KR101642795B1 - 염 스트레스 내성을 가지는 벼 유래 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내염성을 증가시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsEXPA7 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 내염성이 증가하므로, 이를 이용하면 간척지 및 염 피해지에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

염 스트레스 내성을 가지는 벼 유래 유전자 및 이의 용도{Gene increasing tolerance to salt stress derived from Oryza sativa and uses thereof}

본 발명은 내염성을 증가시키는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법, 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물에 관한 것이다.

토양 내의 높은 농도의 염은 벼 종자 발아, 생장, 수량 등에 부정적인 영향을 끼친다. 세계 경작지의 6% 이상이 염에 의한 피해를 보고 있으며, 벼는 곡물 중 가장 염해에 취약한 작물이다(Munns and Tester, Annu Rev Plant Biol 59, 651-681, 2008). 이러한 염에 열악한 토양에서 생존과 생장이 증진된 벼를 생산하기 위해 식물의 염해 저항성 유전자의 발굴 및 개발이 절실히 요구된다.

익스펜신(Expansin)은 식물 고유의 세포벽 단백질로서 식물 세포벽을 느슨하게 함으로써, 식물 세포가 신장하도록 유도하여 식물의 생장에 있어서 반드시

필요한 단백질이며(Cosgrove, D. J., Nature 407, 321-326, 2000), 단백질의 구조에 따라 EXPA, EXPB, EXLA 및 EXLB의 4개의 아과(subfamily)로 나뉜다(Choi, D., Plant Physiol 126, 511-518, 2006; Kende, H., Plant Mol Biol 55, 311-314, 2004). 세포벽의 물리적 성질에 변화를 줌으로써, 식물 생장과 발달 전반에 걸쳐 영향을 주며, 특히 벼의 일종인 부도(deepwater rice)에서 익스펜신 유전자가 절간의 생장과 깊이 관련되어 있다는 사실이 밝혀지면서 익스펜신이 식물 생장을 직접적으로 유도하는 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Lee, Y., Curr Opin Plant Biol 4, 527-532, 2001; Lee, Y., Plant Physiol 130, 1396-1405, 2002). 또한, 익스펜신은 뿌리의 생장과 발달에도 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있으며, 애기장대의 익스펜신 유전자 중 AtEXPA7과 AtEXPA18의 발현이 뿌리털 형성과 밀접하게 연관되어 있다는 것이 확인된 바 있다(Cho, H. T., Plant Cell 14, 3237-3253, 2002). 아울러, 대두 유식물체의 뿌리를 사용한 실험에서는 오직 뿌리의 생장 부위에서만 익스펜신 유전자가 강하게 발현된다는 것이 확인되었으며(Lee, D. K., Plant Physiol 131, 985-997, 2003), 토마토, 벼, 바나나 같이 다양한 식물 종에서 익스펜신은 세포벽의 연화 과정에 영향을 미치거나, 열매가 발달하는 동안 열매의 크기가 증가하는데 중요한 역할을 하기도 한다(Anjanasree, K. N., J Plant Biochem Biotechnol 12, 31-35, 2003; Cho, H. T., Plant Physiol 113, 1137-1143, 1997; Cho, H. T., Plant Physiol 113, 1145-1151, 1997; Cho, H. T.,Plant Cell 9, 1661-1671, 1997; Hiwasa, K., Plant Physiol 117, 564-572, 2003; Rose, J. K. C., Proc Natl Acad Sci USA 94, 5955-5960, 1997).

최근에는 세포의 팽창(expansion), 열매 조직의 연화(softening), 탈리(abscission), 발아, 스트레스 반응 및 기생 관계(parasitism) 등의 다양한 생리 및 생태적 현상에 있어서 익스펜신의 기능에 대한 연구가 수행되고 있으며, 일련의 연구 결과에 따르면 익스펜신의 활성이 호르몬 작용에 의하여 영향을 받는 것으로 나타났다(Cho, H. T., Plant Hormones 3 rd edn, 262-281, 2004). 이와 같이 익스펜신은 식물의 생장과 분화에 필요한 세포벽의 변화를 유도하는 중요한 요소라고 할 수 있으며, 더욱이, 익스펜신이 염분을 비롯한 각종 스트레스 반응에 밀접하게 관련되어 있다는 연구 결과들이 보고됨에 따라 그 관심이 급증되고 있는 실정이다(Gao, X., Russ . J Plant Physiol 57, 241-246, 2010).

