KR101261277B1 - 고구마 뿌리 유래의 ＩｂＬＥＡ14 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 스트레스 내성 관련 IbLEA14(pomoea batatas Late embryogenesis abundant 14) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 스트레스 내성 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

고구마 뿌리 유래의 ＩｂＬＥＡ14 유전자 및 이의 용도{IbLEA14 gene from a root of Ipomoea batatas and uses thereof}

본 발명은 고구마 뿌리 유래의 IbLEA14 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 스트레스 내성 관련 IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 스트레스 내성 형질전환 식물체의 제조 방법 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 22톤으로 높아 식량과 가축사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 특히 고구마는 건물 중의 약 70%가 전분으로 이루어져 주정의 원료작물로 오래전부터 이용되었으며, 바이오에탄올 생산을 위한 친환경 대체에너지 작물로 최근 재조명되고 있다.

최근 급속한 산업화와 인구증가에 의해 지구규모의 환경문제와 식량문제가 제기되고 있어 사막화지역, 공해지역, 추운 지역 등의 조건이 불리한 지역에서도 잘 자라는 환경재해 내성 농작물 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 조건 불리 지역에 적합한 산업용 고구마를 개발하기 위하여 분자육종에 의한 환경재해 내성 형질전환 고구마 연구가 시도되고 있다(Lim et al. Mol Breeding 19, 227-239, 2007; Kim et al. Mol Breeding 24, 233-244, 2009).

건조, 염 등의 열악한 토양에서 식물체의 생존과 생장을 증진하는 환경재해 내성 고구마를 개발하기 위해서는 건조, 염과 같은 다양한 스트레스에 특이적으로 과발현하는 유전자의 개발이 절실히 요구된다. 또한 잎에서 광합성의 결과물들이 고구마의 덩이 뿌리의 전분이 되므로 덩이뿌리에서 유용소재를 생산하고자 할 때 잎에서 과발현하는 유전자의 개발 연구는 중요하다고 생각된다. 그러므로 고구마의 덩이뿌리(tuberous root)에 과발현하는 스포라민(sporamin) 단백질을 암호화하는 유전자가 오래전에 분리되어 연구된 바 있다(Hattori et al. Plant Mol Biol 14, 595-604, 1990). 또한, 최근 건조를 포함한 다양한 스트레스 조건에서 고구마의 어린뿌리에 특이적으로 과발현하는 유전자가 보고되고 있으며(Kim et al. Plant Physiol Biochem 46, 196-204, 2008; Kim et al. BMB Rep 41, 259-265, 2008), 이러한 관점에서 스트레스 조건에서 고구마 잎에 특이적으로 강하게 발현하는 유전자의 분리는 환경재해 내성 식물체 및 각종 유용소재를 생산하는 형질전환 고구마를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 즉 첨단 생명공학기술을 이용한 대사공학으로 특히 건조지역, 간척지역 및 공해지역 등의 한계농지(조건 불리지역)에서 잘 자라면서 전분, 기능성 단백질 등 산업적으로 유용한 소재를 생산하는 고구마 품종을 개발하면 식량수급에 영향을 주지 않고 친환경 바이오에너지 등을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 IbLEA14 (Late embryogenesis abundant 14) 단백질은 종자가 건조되면서 성숙되는 동안 다량 발현되는 LEA 단백질 그룹들 중 하나이다. LEA 단백질들은 종자 성숙뿐만 아니라 건조 스트레스에서도 역시 발현된다. LEA 단백질들은 특정한 세포 구조를 보호하거나 이온을 격리하고 세포의 수분 요구량을 최소화로 유지시켜서 건조 스트레스에 내성을 증진시킨다고 보고되고 있다(Baker et al. Plant Mol Biol 11, 277-291, 1988; Dure et al. Plant Mol Biol 12, 475-486, 1989). 대부분의 LEA 단백질들은 세포질에 존재하며, 친수성 아미노산 잔기들로 구성되어 랜덤 코일(random coil) 혹은 알파-나선(α-helices)으로 이루어져 있다. 하지만 LEA14 단백질은 소수성 아미노산 잔기들이 많이 존재하고 3차구조를 가지고 있다(Cuming et al. Kluwer Academic Publishers, Dordercht, The Netherlands, pp 753~780, 1999). 최근 애기장대에서 cDNA 마이크로어레이 실험 결과 건조, 저온 및 염 등과 같은 스트레스 조건에서 LEA14가 정상조건보다 5 배 이상이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, LEA14 단백질은 건조 및 염 등의 다양한 환경스트레스 뿐만 아니라 기계적인 상처에 의해서도 발현이 유도됨이 보고되었다(Seki et al. Plant Cell 13, 61-72, 2001; Singh et al. Protein Sci 14, 2601-2609, 2005). 목화, 콩 및 애기장대 등의 다양한 식물들에서 LEA14가 확인되었으며, 이들은 스트레스 조건에서 식물호르몬인 앱시스산(ABA)에 대해 의존적이거나 독립적으로 발현이 되었다(Wise et al. BMC Bioinformatics 4, 52-70, 2003; Bies-Etheve et al. Plant Mol Biol 67, 107-124, 2008). 하지만 아직 고구마에서 LEA14 유전자가 보고된 바는 없다.

