WO2018080031A1 - 차축조 유래의 ＣｈＥＸＰ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

차축조 유래의 ＣｈＥＸＰ 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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WO2018080031A1
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chexp
chara
coralina
plant
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최상봉
박수현
김형세
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명지대학교 산학협력단
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)

Definitions

  • the present invention relates to ChEXP genes derived from axons and their use.
  • ChEXP ChEXP is a protein that breaks down the hydrogen bonds of polymers, the fibrous constituents of cell walls, to loosen the cell walls, and was first isolated from cucumber hypocotyl under acidic conditions. This protein reversibly decomposes hydrogen bonds between polysaccharides that make up the microfibril of the cell wall in cucumber hypocotyl, and is active in the cotyledons of oats, where the growth is active, and cucumbers, Arabidopsis, soybeans, rice, corn, etc. It was found by sequencing of cDNA that is common to monocotyledonous and dicotyledonous plants and very similar in structure (Shcherban et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 9245-9249).
  • Expansin is composed of 225-300 amino acids, and phylogenetic analysis based on amino acid sequence and motif is divided into four groups (EXPA, EXPB, EXPLA, EXPLB), but the flexibility found in plants or non-plant organisms It is divided into five groups, including one lower group (EXLX).
  • expandin In addition to cell expansion, expandin is involved in cell division, morphogenesis, and environmental changes. It is involved in various traits such as plant morphology, fruit maturation, pollen maturation and pollen elongation, root growth, root hair differentiation, salinity resistance, drought resistance, and yield increase.
  • Expansin proteins (EXPA, EXPB, EXLA, EXLAB) based on genomic data vary depending on the species and evolution of the plant, and Arabidopsis thaliana ) 35, rice ( Oryza sativa ) 33, poplar ( Populus trichocarpa ) 55, apple ( Malus ⁇ domestica ) 60, Amborella trichopoda 22, Buddha ( Selaginella moellendorffii ) 19 were reported, 23 moss ( Physcomitrella patens ). Among the genes encoding them, the most studied is the function related to interstem elongation of stems in freshwater conditions.
  • Korean Patent No. 1674995 describes a rice-derived gene having a salt stress resistance and use thereof
  • Korean Patent No. 077670 describes a cDNA of sweet potato-derived pancin gene and a high productivity transgenic plant using the same.
  • ChEXP gene derived from the axle and its use is not known at all.
  • the present invention is derived from the above-mentioned demands.
  • the cloning of ChEXP cDNA is performed to identify the function of the expandin protein (ChEXP) of Chara coralina , an algae that grows in freshwater conditions similar to freshwater rice.
  • ChEXP ChEXP cDNA transformed Arabidopsis plants by Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens) with an expression vector for gene transfer, was prepared the extreme paensin protein (ChEXP) transgenic Arabidopsis plants, Absecon seusan ( ABA) and salt treatment conditions, it was confirmed that the seed germination of the above-explained transgenic Arabidopsis plant (ChEXP) over the non-transformant.
  • ChEXP extreme paensin protein
  • the present invention is ChEXP gene plant crops with a spore plants JAERI relation to the length of cell cloning, Extensible paensin gene (ChEXP) of the primary construction of up to about 3 cm, and using the plant the expression of ChEXP gene control
  • ChEXP Extensible paensin gene
  • the present invention is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, axle ( Chara Chalph from Charina ( Chara) coralina Expansin) protein.
  • the present invention also provides a gene encoding the protein.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention increases the seed germination efficiency compared to the non-transformant under the environmental stress conditions of the plant comprising the step of transforming the plant cells with the recombinant vector overexpressing the gene encoding ChEXP ( Chara coralina Expansin) protein It provides a method to make.
  • ChEXP Chara coralina Expansin
  • the present invention is a method for producing a transformed plant with the seed germination efficiency is increased compared to the non-transformant under environmental stress conditions comprising the step of transforming plant cells with the recombinant vector and the environmental stress produced by the method It provides a transgenic plant with increased seed germination efficiency compared to the non-transformant under the conditions.
