a herbicidas que contienen glufosinato. El gen PAT se deriva de Streptomyces viridochromogenes y codifica una fosfinotricinaacetiltransferasa que confiere tolerancia al glufosinato (patentes de EE. UU. N.os 5531 236, 5646024, 5648 477 y 5 276 268). El gen PAT se puede utilizar como un marcador seleccionable de la transformación. Las plantas transgénicas que expresan el gen PAT también tienen tolerancia a herbicidas que contienen glufosinato. Por lo tanto, una planta transgénica que comprende la SEQ ID NO: 1 tiene tanto una tolerancia a herbicidas como unas propiedades insecticidas mejoradas.

Un experto en la técnica podría reconocer que durante la inserción de una molécula de ácido nucleico, tal como la SEQ ID NO: 1, en una célula, los extremos 5' y/o 3' de la molécula insertada se podrán eliminar o reorganizar. Tales deleciones o reorganizaciones puede que no afecten a la función de la molécula insertada y estos cambios relativamente pequeños resultarán en una molécula insertada que podrá considerarse sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:1. Un experto en la técnica también podría reconocer que la molécula de ácido nucleico, tal como la que comprende la SEQ ID NO: 1, podrá experimentar una reorganización o una duplicación totales o parciales durante el evento de inserción, de modo que la molécula insertada constituya una reorganización o una duplicación totales o parciales de la molécula de ácido nucleico de partida. Un experto en la técnica podría reconocer que esta molécula insertada todavía podrá tener las mismas características y/o rasgos que la molécula de partida, de modo que la molécula insertada es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:1, y la célula transformada o la planta transformada resultantes todavía podrán ser deseables.

Un experto en la técnica podría reconocer que un transgén para su uso comercial, tal como una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1, podrá necesitar modificaciones relativamente menores en la secuencia del ácido nucleico para cumplir con las normas reguladoras gubernamentales. Tales modificaciones no afectarían a la función de la molécula resultante, que sería sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1. Un experto en la técnica podría reconocer que la molécula de ácido nucleico modificado sería esencialmente idéntica a la molécula de partida.

Por lo tanto, la invención engloba una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntico a la SEQ ID NO: 1, donde ciertos nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 se eliminan, sustituyen o reorganizan, lo que resulta en una SEQ ID NO: 1 mutada y donde la funcionalidad de la SEQ ID NO:1 mutada es idéntica a la molécula de partida. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico quimérico y/o un constructo o vector de ácido nucleico recombinante que comprenden, están constituidos o consisten esencialmente en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 98%, idéntica en al menos un 99% o idéntica en un 100% a la SEQ ID NO: 1. En una realización, esta molécula de ácido nucleico quimérico podrá comprender casetes de expresión, elementos reguladores transcripcionales o traduccionales u orígenes de replicación procarióticos adicionales. En otra realización, la molécula de ácido nucleico quimérico podrá ser un constructo de ácido nucleico recombinante tal como un vector binario o un vector adecuado para la expresión en procariotas. El constructo de ácido nucleico recombinante podrá ser adecuado para la expresión transitoria o estable en plantas. En una realización, una molécula de ácido mucleico de la invención tal como se describe en la presente es una molécula de ácido nucleico aislado. En otra realización, la invención engloba la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1 ya sea como una molécula de ácido nucleico aislado o como parte de una molécula de ácido nucleico más grande.

En otra realización, la presente invención contempla el uso de la SEQ ID NO: 1, o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1, donde la expresión de dicha molécula confiere propiedades insecticidas mejoradas útiles para controlar plagas de insectos coleópteros incluidas Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de la raíz del maíz occidental, D. virgifera zeae, el gusano de la raíz del maíz de México y D. longicornis barberi, el gusano de la raíz del maíz septentrional.

En otra realización, la presente invención contempla una célula hospedadora transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la célula podrá ser una célula bacteriana o una célula vegetal. En algunas realizaciones, la célula bacteriana podrá ser una célula de Escherichia coli, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium; Bacillus cereus, Agrobacterium ssp. o Pseudomonas ssp.