한국공개특허 제2009-0043754호에는 고구마 뿌리 유래의 스트레스 관련 유전자인 IbTIP1 이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0596653호에는 스트레스에 의해 발현이 유도되는 고구마 유래의 퍼옥시다제 유전자가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0930593호에는 고구마 뿌리 유래의 swDREB1 유전자가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 건조 처리된 고구마 실뿌리로부터 분리한 IbLEA14 유전자가 건조, 염, 저온 및 화합물 스트레스를 포함하는 다양한 스트레스 조건하에서 강하게 발현하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마 유래의 스트레스 내성 관련 IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 IbLEA14 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbLEA14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 스트레스 내성 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 고구마 실뿌리 유래의 IbLEA14 유전자는 건조, 염, 저온 및 화합물 스트레스를 포함하는 다양한 스트레스 조건하에 특히 잎에서 강하게 발현이 유도되기 때문에, 이를 이용하면 조건 불리 지역에 적합한 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체를 개발하는데 유용할 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명의 건조 처리된 고구마 뿌리 유래 IbLEA14 유전자의 염기서열과 이로부터 추론한 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 IbLEA14 단백질의 소수성 플롯(hydrophobicity plot)으로 아미노산의 친수성 및 소수성 정도를 나타낸 도면이다.
도 3은 고구마 유래 IbLEA14 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(콩, 토마토, 목화 및 차나무)의 LEA14 유전자 아미노산 서열을 비교한 도면이다.
도 4는 고구마 유래 IbLEA14 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(콩, 토마토, 목화 및 차나무)의 LEA14 유전자 사이의 유연관계를 나타낸 도면이다.
도 5는 고구마의 여러 조직에서 IbLEA14 유전자가 발현하는 양상을 RT-PCR 후, 전기영동을 실시한 결과를 보여준다. L: leaf(잎), S: stem(줄기), TR: tuberous root(저장뿌리), FR: fibrous root(실뿌리), TPR: thick pigmented root(굵은 뿌리).
도 6은 고구마의 여러 조직에서 IbLEA14 유전자가 발현하는 양상을 Realtime PCR로 분석한 그래프이다. L: leaf(잎), S: stem(줄기), TR: tuberous root(저장뿌리), FR: fibrous root(실뿌리), TPR: thick pigmented root(굵은 뿌리).
도 7은 고구마 잎 및 실뿌리에서 건조처리 0, 1, 2, 4, 8, 16 및 24 시간 후에 IbLEA14 유전자의 발현 양상을 나타낸 Realtime PCR 그래프이다.
도 8은 고구마 잎에 식물호르몬인 0.1 mM의 앱시스산(ABA)을 처리하여 0, 2, 4, 8, 12 및 24 시간 후, IbLEA14 유전자의 발현 양상을 나타낸 Realtime PCR 그래프이다.
도 9는 고구마 잎에 100 mM의 염화나트륨(NaCl)을 처리하여 0, 2, 4, 8, 12 및 24 시간 후, IbLEA14 유전자의 발현양상을 나타낸 Realtime PCR 그래프이다.
도 10은 다양한 저온 조건인 25, 15, 10 및 4℃에서 24시간 동안 고구마 식물체를 배양한 후, 잎에서 IbLEA14의 발현 수준을 나타낸 Realtime PCR 그래프이다.
도 11은 고구마 잎에 400 mM 과산화수소, 0.05 mM 메틸 비올로젠(methyl viologen, paraquat), 0.5 mM 카드뮴 및 0.5 mM의 구리를 처리하여 24시간 후, IbLEA14 유전자의 발현 양상을 나타낸 Realtime PCR 그래프이다.
도 12는 IbLEA14 유전자가 고구마의 게놈상에 존재하는 것을 확인한 서던 블롯의 결과를 보여준다.
도 13은 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 14는 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2를 이용하여 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인에서 항생제 선발 마커 유전자인 HPT (hygromycin phosphotransferase) 및 IbLEA14 cDNA의 도입 여부를 게놈 DNA의 PCR로 분석한 것이다.
도 15는 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2로 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인에서 IbLEA14의 발현 양상을 Realtime PCR로 분석한 것이다.
도 16은 IbLEA14 유전자가 과발현된 형질전환 고구마 캘러스에서 IbLEA14 단백질의 발현 수준을 FLAG-tag 항체를 이용하여 분석한 것이다.
도 17은 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2로 형질전환시킨 고구마 캘러스 라인을 PEG(건조) 및 NaCl(염)로 처리한 다음, 시각적 손상 정도 및 지질과산화의 정도를 분석한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 고구마 유래의 스트레스 내성 관련 IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 IbLEA14 단백질의 범위는 고구마로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 IbLEA14 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 IbLEA14 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 IbLEA14 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 IbLEA14 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열 및 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

