KR101350170B1

KR101350170B1 - 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR101350170B1
Application number: KR1020110117365A
Authority: KR
Inventors: 이상훈; 이기원; 최기준; 김기용; 지희정; 임영철; 김차영; 곽상수; 전효곤
Original assignee: 한국생명공학연구원; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2011-11-11
Publication date: 2014-01-14
Also published as: KR20130054478A

Abstract

본 발명은 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법, 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 식물체의 안토시아닌 함량 증진용 조성물, 상기 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법 및 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

Description

안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 {Method for preparing transgenic plant with increased anthocyanin content and the plant thereof}

본 발명은 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법, 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 식물체의 안토시아닌 함량 증진용 조성물, 상기 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법 및 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.

안토시아닌은 수용성 색소 배당체 (glucoside)로서 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있는 식물성 천연 색소이다. 안토시아닌은 통상 식물체의 액포에 존재하며, 세포액의 산성 농도, 색소 화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합 상태 등에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타낸다.

안토시아닌의 생리 활성으로는 항노화 활성, 항균 활성, 항돌연변이 활성, 항콜레스테롤 활성, 항궤양 활성, 항산화 활성, 시력 보호 활성 등이 알려져 있는데, 특히 항산화 활성의 경우 천연 항산화제인 토코페롤보다 5 ∼ 7배의 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 현재 안토시아닌은 그것의 갖는 여러 생리활성으로 인하여 건강 기능성 식품, 화장품, 의약품, 염료 등에 활용되고 있다.

생명공학기술의 발전을 통하여 안토시아닌의 신규 생리활성 규명, 안토시아닌 생합성에 관련된 유전자의 분리 및 기능 규명, 식물체로부터 안토시아닌의 분리 방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 결과 식물체의 색소합성 조절 메커니즘 구명을 통해 식물체에서 원하는 색소를 대량으로 생산하는 것이 가능하게 될 것이다.

특히, 최근 분자농업의 발달로 다양한 식물 유전자원의 조직배양을 통해서 2차 대사산물을 대량생산하는 연구가 진행되고 있다. 천연색소에 관한 연구는 유럽 및 일본 등지에서 안토시아닌 (anthocyanin), 베타시아닌 (betacyanin), 시코닌 (shikonin) 및 카르타민 (carthamin) 등에 관한 연구가 활발하게 이루어져 왔다. 그러나 색소 대량 생산을 위해서는 생산공정 및 색소추출, 정제 등에 관한 연구가 좀 더 이루어져야 한다 (Mapari et al. 2005 Curr. Opin. Biotechnol. 16, 231-238).

한편, 한국등록특허 제10-0990842호에는 안토시아닌 대량생산 시스템이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1018079호에는 안토시아닌 생합성 촉진 기능을 가지는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0037150호에는 멜론에서 분리된 안토시아닌 생합성 관련 유전자가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 고구마 유래의 전사인자 IbMYB1a 유전자를 이용하여 안토시아닌 함량을 증가시킨 형질전환 식물체의 제조방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 담배 또는 알팔파 식물체가 안토시아닌 함량이 현저하게 증가하는 것을 확인하였고, 이를 통하여 안토시아닌 대량생산 시스템의 구축을 가능하게 함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는, 식물체의 안토시아닌 함량 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 안토시아닌 대량생산 시스템은 천연색소의 확보에 용이하게 이용되어, 천연색소를 이용하는 건강 기능성 식품 산업, 화장품 산업, 의약품 산업 및 염료 산업 발전에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 안토시아닌 생합성 관련 전사인자 유전자 IbMYB1a 염기서열 및 발현벡터 모식도를 나타낸다.
도 2는 안토시아닌 생합성 관련 전사인자 유전자 IbMYB1a로 형질전환된 담배 식물체를 나타낸다.
도 3은 안토시아닌 생합성 관련 전사인자 유전자 IbMYB1a로 형질전환된 담배 식물체에서 안토시아닌 생합성 관련 구조 유전자의 전사체 발현 분석을 나타낸다 (chalcone synthase (CHS),chalcone isomerase (CHI),flavanone-3-hydroxylase (F3H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR),andanthocyanidin synthase (ANS)).
도 4는 형질전환 담배 식물체의 안토시아닌 정량분석 결과를 나타낸다.
도 5는 안토시아닌 생합성 관련 전사인자 유전자 IbMYB1a로 형질전환된 알팔파 식물체를 나타낸다.
도 6은 IbMYB1a로 형질전환된 알팔파 식물체의 형질전환 여부를 확인한 결과이다.
도 7은 형질전환 알팔파 식물체의 안토시아닌 정량분석 결과를 나타낸다.
도 8은 다양한 식물 유래 R2R3 유형 MYB 전사인자의 과발현에 의한 담배 잎에서 안토시아닌 생성 여부를 조사한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 IbMYB1a 단백질 및 유전자는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있으나 (Genebank 등록번호 AB444398), IbMYB1a와 식물의 안토시아닌 함량과의 상호 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