그러나, 현재까지 익스펜신 과다발현 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용한 스트레스 실험에서 염분 스트레스를 처리한 곳에서의 유식물의 크기와 야생형의 유식물의 크기가 차이가 없는 것이 확인된 결과와(Muhling, K. H., Plant Physiol 159, 137-146, 2002), 내염성 옥수수(Zea mays L.)를 이용한 연구에서 염분 농도에 따른 옥수수 익스펜신 단백질의 발현 양상을 분석한 결과, 염분 처리구와 대조구에서 모두 익스펜신이 발현될 뿐만 아니라 내염성 옥수수에서 야생형 옥수수보다 더 많은 양의 익스펜신이 발현된다는 사실이 보고된 결과(Pitann, B., J Plant Nutr Soil Sci 172, 75-77, 2009), 그리고 염생식물 중에서 칠면초(Suaeda japonica)를 재료로 익스펜신 유전자를 분리하여 특성을 밝히고, 토양환경의 염분 농도에 따른 생장 정도와 익스펜신 유전자 발현 양상과의 연관성을 보고한 결과들만 개시되어 있을 뿐(Soong-Taek Hwang, Journal of Life Science 23(2), 182-189, 2013), 본 발명에서와 같이, 경제적으로 가장 중요한 식량작물 중 하나인 벼로부터 식물의 내염성을 증가시키는 익스펜신 유전자, OsEXPA7 유전자에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 환경 스트레스 내성, 특히 염 스트레스 내성을 가지는 생육 및 발달이 조절된 신기능성 작물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 제조합 벡터를 형질전환시킨 벼 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 벼 식물체가 염 스트레스 처리시 야생형 식물체보다 내염성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 염 스트레스 내성을 가지는 작물을 개발하기 위하여, 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법, 상기 유전자를 이용하여 염 저항성이 향상된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7)"은 벼 유래의 α-익스펜신(expansin) 아과(subfamily)에 속하는 유전자로, 익스펜신은 식물 고유의 세포벽 단백질로서 식물 세포벽을 느슨하게 함으로써, 식물 세포가 신장하도록 유도하여 식물의 생장에 있어서 반드시 필요한 단백질이다. 또한, 익스펜신은 뿌리의 생장과 발달에도 직접적으로 관여하는 것으로도 알려져 있으며, 최근에는 애기장대 유래의 AtEXPA1 유전자, 옥수수 유래의 ZmEXPA1 유전자 및 염생식물인 칠면초 유래의 SjEXPA1, SjEXPA2 및 SjEXPA3 등의 익스펜신 유전자가 염 스트레스 반응과 밀접하게 관련되어 있음이 보고된 바 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 벼 유래 OsEXPA7 유전자는 염 스트레스 하에서 강하게 발현하고(도 3), 상기 유전자가 도입된 OsEXPA7 과발현 형질전환체의 종자 및 형질전환 벼 식물체의 내염성이 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7).

본 발명에서 용어 "야생형"이란 본 발명의 벼 유래 OsEXPA7 유전자를 포함하는 형질전환 식물체에 대한 대조구를 의미한다. 구체적으로 상기 식물체는 벼이며, 이 기술분야에 알려진 벼의 모든 품종을 포함한다. 더욱 구체적으로 상기 벼 식물체는 동진벼 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 용어 "식물체"란 식물이 지닌 유형의 몸으로, 식물의 전체, 식물의 일부, 종자 또는 식물 세포를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "내염성(salt tolerance)"이란 식물이 높은 염분환경에 견디어 생육할 수 있는 성질로, 토양의 높은 염농도에 대한 식물의 저항성을 의미한다.

본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsEXPA7 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsEXPA7 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 내염성을 증가시키는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자 도입에 의해 형질전환된 식물의 내염성이 증가되는 것을 의미한다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법 (microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "형질전환체"란 본 발명의 염 스트레스 내성을 가지는 벼 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 의미한다.

상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 사용하였다(실시예 3-2).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일실시예에 따른 방법에서, 상기 OsEXPA7 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 일실시예에 따른 방법에서, 상기 OsEXPA7 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼(Oryza sativa) 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과(Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과(Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae) 또는 난초과(Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 내염성을 증가시킬 수 있는 것이다.