본 발명의 구현예에 따라, IbLEA14 유전자는 바람직하게는 고구마 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 고구마 IbLEA14 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 IbLEA14 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, IbLEA14 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

IbLEA14 단백질-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pKBS1-1 벡터, pBI101 벡터 및 pCAMBIA 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 IbLEA14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 스트레스는 건조, 저온, 염 또는 화합물 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 저온은 4~15℃, 바람직하게는 15℃이다. 상기 염은 바람직하게는 NaCl이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 화합물은 바람직하게는 과산화수소, 메틸 비올로젠, 카드뮴 또는 구리일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae) 또는 난초과(Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 식물체는 십자화과, 가지과, 장미과 또는 메꽃과에 속하는 식물체이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 스트레스 내성 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명은 또한, 본 발명의 IbLEA14 유전자를 포함하는, 식물의 스트레스에 대한 내성을 증진시키기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 IbLEA14 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 고구마 유래의 IbLEA14 유전자를 포함하며, 상기 유전자 IbLEA14를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 스트레스 내성을 증진시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고구마 IbLEA14 유전자의 클로닝 , 염기서열 분석 및 유연관계 분석

고구마(Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. White star) 식물체를 MS (Murashige and Skoog, 1962) 기본배지에서 60일 동안 배양하였다. MS 기본배지에서 배양된 고구마 식물체는 25℃ 항온기에서 16시간 광 및 8시간 암주기에서 60일간 배양 후, 토양으로 옮겨졌다. 토양으로 옮긴 고구마는 25℃ 항온기에서 16 시간 광 및 8시간 암주기 조건으로 14일간의 순화과정을 거친 후 실험에 사용되었다. 토양에서 재배된 식물체의 실뿌리를 분리하여 25℃ 항온기에 6시간 동안 건조처리를 하였다. 건조처리 후 실뿌리(fibrous root) 조직을 CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)을 통해 총 RNA를 분리하였다. Poly(A) Tract mRNA 분리 시스템(Promega사)을 사용하여 mRNA를 분리하고, SMART-cDNA 합성키트(Clontech사)를 사용하여 건조 처리된 고구마 실뿌리의 cDNA 라이브러리를 제작하였다 (Kim et al. BMB Rep 42, 271-276, 2009). RISA 384 multi-capillary sequencer (Shimadzu 사)를 이용하여 염기서열을 분석한 후 CAP3 프로그램을 이용하여 각 서열의 클러스터(cluster)를 만들었다. 각 ESTs의 기능 분석은 NCBI 데이타베이스를 이용하였다. 그 중 3개의 LEA14 클러스터를 찾았고, 동일한 방법으로 서열 분석한 결과 1개의 동일한 서열임을 확인하였다.

IbLEA14 cDNA 유전자의 전체길이는 793 bp로써 102 bp의 5'-말단 비번역영역(UTR), 211 bp의 3'-말단 비번역영역 및 480 bp의 코딩영역(160 개의 아미노산으로 구성)으로 구성되어 있음을 보였다(도 1). 또한 IbLEA14 단백질의 친수성 아미노산 잔기와 소수성 아미노산 잔기의 분포를 조사한 결과, 높은 소수성을 나타내었다(도 2).

