KR101592357B1 - 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)에서 동정된 유전자인 DaCBF7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 냉해 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 냉해 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도{Novel Gene Implicated in Plant Cold Stress Tolerance and Use Thereof}

본 발명은 냉해 스트레스에 대한 반응에 관여하는 유전자 및 이를 포함하는 식물의 냉해 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.

이동이 불가능한 고등식물은 고정된 생착 환경 내에서 일생동안 건조, 고염, 냉해, 중금속, 열충격 및 오존과 같은 다양한 환경 스트레스에 직면하게 되며, 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되어 작물생산 감소 및 경작환경 제한으로 인한 경작지 감소의 주요 원인이 된다.

고등식물은 비생물학적 스트레스에 노출된 이후, 유전자 발현의 패턴에서 일련의 변화가 일어나며, 이러한 반응은 성장속도, 생산성 및 종 분포에 영향을 미친다. 특히 열대 또는 아열대 원산지를 갖는 곡물류인 벼는 종종 저온 손상을 받으며, 이러한 손상을 받은 식물체는 퇴록, 괴사 또는 생장 지연과 같은 다양한 증상을 나타낸다 (De Datta, 1981). 온대 지역에서, 벼는 종종 개화시기 뿐 아니라 유식물체 단계에서도 저온 손상에 직면하게 된다.

저온-반응 기전을 이해하기 위하여, 연구자들은 몇 종의 식물체에서 저온-유도성 단백질을 코딩하는 다수의 유전자를 분리하였으며(Guy, 1999; Thomashow, 1999), 저온 하에서 유도되는 유전자들은 다양한 유전산물을 생성시킴으로써 세포를 보호하는 기능을 하는 것으로 예측되었다. 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)은 남극 지방의 가혹한 환경에서 번성하는 유일한 단자엽 식물로서, 환경 스트레스에 대응하는 고등식물의 방어 메카니즘 연구에 매우 유용한 식물이다. 최근 남극좀새풀을 이용하여 저온, 건조 및 염 스트레스에 대한 내성에 관여하는 유전자를 발굴하고자 하는 노력이 계속되어오고 있지만, 아직 남극좀새풀 내 환경 스트레스 저항성을 조절하는 유전자는 거의 밝혀진 바가 없다. 본 발명자들은 밀(Triticum monococcum)의 TmCBF7 유전자와 상동성을 가지는 남극좀새풀 유전자를 탐색한 결과, 냉해 스트레스에 관여하는 새로운 유전자를 동정하고 이를 DaCBF7라 명명하였다. DaCBF7은 그 기능이 아직 밝혀지지 않은 신규 유전자로서, 비생물학적 스트레스와의 관계가 본 발명자들에 의하여 처음으로 규명되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식물의 비생물학적 스트레스, 특히 저온에 의해 발생하는 냉해 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키고 경작지 제한을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)의 DaCBF7 유전자의 발현을 대상 식물체에서 증가시킬 경우 상술한 냉해 스트레스에 대한 강화된 내성을 수득할 수 있음을 확인으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 냉해 스트레스 내성 증진방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 식물의 비생물학적 스트레스, 특히 저온에 의해 발생하는 냉해 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키고 경작지 제한을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)의 DaCBF7 유전자의 발현을 대상 식물체에서 증가시킬 경우 상술한 냉해 스트레스에 대한 강화된 내성을 수득할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 가해준 뒤 유전자 발현 프로파일을 조사한 결과, 대조군에 비해 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 새롭게 밝혀진 남극좀새풀 유전자의 뉴클레오타이드 서열이며, 이 유전자의 이름은 본 발명자들에 의해 DaCBF7(Deschampsia antarctica CBF7, C-repeat Binding Factor 7)로 명명되었다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 유전자를 과발현시킨 식물체는 다양한 비생물학적 스트레스가 가해지는 환경에서도 그 생존률이 크게 증가함을 확인하였다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로는, 본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물은 단자엽 식물(monocot)이며, 가장 구체적으로는 식물은 벼(Orysa sartiva L.)이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들어 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 구체적으로는 전기천공법(electroporation)을 사용한다.