상기 IbMYB1a 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

IbMYB1a 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. 상기 대조구 식물은 IbMYB1a 유전자로 형질되지 않은 식물체를 말한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, 상기 IbMYB1a 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

상기 식물체는 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 담배 또는 알팔파 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는, 식물체의 안토시아닌 함량 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 IbMYB1a 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.

본 발명의 형질전환 담배 식물체로부터 안토시아닌을 추출하기 위해, 물 또는 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용할 수 있다. 상기 유기용매는 통상 사용할 수 있는 모든 용매가 가능하며, 추출 방법 또한 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체를 포함하는 사료 조성물을 제공한다. 본 발명의 사료 조성물에서, 상기 형질전환 식물체는 바람직하게는 알팔파 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 형질전환 알팔파 식물체를 포함하는 사료 조성물은 일반적인 사료 첨가제로서의 용도와 상응하며, 다만 상기 형질전환 알팔파 식물체는 안토시아닌을 생산하여 함유하고 있다는 것을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 안토시아닌 색소합성 전사인자 IbMYB1a 유전자의 클로닝

안토시아닌 대량 생산시스템을 개발하기 위해 사용된 유전자는 자색고구마 (cv. Sinzami 신자미 품종)로부터 안토시아닌 생합성 관련 전사인자 유전자 IbMYB1a를 분리하여 이용하였다. 자색고구마의 덩이뿌리에서 총 RNA를 분리하였다 (Kim CY et al. 2010, Physiologia Plantarum 139: 259-261). 분리된 총 RNA는 First-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermantas, Canada)를 이용하여 설명서대로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 Adavantage 2 polymerase mix (Clontech, Tokyo, Japan)를 이용하여 고구마 IbMYB1a 전사인자를 PCR을 통하여 증폭하였다. 본 실험에 사용한 프라이머 염기서열은 다음과 같다 : IbMYB1a-F: 5'-AGCTAAGAATTTCCGACACCCTTCAATA-3' (서열번호 2), IbMYB1a-R: 5'-GTGAATTTAACGCTTAGCTTAACAGTTCT-3' (서열번호 3). PCR 증폭은 95℃에서 2분간 변성, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분을 1 사이클로 하여 30 사이클 및 72℃에서 10분간 최종 연장반응에 의해 수행되었다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, 미국)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열분석 결과 클로닝된 IbMYB1a 유전자는 총 797bp로 구성되어 있고, ORF(open readin frame)는 750 bp로 구성되었다 (도 1).

실시예 2. 안토시아닌 색소합성 전사인자의 식물체 과발현용 운반체 제작

상기 실시예 1에서 클로닝된 IbMYB1a 유전자를 식물체에서 과발현시켰을 때 안토시아닌 색소 합성을 증대시킬 수 있는지를 알아보기 위해서, 카나마이신 저항성을 지니는 pCAMBIA 2300의 식물발현 벡터 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)의 duplicated 35S 프로모터와 35S 터미네이터 사이에 IbMYB1a 유전자의 전체 (open reading frame)가 삽입된 벡터, 고구마 뿌리 고발현 스포라민 유전자 SPO 프로모터와 SPO 터미네이터 사이에 IbMYB1a 유전자의 전체 (open reading frame)가 삽입된 벡터, 산화 스트레스 유도성 고구마 퍼록시다아제 유전자 SWPA2 프로모터와 SPO 터미네이터 사이에 IbMYB1a 유전자의 전체 (open reading frame)가 삽입된 벡터를 각각 제작하였다. 상기 제작된 과발현 운반체는 1) pCam-d35S-IbMYB1a, 2) pCam-SPO-IbMYB1a, 3) pCam-SWPA2-IbMYB1a로 각각 명명하였다 (도 1).