고구마 IbLEA14의 코딩영역을 블라스트(BlastX)로 조사하였을 때 콩(Glycine max)의 GmLEA14과 아미노산 수준에서 70%의 상동성을 보였으며, 토마토 (Lycopersicon esculentum)의 LeER5와는 61%의 상동성을 보였다(도 3). 고구마 IbLEA14의 추정되는 단백질의 아미노산 서열과 다양한 식물 종의 LEA 사이의 유연관계를 ClustalW 프로그램(http://plant.pdrc.re.kr/gene/align/ClustalW.html)을 이용하여 조사한 결과 고구마 IbLEA14는 LEA14계열의 단백질임을 확인하였다(도 3 및 4).

실시예 2: 고구마 조직별 IbLEA14 유전자의 발현 분석

건조 처리한 고구마 뿌리로부터 분리한 본 발명의 고구마 IbLEA14의 조직별 발현양상을 분석하기 위해 RT-PCR 및 Realtime PCR을 수행하였다. CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)으로 고구마 조직(잎, 줄기, 저장뿌리, 실뿌리 및 굵은 뿌리)으로부터 총 RNA를 추출한 후, RNA 2㎍을 사용하여 MMLV Reverse Transcription System cDNA 합성키트(Promega사)로 cDNA를 합성하였다. IbLEA14 유전자 특이적 프라이머 및 Accel Taq Premix 키트(Genedocs사)를 사용하여 IbLEA14 유전자의 발현양상을 조사하였다. IbLEA14에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3'; 서열번호 3) 및 역방향(5'-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3'; 서열번호 4) 프라이머를 사용하였다. 그 결과 IbLEA14 유전자는 실뿌리(fibrous root) 및 굵은 뿌리(thick pigmented root)에서 강하게 발현되었으며, 저장뿌리(tuberous root) 및 줄기(stem)에서도 발현되었다. 하지만 잎(leaf)에서는 매우 약하게 발현되는 양상을 보였다(도 5 및 6). 따라서 건조처리된 고구마 뿌리 조직에서 분리한 IbLEA14 유전자는 정상 생육조건에서 실뿌리 및 굵은 뿌리에서 주로 발현되는 유전자임을 알 수 있었다.

실시예 3: 건조처리를 포함한 다양한 스트레스 처리에 의한 IbLEA14 유전자의 발현특성 분석

IbLEA14 유전자가 건조를 포함한 다양한 스트레스 처리에 대해 반응하는 정도를 분석하기 위해, 다양한 스트레스 조건인 건조, 식물호르몬(ABA), 저온 및 스트레스 관련 화합물 처리를 한 후 IbLEA14 유전자의 발현 변화를 Realtime PCR을 이용하여 분석하였다.

먼저, IbLEA14 유전자가 건조처리에 의해 반응하는 정도를 분석하기 위해, 고구마의 잎 및 실뿌리 조직을 시간대별(0, 1, 2, 8, 16 및 24시간)로 건조처리한 후에 상기 실시예 2에서 수행한 방법으로 RNA를 분리한 후, cDNA를 각각 합성하였다. 상기 실시예 2에서 사용한 IbLEA14 유전자 특이적 프라이머로 Realtime PCR을 수행하였다. 그 결과 IbLEA14 유전자는 잎 조직에서 건조처리 16시간 후에 가장 강한 발현 수준을 보였으며, 24시간 후까지 강한 발현 수준이 유지되었다(도 7). 반면에 실뿌리 조직에서는 건조처리에 의한 IbLEA14의 발현량이 1시간 이후 가장 강한 발현 수준을 보였으며, 24시간 후까지 발현 수준이 유지되었다.

일반적으로 건조 스트레스 하에서는 식물호르몬인 앱시스산의 양이 증가되며, 앱시스산이 건조에 대응하여 식물의 기공 개폐를 조절하는 것으로 알려져 있다 (Cornic et al. Trends Plant Sci 5, 187-188, 2000). 따라서 건조처리에 반응한 IbLEA14 유전자가 앱시스산 처리에 의해서 발현이 증가하는 지를 관찰하기 위해, 고구마의 잎 조직에 0.1 mM의 앱시스산을 시간대별(0, 2, 4, 8, 12 및 24시간)로 처리한 후 동일한 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였으며 Realtime PCR을 수행하였다. 그 결과, 처리 2시간 후에 발현증가가 확인되었으며, 처리 24시간 후까지 발현이 유지되었다(도 8). 따라서 고구마의 IbLEA14 유전자는 앱시스산에 대한 의존적인 신호전달 기작에 의해 그 발현이 조절되는 것으로 생각된다.