특정 뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물의 냉해 스트레스 내성 증진방법을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체의 제조는 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 식물체의 냉해 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 냉해 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 냉해 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 DaCBF7 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸 그림이다. 별표는 추정 종결코돈을, 밑줄 친 부분은 보존적인 AP2 DNA 결합-도메인을 나타낸다.
도 2는 저온 스트레스에 노출시킨 뒤 DaCBF7 유전자의 qPCR 분석결과를 나타낸 그림이다. 왼쪽의 수직 축은 유전자 전사체 양의 상대적 비율을 내부 대조군인 DaEF1A 및 DaCYP와 비교하여 상대적 비율로 표시한 것이다. 데이터 및 에러 바는 3개의 복제 샘플의 실험 값에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다. 총 RNA를 정상 조건(15℃, no treatment)의 시료 및 저온 조건(4℃)의 시료로부터 채취하였다. 세 개의 생물학적 복제 샘플로 각각의 실험을 수행한 결과 유사한 결과를 얻었다.
도 3은 벼의 원형질체에 DaCBF7과 GFP를 융합시킨 단백질을 일시적으로 발현시켜 DaCBF7의 세포 내 위치를 분석한 그림이다. 형광현미경의 GFP 필터로 관찰한 결과 DaCBF7은 세포 내에서 핵에 위치하고 있음을 확인할 수 있었다.
도 4는 형질전환 식물체의 개별 라인을 선별하고 형질전환 식물체에서 DaCBF7의 발현을 확인한 그림이다. 지놈 DNA를 이용하여 서던 혼성화를 수행한 결과, DaCBF7을 과다발현하는 10개의 개별라인이 존재하는 것을 확인하였다(도 4a). 형질전환 벼 식물체에서 DaCBF7이 발현하는지를 확인하고자 RNA를 추출하여 역전사 반응을 수행하고 이를 DaCBF7 유전자에 대한 프라이머로 PCR을 수행한 결과, DaCBF7이 돌연변이 식물체 내에서 발현되는 것을 확인하였다(도 4b).
도 5는 DaCBF7 과다발현 식물체와 야생형 벼의 저온 스트레스에 대한 저항성을 비교한 그림이다. 약 5주된 식물을 4℃ 저온 챔버에서 1주일 간 배양한 후 다시 정상조건인 28℃에서 키우며 생장을 비교해본 결과 DaCBF7 과다발현 돌연변이 식물체가 야생형 벼보다 저온 스트레스에 대해 저항성이 높은 것을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

유전자 클로닝

종래에 보고된 transcriptome 데이터(Lee et al., 2013)로부터 Triticum monococcum(진뱅크 접근번호 AAX28965)의 TmCBF7에 대한 전체 아미노산 서열을 이용한 tBLASTN 알고리즘을 통해 DaCBF7의 부분적인 유전자 서열을 수득하였다. 5' RACE(rapid amplification of cDNA ends)를 위하여, RNeasy plant 미니 킷 (Qiagen, Chatsworth, CA)을 이용하여 잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. 5′ RACE 킷(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 RACE PCR을 수행하였다. 역전사 및 PCR 반응을 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다:

프라이머 F, 5′-AGAAGTCGCGCATCTGGCTCGGCACCTT-3′;

프라이머 R1, 5′-GCGCATTGTCTTCGCCGCTGCAACTGT-3′; 및

프라이머 R2, 5′-AGGTGCGCTTTACGGCCCTTGATGGCGA-3′.

PCR의 주요 산물은 젤로 정화하고 ABI3730XL DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 직접 PCR 시퀀싱을 통해 시퀀싱하였다.

남극좀새풀 배양

자연조건에서 생장한 남극좀새풀[Deschampsia antarctica Desv.(Poaceae)]을 킹 조지섬 바톤 반도의 대한민국 세종 남극기지 인근(62°14'29"S; 58°44'18"W)에서 채집하였다. 채집한 식물을 연구실로 옮긴 후 2% 수크로오스를 포함하는 0.5× MS(Murashige and Skoog)배지를 공급하면서 150 μmol m^-2 s^-1 의 광강도로 16시간 광 조건/ 8시간 암 조건 하에서 남극좀새풀의 루비스코(RuBisCo) 활성이 높아지는 15℃(Pet al. 2006)에서 수경재배하였다.