실시예 3. 안토시아닌 색소합성 담배 형질전환체의 제조

상기 실시예 2에서 제작된 1)pCam-d35S-IbMYB1a, 2) pCam-SPO-IbMYB1a, 3) pCam-SWPA2-IbMYB1a 식물발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 (H, R. and Willmitzer L. (1988) Nucleic Acids Res 16:9877)에 동결-해동 (freeze-thaw) 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환된 아그로박테리움과 담배 (Nicotiana tabaccum cv SR-1) 잎 절편을 공동 배양하여 담배를 형질전환하였다. 형질전환을 위해 대조군인 야생형 담배를 1mg/L의 NAA (a-naphthalene acetic acid), 1mg/L의 BA (6-benzyladenine), 10g/L의 수크로스, 8g/L의 한천 (agar)이 첨가된 MS 배지에서 3일간 공동배양한 후, 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1mg/L의 NAA, 1mg/L의 BA, 300mg/L의 카르베니실린, 100mg/L의 Km (Kanamycin), 10g/L의 수크로스, 8 g/L 한천이 첨가된 MS 배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다. 재분화된 신초는 300 mg/L의 카르베니실린, 100mg/L의 Km, 10 g/L의 수크로스, 8g /L의 한천이 첨가된 MS 배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 배양은 26℃, 16시간 광주기/8시간 암주기의 조건에서 배양하였고, 발근된 개체는 순화 후 화분으로 이식하여 온실에서 평균 기온 26℃ 이상의 조건에서 생육시켰다.

실시예 4. 형질전환 담배의 안토시아닌 색소합성 전사인자의 발현 분석

상기 실시예 3에서 선발된 각각의 형질전환 담배에서 IbMYB1a 유전자가 안정적으로 발현하는지 확인하기 위하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. 카나마이신이 포함된 배지에서 선발된 형질전환 담배 식물체를 대상으로 분석한 결과, 안토시아닌 색소합성 전사인자인 IbMYB1a 유전자가 안정적으로 발현됨을 확인하였다 (데이터 미제시).

실시예 5. 형질전환 담배의 표현형 관찰

상기 실시예 4에서 선발된 각각의 형질전환된 담배 식물체는 비형질전환 대조구와 비교하여 유식물체에서 외형적인 표현형의 차이가 나타났다. IbMYB1a 유전자가 도입된 형질전환 담배 식물체의 경우 잎, 줄기, 뿌리 등에서는 안토시아닌 색소의 증가를 확인할 수 있었다 (도 2). 안토시아닌 색소가 잎, 줄기, 뿌리 등의 전신조직에서 안정적으로 균일하게 축적되는 계통과 안토시아닌 색소가 잎, 줄기뿌리 등의 전신에서 얼룩덜룩하게 축적되는 계통을 획득하였다 (데이터 미제시).

이상의 결과로 안토시아닌 색소합성 전사인자인 고구마로부터 분리한 IbMYB1a를 형질전환하는 경우에는 프로모터의 특성과 상관없이 안토시아닌 색소의 대량 생산이 관찰되어 이 유전자의 식물로의 도입은 안토시아닌 색소의 대량 생산이 가능하리라 판단된다.

