KR20120110809A - 애기장대 유래 ＡｔＥＸＰＡ7 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

애기장대 유래 ＡｔＥＸＰＡ7 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 증가시키는 방법, 상기 AtEXPA7 유전자를 이용한 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 AtEXPA7 유전자를 포함하는 식물체의 뿌리 생장 증가용 조성물, 상기 AtEXPA7 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 조절하는 방법 및 상기 AtEXPA7 유전자를 포함하는 RNAi 재조합 벡터로 형질전환되어 뿌리 생장이 감소된 형질전환 식물체에 관한 것이다.

Description

애기장대 유래 ＡｔＥＸＰＡ7 유전자 및 이의 용도{AtEXPA7 gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof}
본 발명은 애기장대 유래 AtEXPA7 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 증가시키는 방법, 상기 AtEXPA7 유전자를 이용한 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 AtEXPA7 유전자를 포함하는 식물체의 뿌리 생장 증가용 조성물, 상기 AtEXPA7 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 조절하는 방법 및 상기 AtEXPA7 유전자를 포함하는 RNAi 재조합 벡터로 형질전환되어 뿌리 생장이 감소된 형질전환 식물체에 관한 것이다.
관다발 식물에서, 뿌리털은 뿌리 표피 세포로부터 나와, 뿌리 표면적을 크게 증가시킨다. 뿌리털 발생은 3가지 주요 단계로 나뉠 수 있다: (1) 뿌리 표피 세포의 뿌리털 세포 또는 비-뿌리털 세포(non-hair cell)의 운명이 결정되는 운명 결정(fate determination) 단계; (2) 뿌리털 세포가 독특한 세포질 특징을 나타내기 시작하고, 뿌리털 팽출부(hair bulge)가 특이적 위치로부터 부풀어오르는 개시(initiation) 단계; 및 (3) 뿌리털이 최종 크기까지 신장되는 말단 생장(tip growth) 단계(Grierson and chiefelbein, 2002, In The Arabidopsis Book, CR Somerville and EM Meyerowitz, eds).
식물세포의 생장 및 형태형성은 완화(loosening) 및 재조립(reassembly)과 같은 세포벽의 변형을 통해 일어난다. 상기 과정은 초기의 뿌리털 팽출부가 뿌리털 세포 표면으로부터 나오는 부위에서 특히 눈에 띈다. 지속적인 뿌리털 말단 생장은 다양한 효소 및 단백질에 의해 수행되고 있는 세포벽-관련 활성과 함께, 뿌리털 말단에서 세포벽 물질의 농축을 필요로 한다(Galway, 2006, Can. J. Bot. 84, 613-621). 몇 가지 뿌리털 특이적 유전자들은 애기장대에서 뿌리털 생장과 관련이 있다. 예를 들어, 뿌리털의 신장 및 형태형성에 있어서의 결함은 애기장대(Arabidopsis thaliana) AtLRX1 (LEUCINE RICH REPEAT/EXTENSIN 1) 및 AtLRX2의 소실에 기인하며, 뿌리털의 길이는 추정 세포벽 퍼옥시다아제(putative cell wall peroxidase)인 RHS18 (ROOT HAIR SPECIFIC 18)의 과발현에 의해 감소된다(Won et al., 2009, Plant Physiol. 150, 1459-1473).