본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsEXPA7 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 내염성이 증가하므로, 이를 이용하면 간척지 및 염 피해지에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 OsEXPA7 유전자의 염기 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 As/Ds 벼 삽입 돌연변이 계통을 대상으로 선발된 내염성 변이체의 Ds 삽입 여부를 확인한 PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 방법을 이용하여, 염(0.7% NaCl) 처리에 따른 벼 뿌리에서의 OsEXPA7 유전자의 발현 정도를 시간(0, 1, 5, 12 및 24시간)에 따라 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 5는 RT-PCR 방법을 이용하여, 본 발명의 OsEXPA7 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체의 OsEXPA7 유전자 발현 정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다. 이때, WT는 원품종인 야생형 동진벼이며, Lane 1 내지 5는 OsEXPA7 유전자가 도입되어 상기 유전자가 과발현되도록 형질전환된 벼이다.
도 6은 NaCl 농도(150 mM NaCl, 200 mM NaCl)에 따른, 본 발명의 OsEXPA7 유전자 도입 과발현 형질전환체의 내염성을 검정한 사진이다.
도 7은 본 발명의 OsEXPA7 과발현 형질전환 벼를 이용한 염(200 mM NaCl) 저항성 생물 검정 결과를 나타낸 사진이다. 구체적으로, (A)는 무처리 대조군, 즉 염처리 직전의 묘목 3주째(seedling 3 weeks)의 원품종인 야생형 동진벼(wild-type, WT)와 OsEXPA7 과발현 형질전환 벼 식물체(transgenic rice plants, OX)를 나타낸 사진이며, (B)는 염 스트레스 처리 초반의 실험군, 즉 5일간 염처리 후 일반수(water)에서 1일째의 WT과 OX를, (C)는 염 스트레스 처리 후반의 실험군, 즉 5일간 염처리 후 일반수에서 20일째의 WT과 OX를 나타낸 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Ac / Ds 벼 삽입 돌연변이 계통 분석 및 염 스트레스 내성 유전자 OsEXPA7 선발

토양 내의 높은 농도의 염은 벼 종자 발아, 생장, 수량 등에 부정적인 영향을 끼친다. 이에, 염 스트레스 내성을 가지는 유전자를 선발하기 위하여, 국립농업과학원과 경상대의 공동연구를 통하여 사전에 구축하여 둔, 옥수수 유래 Ac / Ds 전이인자를 벼에 형질전환하여 얻어진 Ac / Ds 벼 삽입 돌연변이 계통을 이용하였다.

구체적으로, 총 20,000여점의 Ac / Ds 벼 변이계통(Ds20,000~Ds40,000)을 대상으로 0.7%의 염(NaCl)을 처리하고, 2주간 생육하여 총 71개체의 내염성 변이체를 선발하였다. 상기 선발된 71개체의 내염성 변이체의 Ds 삽입여부를 확인하기 위하여, Ac 프라이머(primer) 세트(AC1543a: 5'-TTCTTGGTGAAATGCTGCCATAC-3'(서열번호 2)와 AC1031: 5'-ATAAGATTGGCCAAGTTGATGTC-3'(서열번호3))를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR의 온도 조건은 94℃에서 1분간 변성시킨 다음, 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 과정으로 25회(25 cycles) 반복 수행 후, 최종적으로 72℃에서 3분간 반응시켰다. PCR 분석 결과, 총 68개체의 변이체에서 Ds 삽입이 확인되었다(도 2).

상기 Ds 삽입이 확인된 68개체의 변이체는 GGBio사에 의뢰하여 Adaptor-PCR 기법을 통한 FST(flanking sequence tag) 유전자 분석을 실시하였다. 내염성 선발 변이체에 대한 FST분석 결과, 68개체의 변이체 중 유전자 내로 Ds 삽입이 확인된 14개의 변이체를 최종 선발하고, 상기 최종 선발된 14개의 Ds 변이체별 유전자를 동정하여 염반응에 대한 발현 양상을 분석하였다. 분석 결과, 14개의 유전자 중에서 6개의 유전자가 0.7%의 염(NaCl) 처리 벼에서 발현이 증가하는 양상을 나타내었다.

상기 염처리에 의해 발현이 증가하는 6개의 유전자 중, 특히 Ds31013 변이체에서 염에 대한 강한 반응성을 보이는 유전자를 선발하고 염기서열을 분석해 본 결과, 익스펜신 수퍼패밀리(expansin superfamily) 유전자들 중 알파-익스펜신 7(α-expansin 7) 유전자임을 확인할 수 있었다.

