KR101282408B1 - 벼 유래의 ＯｓＨＭＢ４ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래의 식물 발달 조절 단백질 OsHMB4(Oryza sativa homeobox 4), 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 발달을 조절하는 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 발달 조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

벼 유래의 ＯｓＨＭＢ４ 유전자 및 이의 용도{OsHMB4 gene from Oryza sativa and uses thereof}

본 발명은 벼(Oryza sativa) 유래의 OsHMB4(Oryza sativa homeobox 4) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 식물 발달 조절 단백질 OsHMB4, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 발달을 조절하는 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 발달 조절용 조성물에 관한 것이다.

호메오박스(HMB, homeobox)는 발달 과정에 수반되는 수많은 유전자들에 존재하는 180 bp 컨센서스 DNA 서열이다. HMB는 60 아미노산 단백질 모티프 호메오도메인(HD, homeodomain)을 코딩하는데, 상기 도메인은 루프(loop) 및 턴(turn)으로 구분되는 3 개의 α-나선으로 이루어진 특징적인 DNA-결합 구조로 폴딩한다. 따라서, HD는 TFs(transcription factors)로서 작용하는 HD 포함 단백질에 의한 다른 유전자들의 서열-특이적 인식을 가능케 하여, 상기 표적 유전자들의 발현을 조절한다. DNA 인식은, DNA의 주된 그루브(groove) 내에 있는 나선 III 및 N-말단 유연성 암(arm) 및 나선 I 및 II 사이의 루프에 의해 성립된다. HD에 의해 효율적으로 결합되는 대부분의 DNA 서열들은 ATTA(상보 가닥에서는 TAAT) 코어를 포함하는데, 이는 고도로 보존된 아미노산과 상호작용한다(Chan et al., 1998, 1442: 1-19). HD-포함 단백질은 인간, 초파리, 선충류 및 식물을 포함하는 다양한 유기체에서 밝혀진 바 있다. 몇가지 호메오박스 유전자들은 식물에서 밝혀진 바 있고, HD의 아미노산 서열 및 다른 보존된 모티프의 존재를 근거로 하여 상이한 그룹으로 목록작성된(catalogued) 바 있다(Jain et al., 2008, FEBS J. 275:2845-2861).

모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 벼(Oryza sativa)의 전체 게놈 서열의 최근 완결은 개화 식물들의 단백질 패밀리의 게놈-전체(genome-wide) 분석을 가능케 한다. 몇가지 연구들은 게놈-전체 규모로 벼 HMB 패밀리를 조사했고 (Jain et al., 2008, FEBS J. 275:2845-2861), 계통발달론적 분석은 상기 형성된 패밀리가 뒷받침이 잘된 서브패밀리를 보여준다는 것을 나타냈다. HD 이외에도, 각각의 서브패밀리는 그에 특화된 1 또는 2 개의 추가 도메인(들)을 포함할 수도 있다. 그러나, 벼에서의 HMB 유전자의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

유전자의 발현 패턴은 종종 그의 기능과 상관있기 때문에, 발현 프로파일 및 게놈-전체 분석 사이의 조합은 방대한 수의 뉴클레오티드 서열 뒤에 감춰진 정보를 해독할 새로운 기회를 제공할 것이다. 마이크로어레이는 이러한 접근법들 중 하나이며, 잠재적인 대상체의 범위를 최소화하는데 특히 유용하다. 이러한 장점들로, 마이크로어레이는 유전자 발현을 연구함에 있어서, 개척 업적으로서의 아라비돕시스에서, 인간 및 효모에 대해서, 그리고 더욱 최근에는 식물에 대해서 독보적으로 이용되어 왔다. 벼 게놈에서는, 2,300 개를 초과하는 추정의 전사 인자들이 예측되었으며, 이들 중 절반 이상은 발현되는 서열에 의해 뒷받침되었다(Wu et al., 2006, J. Integr. Plant Biol. 48: 1216:1224).