스트레스 처리 및 샘플링

3-4개의 새싹 중 가장 긴 5cm 길이를 가지는 각 5개의 식물을 실험에 사용하였다. 저온 스트레스를 가하기 위해 식물들을 저온 챔버에 옮기고 4℃에서 정해진 시간동안 배양하였다.

RT-PCR을 이용한 유전자 발현양상 분석

RNeasy Plant 미니 킷(Qiagen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 식물 샘플의 잎으로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript Ⅱ(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 시료에서 추출한 1 μg 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

유전자 특이적 프라이머는 DaCBF7의 서열에 따라 설계하였다; DaCBF7RT 정방향 프라이머 5'-GAAGACAATGCGCTGTTCGACCTT-3', 및 역방향 프라이머 5'-AAAGCTACTAGGACCAGAGGAGCG. 두 개의 대조군 유전자인 DaCYP 및 DaEF1a1 가 내부 대조군으로 사용되었다: DaCYP 정방향 프라이머 5'- GCGCATCACCTTCCAAATTTCCCA-3′ 및 역방향 프라이머 5'- ATAGAAGCTACCGTGCCTGGTTGT-3', DaEF1a1 정방향 프라이머 5'-TTTGTCCACTGCTACACTCGTGGT-3' 및 역방향 프라이머 5'-TCGAAGGCTGACGGACATAACCAA-3' (Lee et al. 2010). 생물학적으로 복제된 샘플을 가지고 SYBR Premix Ex Taq™ DNA 폴리머레이즈(Takara, Seoul, Korea) 및 Mx3000P 실시간 PCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 qPCR을 세 번 수행하였다.

벼 원형질체 세포내 단백질 위치 분석

벼 식물체 내에서의 DaCBF7의 단백질 위치를 분석하기 위하여 DaCBF7이 초록형광물질과 융합되어 있는 플라스미드를 재조합하였고 이를 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 pBI221벡터에 LR반응을 이용하여 치환시켰다. 재조합된 플라스미드를 과다발현하는 대장균에서 플라스미드를 대량으로 추출한 후, 28℃ 챔버에서 7일간 키운 식물에 효소액을 처리하여 추출한 원형질체에 PEG를 이용하여 일시적으로 발현시켰다. 일시적으로 형질전환 시킨 원형질체를 28℃ 챔버에서 16시간 배양하고 형광현미경(Olympus)의 GFP 필터를 이용하여 발현을 확인하였다.

유전자 과다발현 컨스트럭트 제작

DaCBF7을 과다발현시키는 플라스미드를 재조합하기 위해 DaCBF7의 코딩 부분의 5' 및 3'쪽에 해당하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물을 pENTR SD-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입한 후, LR 크로나아제 효소(Invitrogen)를 이용하여 유비퀴틴 프로모터 하에서 유전자를 과다발현 시키는 pGA2897 벡터에 치환시켰다. 대장균에서 플라스미드를 추출한 후 이를 아그로박테리움(LBA4404)에 전기천공법을 이용하여 삽입하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다.

벼 식물체 배양

야생형 및 DaCBF7 과다발현 돌연변이 식물체의 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, 2,4-D (2 mg/L), 0.03% 카제인 수화물, 25 mM L-프롤린, 0.2% 젤라이트로 구성된 CHU 배지(Duchedfa Biochemie)에 심은 후 약 1주간 생장 챔버(16시간 광 조건/ 8시간 암 조건, 28 ℃)에서 키워 캘러스(callus)를 유도하여 조직배양의 재료로 사용하였다. 같은 방법으로 소독한 종자를 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28 ℃ 조건)에서 키운 후, Sunshine MIX #5 (Sun Gro Horticulture)와 수도용 상토를 섞어서 만든 흙에 심어서 약 3주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 성장시키고 이를 온실에 옮겨 약 4달간 키운 후 종자를 수득하였다.