  • the present invention also provides a transformed seed of the plant.
  • the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, ChEXP ( Chara ) derived from Chara coralina coralina Expansin) provides a composition for increasing germination efficiency of seeds under environmental stress conditions of plants, including a gene encoding a protein as an active ingredient.
  • the present invention relates to ChEXP ( Chara) of axle, a lower-level organism of land plants. coralina Expansin) protein was found to increase seed germination efficiency under environmental stress conditions of plants.
  • ChEXP Chara
  • coralina Expansin coralina Expansin protein was found to increase seed germination efficiency under environmental stress conditions of plants.
  • 1 is an axle ( Chara) coralina ) shows the sequence of the expansion of the expansion cDNA gene ( ChEXP- CDS).
  • Figure 2 shows the structure of a binary vector made by cloning the vector (pB2GW7) in order to transform the axon-derived expandin cDNA gene ( ChEXP- CDS) to Arabidopsis.
  • FIG. 3 shows that seed of Arabidopsis transformant (ChEXP OX) into which the axon-derived pancinin cDNA gene was inserted was promoted to germination more than non-transgenic wild species (Col-0) in a medium containing 10 ⁇ M of ABA.
  • AEXPA2 OX is an overexpressed expandin protein derived from Arabidopsis.
  • FIG. 4 shows that seed of Arabidopsis transformant (ChEXP OX) into which the axon-derived pancinin cDNA gene was inserted was promoted to germination more than non-transgenic wild species (Col-0) in a medium containing 200 ⁇ M of NaCl. .
  • AEXPA2 OX is an overexpressed expandin protein derived from Arabidopsis.
  • the present invention consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, Chara Chalph from Charina ( Chara) coralina Expansin) protein.
  • ChEXP proteins includes proteins having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and functional equivalents of the proteins.
  • “Functional equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of the amino acid Is 95% or more of sequence homology, and refers to a protein that exhibits substantially homogeneous physiological activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • substantially homogeneous physiological activity is meant the property of increasing seed germination efficiency compared to nontransformers under environmental stress conditions of plants.
  • the present invention also provides a gene encoding the ChEXP protein.
  • the gene encoding the ChEXP protein according to the present invention may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene has a base sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the ChEXP protein.
  • recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • the gene sequence encoding the ChEXP protein may be inserted into a recombinant expression vector.
  • recombinant expression vector means a bacterial plasmid, phage, yeast plasmid, plant cell virus, mammalian cell virus, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize in the host.
  • An important feature of the expression vector is that it has an origin of replication, a promoter, a marker gene and a translation control element.
  • Expression vectors comprising gene sequences encoding ChEXP proteins and appropriate transcriptional / translational control signals can be constructed by methods well known to those of skill in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, DNA synthesis techniques, in vivo recombinant techniques, and the like. The DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in the expression vector to drive mRNA synthesis. Expression vectors may also include ribosomal binding sites and transcription terminators as translation initiation sites.
  • the present invention also provides a method of increasing seed germination efficiency compared to non-transformants under environmental stress conditions of plants, comprising overexpressing a gene encoding a ChEXP protein by transforming a plant cell with the recombinant vector. .
  • the environmental stress condition may be preferably an abscisic acid or a salt stress condition, but is not limited thereto.
  • Preferred examples of recombinant vectors of the invention are Ti-plasmid vectors capable of transferring part of themselves, the so-called T-region, to plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens.
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which plant cells or new plants can be produced that properly insert hybrid DNA into the plant's genome. have.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those that can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the promoter may be suitable promoters for transformation, preferably, CaMV 35S promoter, actin promoter, ubiquitin promoter, pEMU promoter, MAS promoter, histone promoter or Clp promoter, but is not limited thereto.
  • the term "promoter” refers to a region of DNA above a structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation, and a constitutive promoter does not limit the selectability.