익스팬신(expansin; EXP)은 분명한 가수분해 활성을 나타내지 않는 세포벽-완화(loosening) 단백질이다(Choi et al, 2006, Physiol. Plant. 126, 511-518). 익스팬신 유전자는 대부분의 식물 종에서 발견되는 멤버(member)를 가지는 다중유전자(multigene) 패밀리를 포함한다. 익스팬신 유전자는 2개의 서브그룹인 EXPA 및 EXPB로 분류될 수 있는데, 이들은 제한된 유사성을 공유하며, 상이한 기질 특이성을 가지는 단백질을 인코딩한다. 애기장대 EXP의 프로모터::리포터 분석은 2개의 EXPA (AtEXPA7 및 AtEXPA18)가 뿌리털 세포에서 특이적으로 발현된다는 것을 밝혀냈다(Cho and Cosgrove, 2002, Plant Cell 14, 3237-3253). AtEXPA7의 수많은 기능적 오쏘로그(ortholog)(즉, 뿌리털 특이적 발현을 나타내는 EXPA-유사 유전자)가 단자엽 식물 및 진정쌍자엽 식물(eudicot) 중에서 실험적으로 동정되었다(Kim et al., 2006, Plant Cell 18, 2958-2970). 최근, 본 발명자들은 쌀 및 보리에서 2개의 뿌리털 특이적 EXPB를 동정하였다(Won et al., 2010, Mol. Cells 30, 369-376). 상기 유전자들은 화본과(Poaceae)에서 뿌리털 생장에 특이적일 수 있는 단백질을 코딩한다. 지금까지, 모든 뿌리털 특이적 EXP는 근위(proximal) 프로모터 영역 내에 뿌리털 특이적 시스 인자(cis-element)(RHE)를 가지고 있는데, 이는 상기 유전자들이 오쏘로그 전사 구성요소에 의한 조절에 적용됨을 나타낸다(Won et al., 2010, Mol. Cells 30, 369-376). 그러나, 상기 유전자의 생물학적 기능은 생체내(in vivo)에서 규명되어야 한다. 본 발명자들은 AtEXPA7이 애기장대에서 정상적인 뿌리털 신장에 필요하다는 것을 증명하기 위해 RNA 간섭(RNAi)을 이용하였다.
한국등록특허 제10-0510055호에는 대두 유래 GmEXP1 유전자를 이용하여 식물체의 뿌리 발달을 촉진하는 방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0834296호에는 고구마 유래 익스팬신 유전자를 이용하여 고구마 저장뿌리의 생산량을 증대시키는 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 AtEXPA7 유전자의 유전자 침묵을 유도하는 재조합 식물 RNAi 벡터를 식물에 형질전환하여, 형질전환 식물체가 대조군에 비해 뿌리 생장이 현저하게 감소한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AtEXPA7 유전자를 이용한 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AtEXPA7 유전자를 포함하는, 식물체의 뿌리 생장 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AtEXPA7 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 AtEXPA7 유전자를 포함하는 RNAi 재조합 벡터로 형질전환되어 뿌리 생장이 감소된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 식물체에 형질전환시키면 뿌리 생장이 증가한다. 따라서 상기 AtEXPA7 유전자를 이용하면 고생산성 형질전환 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 AtEXPA7 cDNA 내 RNAi 표적 영역을 나타낸 것이다. (A) 상단 및 하단에서 코딩 및 비-번역(untranslated) 영역을 각각 나타내는 AtEXPA7 cDNA 서열. 개시(ATG) 및 종결(TAA) 코돈은 박스로 표시하였다. RNAi 표적 영역은 실선(RNAi-1) 및 점선(RNAi-2)으로 표시하였다. (B) RNAi-1 또는 RNAi-2 구축물의 발현은 AtEXPA7 프로모터(pE7)에 의해 구동되었다. 화살표는 전사 개시 부위를 나타낸다.
도 2는 AtEXPA7에 대한 RNAi가 뿌리털 신장을 억제한다는 것을 나타낸다. (A) pE7:YFP 형질전환체 뿌리의 형광 현미경 사진. AtEXPA7 프로모터(pE7)는 YFP(황색 형광 단백질)의 뿌리털 특이적 발현을 지시한다. 바(bar)=100 ㎛. (B) 대조군(Cont, pE7 : YFP) 및 AtEXPA7-RNAi (pE7 : E7 - RNAi) 라인(RNAi-1 및 RNAi-2)의 뿌리 이미지. 바=100 ㎛. (C) 대조군 및 AtEXPA7-RNAi 형질전환체의 뿌리털 길이. 숫자는 독립적 RNAi 형질전환 라인을 나타낸다. 데이터는 평균±표준오차(N=495(대조군), 540(라인 13번), 521(라인 14번), 597(라인 7번) 및 556(라인 8번))를 나타낸다.
도 3은 뿌리털 길이의 분포를 나타낸 것이다. (A) 대조군 식물(Cont, pE7:YFP)에서 뿌리털 길이의 분포. (B) AtEXPA7-RNAi-1 형질전환체에서 뿌리털 길이의 분포. (C) AtEXPA7-RNAi-2 형질전환체에서 뿌리털 길이의 분포. 관찰된 뿌리털의 수는 540(대조군), 913(RNAi-1) 및 791(RNAi-2) 이었다. 수직 점선은 평균을 나타낸다.