과다발현 형질전환체 제작

과다발현 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움을 이용한 벼 조직배양을 수행하였다. 캘러스 유도 배지(CHU media)에서 약 7일간 키운 캘러스에 아그로박테리움을 감염시킨 후 200 μM의 아세토시린곤(acetosyringone)을 포함하는배지에서 4일간 배양한 후 함께 자란 아그로박테리움을 수세하고 항생제가 들어있는 캘러스 유도배지로 옮겨주었다. 항생제 선별과정에서 새롭게 자란 캘러스를 옥신과 싸이토키닌이 들어있는 재분화배지에 옮겨 식물로 재분화시킨 후 흙으로 옮겨 순화과정을 거친 뒤 흙으로 옮겨 온실조건에서 키워 T0 세대의 식물을 획득하였다. 확보한 식물의 벡터 삽입 여부를 확인하기 위하여 지놈 DNA를 추출하여 벡터 내부 항생제에 대한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 벡터의 삽입을 확인하였다.

RT-PCR을 이용한 과다발현 확인

과다발현 돌연변이 식물체에서 유전자의 발현을 확인하기 위하여 전체 RNA를 추출하고 올리고 dT 프라이머와 M-MLV 역전사효소(Enzynomics)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Intron) 2.5 ㎕, dNTP 혼합액(각 2.5 mM) 2 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(Intron)를 넣어 총 부피를 25 ㎕ 로 만들고 BioRad 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 95℃에서 3분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 28회 수행하였고, 28회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. 사용된 유전자의 프라이머는 아래의 표 1과 같다.

RT-PCR에 사용된 유전자의 프라이머

프라이머	서열
DaCBF7 full FW	5'-ATGGAGGCAGACGCAAGCC-3'
DaCBF7 full RV	5'-CCAGAGGAGCGGCTCGCT-3'
OsUbiQ10 RT FW	5'-ATGCAGATCTTTGTGAAGACATTG-3'
OsUbiQ10 RT AS	5'-TTACTGACCACCACGGAGGC-3'

지노믹 서던(genomic Southern) 혼성화

조직배양을 통하여 획득한 과다발현 돌연변이 식물체에서 개별라인을 선별하기 위하여 식물체에서 지놈 DNA를 추출하여 제한효소 HindⅢ를 이용하여 전체 DNA를 절단하고 이를 0.8 % DNA 젤에 전기영동하여 전개한 후 0.25 N 농도의 HCl 용액으로 푸린기를 떼어내고 0.2 N 농도의 수산화나트륨 용액으로 변성시키고 이를 다시 중화시키는 전처리 과정을 거친 후, Hybond 멤브레인에 블롯팅 시켜 서던 혼성화를 수행하였다. 과다발현 벡터인 pGA2897의 항생제 마커인 Hpt 유전자를 서던 혼성화에 탐침으로 사용하여 16시간동안 65도의 챔버에서 혼성화를 시켰다. 혼성화된 멤브레인은 4번의 수세 과정을 거친 후 BAS image plate에 15시간 노출시켜 혼성화 결과를 확인하였다.

저온 스트레스 민감도 측정

야생형 및 DaCBF7 과다발현 돌연변이 식물체의 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광/ 8시간 암, 28 ℃ 조건)에서 키운 식물을 흙으로 옮겨 3주 동안 키운 뒤 실험에 사용하였다. 약 5주 된 식물을 7일 동안 4℃의 저온 챔버에서 키운 후, 다시 28℃의 생장 챔버로 옮겨 키우며 생장을 관찰하는 방법으로 저온 스트레스에 대해 내성을 갖는 정도를 비교하였다.

실험결과

유전자 염기서열 분석

밀(Triticum monococcum)에서 분리한 CBF7의 전체길이 아미노산 서열을 이용한 tBLASTN 탐색 및 종래에 보고된 D. antarctic의 transcriptome 데이터에 기반하여, T. monococcum CBF7과 80%의 일치를 보이는 부분적 서열 상동성 유전자를 동정하였다. 상동 유전자(DaCBF7)의 전체 서열은 상업적으로 이용가능한 5'-RACE 기술을 통해 수득하였다. 수득한 cDNA 서열은 270 아미노산의 ORF(open reading frame), 117 bp의 5’UTR(untranslated region) 및 50 bp의 3’UTR을 가지는 것으로 예측되었다(도 1). 컴퓨터 분석을 통한 아미노산 서열 추정 결과, 61 아미노산으로 구성된 AP2 DNA 결합부위가 중앙 부위에 존재함을 알 수 있었다. DaCBF7의 분자량 계산값은 28,415 Da이고 등전점은 6.0 이었다.

