KR101383331B1 - 식물 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 - Google Patents

식물 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물체의 CaDSR6 (Capsicum annum drought stress responsive 6) 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조 및 염 스트레스 등의 비생물학적 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 이들 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도{Novel Gene Implicated in Plant Stress Tolerance and Use Thereof}
본 발명은 비생물학적 스트레스에 대한 반응에 관여하는 유전자 및 이를 포함하는 식물의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.
고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간에게 뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 단기적 또는 장기적인 물 부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 식물은 스스로 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘을 가동하고 있다(Shinozaki and Yamaguchi-shinozaki, 2007). 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.
고추(Capsicum annum L.)는 감자과에 속하며, 고유의 매운 맛이 있어 널리 재배되고 있는 상업적으로 중요한 작물이다. 본 발명자달은 수분 부족 스트레스에 대한 고추의 반응에 대해 관심을 가져왔으며, 앞선 연구에서 고추에서 탈수에 의해 유도되는 유전자들을 감산 혼성화(subtractive hybridization)와 DD PCR(differential-display PCR) 방법을 이용하여 분리하고 특성을 연구하였다(Park et al., 2003; Hong and Kim, 2005). 이 cDNA들 중에서 Ca -LEAL1(Capsicum annum late embryogenesis - abundant - like protein 1)(Park et al., 2003), Ca - DREBLP1 (Capsicum annum dehydration - responsive element binding-factor-like protein 1) (Hong and Kim, 2005), CaPUB1(Capsicum annum putative U- box protein 1) (Cho et al., 2006a), CaXTHs(Capsicum annum xyloglucan endotransglucosylase / hydrolase homologs)(Cho et al., 2006b), CaRma1H1(Capsicum annum RING member - anchor ubiquitin ligase homolog1) (Lee et al., 2009) 그리고 CaSRP1(Capsicum annum stress related protein 1)(Kim et al., 2010)은 건조 스트레스에 의해서 빠르게 유도되었다. 이들은 아마도 고추에서 건조 스트레스 반응에 대해 기능적으로 양성 또는 음성 조절자일 것이다. 본 발명자들은 앞서 밝힌 cDNA들 외에 CaDSR6 유전자를 발굴하였다. CaDSR6는 그 기능이 아직 밝혀지지 않은 신규 유전자로써, 비생물학적 스트레스와의 관계가 본 발명자들에 의하여 처음으로 규명되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 가뭄 및 고염을 비롯한 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고추의 CaDSR6 유전자의 발현을 증가시킬 경우 상술한 비생물학적 스트레스에 대한 강화된 내성을 수득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포 및 식물체를 재공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 가뭄 및 고염을 비롯한 식물의 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고추의 CaDSR6 유전자의 발현을 증가시킬 경우 상술한 비생물학적 스트레스에 대한 강화된 내성을 수득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 가해준 뒤 유전자 발현 프로파일을 조사한 결과, 대조군에 비해 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 새롭게 밝혀진 고추 유전자의 뉴클레오타이드 서열이며, 이 유전자의 이름은 본 발명자들에 의해 CaDSR6 (Capsicum annum drought stress responsive 6)로 명명되었다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 유전자를 과발현시킨 식물체는 다양한 비생물학적 스트레스가 가해지는 환경에서도 그 생존률이 크게 증가함을 확인하였다.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 내성이 강화되는 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.
본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프로모터는 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 (NOS 3' end) 서열이다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.
본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101이 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 바람직하게는 전기천공법(electroporation)을 사용한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업 계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.
일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진방법을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.