도 4는 AtEXPA7 및 AtEXPA18 전사체의 정량적 RT-PCR 분석. (A) 대조군(Cont, pE7 : YFP), AtEXPA7-RNAi-1 및 AtEXPA7-RNAi-2 형질전환체의 뿌리에서 AtEXPA7 전사체의 상대적인 수준. (B) 대조군(Cont, pE7 : YFP), AtEXPA7-RNAi-1 및 AtEXPA7-RNAi-2 형질전환체의 뿌리에서 AtEXPA18 전사체의 상대적인 수준. 데이터는 3회의 독립적 실험값의 평균±표준오차를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 뿌리 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 AtEXPA7 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 AtEXPA7 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
AtEXPA7 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 AtEXPA7 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대이다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는, 식물체의 뿌리 생장 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtEXPA7 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 뿌리 생장을 증가시킬 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtEXPA7 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 뿌리 생장을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 AtEXPA7 유전자의 발현을 증가시키면, 식물의 뿌리 생장을 증가시킬 수 있으며, 상기 AtEXPA7 유전자의 발현을 감소시키면, 식물의 뿌리 생장을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 RNAi 재조합 벡터로 형질전환되어 뿌리 생장이 감소된 형질전환 식물체를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 재료 및 생장 조건
RNAi 구축물을 애기장대(컬럼비아 생태형; Columbia ecotype)에 형질전환했다. 애기장대 종자를 4℃에서 3일 동안 저온 처리한 후, 암 조건에서 발아시켰다. 애기장대 식물은 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58C1 (Bechtold 및 Pelletier 1998)를 이용해 형질전환되었고, 상기 형질전환체는 하이그로마이신-함유(10 ㎍/mL) 피토-아가(phyto-agar) 플레이트 상에서 선별되었다. 4일 된 T2 형질전환 유묘의 뿌리는 뿌리털 길이의 측정 및 RNA 추출을 위해 수집되었다.
AtEXPA7 - RNAi 구축물
AtEXPA7 cDNA 내 RNAi 표적 영역을 PCR 및 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 증폭하였다. cDNA 주형은 애기장대 유묘의 뿌리로부터 획득하였다. 2개의 RNAi 표적 영역인 RNAi-1 및 RNAi-2를 도 1A에 나타냈다. RNAi-1 및 RNAi-2 표적 영역은 센스 및 안티센스 절편을 각각 제조하기 위해 pHannibal 벡터의 XhoI/EcoRI 및 BamHI/XbaI 부위에 삽입되었다. 그 후, 클로닝된 pHannibal 벡터로부터 제조된 XhoI/XbaI 절편을 바이너리 벡터(binary vector) pE7p13M의 SalI/XbaI의 부위로 삽입하였다(Lee et al., 2010, Plant Cell 22, 1812-1825). pE7p13M은 pCAMBIA1300 (Hyg+)으로부터 변형되었고, 전사 개시 부위로부터 -480 bp 위치에 AtEXPA7 프로모터를 포함한다(Kim et al., 2006, Plant Cell 18, 2958-2970)(도 1B). 모든 형질전환 구축물은 뉴클레오티드 시퀀싱으로 확인되었고, 형질전환 식물의 유전자 완전성(integrity)은 게놈 DNA의 PCR 증폭으로 확인되었다.
Figure pat00001
뿌리털의 관찰
뿌리털의 관찰 및 뿌리털 길이의 측정은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(Ganguly et al., 2010, Plant Physiol. 153, 1046-1061). 뿌리털 길이의 측정을 위해, 뿌리의 디지털 사진은 입체현미경(Leica MZ FLIII)을 이용해 40× 내지 50× 배율로 촬영되었다. 뿌리털의 성숙 영역(말단으로부터 약 0.78 mm) 내에서 뿌리털을 계수하였고, 측정은 뿌리의 각 측면으로부터 수직으로 돌출된 20개의 뿌리털에 대해 수행되었다.
정량적 RT - PCR ( qRT - PCR ) 분석
총 RNA는 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 4일 된 유묘의 뿌리(각 라인에서 25개씩)로부터 분리되었다. cDNA는 이전에 기재된 바와 같이 합성되었다(Lee and Cho, 2006, Plant Cell 18, 1604-1616). qRT-PCR 분석은 EvaGreen Master mix (Applied Biological Materials Inc) 및 Chromo4TM Four-Color Real-Time Detector (Bio-Rad)를 이용하여 수행되었다. 유전자-특이적 신호는 Actin7에 대한 상대적인 수치로 표준화되었다. 각각의 반응은 3회씩 수행되었고, 각 실험은 독립적인 RNA 제조물을 이용하여 3회씩 반복되었다. 정량적 RT-PCR에 사용된 프라이머는 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
등록번호
본 발명에서 분석된 유전자의 등록번호는 AT1G12560 (AtEXPA7) 및 AT1G62980 (AtEXPA18)이다.