실시예 6. 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현 양상

안토시아닌 색소합성 유전자가 도입된 담배 개체에서 색소합성에 관련한 구조유전자의 발현이 어떻게 변화되었는지를 살펴보기 위해서, 비형질전환 대조구와 IbMYB1a 유전자가 도입된 형질전환 담배 식물체의 잎 조직 (0.2 g)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 총 RNA (2 μg)는 First-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermantas, Canada)를 이용하여 설명서대로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA (20 μl)를 5배 희석한 후 5 μl를 주형으로 하여 담배 식물체에서 안토시아닌 생합성 관련 유전자를 대상으로 RT-PCR를 수행하였다. PCR 증폭은 95℃에서 2분간 변성, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 및 72℃에서 10분간 최종 연장반응에 의해 수행되었다. 본 실험을 위해 사용한 담배 안토시아닌 생합성 유전자 RT-PCR용 프라이머는 다음과 같다 : CHS-F: 5'-ATAGGTTCTGATCCAATTCCAGAG-3' (서열번호 4), CHS-R: 5'-CTGTGGAGAACAACAGTCTCAACT-3' (서열번호 5), CHI-F: 5'-ACGGGTAAGCAATACTCAGAGAAG-3' (서열번호 6), CHI-R: 5'-TAGACTCCAATTTCTGGAATGGT-3' (서열번호 7), ANS-F: 5'-CTGGCCTAAAATCCCTACTGACTA-3' (서열번호 8), ANS-R: 5'-TCTCTTTATTCACAACCCCTCTGT-3' (서열번호 9), DFR-F: 5'-CCTAGCTTAATCACTGCACTTTCA-3' (서열번호 10), DFR-R: 5'-ATTGGTTGACTTTCCTGTACCATT-3' (서열번호 11), F3H-F: 5'-TATCCAATTCGGGCTAGAGACTAC-3' (서열번호 12), F3H-R: 5'-GGGTACACTATAGCTTCTGGTGCT-3' (서열번호 13), ACTIN-F: 5'-TGGACTCTGGTGATGGTGTC-3' (서열번호 14), ACTIN-R: 5'-CCTCCAATCCAAACACTGTA-3' (서열번호 15).

3가지 종류의 프로모터에 조절하에서 IbMYB1a 유전자의 과발현에 의하여 담배 안토시아닌 생합성 주요 관련 유전자들 (CHS , ANS , DFR)의 발현 또한 대조구에 비해 크게 증가됨을 알 수 있었다 (도 3). 이 실험을 바탕으로 고구마 유래 IbMYB1a 유전자 발현이 담배 안토시아닌 생합성 유전자인 CHS , ANS , DFR 등을 전사적 수준에서 조절함으로써 담배에서 안토시아닌 생성을 증가시키는 것으로 생각된다.

실시예 7. 안토시아닌 대량생산 담배의 안토시아닌 함량 분석

비형질전환 대조구 및 형질전환 담배 식물체 (pCam-d35S-IbMYB1a, pCam-SPO-IbMYB1a 및 pCam-SWPA2-IbMYB1a 발현 벡터로 각각 형질전환된 담배)를 대상으로 Mehrtens F 등 (Mehrtens F et al. (2005) Plant Physiol. 138: 1083-1096)이 기재한 방법으로 총 안토시아닌의 함량을 분석하였다. 비형질전환 대조구 및 각각의 형질전환 담배 식물체 3개씩의 식물체를 샘플링하여 안토시아닌을 추출하였고, 안토시아닌 함량을 흡광광도계를 이용하여 530nm와 657 nm에서 흡광도값을 읽고 아래의 공식을 대입하여 각 시료의 전체 안토시아닌 함량을 측정한 후 평균값으로 나타내었다 : (Q _Anthocyanins =(A ₅₃₀ -0.25 xA ₆₅₇ ) xM ^-1 , M은 사용된 시료의 g 무게). 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 대조구에 비해 안토시아닌 색소합성 유전자 IbMYB1a가 도입된 담배 개체의 잎에서 35S-IbMYB1a-OX 라인, SPO-IbMYB1a-OX 라인 및 SWPA2-IbMYB1a-OX 라인은 각각 265배, 620배 및 485배의 안토시아닌이 증가하였다. 이로써 안토시아닌 색소합성 유전자가 도입된 담배 식물체가 안토시아닌을 대량생산함을 확인하였다.

실시예 8. 안토시아닌 색소합성 전사인자의 과발현 형질전환 알팔파 제작

상기 실시예 2에서 제작된 pCam-d35s-IbMYB1a 식물발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 (H, R. and Willmitzer L.(1988) Nucleic Acids Res 16:9877)에 동결-해동(freeze-thaw) 방법을 이용하여 형질전환하였다. 본 발명에서는 상기 IbMYB1a 유전자를 포함하는 식물 운반체로 형질전환된 알팔파 식물체를 제작하기 위하여, 상기 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주를 사료작물인 알팔파에 형질전환시켰다.