또한, 추가적으로 Southern 분석과 FST(flanking sequence tag) 분석에 의한, 상기 Ds31013 변이체 계통의 부위 해석 결과, OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자(NCBI의 database Genbank accession No. KJ018634)를 확인하고, 이를 내염성 작물 개발을 위한 내염성 관련 후보 유전자로 최종 선발하였다(서열번호 1 및 도 1).

실시예 2: OsEXPA7 유전자의 발현 분석

상기 실시예 1에서 선발한 OsEXPA7 유전자가 내재되어 있는 변이체 Ds31013의 염에 대한 발현 양상을 확인하기 위하여, 상기 변이체 벼의 뿌리에 0.7%의 염(NaCl)을 처리한 염 스트레스 하에서, 각각 0, 1, 5, 12 및 24시간별로 상기 변이체 Ds31013에 내재되어 있는 OsEXPA7 유전자의 발현 정도를 RT-PCR을 수행하여 분석하였다. 이때, RT-PCR의 온도 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초의 과정으로 30회(30 cycles) 반복 수행 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.

구체적으로, 변이체 Ds31013 벼 시료로부터 Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 이용하여 RNA를 추출하고, 추출한 3 ㎍의 RNA는 MMLV reverse transcriptase(RNaseH free; Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성하고, RT-PCR을 수행하여 변이체 Ds31013에 내재되어 있는 OsEXPA7 유전자의 발현 정도를 분석하였다. 이때, RT-PCR에 사용한 프라이머 세트는 변이체 Ds31013 유전자의 코딩(coding) 부분 중 2개의 프라이머(Ds31013 5': 5'-ACGGCGCTGTTCAACTCCGG-3'(서열번호 4), Ds31013 3': TCAGACCCGGAAGTTCTTGCCC-3'(서열번호 5))를 합성하여 사용하였다.

RT-PCR을 수행하여, 염 스트레스 하에서 변이체 Ds31013에 내재되어 있는 OsEXPA7 유전자의 발현 정도를 분석해 본 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0.7%의 염(NaCl) 처리 후, 1, 5, 및 12시간 경과 시에 벼 유래 OsEXPA7 유전자가 강하게 발현됨을 확인하였으며, 24시간 경과 후에는 발현되지 않는 자극 유도성 유전자임을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, Ac/Ds 벼 삽입 돌연변이 계통에서 선발된 벼 유래 OsEXPA7 유전자가 염 스트레스 하에서 강하게 발현되는 내염성 관련 유전자임을 알 수 있었다.

실시예 3: 식물 형질전환용 OsEXPA7 과발현 벡터 및 형질전환체 제작

염 스트레스 내성을 지닌 형질전환 벼를 제조하기 위하여, 상기 실시예 2에서 내염성 관련 유전자로 확인된 OsEXPA7 유전자 과발현 벡터를 제작하고, 벼에 상기 벡터를 삽입하여 내염성 형질전환 벼를 제작하였다.

실시예 3-1: 식물 형질전환용 OsEXPA7 과발현 벡터 제작

벼 유래 OsEXPA7 유전자의 과발현 벡터 제작을 위해, 도 4에 나타난 바와 같이, PGD(Phosphogluconate dehydrogenase) 프로모터를 이용하였으며, 항생제 저항성 마커로는 PPT(Phosphinothricin) 저항성 유전자를 사용하여 OsEXPA7 과발현 벡터를 제작하였다.

실시예 3-2: 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens ) 형질전환체 제작

상기 실시예 3-1에서 제작된 PGD 프로모터에 융합된 OsEXPA7 유전자의 형질전환용 벡터를 아그로박테리움 투메페시안스 GV3101에 도입하기 위하여, 열충격(heat shock) 방법을 사용하여 형질전환하였다. 구체적으로, 실시예 3-1에서 제작한 식물 형질전환용 벡터를 아그로박테리움 투메페시안스 GV3101와 함께 섞어준 뒤 동결과 해동(freeze and thaw)을 2 내지 3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock) 방법에 의해 형질전환한 후 스펙티노마이신(spectinomycin) 항생제 50 mg/L이 포함된 YEP 배지(Difco, frarie, USA)에서 배양하여 콜로니를 확인하였다.