실시예 1: 뿌리털의 생장을 억제하는 AtEXPA7 에 대한 RNAi
본 발명자들은 뿌리털 세포에서 AtEXPA7의 전사 수준을 감소시키기 위해 2개의 RNAi 구축물을 제작했다. 상기 RNAi 구축물은 그 길이가 130 bp(개시 코돈으로부터 357 내지 486 bp) 및 177 bp(552 내지 728 bp) 였다(도 1A). RNAi 전사체의 발현은 뿌리털 개시 및 말단 생장 단계 동안에 뿌리털 세포-특이적 RNAi 발현을 얻기 위해, AtEXPA7 프로모터(pE7)에 의해 구동되었다(도 1B).
26개의 RNAi-1 및 25개의 RNAi-2 형질전환체를 T1 세대에서 획득했으며, 상기 모든 형질전환체는 대조군보다 더 짧은 뿌리털을 가졌고, 각 RNAi 구축물에 대한 2개의 독립적인 라인이 T2 세대에서의 추가적인 분석을 위해 선택되었다. 측정은 독립 라인 당 521 내지 597개의 뿌리털에 대해 수행되었다. RNAi 라인의 뿌리털은 대조군 라인(pE7 :: YFP)에 비해 25~48% 더 짧았고, RNAi-2 라인은 RNAi-1 라인보다 약간 더 짧은 뿌리털을 나타내었다(도 2)(Cho et al., 2007, Plant Cell 19, 3930-3943).
본 발명자들은 형질전환 라인에서 뿌리털 길이의 분포를 분석했다. 뿌리털의 수는 0.05 mm 간격을 이용해 계수하였다. 각각의 뿌리털 길이 간격 내에서 발견되는 뿌리의 상대적인 수는 총 뿌리털의 백분율로서 나타내었다. 대조군 식물에서, 대다수의 뿌리털(각 뿌리털 길이 간격에서 모든 뿌리털의 10% 초과)은 0.25 내지 0.50 mm 사이에, 즉 5개의 0.05 mm 간격에 분포한 반면, RNAi-1 형질전환체에서는 7개의 간격(0.10 내지 0.45 mm)에, RNAi-2 형질전환체에서는 5개의 간격(0.10 내지 0.35 mm)에 분포하였다(도 3). 두 RNAi 라인에서, 뿌리털 분포 패턴은 긴 뿌리털의 감소 및 그에 비례하는 짧은 뿌리털의 증가를 나타내었다. 상기 뿌리털 길이의 전반적인 감소는 RNAi 라인이 대조군에 비해 더 낮은 생장 능력 및 뿌리털 말단 생장의 더 이른 중단을 가진다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 결과는 AtEXPA7이 지속적인 뿌리털 말단 생장에 필요하다는 것을 나타낸다.
AtEXPA7이 뿌리털 형태형성의 초기 단계인 뿌리털 개시 동안 필수적인지 아닌지를 결정하기 위해, 대조군과 RNAi 라인 사이에서 뿌리털의 수를 비교하였다. 그러나, AtEXPA7 발현의 RNAi 타겟팅(targeting)은 뿌리털의 수에 대해 현저한 효과를 나타나지 않았다(데이터 미제시).
