KR101303775B1

KR101303775B1 - 내염 및 내한발성 유전자 ＯｓＳＤＴ１ 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101303775B1
Application number: KR1020110096837A
Authority: KR
Inventors: 김범기; 변명옥; 윤인선; 김둘이; 강현중; 이계윤; 황현식; 김현미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2013-09-09
Also published as: KR20130033033A

Abstract

본 발명은 내염성 및 내한발성 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 비생물적 스트레스 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 염 및 한발 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 내염성 및 내한발성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.

Description

내염 및 내한발성 유전자 ＯｓＳＤＴ１ 및 이의 용도{Salt and drought stress tolerant gene, OsSDT1 and use thereof}

본 발명은 내염성 또는 내한발성 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포 내 수준을 조절하여 식물의 내염성 또는 내한발성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자에 관한 것이다.

농업은 타 산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성이 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물의 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다.

한발은 강수부족으로 수량손실을 야기하거나 일정한 강수기간이 없어 관개수에 의존하여 작물을 재배하는 것으로 한발은 재배기간 중 어느 때라도 발생할 수 있고 지역에 따라서는 연중 발생하기도 한다. 생육초기에는 이앙시점이나 파종이 지연되고 중기에 발생한 한발이 지속되면 개화시기의 지연으로 수량에 치명적인 영향을 미친다. 우리나라는 연 강수량이 1,250 mm 정도로 풍부하지만 7-8월에 편중되어 있어 봄, 가을에는 반 건조성 기후의 성격을 띠고 있다. 따라서 봄, 가을은 상습적으로 한발이 일어나고 때에 따라서는 7-8월에도 강우가 부족하여 한해(旱害)를 입기도 한다.

작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염해지(鹽海地)가 많다. 염해지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부 지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염의 피해를 받는 일이 많다.

식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발 및 염해에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다.

특히, 염해와 한발은 작물의 삼투압에 의한 수분부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자 발현의 변화 등도 야기한다.

현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(1995-2004)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836 천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.

[특허문헌]
한국특허 등록번호 10-0781075, 한국특허 등록번호 10-0861524, 및 한국특허공개번호 10-2011-0029941

이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 염(salt) 및/또는 한발(drought) 저항성 유전자를 이용하여 식물의 이러한 비생물적 스트레스 저항성을 향상시키는 방법, 이러한 유전자를 이용하여 염 및 한발 저항성이 향상된 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 방법으로 제조된 염 및 한발 저항성이 향상된 형질전환 식물을 제공하는데에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 내염성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 내한발성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 내염성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 OsSDT1 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 내한발성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 식물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공한다.

즉, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포내 수준(level)을 증가시켜 식물의 내염성 또는 내한발성을 향상시키는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 식물의 내염성 또는 내한발성을 향상시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 식물에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 내염성 또는 내한발성 식물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터, 및 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 내염성 또는 내한발성이 향상된 형질전환체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(이하, OsSDT1 폴리펩티드도 동일한 의미로 칭한다)에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 염 또는 한발에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 OsSDT1 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsSDT1 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 폴리펩티드과 융합으로 만들어진　융합 폴리펩티드　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편(fragment)으로서 야생형의 OsSDT1 폴리펩티드과 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 OsSDT1 폴리펩티드의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 폴리펩티드의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 기전을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테아제를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

상기 OsSDT1 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 상기 염기 서열은 야생형 폴리펩티드과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 OsSDT1 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 목적 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 목적 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 폴리펩티드 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 목적 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 목적 폴리펩티드의 안정성을 증진하는 방법 또는 폴리펩티드의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 서열번호 2의 폴리펩티드 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포 내 수준 증가는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가를 위해서 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 이를 형질전환함으로써 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "재조합 발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 116,718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터에서, 프로모터는 단자엽 식물용 Maize Ubiquitine promoter이나, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 유전체(genome)을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기, 조건에 목적 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 RD29A 프로모터, SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게, 환경 스트레스 유도성 프로모터, 더 더욱 바람직하게 염 또는 한발 스트레스 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 감자 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

바람직하게, 본 발명이 제공하는 재조합 발현 벡터는 프로모터의 하류에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자의 발현을 가능하게 연결한 것이다.