실시예 4: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작 및 분석

실시예 4-1: 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환체 제작

동진벼로부터 유기된 캘루스(callus)는 상기 실시예 3-2에서 제작한 OsEXPA7 유전자 과발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 GV3101과의 동조배양을 통해 형질전환하였으며, 형질전환 후, 항생제 PPT(phosphinothricin, 포스피노트리신)가 포함된 MS 배지에서 형질전환체를 선발하고, 최종적으로 상기 선발된 형질전환체를 온실에서 생육하여 형질전환 된 벼를 제조하였다.

실시예 4-2: OsEXPA7 유전자 삽입 벼 형질전환체 분석

상기 실시예 4-1에서 OsEXPA7 유전자 과발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 제작한 형질전환 벼에, OsEXPA7 유전자 과발현 벡터가 제대로 삽입되었는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1에서 제작한 OsEXPA7 유전자가 도입된 벼 형질전환체의 RNA를 Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 이용하여 추출한 후, MMLV reverse transcriptase(RNaseH free; Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성하고, RT-PCR을 수행하여 OsEXPA7 유전자의 발현 정도를 분석하였다. 이때, OsEXPA7 유전자를 증폭하기 위한, 프라이머는 정방향 프라이머(OsEXPA7 -Forward: 5'-TCTAGATCGCAACTCACAATGTCG-3'(서열번호 6))와 역방향 프라이머(OsEXPA7 -Reverse: 5'-GAGCTCTCAGACCCGGAAGTTCTTG-3'(서열번호 7))를 이용하였으며, RT-PCR의 온도 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초의 과정으로 30회(30 cycles) 반복 수행 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.

RT-PCR 수행 후, 증폭된 PCR 산물의 밴드를 확인해 본 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, OsEXPA7 유전자 삽입 벼 형질전환체가 원품종인 야생형(wild type, WT) 동진벼에 비해 OsEXPA7 유전자가 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통하여, OsEXPA7 유전자 과발현 벡터가 도입된 아그로박테리움 형질전환체를 이용하여 생산한 형질전환 벼에, OsEXPA7 유전자 과발현 벡터가 제대로 삽입되었음을 알 수 있었다.

실시예 5: OsEXPA7 형질전환 벼식물체를 이용한 염 스트레스 저항성 검정

실시예 5-1: in vitro 상에서의 염 스트레스 저항성 검정

염 스트레스 환경 하에서, OsEXPA7 유전자가 과발현된 벼 형질전환체의 종자 발아력을 알아보고자, OsEXPA7 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체의 종자를 이용하여 in vitro 상에서 내염성을 검정하였다.

구체적으로, 150 mM과 200 mM의 염(NaCl)이 포함된 MS배지에서 OsEXPA7 유전자 도입 과발현 형질전환체의 종자를 2주간 배양하여 내염성을 검정하였다. 이때, 대조구로는 원품종인 야생형(wild type) 동진벼를 사용하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 150 mM과 200 mM의 염(NaCl)이 포함된 MS배지에서 배양된 OsEXPA7 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체(transgenic rice)의 발아 종자의 뿌리 및 줄기 신장이 대조구에 비해 증진됨을 확인하였고, 이를 통해 OsEXPA7 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체가 염 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 5-2: OsEXPA7 유전자 과발현 벼 형질전환체 유묘의 염 스트레스 저항성 검정

OsEXPA7 유전자가 과발현된 벼 형질전환체를 이용하여 염 처리시에 나타날 수 있는 생리적인 반응을 분석하기 위하여, OsEXPA7 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체의 유묘를 이용하여 내염성 생물검정을 하였다.

구체적으로, OsEXPA7 도입 과발현 벼 형질전환체와 대조구로 사용한 원품종인 야생형(wild type) 동진벼의 종자를 4각 포트에 파종한 후, 온실에서 3주간 배양하였다(도 7의 A). 배양 3주 후, 염 저항성 검정을 위해 상기 벼 형질전환체와 대조구 식물체의 유묘를 200 mM의 염(NaCl)이 포함된 물에서 5일간 배양하고, 5일 후 일반수(water)로 옮겨 지속적으로 배양하면서 OsEXPA7 유전자 과발현 벼 형질전환체와 대조구 식물체의 염 저항성을 비교하였다.