En otra realización, la presente invención contempla una planta, parte de la planta, tejido vegetal, cultivo de células vegetales o célula vegetal transgénicos que comprenden una célula vegetal transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, esta molécula de ácido nucleico podrá ser un cromosoma, en el cual se ha integrado una molécula de ácido nucleico de la invención tal como se describe en la presente. La célula vegetal transgénica podrá ser capaz o no de regenerarse y formar una planta transgénica. La planta transgénica podrá ser una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea. En algunas realizaciones, la planta transgénica podrá ser una planta de cultivo, que incluye, sin carácter limitante, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, avena, pasto, pasto gramíneo, pimientos, papas, algodón, arroz, soja, caña de azúcar, remolacha azucarera, tabaco, cebada y colza oleaginosa.

En otra realización, la presente invención contempla una progenie de cualquier generación de la planta transgénica, donde la progenie comprende la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1. En otra realización, la invención contempla un propágulo de cualquier generación de la planta transgénica, donde el propágulo comprende la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el propágulo podrá ser una semilla o un esqueje. El esqueje podrá ser de una parte de la planta transgénica que está por encima del suero, tal como un tallo o una hoja, o por debajo del suelo, tal como una raíz o un rizoma.

En otra realización, la presente invención contempla un método para producir una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas, que comprende introducir la SEQ ID NO: 1, o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1, en una planta para producir de esta manera una planta transgénica, donde la molécula de ácido nucleico provoca la expresión de los genes mCry3A y eCry3.1Ab en una cantidad que proporciona el control del insecto. En una realización, la molécula de ácido nucleico se podrá introducir en la planta mediante un método de transformación, que incluye, sin carácter limitante, la transformación mediada por Agrobacterium o biolística o bombardeo con partículas. Un método de este tipo incluiría los pasos de a) proporcionar la molécula de ácido nucleico; b) introducir en una planta, cultivo tisular o una célula vegetal la molécula de ácido nucleico del paso (a) para obtener una planta transformada, cultivo tisular transformado o una célula transformada que tienen propiedades insecticidas mejoradas; y c) cultivar dicha planta transformada o regenerar una planta transformada a partir del cultivo tisular transformado o de la célula vegetal transformada, de manera que se produzca una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico también se podrá introducir en una planta mediante el cultivo selectivo, que incluye la autofecundación o cruzamiento exogámico, de manera que la progenie porte la molécula de ácido nucleico. En una realización, el método incluiría los pasos de a) obtener una planta transgénica fértil que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1; b) cultivar dicha planta en condiciones adecuadas para producir dicha semilla transgénica. En otra realización, el método incluiría los pasos de a) obtener una planta transgénica fértil que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1; b) cruzar sexualmente la planta progenitora transgénica con una segunda planta progenitora; c) seleccionar una planta de la progenie de la primera generación con propiedades insecticidas mejoradas. Opcionalmente, un método podrá incluir los pasos adicionales de d) autofecundar la planta de la progenie de la primera generación, para producir de esta manera una pluralidad de plantas de la progenie de la segunda generación; y e) seleccionar a partir de las plantas de la progenie de la segunda generación una planta con propiedades insecticidas mejoradas, donde las plantas de la progenie de la segunda generación comprenden una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1, o una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1, y las plantas de la progenie de la segunda generación tienen propiedades insecticidas mejoradas respecto a una planta no transgénica.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Constructos sintetizados

Se construyeron cinco constructos vectoriales binarios con diferentes combinaciones de potenciadores transcripcionales, promotores, potenciadores traduccionales y terminadores y variantes de estos elementos genéticos, que impulsan la expresión de las variantes de mCry3A y eCry3.1Ab. Existe constancia de que todos los promotores utilizados son promotores constitutivos fuertes y cabía esperar que la adición de los potenciadores transcripcionales y traduccionales resultara en plantas transgénicas con niveles excelentes de expresión y control de insectos. Se crearon versiones de los genes mCry3A y eCry3.1Ab con diferentes preferencias de codones para reducir la identidad secuencial nucleotídica entre ambos. Las regiones de identidad secuencial nucleotídica entre los genes mCry3A y eCry3.1Ab podría dar como resultado una reducción de la expresión génica, en el nivel transcripcional o postranscripcional. Por lo tanto, el diseño de secuencias de nucleótidos con una identidad mínima podrá resultar en expresiones más elevadas de cualquiera de los genes mCry3A o eCry3.1Ab, o de ambos, en una planta transgénica. La Tabla 1 muestra los cinco constructos creados y enumera los elementos génicos con cada secuencia codificante (CDS). La Tabla 2 define cada uno de los elementos génicos nombrados en la Tabla 1.