본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 내염성 및 또는 내한발성이 향상된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서의 형질전환은 당업자에게 공지된 다양한 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한, 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 식물은 콩, 감자, 배추, 무, 고추 등 쌍자엽 식물일 수 있으나, 벼, 밀, 보리, 옥수수 등의 단자엽 식물이 보다 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서 재조합 발현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환되었으며, 벼 캘러스와 재조합 발현 벡터가 아그로박테리움 투메파시엔스를 공동배양하여 형질전환체를 제작하였다.

본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 OsSDT1 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여 이를 벼에 형질전환시켜 OsSDT1의 세포내 발현 수준을 증가시켰다. 그리고 OsSDT1의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과, OsSDT1의 과발현이 염 및 한발에 대한 저항성을 향상시킴을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed)를 제공하여, 식물 종자를 수득하기 위한 재배 방법으로는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 염 및/또는 한발 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 내염성 및/또는 내한발성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 OsSDT1 유전자를 과발현하는 재조합 발현 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 3에 따른 벼 형질전환체의 검정 실험으로 Genomic PCR 이용한 과발현 검정 전기영동 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 벼 형질전환체의 검정 실험으로 RT-PCR을 이용한 과 발현 검정 전기영동 결과이다.
도 4는 염 처리 또는 한발 처리가 형질되기 전의 품종인 동진 벼(흰색 포트의 가운데)와 형질전환체(흰색 포트의 왼쪽 및 오른쪽)의 생육에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 도 4에서 도 4a는 무처리 대조구이며, 도 4b는 한발 처리구의 사진과 한발 처리시 생존 잎 수를 정량화와 수분 상실율의 대표적인 그래프이며, 도 4c는 염 처리구의 사진과 염 처리시 식물체 당 죽은 잎의 비율이다.
도 5는 고 삼투압 스트레스 처리가 본 발명의 형질전환체에 미치는 영향을 평가한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> OsSDT1 과발현 형질전환용 벡터 및 이를 포함한 아그로박테리아의 제작

본 실험에 사용된 벼 품종은 동진벼이며, 멸균된 현미종자는 1/2MS에 1% Sucrose, 그리고 0.4% phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)에서 장일조건으로 2주간 생육 하였다. 이들 식물체로부터 Trizol을 이용하여 전 RNA를 분리 후 역전사 효소를 이용하여 5의 RNA로부터 30의 cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA로부터 A30 유전자의 coding 지역은 Forward primer-CACC ATG GTG GAG GTG GGA GGA GGA G, Reverse primer-CCG GTC GAG GGG CTC GGT를 이용하여 PCR을 통하여 중폭되었다. pENTR/D-Topo kit를 이용하여 PCR 산물로 Entry clone이 제작 되였으며, 유전자의 과발현을 위하여 LR 반응에 의하여　ubiquitin promotor를 가지고 박테리아 마커 유전자로서 테트라사이클린을, 식물체 마커 유전자로서 하이그로마이신을 사용할 수 있는 binary vector인 pGA2897 vector로 cloning 되었다. 시퀀싱을 통해 유전자의 삽입과 프레임이 확인된 pGA2897-OsSDT1은 벼형질전환을 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)-LBA4404(마커로 리팜피신과 스트렙토마이신을 가지는 균주)로 먼저 형질 전환되었다. 100㎕의 아그로박테리움에 pGA2897-OsSDT1 DNA를 2㎕넣은 후 얼음에 둔다. 이를 큐벳에 넣은 후 1.25kV의 전기충격을 가한 직후 YEP배지 1ml을 넣어 15ml 튜브로 옮겨 30℃에서 3시간동안 배양한 한다. 배양액 중 300㎕을 테트라사이클린, 리팜피신, 스트렙토마이신이 들어간 YEP배지에 도말하여 하여 일간 30℃에서 키웠다. 이 중 하나의 콜로니를 선별하여 콜로니PCR을 통하여 유전자 삽입을 확인하고 스탁으로 보관하였다.