본 연구에서, 벼에서의 1,239개의 TF(transcription factor)를 포함하는 27,614개의 유전자의 어레이를 300k 3'-틸링 마이크로어레이(3'-tiling microarray)에 사용하여, 상이한 조직에서 식물생장 및 생식 발달과 관련된 각종 단계에서의 유전자 발현을 조사한 결과, HMB4는 종자 발아, 개화시 고도로 발현되는 것을 확인하였으며, 따라서 개화와 결부되어 있을 것으로 예측되나, 현재 이에 대해서 보고된 바는 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 식물성장 및 생식 발달과 관련된 각 단계에서 과발현되는 HMB4 유전자를 찾아내었고, 이 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 벼 식물체가 야생형에 비해 조기 개화가 유도되고, 성장 속도가 빨라지고, 종자의 크기가 더 커져 질량이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 식물 발달 조절 단백질 OsHMB4을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 식물의 발달을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용한 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 발달 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 OsHMB4 유전자를 이용하여 식물체의 개화 시기, 식물체의 성장 속도 또는 종자 크기를 포함한 식물체 발달을 조절할 수 있으며, 이를 통해 작물의 생산성 및 상품성 증대를 도모할 수 있다.

도 1은 상이한 생장 단계 동안 상이한 조직에서의 HMB4의 발현 패턴을 나타낸다. 발아하는 종자(GermSeed)로부터 샘플을 수집하고, 14-일령 유식물을 일반 조건(잎, 뿌리)에서 생장시켰다. 상이한 생장 단계에서의 원추: 단계 0, 1, 2, 3 또는 수분 이전, 이후 (NPS0, NPS1, NPS2, NPS3 또는 BefPol, AftPol); 또한, 캘러스 및 재생 캘러스(Callus, RegCal)도 시험했다.
도 2는 형질전환 벼가 일관적으로 이른 출수기를 나타낸다. T2 식물을 2010년 하계-춘계 동안 야외에서 생장시켰고, T3 식물은 2010년에서 2011년에 이르는 동계 동안 온실에서 생장시켰다.
도 3은 잎, 지엽, 원추 출수 이전 및 이후(L, FL, BH 및 AH)에서의 생식 단계 동안의 HMB4의 발현 패턴(A) 및 프라이머 쌍(B)을 나타낸다. HMB4 프라이머쌍은 IM, S8a, T12b에 이용했고, G-H 프라이머쌍은 T12b에 대해서만 이용했다.
도 4는 식물 발달의 초기 단계에서의 1차적인 시험을 나타낸다. (A, B) 4일령(A) 및 2주령(B) 유식물의 센티미터로 나타낸 초장(height), (C) 4일령 유식물의 외관, (D) 2주령 유식물의 잎 샘플에서의 RT-PCR 결과, (E) 형질전환 및 백그라운드 종자의 발아율
도 5는 3'-틸링 마이크로어레이를 위한 프로브 디자인을 나타낸다. 벼 3'-틸링 마이크로어레이는 IRGSP, RAP1 데이터베이스(http://rapdb.lab.nig.ac.jp)에 기탁된 27,448개의 유전자로부터 고안되었다. 10가지 60-nt 길이 프로브는 각 유전자의 정지 코돈 말단 앞쪽 60bp에서 출발하여 10bp의 변동이 있게 고안되어, 10가지 프로브가 유전자의 3' 영역 내 150bp를 포함한다.
도 6은 형질전환 벼를 제조하기 위한 벡터 구축을 나타낸다. (A) 과발현 또는 단순 구축물(construct)은 Rab21 프로모터 및 3'NOS 터미네이터의 구동 하에 TF 유전자를 포함한다. 벡터는 또한 2 개의 기타 카셋트를 포함한다: 각각 리포터 및 선별 인자로서의, Wsi18 프로모터, GFP 코딩 영역, 3'PinII 터미네이터 및 P35S 프로모터, BAR 유전자, 3'NOS 터미네이터, (B) 융합- 또는 태그된- 단백질 구축물은 PGD 프로모터 및 3'PinII 터미네이터에 의해 구동되는, 10 His-GST 이중 태그에 융합되어 있는 TF 유전자를 포함한다. 2 개의 기타 카셋트는 (A)와 완전히 동일하다.
도 7은 T-DNA 플랭킹(flanking) 분석을 나타낸다. (i) gDNA를 제한효소로 절단함; (ii) 절단한 혼합물을 어댑터와 라이게이션함; (iii) 두번째 혼합물을 첫번째 단계에 사용한 것과 동일한 효소로 다시 절단함; (iv) PCR 증폭(2회 PCR); (v) 적당한 프라이머를 이용한 PCRII 생성물의 직접적인 서열분석

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa) 유래의 식물 발달 조절 단백질 OsHMB4(Oryza sativa homeobox 4)를 제공한다.