  • conventional terminators can be used, examples of which are the octopine gene of nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacteriumtumefaciens ) Terminator, phaseoline (phaseoline) terminator, E. coli rrnB1 / B2 terminator, but is not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacteriumtumefaciens ) Terminator, phaseoline (phaseoline) terminator, E. coli rrnB1 / B2 terminator, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector may preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by chemical methods, and all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, kanamycin, hygromycin, chloramphenicol, G418, and antibiotics such as bleomycin. Resistance gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by using the CaCl 2 method or one method (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166: 557-580 (1983)) when the host cell is a prokaryotic cell . And the electroporation method.
  • the host cell is a eukaryotic cell, gene gun-mediated transformation (bombardment), Agrobacterium-mediated transformation, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection and
  • the vector can be injected into the host cell by DEAE-dextran treatment or the like, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of transforming plant cells with the recombinant vector.
  • a method for producing a transformed plant having increased seed germination efficiency compared to a non-transformer under environmental stress conditions including the step of regenerating the plant from the transformed plant cells.
  • the environmental stress condition may be preferably an abscisic acid or a salt stress condition, but is not limited thereto.
  • the method for transforming the plant cells is as described above.
  • the method of the present invention comprises the step of regenerating the transformed plant from the transformed plant cells.
  • the method of regenerating the transgenic plant may use any method known in the art. Techniques for regeneration of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for many different species.
  • plants transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding a ChEXP protein of the present invention have increased seed germination efficiency compared to non-transformants under environmental stress conditions.
  • the present invention also provides a transgenic plant and seed thereof produced by the above method.
  • the plant is a monocotyledonous plant such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oats, onions, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato , Celery, carrots, buttercups, parsley, cabbage, cabbage, gatchi, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybeans, green beans, kidney beans, peas and other dicotyledonous plants, but is not limited thereto.
  • the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, ChEXP ( Chara ) derived from Chara coralina coralina Expansin) provides a composition for increasing germination efficiency of seeds under environmental stress conditions of plants, including a gene encoding a protein as an active ingredient.
  • the composition is capable of increasing the germination efficiency of the seed under the environmental stress conditions of the plant by transforming the plant with a recombinant vector comprising a gene encoding a ChEXP protein as an active ingredient.
  • the environmental stress condition may be preferably an abscisic acid or a salt stress condition, but is not limited thereto.
  • the fragment sequence of the gene encoding the Chara Expansin protein obtained through RNAseq was subjected to PCR with specific primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) to obtain a ChEXP gene fragment PCR product.
  • the product was inserted into the pGEM-T Easy vector and analyzed for sequencing, and found to be identical to the sequence of RNAseq.
  • Gene-specific nested primers SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7
  • DNA Working SpeedUp TM DNA Working SpeedUp TM to confirm that the fragment gene lacks the 3 'sequence and to analyze the remaining coding sequence.
  • the complete cDNA gene coding sequence was obtained using Premix Kit (Seegene) (FIG. 1).
  • Agrobacterium Tomerfaciens to make a transformed Arabidopsis
  • the expression vector of 35S :: ChEXP was transformed into GV3101 by electroporation. Colonies were obtained by incubating at 28 ° C. for 2 days, and the transformations were confirmed by PCR.
  • PCR primers used are the same as SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • the germination efficiency was measured by counting the number of seeds germinated every day for 7 days with 50 seeds as a whole, and calculating the average by repeating the same experiment three times for statistics.
  • Transgenic plants expressing the axon-expanded protein showed increased germination efficiency at ABA stress (FIG. 3) and salt stress (FIG. 4) compared to ecotype Col-0 plants.

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Abstract

본 발명은 차축조 유래의 ChEXP 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 육상 식물의 하위 단계 생물인 차축조(Chara coralina)의 익스팬신(Chara Expansin protein)이라는 단백질이 식물의 환경 스트레스 조건하에서 종자의 발아효율을 증가시키는 사실을 규명하였다. 본 발명의 유전자를 이용하여 환경 스트레스 조건 하에서도 발아가 촉진된 식물체를 창출할 수 있으며 또한, 향후 원예작물의 발아를 가뭄과 같은 환경에서도 촉진시켜 환경 스트레스에도 꽃과 종자를 단기간에 얻을 수 있다.