실시예 2: RNAi 형질전환체에서 AtEXPA7 및 AtEXPA18 전사체의 정량적 RT -PCR 분석
AtEXPA7 전사체의 간섭을 확인하기 위해, 상기 RNAi 형질전환체는 qRT-PCR을 이용하여 조사되었다. 표적 전사체는 RNAi-1 라인 13번 및 14번에서 45 및 25%씩 각각 감소하였고, RNAi-2 라인 7번 및 8번에서는 49 및 58%씩 각각 감소하였다(도 4A). 반면, 상기 RNAi 라인은 AtEXPA7의 가장 가까운 파라로그(paralog)인 AtEXPA18의 전사에 있어서는 현저한 감소를 나타내지 않았다(도 4B). 상기 결과는, AtEXPA7 전사체 수준의 감소가 AtEXPA7-RNAi 형질전환체에서 관찰되는 뿌리털 신장의 억제를 야기한다는 것을 나타낸다. 게다가, AtEXPA18가 뿌리털 특이적으로 발현되고 AtEXPA7와 유사한 기능을 수행할 수 있다고 해도, 뿌리털 신장 동안 감소된 AtEXPA7 수준을 완전히 보상할 수는 없다. 따라서, 다른 뿌리-특이적 AtEXP가 AtEXPA7을 보상하지는 않을 것으로 생각된다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> AtEXPA7 gene from Arabidopsis thaliana and uses thereof <130> PN11044 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1033 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 caaaaacaaa ccctaagaat aaagaaaaag aggctagaat gggtccaatc tcaagttctt 60 ggagctttaa caaattcttc tcaatagttt tcgttgtttt cgccatctcc ggcgagttcg 120 tcgctggata ctatcgacca ggcccatgga gatatgctca cgccactttc tacggtgacg 180 agaccggtgg tgaaaccatg ggtggtgcat gtgggtacgg aaaccttttt aacagcggct 240 acggactgtc cacggcggcg ctaagcacga cattgttcaa tgatggttac ggatgcggcc 300 aatgttttca gataacatgt tcgaaatcac cgcattgtta ctctggaaaa tcaacagtgg 360 tcacagccac caatctttgc cctcctaatt ggtaccaaga ctccaacgct ggtggttggt 420 gcaatcctcc tagaacccat ttcgatatgg ctaaaccagc tttcatgaaa ctcgcttact 480 ggagggccgg tatcatccca gttgcatacc gaagagtgcc atgccaaagg agtggaggta 540 tgaggtttca attccaaggt aattcttatt ggcttcttat cttcgtcatg aacgttggtg 600 gcgccggaga catcaagagc atggccgtta aaggtagccg gacgaattgg ataagcatga 660 gccacaattg gggagcctct taccaagctt tttcctctct ctatggtcaa tctctctctt 720 tccgggtcac ttcttacacc accggtgaaa ccatctatgc ttggaacgtt gctccggcta 780 actggagcgg cggtaagact tacaagagca ccgctaattt ccgttaaaac taggcttttg 840 ccctaccaaa cgaaaacgga gttttctctt ctccttcttt ttttgttaag agtttcggtg 900 gccttttgtt gtggtggccc ggctttatgt tatacatcta catgtatgta taatgtatgt 960 atgtatctaa ttgtgatata actcttctta taaatatcat gaagtcaaca cttcttgatc 1020 aagagaattc gtt 1033 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri1a-XhF1 primer <400> 2 cttcctcgag aacgttggtg gcgccgga 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri1a-EcR1 primer <400> 3 agcagaattc caagcataga tggtttcac 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri1b-XbF2 primer <400> 4 ttcgtctaga acgttggtgg cgccgga 27 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri1b-BaR3 primer <400> 5 gcaaggatcc aagcatagat ggtttcac 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri2a-XhF1 primer <400> 6 ctaactcgag ccaagactcc aacgctggtg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri2a-EcR1 primer <400> 7 cactgaattc gcatggcact cttcggtatg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri2b-XbF2 primer <400> 8 ctaatctaga ccaagactcc aacgctggtg 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-Ri2b-HdR2 primer <400> 9 tccaaagctt tggcatggca ctcttcggt 29 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-rt-F primer <400> 10 gatatgctca cgccactt 18 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-rt-R primer <400> 11 gtccgtagcc gctgtta 17 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18-rt-F primer <400> 12 tcgtcagacc atttacgctt a 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18-rt-R primer <400> 13 ctcaacaaca aatggcaaaa cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> act_rtF2 primer <400> 14 tcccgctatg tatgtcgcca tc 22 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> act_rtR1 primer <400> 15 ctggaacaag acttctgggc atct 24

Claims (11)

  1. 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtEXPA7 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 뿌리 생장을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AtEXPA7 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 AtEXPA7 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항의 방법에 의해 제조된 뿌리 생장이 증가된 형질전환 식물체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  8. 제5항에 따른 식물체의 종자.
  9. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는, 식물체의 뿌리 생장 증가용 조성물.
  10. 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AtEXPA7 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 뿌리 생장을 조절하는 방법.
  11. 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 AtEXPA7 (expansin A7) 유전자를 포함하는 RNAi 재조합 벡터로 형질전환되어 뿌리 생장이 감소된 형질전환 식물체.
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