애기장대의 LEA14 유전자는 건조 및 염 스트레스에 대한 발현유도 특성을 보였다(Seki et al. Plant Cell 13, 61-72, 2001). 그러므로, IbLEA14의 염 스트레스에 대한 반응성을 알아보기 위해 100 mM 염화나트륨을 시간대별(0, 2, 4, 8, 12 및 24시간)로 처리한 후, 동일한 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였으며 Realtime PCR을 수행하였다. 그 결과, 처리 2시간 후부터 발현이 증가하기 시작하였으며, 처리 12시간 후에 최고의 발현 수준을 보였다(도 9).

다음으로 IbLEA14 유전자의 다양한 저온조건에서의 반응성을 알아보기 위해, 다양한 온도조건(25, 15, 10 및 4℃)에서 24시간 동안 배양하여 유전자 발현수준을 조사하였다. 그 결과, 15℃에서 12시간 동안 처리한 식물체의 잎에서 25℃의 대조군보다 6배 높은 IbLEA14의 발현증가를 보였다(도 10).

다음으로 IbLEA14의 다양한 화합물 스트레스에 대한 반응성을 알아보기 위해, 400 mM 과산화수소(H₂O₂), 0.05 mM 메틸 비올로젠(methyl viologen, paraquat), 0.5 mM 카드뮴(Cd) 및 0.5 mM의 구리(Cu)를 24시간 동안 처리 후, 동일한 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였으며 Realtime PCR을 수행하였다. 메틸 비올로젠은 활성산소를 과량으로 발생하여 식물을 고사시키는 비선택성 제초제이다(Babbs et al. Plant Physiol 90, 1267-1270, 1989). 각각의 대조군으로는 멸균수를 사용하였다. 그 결과, IbLEA14 유전자는 과산화수소, 메틸 비올로젠 및 구리를 처리하였을 때 잎 조직에서 발현 증가를 보였고, 특히 카드뮴 처리를 하였을 때 강한 발현 증가를 보였다(도 11). 상기 결과들은 IbLEA14 유전자가 다양한 스트레스에 반응성을 가진다는 것을 보여준다. 따라서 IbLEA14 유전자는 건조, 염 등의 열악한 토양에서 유식물체의 초기 생장을 좋게 하는 환경재해 내성식물체(고구마 포함)의 개발에 도움이 될 것으로 판단된다.

실시예 4: IbLEA14 유전자의 서던 블롯 분석

IbLEA14 유전자의 고구마 게놈(genome) 내의 존재 및 다른 상동성 유전자의 존재 여부를 관찰하기 위하여 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)을 실시하였다. CTAB 방법으로 고구마 잎으로부터 게놈 DNA를 분리 및 정제한 후 EcoRI, HindIII 및 BamHⅠ로 절단하였다. 제한효소로 절단된 게놈 DNA를 전기영동한 후, IbLEA14 cDNA의 3'-말단 특이적 영역의 300 bp를 ³²P 방사성 동위원소로 표지한 탐침자를 사용하여 서던 블롯을 수행하였다.

그 결과 IbLEA14 유전자는 제한효소로 절단된 각 절편들에서 IbLEA14의 탐침자가 인식하는 DNA 밴드가 1개 이상 존재하여 본 발명의 IbLEA14 유전자가 고구마 게놈 내에 여러 카피(copy) 수로 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 12).

실시예 5: IbLEA14 유전자의 과발현 벡터와 RNAi 벡터의 제조 및 이를 이용하여 형질전환된 고구마 캘러스

IbLEA14 유전자의 스트레스 내성과 관련된 기능 분석을 위해 형질전환 발현벡터를 제작하였다. IbLEA14의 과발현을 위해 IbLEA14에 대한 코딩지역 특이적 프라이머는 attB1와 attB2 염기서열을 포함한 정방향(5'-ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATCTGGTGGACAAG-3'; 서열번호 5) 및 역방향(5'-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGCAGCTTCTGCCTC-3'; 서열번호 6) 프라이머를 사용하였다. PCR 최종 산물은 BP 클로나제(clonase) 재조합 반응을 이용한 Invitrogen사의 pDONR 207 벡터에 도입하였으며, BP 클로나제 반응 후 DNA 단편들은 N 말단에 FLAG-tag이 포함된 과발현 벡터인 pGWB12와 RNAi 벡터인 pH7GWIW2에 CaMV35S 프로모터의 발현 조절이 되도록 삽입하였다. 재조합 플라스미드는 아그로박테리움 EHA105 균주를 이용해 고구마 캘러스에 형질전환 하였다(도 13).