Description

차축조 유래의 ＣｈＥＸＰ 유전자 및 이의 용도
본 발명은 차축조 유래의 ChEXP 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
익스팬신(ChEXP)은 pH 의존적으로 세포벽의 섬유소 구성분자인 폴리머의 수소결합을 파괴하여 세포벽을 느슨하게 만드는 단백질로서 산성 조건하의 오이의 하배축에서 처음 분리되었다. 이 단백질은 오이 하배축에서 세포벽의 섬유소(microfibril)를 구성하는 다당류간 수소결합을 가역적으로 분해하고, 귀리의 자엽초에서는 길이생장이 활발한 부위에서 활성이 크며 오이, 애기장대, 콩, 벼, 옥수수 등 단자엽과 쌍자엽 식물체에 공통으로 존재하고 그 구조가 매우 유사한 것으로 cDNA의 염기서열 분석에 의하여 밝혀졌다(Shcherban et al.1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:9245-9249).
익스팬신은 225~300개의 아미노산으로 구성되어 있고, 아미노산 서열과 모티프에 기초한 계통수 분석 결과 크게 4개의 그룹(EXPA, EXPB, EXPLA, EXPLB)으로 나뉘지만, 식물 또는 식물 이외의 생물에서 발견되는 유연성이 낮은 한 그룹(EXLX)을 포함하여 다섯 그룹으로 구분된다.
익스팬신은 세포 확장 이외에도 세포분열, 형태형성, 환경 변화에 관여한다. 식물의 형태 형성, 과일 성숙, 화분 성숙과 화분관 신장, 뿌리 생장, 뿌리털 분화, 염분 저항성, 가뭄 저항성, 수량증가 등 다양한 형질 발현에 관여한다.
유전체 데이터에 기초한 익스팬신 단백질(EXPA, EXPB, EXLA, EXLAB)은 식물의 종과 진화에 따라 그 수가 다르며 애기장대(Arabidopsis thaliana)는 35개, 벼(Oryza sativa)는 33개, 포플라(Populus trichocarpa)는 55개, 사과(Malus×domestica)는 60개, 암보렐라(Amborella trichopoda)는 22개, 부처손(Selaginella moellendorffii)은 19개, 이끼(Physcomitrella patens)는 23개로 보고되었다. 이들을 암호화하는 유전자 중에서 가장 많이 연구된 것은 벼로 담수 조건에서 줄기의 절간 신장에 관련된 기능이다.
한편, 한국등록특허 제1642795호에서는 '염 스트레스 내성을 가지는 벼 유래 유전자 및 이의 용도'가 기재되어 있고, 한국등록특허 제0737670호에서는 '고구마 유래 익스팬신 유전자의 ｃＤＮＡ 및 이를 이용한 고 생산성 형질전환 식물체'가 기재되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '차축조 유래의 ChEXP 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 담수 벼와 유사하게 담수 조건에서 자라는 조류인 차축조(Chara coralina)의 익스팬신 단백질(ChEXP)의 기능을 규명하기 위하여 ChEXP cDNA를 클로닝하였고, 상기 ChEXP cDNA 유전자의 발현 벡터를 가지는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 애기장대 식물체를 형질전환시켜, 상기 익스팬신 단백질(ChEXP) 과발현 형질전환 애기장대 식물체를 제조하였으며, 앱시스산(ABA)과 염 처리 조건에서 상기 익스팬신 단백질(ChEXP) 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 종자 발아가 비형질전환체에 비해 촉진됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 재배 작물과 원연관계의 포자식물이며 세포의 길이가 약 3 cm에 이르는 차축조의 익스팬신 유전자(ChEXP)를 클로닝하고 ChEXP 유전자의 발현이 조절된 식물체를 이용하여 ChEXP 유전자가 식물체의 종자 발아에 관여하며, 특히 앱시스산 또는 염 조건에서 종자 발아를 촉진하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 차축조(Chara coralina) 유래의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 형질전환된 종자를 제공한다
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 차축조(Chara coralina) 유래의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 환경 스트레스 조건하에서 종자의 발아효율 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명은 육상 식물의 하위 단계 생물인 차축조의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질이 식물의 환경 스트레스 조건하에서 종자의 발아효율을 증가시키는 사실을 규명하였다. 본 발명의 유전자를 이용하여 환경 스트레스 조건 하에서도 발아가 촉진된 식물체를 창출할 수 있으며 또한, 향후 원예작물의 발아를 앱시스산 또는 염 존재와 같은 환경에서도 촉진시켜 환경 스트레스에도 꽃과 종자를 단기간에 얻을 수 있다.