형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 촉진용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조 및 염 스트레스 등의 비생물학적 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 이들 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 CaDSR6이 건조 스트레스에 의하여 상향-조절됨을 보여주는 그림이다. 광조건 하에서 자란 10 일령 고추 유묘에 매일 30-90분 간 건조 환경을 가해준 후 총 RNA를 수득하였다. CaDSR6의 유도 패턴은 RT-PCR을 통하여 조사하였다. CaLEAL1 유전자를 양성 대조군으로 사용하였으며, CaACT 전사체를 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2는 고추 CaDSR6 단백질의 서열 분석 결과를 6가지 CaDSR6 유사체의 다중 배열을 통해 나타낸 그림이다. CaDSR6의 예측 아미노산 서열을 토마토(진뱅크 접근번호 No. AK327753), 포도(진뱅크 접근번호 No. XM_002262861), 캐스터 오일(진뱅크 접근번호 No. XM_002509492), 콩(진뱅크 접근번호 No. BT095143), 벼(진뱅크 접근번호 No. NP_001045217) 및 애기장대(진뱅크 접근번호 No. At3g01860)의 서열과 비교하였다. 10개 중 최소 6개가 일치하는 아미노산 잔기는 어둡게 표시하였다. 10개 단백질 모두에서 보존적인 아미노산 서열은 검은색으로 표시하였다.
도 3은 야생형 및 35S: CaDSR6 형질전환 애기장대의 형태비교 결과에 대한 그림이다. 도 3a는 광조건에서 자란 3일령의 야생형 및 T3 35S: CaDSR6 형질전환 애기장대 유묘의 형태를 정상 성장 조건 하에서 비교한 결과를 나타낸 그림이다. 도 3b는 정상 성장 조건에서 자란 발아 5일 후의 야생형 및 CaDSR6-과발현 유묘의 초기 뿌리생장 형태를 비교한 그림이다.
도 4는 건조 스트레스 후 야생형 및 35S: CaDSR6 형질전환 식물체의 생존률을 나타낸 그림이다. 광조건 하에서 자란 3주령 야생형 및 형질전환 식물체를 물을 주지 않고 6일간 기른 후 다시 물을 주어(re-watering) 3일 후 생존률을 측정하였다. 6일간 건조 스트레스가 가해진 식물이 정상 수분상태로 돌아온 후 계속 성장하는 능력을 생존률로 간주하였다.
도 5는 12일령 야생형 및 CaDSR6-과발현체 유묘를 150 mM NaCl 배지에서 배양한 후 형태를 비교한 결과를 나타낸 그림이다. 관찰 결과, 형질전환 식물체는 야생형에 비해 정상적인 성장을 함으로서 염 스트레스에 내성을 가지는 표현형을 가짐을 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
CaDSR6 유전자의 클로닝 및 분석
수분 스트레스를 처리한 고추의 잎으로부터 제조사의 방법에 따라 λ-uni-Zap II(Stratagene, La- Jolla, CA) cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 CaDSR6의 전장 cDNA를 PCR 증폭하였다. 센스 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위해 T3 프로모터에 대응하는 벡터 특이적 프라이머(표 1)를 사용하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 CaDSR6 cDNA 일부분의 3’말단에 대응하는 서열로부터 디자인하였다(표 1). PCR 시 고충실도의 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며, 어닐링은 52℃에서 30초간, 연장은 68℃에서 1분간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다. PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 도입하였으며, DH5α E.coli에 형질전환 시켰다. 12개의 콜로니 산물에서 얻은 삽입 cDNA를 시퀀싱 반응을 통하여 염기서열을 확인하였다. 확인된 염기서열은 cDNA 1007 bp, 708 bp로 이루어진 CDS를 포함하고 있었다.
CaDSR6 유전자의 발현 분석
건조 스트레스 하에서 CaDSR6의 전사수준 발현을 분석하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다(Seo et al ., 2009). 분석시 사용한 프라이머는 하기의 표 1에 나타냈다. 그 결과, 건조 스트레스를 주는 시간이 늘어날수록, CaDSR6 전사의 발현이 매우 높게 증가하였다. 이는, CaDSR6가 건조 스트레스 관련 신호전달에 관여하는 유전자임을 의미한다.