그 결과, 도 7의 B에 나타난 바와 같이, 일반수로 옮겨 배양한 1일째에는 OsEXPA7 유전자 과발현 벼 형질전환체와 대조구 식물체의 성장에서 있어서 큰 차이를 나타내지 않은 반면, 5일째부터 상기 벼 형질전환체는 염 저항성을 보이기 시작하였으며, 도 7의 C에 나타난 바와 같이, 20일 경과 후에는 OsEXPA7 유전자 과발현 벼 형질전환체와 대조구 식물체의 성장에 있어서 두드러진 차이를 나타내었다. 이를 통하여, OsEXPA7 유전자 도입 과발현 벼 형질전환체가 대조구 식물체에 비해 확연한 염 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

이러한 일련의 결과들을 통하여, 벼 유래 OsEXPA7(Oryza sative α-expansin 7) 유전자가 도입된 OsEXPA7 과발현 형질전환체의 종자 및 벼 식물체의 성장이 대조구에 비해 증진됨을 확인함으로써, 상기 벼 유래 OsEXPA7 유전자가 염 스트레스 내성을 가진 유전자임을 알 수 있었으며, 염 피해에 대한 강한 염내성을 지닌 식물 생산에 적용할 수 있음을 알 수 있다.

RB: right T-DNA border
XhoI: XhoI restriction enzyme
PGD promoter: phosphogluconate dehydrogenase(PGD) promoter
XHoI XbaI: XHoI/XbaI digestion fragment
OsEXPA7: Oryza sativa α-expansin 7 gene
T35S: Cauliflower Mosaic Virus(CaMV) 35S terminator
P35S: Cauliflower Mosaic Virus(CaMV) 35S promotor
bar: phosphinothricin acetyltransferase gene
3' nos: 3' nopaline synthase
LB: left T-DNA border

<110> Republic of Korea <120> Gene increasing tolerance to salt stress derived from Oryza sativa and uses thereof <130> P14R12D1360 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 830 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsEXPA7 gene sequence <400> 1 actagtctcg agtctagatc gcactcacaa tgtcgccggc gccgcgggtg ttggtgttgg 60 tggtggccac agtggtggcg ctgcaggtgt cgccggcggc ggggcggatc ccgggggcgt 120 acgggggcgg ggagtggcag agcgcgcacg caacgttcta cgggggcagc gacgcgtcag 180 ggacgatggg cggggcgtgc gggtacggga acctgtacag ccaggggtac ggggtgaaca 240 acgcggcgct gagcacggcg ctgttcaact ccgggcagag ctgcggcgcg tgcttcgaga 300 tcaagtgcgt gaaccagccc gggtgggagt ggtgccaccc ggggagcccc tccatcctca 360 tcaccgccac caacttctgc ccgcccaact acgccctccc ctccgacaac ggcggctggt 420 gcaaccctcc tcgcccccac ttcgacctcg ccatgcccat gttcctccac atcgccgagt 480 accgcgccgg catcgtcccc gtctcctacc gccgggtgcc gtgcaggaag aagggagggg 540 ttcggttcac gataaacggg ttcaggtact tcaacctggt gctgatcacg aacgtggccg 600 gggccgggga catcgtgagg gcgagcgtga aggggacgag caccgggtgg atgcccatgt 660 cgcggaactg gggccagaac tggcagtcca actccgtcct cgtcggccag gcgctctcgt 720 tccgcgtcac cggcagcgac cgccgcacct ccacatcctg gaacgccgca cccgccggat 780 ggcacttcgg ccagaccttc gagggcaaga acttccgggt ctgagagctc 830 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AC1543a <400> 2 ttcttggtga aatgctgcca tac 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AC1031 <400> 3 ataagattgg ccaagttgat gtc 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ds31013 5' <400> 4 acggcgctgt tcaactccgg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ds31013 3' <400> 5 tcagacccgg aagttcttgc cc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsEXPA7-Forward <400> 6 tctagatcgc aactcacaat gtcg 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsEXPA7-Reverse <400> 7 gagctctcag acccggaagt tcttg 25

Claims (9)

1. 서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa α-expansin 7) 유전자를 포함하는, 식물의 내염성을 증가시키는 재조합 벡터.
   
2. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 내염성을 증가시키는 형질전환체.
   
3. 서열번호 1로 표시되는 벼(Oryza sativa) 유래의 OsEXPA7(Oryza sativa -expansin 7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 내염성을 증가시키는 방법.
   
4. 서열번호 1로 표시되는 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 내염성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
   
5. 제4항의 방법에 의해 제조된 내염성이 증가된 형질전환 식물체.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것인 형질전환 식물체.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼(Oryza sativa)인 것인 형질전환 식물체.
   
8. 제5항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
   
9. 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 벼 유래의 OsEXPA7 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 내염성 증진용 조성물.

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