도 1은 차축조(Chara coralina) 유래의 익스팬신 cDNA 유전자(ChEXP-CDS) 서열을 보여주는 것이다.
도 2는 차축조 유래의 익스팬신 cDNA 유전자(ChEXP-CDS)를 애기장대에 형질전환시키기 위해 벡터(pB2GW7)에 클로닝하여 만든 바이너리 벡터(binary vector)의 구조를 나타낸다.
도 3은 차축조 유래의 익스팬신 cDNA 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체(ChEXP OX)의 종자가 ABA 10μM이 포함된 배지에서 비형질전환체인 야생종(Col-0)보다 발아가 촉진된 것을 나타낸다. AEXPA2 OX는 애기장대 유래의 익스팬신 단백질 과발현체.
도 4는 차축조 유래의 익스팬신 cDNA 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체(ChEXP OX)의 종자가 NaCl 200μM이 포함된 배지에서 비형질전환체인 야생종(Col-0)보다 발아가 촉진된 것을 나타낸다. AEXPA2 OX는 애기장대 유래의 익스팬신 단백질 과발현체.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 차축조(Chara coralina) 유래의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 ChEXP 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율을 증가시키는 특성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스 조건은 바람직하게는 앱시스산(abscisic acid) 또는 염 스트레스 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol . Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스 조건은 바람직하게는 앱시스산(abscisic acid) 또는 염 스트레스 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율이 증가된다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 차축조(Chara coralina) 유래의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 환경 스트레스 조건하에서 종자의 발아효율 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물의 환경 스트레스 조건하에서 종자의 발아효율을 증가시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스 조건은 바람직하게는 앱시스산(abscisic acid) 또는 염 스트레스 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 식물 재료 및 생장 조건
애기장대 생태형 Col-0 종자를 MS(Murashige 및 Skoog) 배지(1x MS, 1% 수크로스 및 0.8 % 한천, pH 5.7) 또는 토양에 파종한 후 22℃, 장일조건(LD, 16h 광-120μmol photons m- 2sec- 1/8h 암) 상태로 재배하였다. 형질전환체의 선별을 위해, 50 ㎍/ml 바스타(Duchefa)를 MS 배지에 첨가하여 사용하였다. 종자들은 토사층 사이에 두고, 암실에서 4℃에 3일 동안 처리한 후 생육상으로 옮겨주었다. 염 스트레스, ABA 스트레스에서 발아를 관찰하기 위해, 200mM NaCl 또는 10uM ABA를 포함하는 1/2MS 배지(1/2x MS, 1% 수크로스 및 0.8 % 한천, pH 5.7)에 장일 조건 상태로 Col-0와 형질전환체를 재배하였다.
실시예 2. 차축조 익스팬신 유전자의 염기서열 결정
RNAseq 통해 얻은 Chara Expansin protein을 암호화하는 유전자의 단편 서열을 특이적인 프라이머 (서열번호 3 및 서열 번호 4)로 PCR을 수행하여 ChEXP 유전자 단편 PCR 산물을 얻었다. 이 산물을 pGEM-T Easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석한 결과 RNAseq의 서열과 일치함을 확인하였다. 단편 유전자에 3' 방향의 서열이 없음을 확인하고 나머지 암호화 서열을 분석하기 위해 유전자 특이적인 네스티드 프라이머(nested primer)(서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7)와 DNA Working SpeedUpTM Premix Kit(Seegene)을 이용하여 완전한 cDNA 유전자 암호화 서열을 얻었다(도 1).