형질전환 고구마 캘러스의 도입된 IbLEA14와 HPT 항생제 선발 마커 유전자는 게놈 PCR을 통해 확인하였다(도 14). CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)으로 고구마 캘러스 라인들의 게놈 DNA를 추출한 후, IbLEA14와 HPT 항생제 선발 마커 유전자의 특이적 프라이머 및 Accel Taq Premix 키트(Genedocs사)를 사용하여 도입 여부를 조사하였다. IbLEA14에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3'; 서열번호 3) 및 역방향(5'-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3'; 서열번호 4) 프라이머를 사용하였으며, HPT 에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GATGTAGCAGGGCGTGGA-3'; 서열번호 7) 및 역방향(5'-GATGTTGGCGACCTCGTA TT-3'; 서열번호 8) 프라이머를 사용하였다. 그 결과 두 종류의 벡터가 삽입된 형질전환 캘러스에서 IbLEA14 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있었다.

형질전환 고구마 캘러스에서 IbLEA14 유전자의 발현 수준을 분석하기 위해 Realtime PCR을 수행하였다(도 15). CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)으로 고구마 캘러스로부터 총 RNA를 추출한 후, RNA 2 ㎍을 사용하여 MMLV Reverse Transcription System cDNA 합성 키트(Promega사)로 cDNA를 합성하였다. IbLEA14 유전자 특이적 프라이머 및 Accel Taq Premix 키트(Genedocs사)를 사용하여 IbLEA14 유전자의 발현 양상을 조사하였다. IbLEA14에 대한 특이적인 프라이머는 정방향(5'-GCCCTGGATGTGGCAGTG-3'; 서열번호 3) 및 역방향(5'-GGCAGCTTCTGCCTCTGCTTC-3'; 서열번호 4) 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 과발현 캘러스 라인 3, 7, 8, 11 및 12번은 비형질전환체보다 7배 이상 높은 발현 수준을 보였으며, RNAi 라인 2, 5, 9 및 10번은 비형질전환체보다 약 80% 낮은 발현수준을 보였다.

과발현된 형질전환 고구마 캘러스에서 IbLEA14 단백질의 발현 수준을 분석하기 위해 FLAG-tag 항체를 이용해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 16). 과발현된 7, 8 및 11번 캘러스 라인에서 IbLEA14 단백질이 강한 발현을 나타내었다. 따라서, 상기 결과를 통해 IbLEA14 유전자가 과발현되거나 발현억제된 형질전환 고구마 캘러스가 성공적으로 제조된 것을 확인하였다.