실시예 1에서 제조된 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.

<실시예 2> 벼 형질전환체의 제작

벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% ethanol에서 1분간 침지시킨 후 락스를 50% 소독한 용액에서 40분간 소독하였다. 이때 락스 30mL당 10uL Tween 20을 떨어뜨린 것을 사용하는 것이 더 바람직하다.

소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척한다. 소독액이 잘 세척이 되면 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 2N6 배지에 볍씨를 치상하였다. 이때 볍씨는 배지 안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하며 씨눈은 위로 향하도록 한다. 2N6 배지는 문헌에 기재한 배지에 일부 수정된 배지로 만든다 (문헌 [Hiel et al., 1994]). 즉 N6 배지 (Chu et al., Scin Sin(1975) 18:659-668)의 다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4g/L와 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D, 4g/L phytagel이 첨가된 고체 배지(pH5.8)이다. 배양온도는 28℃이며 암처리한다.

2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어야 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다.

아그로박테리움은 목적 유전자가 삽입된 것을 준비하여 AB 고체 배지에 3일간 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 만들었다. 흡광도기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 먼저 OD₅₉₅=0.1이 되도록 만든 후 AAM으로 10배 희석하여 OD₅₉₅=0.01이 되도록 만들었다.

현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분간 침지시켜 아그로박테리움을 접종하며, 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어 주는 것이 바람직하다. 접종이 끝나면 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리며 여과지를 이용하여 여액을 제거하였다. 이 작업은 신속히 진행하며 캘러스가 지나치게 여과지 위에 오래 방치되어 마르지 않도록 주의한다. 캘러스는 2N6-AS 배지에 옮겨서 공동배양하였다. 2N6-AS배지는 2N6 배지에 10g/L glucose와 100uM acetosyringone을 추가하여 만든 배지로 pH5.2로 조정하였다. 배지 위에는 미리 여과지를 한 장씩 깔아놓아서 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 올려놓는다. 여과지는 공동배양 기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일간 암배양 하였다.

공동배양이 끝나면 캘러스에 유용 유전자를 삽입하는 기능을 맡았던 아그로박테리움이 더 이상 필요 없으므로 세척 작업을 통해 제거 한다. 세척은 멸균증류수 1L에 항생제인 carbenicillin을 500mg을 넣은 용액으로 수행하며, 캘러스를 3회 정도 세척한 뒤 여과지를 사용하여 여액까지 모두 제거하였다. 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하는 경우에는 공동배양 기간동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않았기 때문에 위의 세척 작업을 하지 않는 것이 더 바람직하다. 캘러스는 2N6 배지에 항생제인 cefotaxime 200mg/L, Hygromycin 40mg/L가 첨가된 2N6-CH 배지로 옮긴다. 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2-3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양한다. 배양온도는 28℃가 적당하며 암배양기에서 14일간 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다.

14일 후, 항생제인 하이그로마이신이 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하면 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대배양하였다. 형질전환된 캘러스의 구분은 새롭게 분화된 캘러스 덩어리의 유무로 판단하며 갈변되어 죽은 캘러스는 버렸다.