실시예 3. 형질전환용 재조합 벡터 제작
35S:: ChEXP 구조물과 35S:: AtEXPA2 구조물을 위해, Chara Expansin (ChEXP) cDNA 유전자와 Arabdiopsis Expansin alpha2 (AtEXPA2) cDNA 유전자 전체를 암호화하는 염기서열을 얻기 위해 RT-PCR을 수행하여 cDNA 클론을 주형으로 한 PCR을 수행하였다. cDNA 클론 PCR을 위한 프라이머는 ChEXP의 경우 ChEXP-F(서열번호 8) 및 ChEXP-R(서열번호 9)를 사용하였으며, AtEXPA2의 경우 AtEXPA2-F(서열번호 10) 및 AtEXPA2-R(서열번호 11)를 사용하였다. 얻어진 DNA 단편들(각각 828bp, 768bp)은 pENTR-D-TOPO 벡터에 클로닝하였다. 마지막으로, 유전자를 pB2GW7에 LR 재조합으로 클로닝하여 35S::ChEXP 및 35S::AtEXPA2를 생성하였다(도 2).
실시예 4. 아그로박테리움을 이용한 애기장대 형질전환과 선별
형질전환된 애기장대를 제작하기 위해, 아그로박테리움 투머파시엔스 GV3101에 35S:: ChEXP의 발현벡터를 전기천공법으로 형질전환시켰다. 2일간 28℃에서 배양하여 콜로니를 얻었으며 이를 PCR을 통해 형질전환을 확인하였다. 사용한 PCR 프라이머는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11와 같다. 확인된 아그로박테리움 투머파시엔스를 50㎍/mL 리팜피신(Rifampicin), 25㎍/mL 젠타마이신(Gentamycin), 50㎍/mL 스펙티노마이신(spectinomycin)이 포함된 액체 LB 배지에 28℃에서 하루 동안 진탕 배양한 후, Floral dipping(Clough와 Bent, 1998, Plnat J. 16:735-743) 방법으로 애기장대를 형질전환시켰다. 제조된 애기장대 형질전환체로부터 종자를 수확한 다음 50㎍/mL 바스타를 함유하는 MS 배지에 도말하여 저항능을 가진 식물전환체 T1을 선별하고, 이 중 싱글 카피(single copy)로 도입되어 바스타 저항성에 대한 분리비가 3:1로 나타나는 T2 식물체를 구별해 동형접합(homozygote)인 형질전환 식물체를 얻었다.
실시예 5. 염 스트레스와 ABA 스트레스 상에서의 발아 효율 측정
발아 효율의 측정은 종자 50개를 전체로 하여 7일간 매일 발아한 종자의 수를 계수해 퍼센트를 구하였으며, 통계를 위해 같은 실험을 3번 반복해 평균값을 구하였다. 차축조 익스팬신 단백질을 발현하는 형질전환 식물체는 생태형 Col-0 식물체에 비하여 ABA 스트레스(도 3)와 염 스트레스(도 4)에서 그 발아 효율이 증가함을 보였다.

Claims (11)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 차축조(Chara coralina) 유래의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질.
  2. 제1항의 ChEXP 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율을 증가시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 앱시스산(abscisic acid) 또는 염 스트레스 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 조건하에서 비형질전환체에 비해 종자 발아효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 앱시스산(abscisic acid) 또는 염 스트레스 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 종자 발아효율이 증가된 형질전환 식물체.
  10. 제9항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  11. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 차축조(Chara coralina) 유래의 ChEXP(Chara coralina Expansin) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 환경 스트레스 조건하에서 종자의 발아효율 증가용 조성물.
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