Tabla 1: Composición de los constructos binarios

Tabla 2: Descripción de los elementos genéticos

Ejemplo 2: Transformación en plantas de maíz

Se utilizó cada uno de los ocho constructos vectoriales binarios para crear eventos transgénicos del maíz. Se produjeron eventos mediante la transformación mediada por Agrobacterium de una línea de maíz sujeta a derecho de propiedad. Los embriones inmaduros se transformaron esencialmente tal como se describe en Negrotto et al. (2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). Empleando este método, los elementos genéticos dentro de las regiones de fronterizas derecha e izquierda del plásmido de transformación se transfieren de forma eficaz y se integran en el genoma de la célula vegetal, mientras que los elementos genéticos fuera de estas regiones fronterizas no se transfieren.

Se utilizó el gen PAT como marcador seleccionable durante el proceso de transformación (Negrotto et al.2000). Los embriones que produjeron callos embriogénicos se transfirieron a una serie de medios de selección de cultivo celular que contenían bialafós como agente de selección y se cultivaron durante 10-11 semanas en total. El medio de selección contuvo 200 mg/mL de timentina y/o 10 mL/L de PPM (siglas en inglés de Mezcla Conservante de Plantas) para garantizar que se eliminaba Agrobacterium del tejido transformado.

Se estudiaron plántulas regeneradas para determinar la presencia del gen PAT y otros genes diana mediante un análisis de Pc R TAQMAN® en tiempo real desarrollado por Ingham et al. (Biotechniques 31(1):132-4, 136-40, 2001). Las plantas positivas para PAT y los genes diana, también denominados como eventos, se transfirieron al invernadero para una propagación adicional.

Ejemplo 3: expresión génica determinada mediante ELISA sándwich cuantitativo

Para determinar los niveles de expresión de mCry3a y eCry3.1Ab, se realizó un ELISA cuantitativo utilizando un método doble para medir las cantidades de las proteínas mCry3a y eCry3.1Ab en la misma muestra a la vez. Se tomaron muestras de las raíces de los eventos transgénicos y se extrajeron en solución salina tamponada con fosfato a pH 7.3 (PBS) que contenía un 0.05% de Tween-20 (PBST). Se midió la proteína soluble total (TSP, por sus siglas en inglés) del extracto utilizando el ensayo de proteínas con BCA Pierce (Thermo Scientific, Rockford, IL). Se recubrieron placas de 96 pocillos de unión elevada (Nunc Maxisorp) con 2 pg/mL del anticuerpo MAb170 anti-mCry3A en tampón. Las placas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato a pH 7.3 (PBS) que contenía un 0.05% de Tween-20 (PBST). Se añadieron las muestras o los patrones en diluyente ELISA (PBST que contenía un 1% de albúmina bovina sérica) a la placa (100 pL/pocillo), se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente (TA) con agitación y se lavaron cinco veces. Se añadieron a la placa 100 pL/pocillo de 0.5 pg/mL de anticuerpo de conejo anti-Cry1Ab conjugado con HRP, 1 pg/mL del anticuerpo MAb174 anti-mCry3A conjugado con biotina y 0.1 pg/mL de estreptavidina conjugada con AP (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA) en diluyente ELISA, se incubaron durante 1 h a TA/agitación y se lavaron como se ha indicado anteriormente. Se añadió el sustrato p-nitrofenilfosfato (SurModics, Eden Prairie, MN) (100 pL/pocillo) y se permitió que la reacción se desarrollará durante 30 min a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia a 405 nm utilizando un lector de microplacas (BioTek Powerwave XS2, Winooski, VT) para medir mCry3A. La placa se lavó como se ha indicado anteriormente. Se añadió el sustrato tetrametilbencidina (Sigma, San Luis, MO) (100 pL/pocillo) y se permitió que la reacción se desarrollará durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Se detuvo la reacción utilizando HCl 1N (100 pL/pocillo). Se midió la absorbancia a 405 nm para detectar eCry3.1Ab. Para normalizar la eficacia de la extracción, se dividió la concentración del analito (mCry3A o eCry3.1Ab) por la concentración de la proteína soluble total (TSP). La curva patrón utilizó un ajuste a la curva de cuatro parámetros para representar gráficamente las concentraciones frente a la absorbancia.