본 발명에 따른 OsHMB4 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 발달을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 OsHMB4 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 OsHMB4 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 OsHMB4 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 OsHMB4 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

서열번호 1로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열 및 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2로 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

본 발명의 구현예에 따라, OsHMB4 유전자는 바람직하게는 벼 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 벼 OsHMB4 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 OsHMB4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, OsHMB4 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsHMB4 단백질-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pKBS1-1 벡터, pBI101 벡터 및 pCAMBIA 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsHMB4 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 발달을 조절하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물의 발달 조절은 개화 시기, 식물체의 성장 속도 또는 종자 크기를 조절하는 것이고, 더욱 바람직하게는 상기 OsHMB4 유전자를 과발현시켜 야생형에 비해 조기 개화를 유도하거나, 식물체의 성장 속도를 증진시키거나, 종자의 크기를 증가시키는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 발달이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물체는 야생형에 비해 조기 개화가 유도되거나, 식물체의 성장 속도가 증진되거나, 종자의 크기가 증가된 식물체일 수 있다. 상기 식물체는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 벼 식물 일수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과(Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과(Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae) 또는 난초과(Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과(Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과(Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과(Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과(Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과(Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과(Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과(Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과(Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과(Callitrichaceae), 운향과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과(Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae) 또는 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 OsHMB4 유전자를 포함하는, 식물의 발달 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 OsHMB4 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 벼 유래의 OsHMB4 유전자를 포함하며, 상기 유전자 OsHMB4를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 발달을 조절할 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 벼 300k 3'-틸링 마이크로어레이(3'-tiling microarray)

비-형질전환 벼 종자(Oriza sativa L. japonica 품종 Nipponbare)를 MS0(Murashi and Skoog) 배지 상에서 발아시키고, 생장 챔버 내에서 인큐베이션했다(28℃, 암실에서 2일에 이어, 광 하에 1일). 이어서, 유식물들을 토양으로 옮기고, 온실에서 성장시켰다(16-시간-명/8-시간-암 주기). 이어서, 식물을 성숙화 때까지 성장시켜 원추(panicle) 샘플을 수집했다. 성숙 종자(Oriza sativa L. cv. Nakdong)로부터의 배 발달 캘러스용으로, 벼 종자들을 선행기술에 기재된 바와 같이 배양했다(Jang et al., 1999, Mol. Breed. 5: 453-461). 재생 캘러스는 캘러스를 아그로박테리움으로 형질전환하지 않고 재생 배지로 옮겨 수합했다.

총 RNA는 TriReagent(Molecular Research Center, Inc.)를 이용해 추출했다. 이어서, 상기 RNA를 이용해, 발현 프로파일링을 벼 3'-틸링 마이크로어레이 분석으로 수행했다. 발현 프로파일링은 NimbleGen(http://www.nimblegen.com)에서 제작한 벼 3'-틸링 마이크로어레이를 이용해 수행했는데, 이는 International Rice Genome Sequencing Project Rice Annotation Project 1 database (http://rapdb.lab.nig.ac.jp)에 기탁된 27,448가지 유전자를 포함한다. 상기 통계 분석을 포함하는 마이크로어레이에 대한 추가 정보는 http://www.ggbio.com (GreenGene Biotech)에서 찾을 수 있다. 마이크로어레이 분석의 재현성을 평가하기 위해, 독립적으로 제조된 총 RNA를 이용해 상기 실험을 2 또는 3회 반복했다. 이중 나선 cDNA의 분석을 위해, Superscript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(Invitrogen, U.S.A.)를 이용했다.

R 전산 환경에서의 림마 패키지(limma package) (Smyth, 2004)를 이용해 다중적인 분석을 수행했다. 상기 패키지는 lmFit에 의해 실행되는 선형적 모델링 접근법 및 eBayes에 의해 실행되는 실험적 Bayes 통계학을 채택했다. 0.05 미만의 조정된-P-값 또는 오류 발견이 있는 유전자를 수집해, 단계 1일 때에 비해 적어도 한 단계에서 유전자 발현이 1 초과 또는 -1 미만인 것을 선별했다. 클러스터링, 주요 요소 분석(principal component analysis) 및 다차원적 스케일링 (multidimensional scaling)과 같은 다변량 통계 시험은 Acuity 3.1(Axon Instruments)를 이용해 수행했다. 계층적 클러스터링은 유클리드 제곱 상관관계(squared Euclidean correlation)을 기반으로 한 유사성 측량으로 수행했고, 평균 거리 클러스터링은 유전자의 거리를 계산하는데 이용했다.