스트레스 처리에 따른 DaCBF7의 발현 양상

냉해 처리 하에서, DaCBF7 mRNA는 점차 축적되었으며, 4시간 후 정점에 달하였다(도 2). 이는 기저값의 3배까지 축적된 후 점차 감소하였다.

원형질체 세포내 단백질 위치 분석

식물세포 내에서 DaCBF7의 단백질 위치를 벼의 원형질체에 DaCBF7을 일시적으로 발현시키는 방법으로 확인하였다. DaCBF7과 초록형광단백질을 융합시키는 플라스미드를 제작하여 야생종에서 추출한 원형질체에 PEG를 이용하여 일시적으로 발현시키고 형광현미경으로 관찰한 결과, DaCBF7은 세포 내에서 핵에 위치하고 있음을 확인하였다.

DaCBF7 과다발현 형질전환체 확보

야생종 종자에서 유도한 캘러스를 아그로박테리움을 이용한 조직배양의 방법으로 형질전환하여, 벡터가 삽입된 캘러스를 확보하고 이를 재분화시켜 T0 세대의 식물을 확보하였다. 개별라인을 선별하기 위하여 서던 혼성화를 수행하였다. 지놈 DNA를 HindⅢ로 절단하여 블롯팅한 결과 총 10개의 개별 라인을 선별할 수 있었다. 이 형질전환 벼 식물체에서 DaCBF7이 과다발현되는 것을 확인하고자, 과다발현 돌연변이 식물체의 잎에서 RNA를 추출하여 역전사반응을 수행하였고, DaCBF7을 특이적으로 인식하는 프라이머를 이용하여 PCR한 결과 형질전환 벼 식물체에서 DaCBF7이 과다발현되었음을 확인할 수 있었다.

벼 형질전환체의 저온 스트레스 표현형 분석

DaCBF7 과다발현 돌연변이 식물체의 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자 5주된 DaCBF7 과다발현 식물과 야생종에 저온 스트레스를 처리하여 저항성을 비교하였다. 4℃의 조건에서 1주간 배양하여 저온 스트레스를 처리한 후 정상조건인 28℃에서 다시 배양하며 성장을 비교해본 결과, 야생종은 식물이 생장이 멈추고 시들어갔지만, DaCBF7 과다발현 돌연변이 식물체는 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaCBF7의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

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2. Lee J, Noh EK, Choi HS, Shin SC, Park H, Lee H. 2013. Transcriptome sequencing of the Antarctic vascular plant Deschampsia antarctica Desv. under abiotic stress. Planta 237(3):823-36

3. PE, BascuL, Sierra A, Bravo L, Corcuera L (2006) Robustness of activity of Calvin cycle enzymes after high light and low temperature conditions in Antarctic vascular plants. Polar Biol 29:909-916