실시예 6: IbLEA14 형질전환 캘러스의 건조 및 염 스트레스에 대한 내성 분석

형질전환 캘러스의 건조 및 염 스트레스에 대한 내성 변화를 확인하기 위해 고구마 캘러스에 PEG (polyethylene glycol) 및 NaCl을 처리한 다음, 그 손상 정도를 지질 과산화의 정량 분석을 통해 조사하였다(도 17). 2주간 배양한 형질전환 캘러스를 30% PEG 및 300 mM NaCl이 첨가된 MS 고체배지에서 72 시간 동안 처리하였으며, 지질 과산화의 정량 분석은 TBA (thiobarbituric acid) 방법을 이용하였다(Peever and Higgins, Plant Physiol 90, 867-875, 1989). IbLEA14가 과발현된 캘러스 라인은 PEG 및 NaCl 처리군에서 RNAi 라인에 비해 낮은 지질과산화 수준을 보이며 건조 및 염 스트레스에 대해 내성을 보였다. 반면에 RNAi 라인들은 건조 및 염 스트레스에 대해 증가된 감수성을 나타내었다. 따라서, IbLEA14의 발현이 고구마 캘러스에서 건조 및 염 스트레스에 대한 내성 증가와 연관됨을 알 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> IbLEA14 gene from a root of Ipomoea batatas and uses thereof <130> PN11008 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 793 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 1 gacgtcatga catatatgag cgtacgtgca taaagagaca agattcaaat ctctcacttt 60 cacgttcagt ttcagtttca gtttcagttt cgaggttgaa aaatggatct ggtggacaag 120 gctaagaatt tcgtgggaga aaagctggcg gagatggaga aaccggaggc cagcatcgcc 180 gacgttgata tcaagggtgt tggattcgac ggtttttcct ttctagctaa ggtcgacgtc 240 aagaatcctt actctgttcc cattcccatc tgcgagatca aatacgagct caagagcgcc 300 ggcagggtga tagcttcagg cacgattcca gacccagggt caattaaggg aaaggacaca 360 accgccctgg atgtggcagt gaaggtgcca cacagtgtgg tggtgaactt ggcgagggac 420 attggtggag attgggacat tgactatcaa cttgatattg gcctcatcat tgatcttcct 480 gtcgttggaa actttaccat tccattgtct cagtcgggtg agatcaagct cccaaccttt 540 tctgatttct ggaagaaacc agaagcagag gcagaagctg cctaacagac atgatcatta 600 acagtggtgt tatatcatta tatgtagtca taacaagatg atgagatgat gaataatgta 660 gttttacaat aacagttgct ttttgcacta tgtagtatgt accttgtttc atttcatcaa 720 atcaaagacc tttttactgt tgtgtcttca aaaaaaaaaa aagaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaa 793 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Ipomoea batatas <400> 2 Met Asp Leu Val Asp Lys Ala Lys Asn Phe Val Gly Glu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Glu Met Glu Lys Pro Glu Ala Ser Ile Ala Asp Val Asp Ile Lys Gly 20 25 30 Val Gly Phe Asp Gly Phe Ser Phe Leu Ala Lys Val Asp Val Lys Asn 35 40 45 Pro Tyr Ser Val Pro Ile Pro Ile Cys Glu Ile Lys Tyr Glu Leu Lys 50 55 60 Ser Ala Gly Arg Val Ile Ala Ser Gly Thr Ile Pro Asp Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ile Lys Gly Lys Asp Thr Thr Ala Leu Asp Val Ala Val Lys Val Pro 85 90 95 His Ser Val Val Val Asn Leu Ala Arg Asp Ile Gly Gly Asp Trp Asp 100 105 110 Ile Asp Tyr Gln Leu Asp Ile Gly Leu Ile Ile Asp Leu Pro Val Val 115 120 125 Gly Asn Phe Thr Ile Pro Leu Ser Gln Ser Gly Glu Ile Lys Leu Pro 130 135 140 Thr Phe Ser Asp Phe Trp Lys Lys Pro Glu Ala Glu Ala Glu Ala Ala 145 150 155 160 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gccctggatg tggcagtg 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 ggcagcttct gcctctgctt c 21 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IbLEA14 forward primer <400> 5 acaagtttgt acaaaaaagc aggcttcatg gatctggtgg acaag 45 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IbLEA14 reverse primer <400> 6 accactttgt acaagaaagc tgggtcttag gcagcttctg cctc 44 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPT forward primer <400> 7 gatgtagcag ggcgtgga 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPT reverse primer <400> 8 gatgttggcg acctcgtatt 20

Claims (13)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고구마 유래의 스트레스 내성 관련 IbLEA14(Ipomoea batatas Late embryogenesis abundant 14) 단백질.
2. 제1항의 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제4항의 재조합 벡터를 고구마 식물세포에 형질전환시켜 IbLEA14 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 고구마 식물의 과산화수소, 메틸 비올로젠, 카드뮴 또는 구리의 화합물 스트레스, 건조, 저온 또는 염 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 제6항의 방법에 의해 제조된 과산화수소, 메틸 비올로젠, 카드뮴 또는 구리의 화합물 스트레스, 건조, 저온 또는 염 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 고구마 식물체.
10. 삭제
11. 제9항에 따른 고구마 식물체의 종자.
12. 제4항의 재조합 벡터로 고구마 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 고구마 식물세포로부터 고구마 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 과산화수소, 메틸 비올로젠, 카드뮴 또는 구리의 화합물 스트레스, 건조, 저온 또는 염 스트레스 내성 형질전환 고구마 식물체의 제조 방법.
13. 제2항의 유전자를 포함하는, 고구마 식물의 과산화수소, 메틸 비올로젠, 카드뮴 또는 구리의 화합물 스트레스, 건조, 저온 또는 염 스트레스에 대한 내성을 증진시키기 위한 조성물.

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