2. 벡터 구축 및 벼로의 형질전환

과발현 벡터의 구축을 위해, TF의 FLcDNA를 바이너리 벡터(pSB11 벡터로부터 유도함, 상세한 구성 요소들은 도 6 참고)에 Gateway technique(Invitrogene)에 의해 삽입했다. TF의 발현은 건조 특이적 또는 구성적 프로모터(constitutive promoter)인 Rab21 또는 PGD1에 의해 각각 구동되었다. 이어서, 구축물을 트리페어런탈 메이팅(triparental mating)에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) LBA 4404로 도입하고, 선행 기술(Jang et al., 1999, Mol. Breed. 5: 453-461)에 기재된 바와 같이 성숙 종자(Oriza sativa L. cv. Nakdong)로부터 배 발달 캘러스로 형질도입했다.

3. T-DNA 플랭킹 서열 분리 및 서열분석

벼에 대한 유전자의 성공적인 형질전환을 확인하기 위해, 온실로 이동 후 T0 세대 형질전환 벼의 잎을 샘플링했다. 이어서, gDNA를 제조사의 매뉴얼에 따라 Dneasy 96 Plant Kit(Qiagen)를 이용하여 추출했다. 이어서, 절단을 위해 HaeIII와 어댑터로써 Ada-422를 이용해 플랭킹 분석을 수행했다(도 7, 더 많은 정보는 www.ggbio.com 에서 찾을 수 있음).

4. 반-정량적(sq) RT-PCR 분석

RNA는 3'-틸링 마이크로어레이용으로 사용한 것과 동일한 방법으로 제조했다. 첫번째 가닥 cDNA 합성을 위해서는, 5 ㎍의 총 RNA를 Super Script III First Strand kit(Invitrogen)를 이용해 제조사의 매뉴얼에 따라 역전사시켰다. 이어서, 벼의 cDNA 혼합물은 2배 희석했다. 유전자 특이적 프라이머(표 1)는 Primer Designer 4 소프트웨어(Sci-ed. Software, NC)를 이용해 고안했다. PCR은 1 ㎕ 벼 cDNA 분취물, 0.25pM 유전자-특이적 프라이머, 10 ㎕의 2x PCR master mix(Intron biotechnology, Inc.)를 포함하는 20 ㎕ 용액에서 수행했다. 반응은, 94℃에서의 2 분 변성, 이어서 20 내지 35 사이클의 PCR(95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초), 및 최종적인 10 분간의 68℃를 포함했다. 이후, 10 ㎕의 반응 혼합물을 2% 아가로스 겔 상에서 분리했다. 이어서, 밴드는 MultiGauge v2.3(Fujifilm, Japan)로 상대적으로 정량했다. RT-PCR의 재현성을 수득하기 위해, 실험은 3개의 독립적인 생물학적 복제 샘플을 이용해 2회 반복했다.

실시예 1: 상이한 생장 단계 동안 상이한 조직에서의 HMB4의 발현 프로파일

HMB4는 마이크로어레이 결과를 근거로 상이한 생장 단계 동안 상이한 조직에서 활성이 있다. 도 1은 원추 발달, 종자 발아 및 캘러스 재생의 상이한 단계에서의 HMB4의 유도를 보여줘, 성장 및 발달에서의 HMB4의 연관성을 시사한다.

실시예 2: HMB4 과발현 벼는 이른 출수기를 나타낸다.