식물 재료로는 알팔파의 품종 중 'Vernal' 품종을 사용하였다. 종자 살균은 70% 에탄올에서 30초간 살균한 후, 30% 소듐 히포-클로라이드 용액에서 30분간 교반하면서 표면살균 하였다. 살균한 종자는 멸균수로 3회 세정한 후 멸균된 필터 페이퍼에 옮겨 물기를 제거하고 1/2 MS 배지에 무균 파종하여 24±2℃, 16시간 광조건의 생장실에서 7-10일간 배양한 유식물체를 형질전환을 위한 식물재료로 이용하였다. 무균 재배한 알팔파 유식물체의 하배축으로부터 캘러스를 유도하기 위한 기본적인 캘러스 유도배지는 1 mg/L 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 0.1 mg/L 키네틴, 0.5 g/L L-프롤린, 0.5 g/L MgSO₄, 0.5 g/L KNO₃, 30g/L 수크로스, 및 0.8% 아가가 첨가된 Gamborg B-5 배지를 사용하였다. 조직이 치밀하고 밝은 녹색을 띠고, 세포의 증식속도가 빠르며 윤기를 띠는 2주간 배양한 캘러스를 선발하여 상기 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 감염시킨 다음 공동배양배지 (Gamborg B-5 배지, 1 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L 키네틴, 0.5 g/L L-프롤린, 0.5 g/L MgSO₄, 0.5 g/L KNO₃, 30g/L 수크로스, 0.8% 아가 및 100 uM 아세토시링원 (AS))에서 암상태에서 3-5일간 공동 배양하였다.

공동배양이 끝난 식물 조직은 2 mg/L 2,4-D, 0.2 mg/L 키네틴, 0.5 g/L L-프롤린, 0.5 g/L MgSO₄, 0.5 g/L KNO₃, 30g/L 수크로스, 및 0.8% 아가가 첨가된 Gamborg B-5 배지에 100 mg/L 카나마이신과 500 mg/L 세포탁심을 포함하는 선발 배지를 사용하여 재분화를 유도하여 선발하였다. 재분화 배지에서 형성된 신초는 0.5 g/L L-프롤린, 0.5 g/L MgSO₄, 0.5 g/L KNO₃, 30g/L 수크로스, 및 0.8% 아가와 식물생장 조절물질이 첨가되지 않은 Gamborg B-5 배지에서 재분화를 유도하여 재분화 식물체가 나오기까지 2주마다 계대배양하였다. 재분화된 식물체는 1/2 MS 배지에 이식하여 유식물체로 생장시킨 후, 뿌리 발생을 유도하여 완전한 식물체로 분화시킨 후, 멸균된 원예용 상토에서 습도가 조절된 환경에서 순화과정을 거쳐 토양에 이식하여 온실에서 재배하였다(도 5).

실시예 9. 형질전환 알팔파의 표현형적 변이 관찰

상기 실시예 8에서 선발된 각각의 형질전환된 알팔파 식물체는 형질전환시키지 않은 대조구와 비교하여 유식물체에서는 외형적인 표현형의 차이가 크게 나타났다. IbMYB1a 유전자가 형질전환된 알팔파 식물체의 경우에는 잎, 줄기, 뿌리 등에서 안토시아닌 색소의 축적을 눈으로 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 10. 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 도입 및 발현 양상 분석