<실시예 3> 벼 형질전환체 검정 및 RT-PCR을 이용한 과발현 검정

형질전환체임을 확인하기 위하여 한 달간 키운 벼를 동결건조시켜 파쇄한 후 이로부터 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 Genomic DNA를 분리하였다. Genomic DNA를 이용하여 다음의 하이그로마이신 유전자 프라이머 Forward primer-ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC GCG, Reverse primer- CTA TTC CTT TGC CCT CGG ACG AGT로 PCR을 통해 OsSDT1유전자와 함께 삽입된 하이그로마이신 유전자의 삽입을 확인함으로써 OsSDT1 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. 또한, 확인된 벼 형질전환체의 total RNA를 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하였고 이 RNA로부터 SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 다음의 OsSDT 유전자 프라이머 Forward primer- CCG TCC ACC TGG TTT GGT CT, Reverse primer- GGC TCG GTT TGG TCC TTG AC와 인터널 컨트롤로서 액틴 유전자 프라이머 Forward primer- TGC TCT GTA CGT CGC CAT CCA G, Reverse primer AAT GAG TAA CCA CGC TCC GTC A로 RT-PCR를 통해 OsSDT1 유전자의 과 발현을 확인하였다. 벼 형질전환체 검정 및 RT-PCR을 이용한 과발현 검정 결과를 각각 도 2 및 3에 나타내었다.

<실시예 4> 내한발성 및 내염성 평가

과발현 형질전환체의 내한발성 검정을 위하여 4주간 온실에서 생육한 벼에 4일간 물 공급을 중단 후 급수를 재개 후 3주 후의 식물체 생육을 검사하였으며, 과발현 형질전환체의 내염성 검정을 위하여 4주간 온실에서 생육한 벼에 250mM NaCl로 처리하여 8일 후의 식물체 생육을 검정하였다. 그 결과를 도 4에 종합적으로 나타내었다.

도 4에 나타나는 바와 같이, 한발 조건 및 고염 조건 하에서 과발현체의 생육이 대조구인 동진 벼에 비하여 양호하거나 높은 생존율을 나타내었다. water loss assay는 하이그로마이신 배지에서 선별된 벼 종자들을 토양으로 옮겨 5주간 키운 후 각 과발현체에서 가장 상위의 잎을 잘라 여과지에 놓고 30분 간격으로 7시간 동안 수분 상실률을 소수점 넷째자리 까지 측정하였다. 그래프는 초기 무게에 대한 수분 상실률을 백분율로 표시하였다. 염 처리는 하이그로마이신 배지에서 선별된 형질 전환체들을 대조군인 동진 벼와 함께 흰 사각 포트에 있는 토양으로 옮겨 4주간 키운 후 250mM의 염을 8일간 처리 하였다. 그 후 형질전환체 각각에 대해 하나의 개체에 있는 잎 수에 대한 죽은 잎의 수를 조사함으로서 그래프를 나타내었다. droght 처리 또한 염처리와 같은 방법으로 벼를 키운 후 이를 4일간 가뭄 처리 하였고 다시 물을 주고 23일간 키워 생존한 잎의 수를 조사함으로서 그래프를 나타내었다.

<실시예 5> 고삼투 저항성의 평가

3일간 1/2 MS에서 발아시킨 벼를 고 삼투압 스트레스 처리를 위하여 400mM mannitol이 첨가된 1/2MS media로 옮긴 후 7일간 후 생육 상태를 관찰하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타나는 바와 같이, 동진은 shoot 부위가 죽어가는 것을 볼 수 있으나, 본 발명에 따른 과발현 형질전환체에서는 이러한 모습이 발견되지 않았다. 또한, 고 삼투압 배지에서 과발현 형질전환체의 생육이 증가하는 현상은 보이지 않고, 오히려 억제되는 현상을 보였다.

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서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체의 내염성 또는 내한발성을 향상시키는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체에 형질전환하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것에 특징이 있는 방법.
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제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 벼에 형질전환하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 내염성 또는 내한발성 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체 제조방법.
프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터.
제 9항의 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 내염성 또는 내한발성이 향상된 형질전환된 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체.
제 10항의 형질전환된 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체에서 수득한 벼, 밀, 보리, 및 옥수수로 이뤄진 1군의 식물체 중에서 선택된 1이상의 식물체 종자(seed).