이어서, HMB4를 분리하고(낙동 품종), 상이한 벡터에 삽입하고(방법 참조), HMB4로 벼(Oriza sativa L. japonica 품종 Ilmi_IM)를 형질전환했다. 두 구축물을 이용해, 백그라운드에 비해 형질전환 벼(S8a_4 및 T12b_1, 벡터 구축 및 명칭 약어에 대해서는 방법 참조)에서 더 이른 출수기가 관찰되었다(도 2). 그때까지, T2 식물의 사진을 촬영했는데, 형질전환 식물은 이미 수분을 마친 반면, IM 원추는 아직도 "출수전" 단계였다(도 2). 이어서, 2010 년 겨울 동안 온실에서 상기 식물의 종자로부터 T3 식물을 생성함으로써 상기 두 라인의 더욱 이른 개화 형질을 확인했다. 온실 조건이 벼 성장에 최적인 것은 아니어서 더 긴 발달 시간이 필요했지만, S8a-4-2 및 T12b-1 2는 각각 여전히 IM 보다 10일 및 8일 더 빠르게 출수되는 원추를 나타냈다(도 2).

실시예 3: HMB4를 벼 게놈의 유전자간 영역에 삽입했다

HMB4 이식유전자의 삽입 부위 및 카피수는 T-DNA 플랭킹 서열분석 방법(GreenGene Biotech, Korea)으로 조사했다. S8a 라인에는 6번 염색체 상의 Os06t0622800-01의 상류 영역으로의 1개의 유전자간 삽입이 있는 반면, T12b에는 Os11t0549401-00의 상류에 1개의 유전자간 삽입이 있고, 1 개는 Os01t0832600-0의 5'상류 1000 영역으로 삽입되었다.

실시예 4: HMB4는 발달을 촉진한다.

형질전환 식물의 조기 개화 표현형을 HMB4 발현 수준과 상관짓기 위해, 개화 발달에 수반되는 4개의 조직을 이용하여 반-정량적 RT-PCR을 수행했다. Rab21은 건조/종자 특이적 유도성 프로모터이고, 원추(panicle) 발달 동안 유도된다(도 3a). 상기 결과는 S8a-4 식물의 원추에서 HMB4의 과발현을 초래하는데, 이는 HMB4가 상기 형질전환 라인에서 rab21 프로모터에 의해 구동되기 때문이다. rab21 프로모터 하에서, 이식유전자는 출수 후 가장 강력하게 발현된다. 따라서, 유전자는 낟알 크기를 크게하며, S8a_4에서는 IM에 비해 더 무겁고 더 큰(11%) 종자를 유도한다.

T12b-1 라인에서, 구성적 프로모터인 PGD가 rab21 대신 사용되었다. 그러나, 4 가지 시험한 조직들 중에서, 지엽은 가장 강력한 HMB4 발현 수준을 갖는다. 이식유전자 발현 수준을 알아내고자 GST로부터의 정방향 프라이머 및 HMB4로부터의 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머쌍(도 3b, G-H 프라이머 쌍)을 이용할 때, HMB4이식유전자는 원추 또는 심지어 일반적인 잎에 비해 지엽에서 현저하게 우성임을 발견했다(도 3a).

그러나, 더 어린 유식물 잎에서는, 이식유전자가 T12b에서 가장 강력하게 발현되었다(도 4D). 이것은 T12b가 4-일령 유식물의 초장에 있어서 IM과 유사하며(도 4A, C), 2-주령에는 IM 보다 훨씬 더 초장이 큰(도 4B) 것으로 짐작할 수 있다. 상기 결과는, PGD 프로모터 하에서는 이식유전자가 생장 단계 동안에 잎에서 계속(constitutive) 발현되고, 따라서 더욱 빠른 유식물 성장을 촉진한다는 점을 시사한다. 이후, HMB4는 지엽에서 발현되고, 개화 시간을 단축한다는 점을 시사한다. 도 4E에서의 도표는 형질전환 및 백그라운드 종자의 발아율에 있어서 차이가 없음을 보여준다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa) 유래의 식물 발달 조절 단백질 OsHMB4(Oryza sativa homeobox 4)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsHMB4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물의 조기 개화를 유도하거나, 식물체의 성장 속도를 증진시키거나, 종자의 크기를 증가시키는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa) 유래의 식물 발달 조절 단백질 OsHMB4(Oryza sativa homeobox 4)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 조기 개화가 유도되거나, 식물체의 성장 속도가 증진되거나, 종자의 크기가 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
10. 제9항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 조기 개화가 유도되거나, 식물체의 성장 속도가 증진되거나, 종자의 크기가 증가된 형질전환 식물체.
11. 삭제
12. 제10항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
13. 제10항에 따른 식물체의 종자.
14. 삭제

Images