안토시아닌 색소합성 유전자의 도입을 확인하기 위하여 형질전환 알팔파 식물체의 신선한 잎 조직으로부터 CTAB를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. PCR 분석은 IbMYB1a 유전자와 카나마이신 저항성 유전자 각각의 특이적인 프라이머 (IbMYB1a 유전자: 정방향 프라이머 5'-AGCTAAGAATTTCCGACACCCTTCAATA-3' (서열번호 2)와 역방향 프라이머 5'-GTGAATTTAACGCTTAGCTTAACAGTTCT-3' (서열번호 3), 카나마이신 저항성 유전자: 정방향 프라이머 5'-AGGACTCTCTGTCATCTCACCTT-3' (서열번호 16)와 역방향 프라이머 5'-CTCTTCAGCAATATCACGGGTAG-3' (서열번호 17)를 이용하여 PCR 분석을 실시하였다. PCR 증폭은 95℃에서 2분간 변성, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1 사이클로 하여 30 사이클 및 72℃에서 10분간 최종 연장반응에 의해 수행되었다. 그 결과 759 bp의 IbMYB1a와 359 bp의 카나마이신 저항성 유전자의 밴드 크기를 확인하였다(도 6A). 따라서 발현벡터의 T-DNA 영역이 형질전환 식물체의 게놈으로 도입되었음을 확인할 수 있었다. 이를 더욱 확인하기 위하여 알팔파의 게놈 DNA(20㎍)을 HindⅢ 제한효소로 처리하여 서던 분석을 한 결과, 모든 형질전환 식물체에서 하나 또는 1 또는 2개의 카피 수를 확인할 수 있었다(도 6B). 한편 알팔파에 도입된 안토시아닌 색소합성 전사인자 IbMYB1a 유전자가 전사되는지를 확인하기 위하여 RNA를 분리하여 노던 블럿 분석을 실시하였다. 그 결과, 비형질전환 식물체에서는 도입 유전자의 발현을 확인할 수 없었으나, 형질전환 식물체에서는 개체간 발현 양의 차이는 있으나 도입한 유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 관찰하였다 (도 6C). 이러한 결과들은 형질전환 식물체내에 IbMYB1a 유전자가 정상적으로 도입되었으며 duplicated 35S 프로모터에 의해 항상적으로 발현되고 있음을 의미한다. 따라서 상기 결과를 종합하면, IbMYB1a 유전자는 알팔파에 안정적으로 형질전환되어 발현함을 알 수 있었다.

실시예 11. 안토시아닌 대량생산 알팔파의 안토시아닌 함량 분석

비형질전환 대조구 및 형질전환 알팔파 식물체 (pCam-d35S-IbMYB1a 발현 벡터로 형질전환된 알팔파)를 대상으로 Mehrtens F 등 (Mehrtens F et al. (2005) Plant Physiol. 138: 1083-1096)이 기재한 방법으로 총 안토시아닌의 함량을 분석하였다. 비형질전환 대조구 및 형질전환 알팔파 식물체 3개씩의 식물체를 샘플링하여 안토시아닌을 추출하였고, 안토시아닌 함량을 흡광광도계를 이용하여 530nm와 657 nm에서 흡광도값을 읽고 아래의 공식을 대입하여 각 시료의 전체 안토시아닌 함량을 측정한 후 평균값으로 나타내었다 : (Q _Anthocyanins =(A ₅₃₀ -0.25 xA ₆₅₇ ) xM ^-1 , M은 사용된 시료의 g 무게). 그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 안토시아닌 색소합성 전사인자 유전자가 도입된 d35S-IbMYB1a-OX 알팔파 개체에서는 개체간의 차이는 있으나 대조구 대비 약 74-129배 정도 많은 안토시아닌을 대량생산함을 확인하였다 (도 7).

실시예 12. 다양한 식물 유래의 R2R3 유형 MYB 전사인자의 과발현에 의한 담배 잎에서 안토시아닌 생성 여부 조사

다양한 식물 유래의 R2R3 유형 MYB 전사인자의 과발현에 의한 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에서 안토시아닌 생성 여부를 조사하였다. 그 결과, 고구마 및 토마토 유래의 MYB 전사인자는 안토시아닌 합성을 증가시켰지만, 감자, 애기장대 및 포도 유래의 MYB 전사인자는 안토시아닌 합성을 증가시키지 못하였다 (도 8).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

스포라민 유전자의 SPO 프로모터 조절하에 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 담배 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 담배 식물의 안토시아닌 함량을 620배 증가시키는 방법.
삭제
스포라민 유전자의 SPO 프로모터 조절하에 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 고구마 (Ipomoea batatas) 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 담배 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 담배 식물세포로부터 담배 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 620배 증가된 형질전환 담배 식물체의 제조 방법.
삭제
제3항의 방법에 의해 제조된 대조구 식물에 비해 안토시아닌 함량이 620배 증가된 형질전환 담배 식물체.
삭제
제5항에 따른 담배 식물체의 종자.
삭제
제5항의 형질전환 담배 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 담배 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법.
제5항의 형질전환 담배 식물체를 포함하는 사료 조성물.
삭제