Tabla 3. Resumen de los datos de expresión de mCry3A

La acumulación de proteína mCry3A tuvo su nivel más alto, en promedio, en los eventos generados a partir de la transformación del constructo binario 18382. Las plantas transgénicas generadas a partir de la transformación de los constructos binarios 21371,21629, 21630, 21386, 21648 y 21649 tuvieron una eficacia mediocre contra el gusano de la raíz del maíz occidental debido a niveles proteicos bajos.

Tabla 4: Resumen de los datos de expresión de eCry3.1Ab

Las cantidades de proteína eCry3.1Ab tuvieron su valor más alto, en promedio, en los eventos generados a partir de la transformación del constructo binario 17629. Sorprendentemente, los eventos generados a partir de los restantes constructos tuvieron unas cantidades mucho menores de proteína eCry3.1Ab.

Ejemplo 4: Ensayos de eficacia para los eventos que comprenden los transgenes 17629 y 18382

Se evaluaron 49 eventos de maíz transgénicos que comprendían el transgén de 17629 y 12 eventos transgénicos que comprendían el transgén de 18382 para determinar la eficacia de campo en el gusano de la raíz del maíz occidental en dos híbridos diferentes (híbridos A y B) en un total de 8 ubicaciones diferentes en los Estados Unidos. Los eventos se plantaron en tres hileras con 3 réplicas de cada uno. Se asignaron calificaciones respecto al daño de alimentación en las raíces a las cuatro pulgadas en 6 plantas de la hilera central. Para el híbrido A, 21 de los 49 eventos que comprendían el transgén de 17629 y 12 de los 12 eventos que comprendían el transgén de 18382 tuvieron una eficacia aceptable contra el gusano de la raíz del maíz occidental, con un 5% de nivel de confianza. Para el híbrido B, 31 de los 49 eventos que comprendían el transgén de 17629 y 12 de los 12 eventos que comprendían en el transgén de 18382 tuvieron una eficacia aceptable contra el gusano de la raíz del maíz occidental.

Ejemplo 5: Ensayos de equivalencia agronómica para los eventos que comprenden los transgenes 17629 y

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es idéntica en al menos un 98% a la SEQ ID NO: 1, o una de sus complementarias, que confiere la expresión de las proteínas insecticidas mCry3A y eCry3.1Ab cuando se introduce en una célula.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislado.

3. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia de ácido nucleico es idéntica en un 100% a la SEQ ID NO: 1.

4. Un vector de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. Una célula hospedadora transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 -4, donde dicha célula es preferentemente una célula bacteriana o una célula vegetal.

6. Una planta, parte de la planta, tejido vegetal, cultivo de células vegetales o propágulo transgénicos que comprenden la célula vegetal transgénica de la reivindicación 5.

7. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha planta es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.

8. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha planta se selecciona a partir del grupo constituido por maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, avena, pasto, pasto gramíneo, pimientos, papas, algodón, arroz, soja, caña de azúcar, remolacha azucarera, tabaco, cebada y colza oleaginosa.

9. Un método para producir una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas que comprende introducir mediante transformación la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una planta, para producir de esta manera una planta transgénica, donde la molécula de ácido nucleico expresa cantidades eficaces de proteína para controlar insectos.

10. Un método para producir una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas, que comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 1-3;

b) introducir mediante transformación en una planta, cultivo tisular o una célula vegetal la molécula de ácido nucleico del paso (a) para obtener una planta transformada, cultivo tisular transformado o una célula transformada que tiene propiedades insecticidas mejoradas; y

c) cultivar dicha planta transformada o regenerar una planta transformada a partir del cultivo tisular transformado o célula vegetal transformada, de modo que se produzca una planta transgénica con propiedades insecticidas mejoradas.