<110> Korea Polar Research Institute <120> Novel Gene Implicated in Plant Cold Stress Tolerance and Use Thereof <130> PN130523 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 810 <212> DNA <213> Deschampsia antarctica <400> 1 atggaggcag acgcaagcca cgcacccacc gcttcttcct cctccgtctc atcttcgacg 60 ctgtcctctt cggcgtcctt ctcctccctg gccaacatcg tgcaagagct tcccaagaac 120 tccaagccca aacagccgaa gaaacgcaag agagccgcct cgccggccgt ggccaccaat 180 ggcgcccaag gagaggagag cagctgctgc accaccgagg acgacaacga cgccgtgagc 240 ggcaagacgc ttcccaacac cggcgctgga gccgtgtcga agagcgggtt caagcacccg 300 tcgtaccgcg gcgtgcggcg ccggagctgg ggcaagtggg tgtccgagat ccgtgagcct 360 cgcaagaagt cgcgcatctg gctcggcacc ttccccaccg cggagatggc ggcacgcgcc 420 cacgacgtgg ccgcgctcgc catcaagggc cgtaaagcgc acctcaactt cccggagctc 480 gcggacgagc tgccgcgcgc ggactccacg tcgcccgcgg acatccaggc tgccgccgcc 540 aaggccgctg ccgccgccac cgtgcagtgc ggtcagtccg agacgtctcc gccgtcctcc 600 cccgtcgcgg agtcgtcgca gccatcggaa gccgcggtat gcgccgacgc ggcgcccgcg 660 cacagttgca gcggcgaaga caatgcgctg ttcgaccttc ccgaccttct cctcgacctc 720 agggacgggc tcctgtggtc gccggtctgg ccgctggcta tggcggccga ggagtacgac 780 ggtggcctca gcgagccgct cctctggtcc 810 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Deschampsia antarctica <400> 2 Met Glu Ala Asp Ala Ser His Ala Pro Thr Ala Ser Ser Ser Ser Val 1 5 10 15 Ser Ser Ser Thr Leu Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ser Leu Ala Asn 20 25 30 Ile Val Gln Glu Leu Pro Lys Asn Ser Lys Pro Lys Gln Pro Lys Lys 35 40 45 Arg Lys Arg Ala Ala Ser Pro Ala Val Ala Thr Asn Gly Ala Gln Gly 50 55 60 Glu Glu Ser Ser Cys Cys Thr Thr Glu Asp Asp Asn Asp Ala Val Ser 65 70 75 80 Gly Lys Thr Leu Pro Asn Thr Gly Ala Gly Ala Val Ser Lys Ser Gly 85 90 95 Phe Lys His Pro Ser Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Ser Trp Gly Lys 100 105 110 Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu 115 120 125 Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala 130 135 140 Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg Lys Ala His Leu Asn Phe Pro Glu Leu 145 150 155 160 Ala Asp Glu Leu Pro Arg Ala Asp Ser Thr Ser Pro Ala Asp Ile Gln 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Val Gln Cys Gly Gln 180 185 190 Ser Glu Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Val Ala Glu Ser Ser Gln Pro 195 200 205 Ser Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp Ala Ala Pro Ala His Ser Cys Ser 210 215 220 Gly Glu Asp Asn Ala Leu Phe Asp Leu Pro Asp Leu Leu Leu Asp Leu 225 230 235 240 Arg Asp Gly Leu Leu Trp Ser Pro Val Trp Pro Leu Ala Met Ala Ala 245 250 255 Glu Glu Tyr Asp Gly Gly Leu Ser Glu Pro Leu Leu Trp Ser 260 265 270 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer <400> 3 agaagtcgcg catctggctc ggcacctt 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer <400> 4 gcgcattgtc ttcgccgctg caactg 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 primer <400> 5 aggtgcgctt tacggccctt gatggcga 28 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCBF7 forward primer <400> 6 gaagacaatg cgctgttcga cctt 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCBF7 reverse primer <400> 7 aaagctacta ggaccagagg agcg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCYP forward primer <400> 8 gcgcatcacc ttccaaattt ccca 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCYP reverse primer <400> 9 atagaagcta ccgtgcctgg ttgt 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaEF1a1 forward primer <400> 10 tttgtccact gctacactcg tggt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaEF1a1 reverse primer <400> 11 tcgaaggctg acggacataa ccaa 24 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCBF7 full forward primer <400> 12 atggaggcag acgcaagcc 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DaCBF7 full reverse primer <400> 13 ccagaggagc ggctcgct 18 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUbiQ10 RT FW <400> 14 atgcagatct ttgtgaagac attg 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsUbiQ10 RT AS <400> 15 ttactgacca ccacggaggc 20

Claims (8)

1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물(monocot)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Orysa sartiva L.)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. (a) 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진용 조성물.
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물의 냉해 스트레스(cold stress) 내성 증진방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물(monocot)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Orysa sartiva L.)인 것을 특징으로 하는 조성물.

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