클로닝 및 형질전환 식물의 제작을 위한 프라이머
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
CaDSR6 cDNA의 클로닝용
T3 프로모터 5’-attaaccctcactaaaggga-3’
CaDSR6 3' UTR 5’-tgtccttcttaatttattaac-3’
AtSRPs ORF의 클로닝, RT-PCR 및 형질전환 식물의 제조
CaDSR6 5’-atgggttcatgtgcttcagtg-3’ 5’-ttagccgacgctatttgca-3’
CaLEAL1 5’-atggatctgattgacaaggc-3’ 5’-tcatatctctacaacctttgatg-3’
CaACT 5’-ttggactctggtgatggtgtg-3’ 5’-aacatggttgagccaccactg-3’
CaDSR6 가 과다발현된 애기장대 형질전환체 제작
CaDSR6을 애기장대에 과다 발현시키기 위해 CaDSR6의 cDNA를 pEG100 운반 벡터(vinary vector)에 재조합하였다. 사용한 프라이머는 상기의 표 1과 같다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스에 형질전환시켰고, 애기장대 형질전환은 플로랄 딥(floral dip) 방법으로 수행했다(Joo et al., 2004). 종자는 0.5 X MS에 Basta가 포함된 배지에서 독립적인 형질전환 개체를 선별하였다.
CaDSR6 가 과다발현된 형질전환체의 표현형 심층분석 결과
0.5 X MS(비타민 B5 포함)와 1% 수크로오즈, 0.8% 아가(select agar; Life Technology, Rockvile, MD, USA)를 포함한 배지의 pH를 5.7로 맞추어 제조한 후, 야생종과 과다발현체의 종자 표면을 소독하여 심었으며 22℃의 광조건에서 키웠다. 라디클이 나오는 것과 뿌리가 생장하는 것을 관찰하기 위해 흡수(imbibition) 후 3일째 될 때를 관찰하였다. 그 결과, 발아나 뿌리 생장에 있어서는 야생종과 CaDSR6 과다발현체와의 차이를 찾을 수 없었다(도 3a 및 3b).
건조 스트레스를 가해준 후의 야생종과 형질전환 애기장대 식물의 생존률 측정
정상 조건에서 자란 3주된 야생종 및 35S: CaDSR6 형질전환 식물에 6일간 물을 주지 않는 방법으로 건조 스트레스를 가했다. 이후 식물들에 다시 물을 주고 3일 후 표현형을 검사하였다. 생존률은 건조 스트레스 후 정상조건으로 돌아왔을 때 성장을 재개하는 능력으로 정의하였다(Cho et al. 2008). 관찰된 생존률은 다음과 같았다(도 4):
야생형, 6.45% (93 개체 중 6); 35S: CaDSR6 #3 형질전환체, 29.03% (93 개체 중 27); 35S: CaDSR6 #4 형질전환체, 58.59% (99 개체 중 58); 35S: CaDSR6 #5 형질전환체, 27.27% (99 개체 중 27).
이와 같이, 야생종에 비해 35S: CaDSR6 형질전환 식물체들이 건조 스트레스에서 월등히 높은 생존율을 보여, 건조 스트레스에 대한 우수한 내성을 가짐을 알 수 있었으며, 이는 CaDSR6가 건조 스트레스의 양성 조절자임을 의미한다.
고염 스트레스를 가해준 후의 야생종과 형질전환 애기장대 식물의 생존률 측정
정상 조건에서 자란 5일된 야생종 및 35S: CaDSR6 형질전환 식물을 150mM의 NaCl이 포함된 고염 배지에서 7일간 키운 후 각 개체들의 뿌리의 길이를 검사하였다. 그 결과 CaDSR6 과다발현체의 경우, 야생종이 자랄 수 없는 고염에서 잘 생장하는 것으로 보아, 고염 스트레스의 내성을 가짐을 알 수 있었다(도 5). 이는 CaDSR6가 고염 스트레스에 대한 양성 조절자임을 의미한다.
참고문헌
1. Seo YS, Kim EY, Kim JH, Kim WT, Enzymatic characterization of class I DAD1-like acylhydrolase members targeted to chloroplast in Arabidopsis. FEBS Lett. 583:2301-2307(2009).
2. Joo S, Park KY and Kim WT, Light Differentially Regulates the Expression of Two Members of the Auxin-induced 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate Synthase Gene Family in Mung Bean (Vigna radiata L.) Seedlings . Planta 218: 976-988(2004).
3. Cho SK, Ryu MY, Song C, Kwak JM, Kim WT, Arabidopsis PUB22 and PUB23 are homologous U-box E3 ubiquitin ligases that play combinatory roles in response to drought stress. Plant Cell 20: 1899-1914(2008).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  4. (a) 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스 또는 염 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진방법.

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